Post on 11-Jan-2017
Analiza specjacyjna czy metalomika?
Beata GodlewskaBeata Godlewska--ŻŻyyłłkiewiczkiewiczUniwersytet w BiaUniwersytet w Białłymstokuymstoku
Nowoczesne przyrządy pomiarowe jako narzędziaw pozyskiwaniu informacji naukowych
Ślesin 12-14 V 2008
SpecjacjaSpecjacjaWystWystęępowanie i rozmieszczenie rpowanie i rozmieszczenie róóżżnych chemicznych nych chemicznych i fizycznych form danego pierwiastka w rzeczywistych i fizycznych form danego pierwiastka w rzeczywistych prpróóbkach bkach
Analiza specjacyjnaAnaliza specjacyjnaAnaliza majAnaliza mająąca na celu identyfikacjca na celu identyfikacjęę i/lub pomiar i/lub pomiar zawartozawartośści jednej lub kilku form chemicznych ci jednej lub kilku form chemicznych pierwiastka w prpierwiastka w próóbcebce
wg IUPAC 2000
Pure Appl. Chem. 72 (2000) 1453
Oznaczanie i identyfikacja Oznaczanie i identyfikacja metale i metaloidymetale i metaloidy
ŚŚrodowiskorodowiskoPrzemysPrzemysłł chemicznychemiczny
MedycynaMedycyna
Biochemia roBiochemia rośślin i zwierzlin i zwierząąt, t, żżywienie, ekotoksykologiaywienie, ekotoksykologia
Metaloenzymy Leki (Pt, Ru, Ti)Białka transportująceKwasy nukleinowe
Metaloporfiryny (Ni, V, Fe) Katalizatory (Ru, Rh, Ni)Metylortęć, org.arsen(oleje, paliwa)
Zw. metalorganiczne(Hg, Pb, Cd, Sn) Różne stopnie utlenienia(As(III)/As(V), Cr(III)/Cr(V),Se(IV)/Se(VI), Fe(II)/Fe(III)
Zw. metaloorganiczneMetalotioneiny, fitochelatyny Polisacharydy Zw. makrocykliczne (kobalamina)
Obszary zainteresowania analizy specjacyjnej
Pierwiastki ważne w biologii i medycynie
RnAtPoBiPbTlHgAuPtIrOsReWTaHfLaBaCs
AcRa Fr
XeITeSbSnInCdAgPdRhRuTcMoNbZrYSrRb
KrBrSeAsGeGaZnCuNiCoFeMnCrVTiScCaK
ArClSPSiAl.MgNa
NeFONCBBeLi
HeHistotne fizjologicznie
toksyczne
istotne w farmakologiii diagnostyce
Kliniczny i biochemiczny aspekt specjacjiKontrola homeostazy, metabolizmu i detoksykacji pierwiastkKontrola homeostazy, metabolizmu i detoksykacji pierwiastkóów w niezbniezbęędnych do prawiddnych do prawidłłowego funkcjonowania organizmowego funkcjonowania organizmóóww
WyjaWyjaśśnienie mechanizmnienie mechanizmóów transformacji biochemicznej jonw transformacji biochemicznej jonóów metali i w metali i prostych zwiprostych zwiąązkzkóów nieorganicznych w organizmach w nieorganicznych w organizmach żżywychywych
Oznaczanie zwiOznaczanie zwiąązkzkóów o wysokich masach czw o wysokich masach cząąsteczkowychsteczkowychzwizwiąązki metalorganiczne (zki metalorganiczne (arsenobetaina, arsenocholina, arsenobetaina, arsenocholina, selenoaminokwasy)selenoaminokwasy)kompleksy z biakompleksy z białłkami: biakami: białłka transportujace (ka transportujace (Al, Cu, Zn, FeAl, Cu, Zn, Fe), ), fitochelatyny (fitochelatyny (Cd, Cu, Zn, CoCd, Cu, Zn, Co), metalotioneiny (), metalotioneiny (Cd, Cu, ZnCd, Cu, Zn)) metaloenzymy (metaloenzymy (Zn, Co, MoZn, Co, Mo)) mmetaloetalocukry cukry (Pb, Sr, Ca)(Pb, Sr, Ca), pochodne chlorofilu (, pochodne chlorofilu (Mg)Mg), kobalaminy , kobalaminy
(Co), glikoproteiny, kwasy nukleinowe (Co), glikoproteiny, kwasy nukleinowe (Cr, Pt, Ru, Ni)(Cr, Pt, Ru, Ni)
Ewolucja analizy specjacyjnej
Model układu biologicznego
Haraguchi, JAAS 19 (2004) 5
Proteomikaproteom - protein complement of the genome
Kompleksowa analiza skKompleksowa analiza skłładu biaadu białłkowego danej kowego danej komkomóórki, tkanki lub organizmurki, tkanki lub organizmu
MetabolomikaKompleksowa analiza metabolitKompleksowa analiza metabolitóów komw komóórkowych,rkowych,substancji masubstancji małłoczocząąsteczkowych: aminokwassteczkowych: aminokwasóów,w,kwaskwasóów organicznych, jonw organicznych, jonóów metaliw metali
„„The variety of paths which individual elements The variety of paths which individual elements follow in any organ adds to the specific follow in any organ adds to the specific character of the organisms. Clearly the paths character of the organisms. Clearly the paths have evolved to create an have evolved to create an elemental distributionelemental distributionwhich we shall call the which we shall call the metallomemetallome, to parallel , to parallel the nomenclature of protein distribution, the the nomenclature of protein distribution, the proteomeproteome..””
R.J.P. Williams, Coord Chem Rev 216 (2001) 583 R.J.P. Williams, Coord Chem Rev 216 (2001) 583
elemental distribution in biological cells and organselemental distribution in biological cells and organs
Metalom
Metalomika Metalomika „„Identyfikacja Identyfikacja bioczbiocząąsteczek zwisteczek zwiąązanych z jonami zanych z jonami metali oraz metali oraz wyjaśnienie ich funkcjifunkcji w ukw ukłładach adach biologicznychbiologicznych””
Metalom (metallome)Metalom (metallome) -- „„czcząąsteczka steczka biologiczna zwibiologiczna zwiąązana z metalem oraz jony metali zana z metalem oraz jony metali alkalicznych i ziem alkalicznych, ktalkalicznych i ziem alkalicznych, któóre wystre wystęępujpująąggłłóównie jako wolne jonywnie jako wolne jony””
H. Haraguchi, J Anal At Spectrom 19 (2004) 5H. Haraguchi, J Anal At Spectrom 19 (2004) 5
metal assisted function biochemistrymetal assisted function biochemistry
Metalomika„„Wszechstronna analiza wszystkich form Wszechstronna analiza wszystkich form wystwystęępowania metali i metaloidpowania metali i metaloidóów wewnw wewnąątrz trz komkomóórki lub typu tkankirki lub typu tkanki””
MetalloproteomicsMetalloproteomics -- the study of the part of the the study of the part of the metallome involving the protein ligandsmetallome involving the protein ligands
HeteroatomHeteroatom--tagged proteomicstagged proteomics –– the use of a the use of a heteroelement, naturally present in a protein or heteroelement, naturally present in a protein or introduced in a tag added by means of derivatisation, for introduced in a tag added by means of derivatisation, for the spotting and quantification of proteinsthe spotting and quantification of proteins
J. Szpunar, Analyst 130 (2005) 442J. Szpunar, Analyst 130 (2005) 442
MetalomyWolne jony metaliWolne jony metaliZwiZwiąązki metaloorganicznezki metaloorganiczne
selenoaminokwasy, arsenobetaina, arsenocholina selenoaminokwasy, arsenobetaina, arsenocholina MetaloproteinyMetaloproteiny
metalotioneiny (Cu, Zn, Cd, Hg)metalotioneiny (Cu, Zn, Cd, Hg) fitochelatyny (Cu, Hg, Cd)fitochelatyny (Cu, Hg, Cd) ferrytyna, hemoglobina (Fe) ferrytyna, hemoglobina (Fe)
MetaloenzymyMetaloenzymykarboksypeptydaza (Zn)karboksypeptydaza (Zn) nitrogenaza (Fe,Mo)nitrogenaza (Fe,Mo) dysmutaza ponadtlenkowa dysmutaza ponadtlenkowa (Mn, Fe, Cu)(Mn, Fe, Cu)
Techniki połączone stosowane w analizie specjacyjnej oraz metalomice
R. Łobiński, Biochimie 88 (2006) 1591
HPLC ICP-MS
CE ICP-MS
ICP
MS
próbka
Chromatografiacieczowa
Elektro-chromatografia
Rozdzielanie jednowymiarowe
A. Sanz-Medel et al. Anal Bioanal Chem 377 (2003) 236K. Połeć et al. J Anal At Spectrom 15 (2000) 1363
Chromatografia cieczowa
Jonowymienna, ICWykluczania, SECOdwróconych faz, RP
transferyna
ceruloplazminaalbuminaSurowica krwi
Cd-metalotioneiny - wątroba królika
IC-HPLC-ICP-MS
Badania Ni i Cu związanych z białkami w organach myszy SEC-ICP-MS (kolumna LMM)
Gomez-Ariza, Anal Bioanal Chem 380 (2008) 17
Ni
Cu
Metalotioneinyz wątroby królika
Wang i Prange; Anal Chem 74 (2002) 626
ElektrochromatografiaElektroforeza kapilarna, CEKapilarna elektroforezastrefowa, CZE
CE-ICP-MS
Badania oddziaływania różnych form rtęciz DNA (CE-ETAAS)
Metylortęćmetylortęć
etylortęć
fenylortęć
Hg(II)
12 h czas inkubacji Hg z DNA
CE: kapilara 40 cm, 12kV, bufor H3BO3-Tris, pH= 9,5
ETAAS: termosprayszczelina 2,6 nm
Li et.al., Anal. Chem 78 (2006) 611
Rozdzielaniejednowymiarowe
Elektroforeza żelowa
SeMet-CaM
1D SDS-PAGE LA-ICP-MS
LA
Ablacja laserowa
Chromatogram moczu (1:1)RP18- ICP - MS
Jakubowski et al.; JAAS 16 (2001) 457
Chromatogram moczu (1:1)
Jakubowski et al.; JAAS 16 (2001) 457
Analizatormas
roztwór białek
Identyfikacja selenizowanej kalmoduliny(SeCaM) techniką ES-MS
Łobiński et al.; JAAS 20 (2005) 493
Widmo po dekonwolucji
LA ICP-MS
ICP MS
Chromatografiawielowymiarowakolumnowa
Metalotioneiny wątrobykrólika związane z Cd
Elektroforeza dwuwymiarowa
Rozdzielenie białek wg ładunku i masy cząsteczkowej 2-DE (CGE)
Jonizacja laserowa wspomagana matrycąMALDI –TOF MS lub MALDI-QMS
Matryca: kwas synapinowykwas 2,5 dihydroksybenzoesowy
337nm
2D elektroferogrambiałek wydzielonychz mitochondriów drożdży
Becker et al. JAAS 19 (2004) 1235
Rozdzieleniebiałek 2D-PAGE
59
Poszukiwanie białek zawierającychmetale LA-ICP-MS
Sygnały 64Zn+ i 56Fe+ w rozdzielonych białkach otrzymane LA-ICP-SFMS
Identyfikacjabiałka (plamka 59)
Stosowane techniki:Stosowane techniki:SDS 2DSDS 2D--PAGE PAGE LALA--ICPICP--SFMSSFMSMALDIMALDI--FTICRFTICR--MSMS
Uzyskane informacje:Uzyskane informacje:Zawiera P, S, Zn, Fe, Cu Zawiera P, S, Zn, Fe, Cu Liczba atomLiczba atomóów S w S –– 1414Zu/S=0,006; Fe/S=0.03Zu/S=0,006; Fe/S=0.03StStężężenie Zn 3,4 mg/g enie Zn 3,4 mg/g
Fe 0,87 mg/gFe 0,87 mg/gMasa 35Masa 35--40 kDa40 kDa
Becker et al. JAAS 19 (2004) 1235
Aac2p Aac2p -- ggłłóówny translokator wny translokator ATP/ADP mitochondriATP/ADP mitochondrióóww
Zakres badań metalomikiTechnika pomiarowaBadania
Techniki sprzężone z ICP-MS
Diagnostyka medyczna
LC-ES-MS, LC-MALDI-MS, GE- MALDI-TOF-MS, LC-ICP-MS, LA-ICP-MS
Identyfikacja biocząsteczek zawierających metale, metaloprotein, metaloenzymów
GC-MS, ES-MS Metabolizm cząsteczek biologicznych i metali (metabolomów)
Techniki sprzężone: LC-ICP-MS, GC-ICP-MS, MALDI-MS
Specjacja chemiczna pierwiastków w próbkach i układach biologicznych
Techniki analizy pierwiastkowej np. ICP-MS
Rozmieszczenie metali w płynach biologicznych, komórkach, narządach
Prange, ABC 383 (2005)372
ICPICP ESIESI MALDIMALDI
Analizowane masyAnalizowane masy 0,010,01--1kDa1kDa 0,050,05--100 kDa100 kDa 11--1000 kDa1000 kDa
Rodzaj prRodzaj próóbkibki ciekciekłłe, gazowe,e, gazowe, ciekciekłłee stastałłeestastałłe e (LA)(LA)
SprzSprzężężenieenie z kolumnz kolumnąą z kolumnz kolumnąą planarneplanarneHPLC, CEHPLC, CE HPLCHPLC 2 DE2 DEplanarne (LA)planarne (LA) 2D2D--PAGEPAGE
Rodzaj informacjiRodzaj informacji identyfikacja identyfikacja identyfikacjaidentyfikacja identyfikacja czidentyfikacja cząąst.,st.,pierwiastka, pierwiastka, czcząąsteczkisteczki sekwencja sekwencja analizaanaliza aminokwasaminokwasóów,w,izotopowa,izotopowa, „„imagingimaging”” MSMSiloilośściowaciowa
Cykl geochemiczny związków metaloorganicznych w środowisku
Proteomika
Najnowsze trendy
Cu związana z białkami o różnych masach cząsteczkowych w organach myszySEC-ICP-MS (kolumna LMM)
Gomez-Ariza, Anal Bioanal Chem 380 (2008) 17
Metody bezpoMetody bezpośśrednierednie::Oznaczanie specjacji arsenu, selenu, antymonu w materiaOznaczanie specjacji arsenu, selenu, antymonu w materiałłach ach
biologicznych technikbiologicznych technikąą generowania wodorkgenerowania wodorkóówwAs(III) i As(V), Se(IV) i Se(VI), Sb(III) i Sb(V)As(III) i As(V), Se(IV) i Se(VI), Sb(III) i Sb(V)
Funkcje metali w układach biologicznych
Strukturalne (Ca, Mg)Strukturalne (Ca, Mg)
Kontrola rKontrola róównowagi kwasowownowagi kwasowo--zasadowej oraz zasadowej oraz ciciśśnienia osmotycznego (Na, K)nienia osmotycznego (Na, K)
Przenoszenie Przenoszenie łładunku (Na, K, Ca)adunku (Na, K, Ca)
Stabilizacja struktury biaStabilizacja struktury białłek (Zn) oraz kwasek (Zn) oraz kwasóów w nukleinowych (Na, Mg)nukleinowych (Na, Mg)
Przenoszenie elektronPrzenoszenie elektronóów (biaw (białłka ka żżelazowoelazowo--siarkowe, siarkowe, biabiałłka miedziowe)ka miedziowe)
Aktywacja enzymAktywacja enzymóów, np. karboksypeptydazy, w, np. karboksypeptydazy, anhydraza wanhydraza węęglanowej, oksydoreduktazy glanowej, oksydoreduktazy
Oddychanie komOddychanie komóórkowe (Fe, Cu)rkowe (Fe, Cu)
Techniki połączone stosowane w metalomice
CE
HPLC
Elektroforezażelowa
Elektro-chromatografia
SDS-PAGE
IEF
IC
RPSEC
CECMEKC
Rozdzielanie Detekcja MS
Atomowa ICP-MS
CząsteczkowaES-MS
MALDI TOF MS
Proteomikaproteom - protein complement of the genome
Kompleksowa analiza skKompleksowa analiza skłładu biaadu białłkowego danej kowego danej komkomóórki, tkanki lub organizmurki, tkanki lub organizmuWyodrWyodręębnianie krbnianie króótkich sekwencji aminokwastkich sekwencji aminokwasóów w (peptyd(peptydóów) czyli poszukuje siw) czyli poszukuje sięęmap peptydowych map peptydowych -- peptydy dzieli sipeptydy dzieli sięę, identyfikuje, , identyfikuje, --informacja o masie czinformacja o masie cząąsteczkowej i kolejnosteczkowej i kolejnośści ci aminokwasaminokwasóów wybranych peptydw wybranych peptydóów w -- poszukiwanie poszukiwanie rróóżżnic w profilach bianic w profilach białłkowych, ktkowych, któórymi rrymi róóżżniniąą sisięęosobnicy zdrowi i chorzyosobnicy zdrowi i chorzy