Validering af molekylærbiologiske

analyser

Marianne Antonius Jakobsen

Afsnitsleder for molekylærbiologisk lab.

Klinisk Immunologisk afdeling, OUH.

Hvordan laver man en god validering?

• Standarden:

• Mere uddybende guideline under DSKB.

Typer af molekylærbiologiske analyser

• Bestemmelse af HLA-vævstyper (SSO-PCR og SSP-PCR)

• Bestemmelse af specifikke HLA-vævstyper (f.eks. HLA-DQ2/8 m. microarrays)

• Genotype bestemmelse (SNP assays)

• Genomisk blodtypebestemmelse

• Frit føtal DNA analyser (RHD bestemmelse)

• Sanger sekventering

• Next Generation sequencing (NGS)

Kvalitative analyser

Hvordan laver man så en god validering af en kvalitativ analyse?

Klinisk Immunologi, OUH

• Produktionsenhed

• Diverse laboratorieafsnit:

o Erytocytlaboratoriet

o HIV/HEP

o Autoimmunlaboratoriet

o Leukocytlaboratoriet

o Molekylærbiologisk

Hvad har vi gjort?

Vores valideringsprotokol

• Formål

• Anvendelsesområde

• Metodebeskrivelse (i drift):

• Målemetode

• Måleenhed

• Udstyr

• Prøvemateriale

• Reagenser/utensilier

• Sporbarhed mht. prøveid

• Svarafgivelse

Prøvemateriale

eller

Sporbarhed mht. prøveid.

Svarafgivelse

• Beskrivelse af hvordan svaret generes og konkluderes

• F.eks. analysesoftware og version

• Procedure omkring analysering, hvem gør hvad?

• Svarafgivelse:

• Simpelt svar

• Mere kompliceret svar og hvilke krav

Vores valideringsprotokol fortsat

• Kriterier for accept:

• Måleområde

• Detektionsgrænse

• Linearitet

• Korrekthed

• Analytisk specificitet

• Præcision/reproducerbarhed

• Afsmitning

• Robusthed/ydre påvirkninger

• Eventuelt

Korrekthed

• Overensstemmelse mellem metode og anden (reference-) metode:

• SNP genotype versus Sanger

• MicroArray versus high resolution HLA

• NGS versus Sanger

Valideringsprotokol

• Valideringsprocedure:

• Anvendt prøvemateriale

• Referencemateriale

• Valideringsbetingelser

• Procedure (punkt for punkt)

Prøvemateriale

• Referencemateriale (kan være rigtig svært at få fat i)

• EQA prøver med kendt svar

• Tidligere kørte patientprøver med kendt diagnose

• F.eks. til HLA-DQ2/8

• Sammenligning med anden standard metode

• Molekylærbiologisk med serologisk

• Prøver fra andre laboratorier

• OBS: hvor sikker er du på den metode, du sammenligner med?

Valideringsprotokol

• Valideringsprocedure:

• Anvendt prøvemateriale

• Referencemateriale

• Valideringsbetingelser

• Procedure (punkt for punkt)

• Indsamling af data:

• Hvilke type data

• Databehandling

Valideringsrapport

• Ændringer i forhold til protokollen

• Resultater (punkt for punkt)

• Kvalitetssikring af metode i drift

• Måleusikkerhed

• Konklusion

• Arbejdsmiljø

• Husk: at skrive rapporten så detaljeret, at du også forstår den om 5 år (og din TA forstår den).

Kvalitetssikring

• Kitkontroller

• Interne kontroller

• Eksterne kontroller

Interne kontroller

• Negativ kontrol (kontaminering)

• Krav til nogle kits

• Rigtig god ide til alle PCR opsæt.

• Positiv kontrol

• Afhænger meget af opsæt:

• Genotypebestemmelse med SNP

• Positiv kontrol til føtal RHD bestemmelse

• Ved 96 brøndsopsæt (marker plades placering)

• Hjemmegjorte kontroller (spikede prøver eller gamle patientprøver)

Eksterne kontroller (EQA)

• Metode- eller sygdomsspecifik

• DEKS

• EMQN

• NEQAS

• INSTAND

• RfB (referenzinstitut für bioanalytik, DAkkS)

• Qualigene

• Udveksling med andre laboratorier

Eksterne kontroller (EQA) • DEKS • EMQN

• Sanger sekventering • NGS • HRF

• NEQAS • Diverse HLA (low resolution, B27, B5701, DQ2/8) • Kimæriseundersøgelse

• INSTAND • Genomiske blodtyper inkl. HPA

• RfB (referenzinstitut für bioanalytik, DAkkS) • IL28B

• Qualigene • MLPA

• Udveksling med andre laboratorier • Føtal RHD bestemmelse

Eksempel på validering 1

• Mannan-bindende lektin (MBL)

• 7 mulige haplotyper (HYPA, LYPA, LYQA, LYPB, LXPA, LYQC og HYPD)

+4

P/Q

Valideringsopsæt

• Metode: Sanger sekventering

• Materiale: Prøver fra Rigshospitalet (SNP assay)

• Fuld overensstemmelse på mulige SNP’s

Hele valideringen er kørt om

• 88 prøver fra SSI (alle SNP’s dækket):

• 80 enslydende

• 3 kunne ikke opformeres

• 5 diskrepans

• Hvilken analyse er så korrekt?

• Tredje metode i brug

• Konklusion har betydet procedureændring

Eksempel på validering 2

• Targeted sekventering af 17 gener med NGS.

• Validering koncentreret om 4 gener, som vi hidtil har Sanger sekventeret.

Ion Torrent:

Opbygning af validering

• Grundig metodebeskrivelse fra prøvehåndtering til dataanalyse

• Anvendt materiale (DNA fra patientprøver og EMQN)

• Korrekthed: • test for kendte varianter i de 4 gener

• Homo/heterozygote

• (Insertioner/deletioner og homopolymer varianter)

• Reproducerbarhed (inter-run) • 2 biblioteker fra samme prøve i 2 forskellige kørsler

• Repeterbarhed (intra-run) • Et bibliotek delt i 2 i samme kørsel

• Robusthed: • Dækning for de enkelte amplikons

• Krydskontaminering

Kriterier for accept

• Kvalitetskrav for selve kørsel

• Total aligned bases

• Alignement kvalitet

• Kvalitetskrav for prøve

• Assigned amplicon reads

• Krav til resultat:

• Genfinde kendte mutationer

• Dækning af kodende regioner eller mulighed for at hurtig identificere ikke-dækkede områder

• Vurdering på krydskontaminering

Hvad valideringen ellers viste

• Heterozygot variant allelfrekvens - 0,42-062

• Homozygot variant allelfrekvens - 0,99-1

• Forward/reverse readfrekvensen - stor variation

Vores erfaring

• NGS har krævet flere tillægsvalideringerne:

• Producent ændrede kittet af flere omgange

• Skiftet apparatur

• Skiftet analysesoftware 2 gange

Vores erfaring

• Fordel med fleksibel akkreditering på både Sanger og NGS

• Validerer metode

• Tilføje gener eller paneler efter behov

• Estimat på usikkerhed

• Ikke udregnet en værdi

• Angiver forbehold i brugerhåndbog og svar:

• Angiver hvis ikke fuld dækning

• Ikke-kodende region ej undersøgt

• Heterozygot deletion af helt exon ej undersøgt

Spørgsmål?