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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU
ANA TEREZA BARUFI FRANCO
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS
ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA
SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA.
SÃO PAULO
2013
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU
ANA TEREZA BARUFI FRANCO
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS
tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE
BOTHROPOIDES JARARACA.
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Medicina da
Universidade Nove de Julho, como requisito
para obtenção do título de Mestre em Medicina.
Orientador: Prof. Dra. Stella Regina Zamuner.
SÃO PAULO
2013
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
“Se enxerguei mais longe, foi porque estava sobre os ombros de gigantes.”
(Isaac Newton).
“Por que o homem quer subir a montanha mais alta do mundo? Ora, a resposta é a mais simples possível, porque ela está lá.”
O desafio é uma virtude inerente ao ser humano. Foi assim que me senti diante da proposta de realizar este trabalho.
Como algo totalmente novo, abracei esse repto, com o doce sabor de aventura e de fascinação, diante às novas sendas abertas por essa jornada através das
fronteiras do conhecimento e da habilidade humana.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
DEDICATÓRIA
À Deus, pela minha vida e pela paz e força nos momentos
em que me encontrei incapaz de prosseguir.
Dedico esta tese às pessoas mais importantes para mim,
minha amada mãe Maria Teresinha, e ao meu amado pai Walter,
principais responsáveis pela minha vida e a quem devo meu
caráter e disciplina ao trabalho; e ao meu querido namorado
Eduardo, sempre paciente e generoso em meus momentos de muito
estudo e ausência.
Ofereço este trabalho em memória do meu avô Antonio, que
sempre me guiou ao sucesso e sempre confiou em minha
capacidade e que agora se encontra junto a Deus.
Esta dedicatória se estende também a minha amiga,
professora e orientadora Drª. Stella Regina Zamuner. A esta devo
a confiança em minha capacidade como pesquisadora, além da
paciência e tranquilidade para me transmitir os ensinamentos da
pesquisa.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
AGRADECIMENTOS
À Universidade Nove de Julho, que aceitou me receber no
programa de Mestrado e acreditou no meu profissionalismo;
À PROSUP/CAPES, pela bolsa de estudos;
À professora Silvia Fernanda Zamuner, que muito me auxiliou
nos experimentos e na melhor compreensão de nossos questionamentos;
Às minhas queridas alunas Luciana e Aline, que muito me
ajudaram desde o início e me ensinaram toda a base científica que hoje
eu possuo. E também pelos momentos alegres, de compreensão e
amizade.
Às minhas irmãs, Carolina, Ana Olívia e Malu pelo apoio.
Aos meus sobrinhos, Maria Eduarda e Antonio, pelos momentos
alegres e de distração.
Aos demais familiares que sempre me incentivaram e torceram
pela minha vitória.
Aos amigos de Mestrado, de modo especial Vera, Elis, Beatriz,
Fernanda, Gabriela e Vinícius pelo apoio sincero e pela agradável
companhia.
E a todas as pessoas que direta ou indiretamente colaboraram
para o sucesso deste trabalho.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
RESUMO
As serpentes do gênero Bothrops e Bothropoides são as responsáveis
pelo maior número de acidentes ofídicos no Brasil, apresentando efeitos
sistêmicos graves, além de induzirem um quadro fisiopatológico caracterizado
por reações locais como edema, mionecrose, dor e hemorragia. A utilização do
soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade
possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos,
porém sua ação não se estende as manifestações locais. A laserterapia de
baixa potência é uma alternativa de tratamento em situações de lesão local,
devido a seus efeitos biológicos, sendo considerado um recurso bioestimulante
em tecidos. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do laser de baixa
potência vermelho- comprimento de onda de 660 nm; e o laser infravermelho-
comprimento de onda 780 nm, em monocamada de células endoteliais
submetidos à lesão por veneno de Bothropoides jararaca. Os resultados
obtidos mostraram que o veneno, afetou a integridade das monocamadas de
células endoteliais em todas as concentrações analisada (5, 10, 12,5, 25 e
50L/mL) em todos os períodos de tempo analisados. Para avaliação do efeito
protetor do laser, a dose usada de 4 J/cm2 reduziu o descolamento de células
endoteliais melhorando assim a integridade celular. Esse efeito foi observado
nos comprimentos de onda de 660 nm nos tempos de 60 e 120 min, o mesmo
efeito não foi observado com o comprimento de onda 780 nm. Desta forma,
este estudo permitiu entender melhor os efeitos fisiopatológicos do
envenenamento botrópico, bem como contribuiu para a melhor compreensão
dos efeitos do laser de baixa potência e, eventualmente, favorecer medidas
terapêuticas mais eficientes e/ou complementares.
Palavras chaves: endotélio, Bothropoides jararaca, laser de baixa potência.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
ABSTRACT
The Bothropoides and Bothrops gender are responsible for the largest
number of snakebites in Brazil, presenting serious systemic effects that induce
pathophysiological alterations characterized by local reactions such as edema ,
myonecrosis, pain and hemohrrage. The antivenom is used to neutralize the
greatest possible amount of circulating venom, minimizing its systemic effects.
But its action does not extend to local manifestations. The low level laser
therapy is an alternative treatment in situations of local lesions due to its
biological effects, and is considered a biostimulate resource to the tissues . The
aim of this study was to analyze the effect of low power laser -red wavelength of
660 nm, and the infrared laser- wavelength 780 nm, in endothelial cells
submitted to injury by Bothropoides jararaca venom. The results showed that
the snake venom affected the integrity of endothelial, in all concentrations (1, 5,
10, 12,5, 25 and 50 µg/mL); and affected the viability of endothelial cell in 10
µg/ mL at all time periods analyzed . To evaluate the protective effect of the
laser, the dose of 4 J/cm2 reduced the detachment of endothelial cells by
improving cellular integrity . This effect was observed in a wavelength of 660 nm
at 60 and 120 minutes. The same effect was not observed with the wavelength
of 780 nm. So, the present study allowed us to better understand the
pathophysiological effects of Bothropoides venom, and contributed to a better
understanding of the effects of low power laser and eventually facilitate
therapeutic measures more efficient and / or complementary.
Keywords : endothelium , Bothropoides jararaca, low level laser
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
ÍNDICE
Conteúdo Página
Resumo
1.Introdução 06
1.1.Acidentes ofídicos e epidemiologia 06
1.2.Mecanismos de ação do veneno botrópico 08
1.3.A serpente Bothropoides jararaca 09
2.Considerações gerais sobre o endotélio vascular 14
2.1.O veneno botrópico e as células endoteliais 16
3.Soroterapia 17
4. Terapia com laser de baixa potência 20
4.1. LBP e acidentes ofídicos 21
4.2. Laser e células em cultura 22
5. Objetivos
5.1. Geral
5.2. Específicos
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6. Material e Métodos
6.1. Veneno de serpente Bothropoides jararaca (VBj)
6.2. Células endoteliais (CE)
6.3. Cultivo Celular
6.4. Irradiação laser de baixa potência
6.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT)
6.6. Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de células
endoteliais – Descolamento Celular
6.7. Análise da liberação da lactato desidrogenase (LDH)
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7. Análise estatística 31
8. Resultados e Discussão
8.1. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de células
endoteliais tEND
8.2. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de células
endoteliais tEND
8.3. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potência
na integridade das células endoteliais tEND.
8.4. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potência
na viabilidade das células endoteliais tEND.
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8.5. Efeito do Laser de Baixa Potência 660 nm na integridade de células
endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
8.6. Efeito do Laser de Baixa Potência 780 nm na integridade de células
endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
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8.7. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na viabilidade de células
endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
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8.8. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na viabilidade de células
endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
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8.9. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na liberação da enzima
Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais submetidas à lesão por
veneno B. jararaca.
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8. 10. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
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9.Discussão 52
10. Considerações Finais 59
11. Referências Bibliográficas 60
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Acidentes ofídicos e epidemiologia
Acidente ofídico ou ofidismo é o quadro de envenenamento decorrente
da inoculação de toxinas através do aparelho inoculador de serpentes. Devido
ao grande número de casos, os acidentes causados por serpentes
peçonhentas constituem, ainda, um problema de Saúde Pública em regiões
tropicais do mundo (Chippaux, 1998; Moura da Silva, 2012).
No Brasil, o primeiro estudo epidemiológico de acidentes ofídicos foi
realizado por Vital Brasil em 1901, quando levantou o número de óbitos por
picadas de serpentes peçonhentas no Estado de São Paulo, registrando um
número considerável de óbitos por acidentes ofídicos desde 1900 (Bochner et
al, 2003), devido ao agravamento do quadro após o envenenamento, conforme
Tabela 1.
As serpentes responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos na
América Latina pertencem ao gênero Bothrops e Bothopoides, da família
Viperidae (Moura da Silva, 2012), e por esse motivo, esse gênero constitui o
grupo mais importante, com mais de 60 espécies em todo o território e pode
ser encontrada em ambientes diversos. Segundo registros das ocorrências
anuais, as serpentes do gênero Bothrops e Bothropoides são responsáveis por
mais de 90% dos acidentes ofídicos no Brasil (Chippaux, 1998; Moura da Silva,
2012), sendo que a maior frequência desses acidentes envolve a serpente
Bothropoides jararaca (Nishijima et al, 2009).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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Tabela 1. Acidentes ofídicos e suas respectivas gravidade
Extraído de: Extraído de: Ministério da Saúde- Acidentes ofídicos
http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/gve_7ed_web_atual_aap.pdf
Com relação ao gênero Bothrops e Botropoides, os acidentes
causados por essas serpentes não apresentam alta letalidade (0,31 %), porém
devido à alta incidência, são consideradas de grande importância
epidemiológica no país (Manual de diagnóstico e tratamentos de acidentes por
animais peçonhentos, 1999), conforme exemplificado na figura.
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Figura 1 – Acidentes ofídicos ocorridos no Brasil.
1.2. Mecanismo de ação do envenenamento botrópico
Os venenos ofídicos constituem uma mistura complexa de proteínas e
outros compostos, com as mais diversas propriedades biológicas. Acredita-se
que os seus efeitos resultem da somatória dos efeitos isolados dos vários
componentes, com atividades biológicas distintas ou sinérgicas (Takeya et al.,
1990; Zychar et al., 2010; Bruserund, 2013).
O envenenamento pela espécie Bothrops e Bothropoides leva a
manifestações sistêmicas e locais, as quais incluem desde dor e edema à
insuficiência renal e choque hipovolêmico (Warrell, 1996; Doin-Silva, et al.,
2009; Milani Junior, et al., 1997; Carneiro, et al., 2002; Zychar et al., 2010;
Bruserund, 2013).
Dentre as manifestações após o envenenamento, aquelas locais se
evidenciam nas primeiras horas após a picada com a presença de edema, dor
e equimose na região da picada, que progride ao longo do membro acometido.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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Além disso, as marcas nem sempre são visíveis no momento da picada, assim
como o sangramento nos pontos de inoculação das presas. Bolhas com
conteúdo seroso ou serohemorrágico podem surgir na evolução e dar origem à
necrose cutânea. As principais complicações locais são decorrentes da
necrose e da infecção secundária que podem levar à amputação e/ou déficit
funcional do membro (Chippaux, 1998; Warrell, 1996).
As manifestações sistêmicas são evidenciadas por sangramentos em
pele e mucosas (gengivorragia, equimoses à distância do local da picada);
hematúria, hematêmese e hemorragia em outras cavidades podem determinar
risco ao paciente. A hipotensão, também presente, pode ser decorrente de
sequestro de líquido no membro picado ou hipovolemia consequente a
sangramentos, que podem contribuir para a instalação de insuficiência renal
aguda (Chippaux, 1998; Warrell, 1996).
1.3 A serpente Bothropoides jararaca (B. jararaca)
A serpente Botropoides jararaca anteriormente classificada como
Botrhops jararaca apresenta porte médio, podendo atingir até 1,5 m, com
presença de escamas superiores fortemente quilhadas. As espécies desse
gênero são encontradas em todo o Brasil e também nas regiões adjacentes ao
Paraguai e Argentina (Barraviera, 1993), conforme figura 2 abaixo:
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Figura 2 – Distribuição geográfica da B. jararaca
extraída de:www.cobrasbrasileiras.com.br
O veneno da serpente B. jararaca consiste de uma mistura complexa
de várias classes de toxinas, sendo que a maior parte consititui-se de
metaloproteinases (Moura-da-Silva, et al., 2012). Diferentemente de outros
venenos botrópicos, o veneno de B. jararaca apresenta concentrações muito
baixas de fosfolipase A2 e/ou miotoxinas; outra classe de protease presente no
veneno de B. jararaca são as serinoproteases, as quais são capazes de induzir
a liberação de bradidinina (Moura da Silva et al, 2012).
Nesse sentido, o gênero B.jararaca possui veneno com maior atividade
proteolítica em comparação aos demais venenos, sendo demonstrado por
estudos que a hemorragia consiste na maior atividade tóxica do veneno de
jararaca (Nishijima et al., 2009; Teixeira et al., 2005; Baldo et al., 2010; Moura-
da-Silva, et al., 2012).
Maior prevalência B. jararaca
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A literatura sugere que metaloproteinases do veneno da serpente
(SVMPs) são responsáveis pela hemorragia local no envenenamento ofídico
(Baramova et al., 1989; Kamiguti, 1996; Nishijima et al., 2009; Teixeira et al.,
2005; Baldo et al., 2010; Moura-da-Silva, et al., 2012). Ainda, as SVMPs
possuem efeito citotóxico sobre as células endoteliais, atuando principalmente
no sistema homeostático (Nishijima et al, 2009).
Assim, a patogenicidade envolvida no envenenamento por B. jararaca
inclui a lesão de vasos da microcirculação, através da ação das
metaloproteinases do veneno ofídico, as quais pertencem à uma subfamília de
enzimas Zn2+-dependentes (Teixeira et al, 2005; Nishijima et al, 2009; Brenes
et al., 2010; Domingos et al, 2013). A lesão dos vasos ocorre quando há
inoculação do veneno, que contém dentre outros componentes, SVMPs,
astacinas e serralisinas, classficadas conforme a figura 03, e que agem na
matriz celular por possuírem elevada afinidade com a mesma (Teixeira et al,
2005; Baldo et al, 2010), desencadeando os efeitos miotóxicos
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Figura 3: Classificação das Metaloproteinases de venenos.
Extraído de Fox et al., 2008
Dados da literatura indicam que as SVMPs atuam sobre proteínas da
matriz extracelular, com diferentes especifidades. Considerando que as
proteínas presentes na matriz são importantes para manter a integridade
estrutural e funcional do endotélio, foi proposto que a degradação dos seus
componentes pelas metaloproteinases de venenos poderia ser o principal
mecanismo envolvido na produção de hemorragia, através da proteólise da
membrana basal, permitindo a formação de fendas intercelulares, culminando
com a saída de hemácias (Baramova et al,1989; Teixeira et al, 2005; Nishijima
et al, 2009; Baldo et al, 2010).
Ainda, a literatura demonstra que as SVMPs hemorrágicas, com
elevado peso molecular, que são constituídas por domínios semelhantes de
disintegrina e domínios ricos de cisteína, são mais ativas na indução
hemorragia em comparação à enzimas que abrangem apenas o domínio de
metaloproteinases (Teixeira et al, 2005; Brenes et al., 2010). Ademais, a
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atividade hemorrágica tem sido associada, também, com a atividade
proteolítica (Teixeira et al, 2005), as quais promovem degradação estrutural e
funcional presente na mionecrose (Baldo et al, 2010).
Diante disso, as células endoteliais têm sido estudadas como
potenciais alvos das toxinas hemorrágicas (Baldo et al, 2010) sendo que o
principal mecanismo de adesão de células endoteliais pode ser interrompido
pela presença de SVMPs, utilizando de mecanismos dependentes ou
independentes de sua atividade proteolítica. Tanto as SVMPs hemorrágicas
quanto as não hemorrágicas demonstraram interferir nos componentes
envolvidos na adesão entre as células endoteliais e as proteínas presentes na
matriz extracelular, culminando na morte celular por apoptose (Teixeira et al,
2005). Em estudos experimentais, as SVMPs hemorrágicas e não-
hemorrágicas são capazes de induzir comparável taxas de apoptose em
células endoteliais, e o aparecimento da hemorragia induzida pelas SVMPs
ocorre muito mais cedo do que a indução de apoptose de células endoteliais in
vitro. (Baldo et al, 2010).
Dentre as SVMPs presentes no veneno de B. jararaca, entre as
isoladas, a jararagina é a que tem sido melhor estudada e pertence ao grupo P-
IIIb, uma MMP hemorrágica, e atua promovendo o influxo leucocitário e pode
estimular diretamente a expressão de mRNA dos genes TNF, IL-1 e IL-6, por
macrófagos licitados (Teixeira et al, 2005), o que sugere que os macrófagos
constituem de alvos importante do mecanismo envolvido na ação decorrente
das SVMPs no processo inflamatório (Teixeira et al, 2005; Baldo et al, 2010).
A jararagina foi a primeira SVMPs isolada do veneno da B. jararaca e
foi caracterizada por completo sua estrutura primária, mostrando que atua
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diretamente nos vasos sanguíneos endoteliais e sub-endoteliais, na matriz
proteica, plaquetas, coagulação, fatores como Fator de von Willebrand (vWF) e
fibrinogênio. Ainda, atua sobre os receptores da superfície das células e sobre
os fibroblastos, células epiteliais e inflamatórias, sendo capaz de promover a
degradação da fibrina e aumento da fibrinólise devido ao aumento da atividade
ativadora do plasminogênio tecidual e inativação do inibidor de α2 plasmina,
além de interferir na função plaquetária através da inibição de colágeno e na
agregação de plaquetas induzida por ristocetina (Moura-da-Silva et al., 2012).
Ademais, Baldo et al. (2010), buscou comparar os efeitos hemorrágicos
imediatos entre a SVMPs BnP1, extraída da B. neuwiedi, pertencente ao grupo
P-Ia e, portanto, considerada de baixo potencial hemorrágico, e a jararagina, na
pele de camundongos. Esse estudo teve por objetivo avaliar as alterações
provocadas entre as SVMPs. A jararagina foi capaz de produzir um efeito
hemorrágico intenso, enquanto que mesmo as doses mais elevadas de BnP1
não foi capaz de produzir efeito comparável. Ainda, este trabalho mostrou que
a jararagina causa lesão hemorrágica na hipoderme dos animais, indicando
degradação massiva de colágeno fibrilar e que a jararagina foi localizada
próximo aos pequenos vasos sanguíneos. (Baldo et al, 2010).
2. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O ENDOTÉLIO VASCULAR
O endotélio vascular é constituído por uma camada contínua de células
– células endoteliais - que revestem o lúmen dos vasos e separam o sangue
dos tecidos. A sua integridade funcional e estrutural é fundamental para a
manutenção da homeostasia e da função circulatória (Carvalho, 1996).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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As células endoteliais de um modo geral são alongadas, poligonais e
dotadas de ampla superfície. A parte luminal está continuamente exposta às
células circulantes e aos componentes plasmáticos. A porção oposta,
abluminal, está em contato com a matriz extracelular e tecidos adjacentes, que
por meio de integrinas, liga-se a lamina basal. Esta é constituída por vários
tipos de colágenos (tipo IV, V e VII), laminina, sulfato de heparan e de
condroitina, proteoglicanos, entactina, nidogênio e sialoglicoproteínas,
associados à fribonectina. Dado o alto teor de colágeno, a lâmina basal pode
ser digerida por colagenases (Carvalho et al., 1996).
O endotélio além da sua função como membrana semipermeável, é
considerado um tecido metabolicamente ativo. Por sua capacidade de sintetizar
e secretar inúmeras substâncias exerce várias funções fisiológicas: a) no
metabolismo de substâncias vasoativas, por conter enzimas que transformam a
angiotensina I em angiotensina II e inativam a noradrenalina, serotonina e
bradicinina; b) na hemostasia, por meio da produção de substâncias
coagulantes (fator de Von Willebrand; inibidor de plaminogênio) e
anticoagulantes, como a prostaciclina (PGI2) c) na produção de antígenos dos
grupos A e B, fibronectina, colágenos d) na modulação do tônus vascular, por
sua capacidade de produzir e liberar fatores relaxantes da musculatura lisa dos
vasos, como o óxido nítrico (NO) (Moncada, et al., 1988; Moncada et al., 1991).
Por outro lado as células endoteliais sofrem alterações de estrutura,
função e propriedades metabólicas, em resposta a fatores de crescimento,
substâncias vasoativas e citocinas, que variam de acordo com o tecido em que
se localizam (Thuillez, 2005). Desse modo, o endotélio ativado afeta o
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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crescimento do músculo liso, por sua capacidade de gerar diversos fatores de
crescimento que induzem espessamento da parede dos vasos e favorecem o
desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Carvalho et al., 1996).
Em síntese, o endotélio, em condições fisiológicas, desempenham papel
protetor do sistema cardiovascular, liberando substâncias que modulam a
contração do músculo liso vascular, a sua proliferação, a adesão e agregação
plaquetária e controlam a hemostasia. Portanto, em condições de disfunção ou
lesão desse tecido, há repercussão sobre a estrutura vascular, tecido adjacente
e, por fim, sobre o sistema cardiovascular.
2.1. O veneno botrópico e as células endoteliais
Os venenos e as toxinas hemorrágicas isoladas afetam,
principalmente, a integridade de vasos de pequeno calibre (Ownby, 1990;
Borkow et al., 1993). Lomonte et al. (1994) demonstraram que os vasos da
microcirculação perdem a sua integridade em 4 a 6 minutos após exposição ao
veneno de Bothrops asper. Este efeito foi atribuído, em parte, à proteólise da
membrana basal dos vasos pelo veneno, levando à saída de eritrócitos por
processo ainda não esclarecido. Adicionalmente, os venenos hemorrágicos, de
modo geral, causam uma série de alterações morfológicas e degenerativas em
células endoteliais, que progridem até a formação de fendas intercelulares,
permitindo a saída de hemácias (Ownby, 1990; Lomonte et al, 1994). Estes
dados sugerem uma ação direta principalmente das SVMPS, importante para o
desenvolvimento da hemorragia.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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Ainda, a mionecrose local é uma consequência comum nos
envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothropoides. Há
evidências de que a mionecrose é causada por uma família de proteínas
denominadas miotoxinas, componentes dos venenos botrópicos, as quais
possuem características de fosfolipases A2 (PLA2) e atuam diretamente sobre a
membrana da célula muscular, por se ligarem e alterarem a membrana
plasmática (Gutierréz et al., 1984; Brenes et al., 1987). Essas miotoxinas
induzem dano tecidual proeminente, de forma que, as alterações morfológicas
são observadas a partir de 15 minutos de sua injeção (Gutierréz & Lomonte,
1995). A miotoxicidade pode, ainda, ser consequência da isquemia dos vasos
da microcirculação e de artérias intramusculares (Gutierréz et al., 1984;
Queiróz & Petta, 1984). Neste sentido, um mecanismo adicional envolvido na
atividade das SVMPs hemorrágicas poderia estar relacionado com o acúmulo
dessas SVMPs próximo de vasos capilares, através das propriedades adesivas
de domínios não catalíticos promovendo a hidrólise dos componentes da
membrana basal e o rompimento dos vasos sanguíneos. Este mecanismo tem
sido sugerido, mas até o momento não há evidências experimentais de que
isso ocorre in vivo (Baldo et al, 2010). Ainda, foi demonstrado que a BaP1, uma
SVMP isolada do veneno de B. asper, causa morte celular por apoptose em
célula endotelial mas que aparentemente as células endoteliais sofrem outros
tipos de morte celular, o que gera efeitos citotóxicos (Brenes et al., 2010).
3. SOROTERAPIA
Devido à eficiência dos antivenenos, os coeficientes de letalidade,
decorrentes do envenenamento botrópico, têm revelado tendência decrescente
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
18
ao longo do tempo. No entanto, a eficiência do tratamento do envenenamento
botrópico é baseada no tempo de adminstração do antiveneno específico
(Hansson et al., 2013). Estudos experimentais têm sugerido que existe uma
significante, embora parcial, neutralização da hemorragia, edema e mionecrose
apenas quando o antiveneno é administrado rapidamente após o
envenenamento (Battelino et al., 2003; Domingos et al, 2013). Neste sentido,
Camey et al (2002), estudaram o efeito farmacológico do veneno de cinco
espécies botrópicas brasileiras: B. atrox, B. leucurus, B. erythromelas, B.
jararaca e B. jararacussu, e verificaram que o antiveneno foi efetivo na
neutralização sistêmica da atividade tóxica de todos os venenos testados.
Porém, os efeitos locais não são neutralizados pelo uso de antiveneno e os
mecanismos envolvidos nesta falta de proteção, até o momento, não foi
esclarecido.
Assim, a neutralização dos efeitos tóxicos sistêmicos é obtida, mas a
neutralização dos danos no tecido local, normalmente não ocorre. Portanto, a
busca de inibidores e/ou neutralizadores complementares à soroterapia para
redução dos efeitos locais causados pelo veneno se reveste de importância
(Nishijima et al, 2009).
No Brasil, tem sido crescente o interesse em investigar terapias
coadjuvantes à soroterapia já existente, embora ainda que insipientes, já
existem estudos que combinam o uso da soroterapia à aplicação de extratos de
plantas medicinais e substâncias sintéticas (Biondo et al., 2003; Cavalcante et
al., 2007).
Nesse sentido, Domingos et al (2013) tem descrito o composto de 1,2,3-
triazóis como uma classe com destaque e presente no sistema heterocíclico de
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
19
azoto de cinco membros, que apresenta diferentes perfis farmacológicos, tais
como atividade antiplaquetária, anticoagulante, antiviral, antimicrobiana, entre
outras funções e, foi demonstrado que tal composto foi capaz de inibir a
hemólise causada por veneno de B. jararaca (50 ug/ml) e L. Muta (15 ug/ml). A
inibição foi superior a 50% contra ambos os venenos.
Igualmente, Faioli et al (2013), concluiu que os extratos de esponjas
marinhas são capazes de inibir os efeitos in vivo, como hemorragia e edema e
os efeitos in vitro, como a coagulação, atividade proteolítica e hemolítica,
desencadeados pela inoculação dos venenos de serpentes de B. jararaca e L.
muta. Também verificaram que a administração de veneno de B. jararaca foi
letal para camundongos após duas horas e apenas extratos das esponjas
marinhas, como A. fulva , A. viridis , ou P. citrina, foram capazes de aumentar
as taxas de sobrevivência dos animais (Faioli et al, 2013), provavelmente pela
capacidade de neutralização dos efeitos sistêmicos. Isso ocorreu devido ao fato
de que os extratos de esponja foram capazes de inibir a hemólise induzida
pelos venenos (Domingos et al, 2013; Faioli et al, 2013; Zychar et al, 2010).
Nishijima et al (2009) descreveu que os extratos vegetais contêm uma
grande diversidade de compostos químicos contendo uma grande variedade de
atividades farmacológicas e buscou avaliar o potencial efeito anti-hemorrágico
de extratos vegetais e flavonóides obtidas a partir de vegetais como Mouriri
pusa, Byrsonima crassa, Davilla elliptica e Quina do Cerrado. Os resultados
sugerem que os extratos metanólicos e flavonóides de Mouriri pusa e Davilla
elliptica exerceram grande capacidade de neutralizar totalmente veneno contra
a atividade hemorrágica do veneno de B. jararaca, provavelmente por conter
substâncias ricas em flavonóides, que serviram como quelantes das SVMPs
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
20
presente no veneno, sugerindo modelos para a concepção de novas moléculas
para melhorar o tratamento atual preconizado para o envenenamento.
Entretanto, qualquer que seja a abordagem terapêutica até hoje
disponível, esta tem se mostrado ineficaz na neutralização dos efeitos locais
produzidos pelo veneno botrópico, os quais são de evolução rápida e intensa.
Por esses motivos, a procura por abordagens alternativas às usualmente
empregadas tem sido motivo de interesse e se constituem em medidas
extremamente relevantes para neutralização e/ou diminuição dos efeitos
degenerativos, bem como a aceleração do processo regenerativo. Outra
possibilidade que começa a ser implementada é a utilização de laserterapia.
4. TERAPIA COM LASER DE BAIXA POTÊNCIA
A palavra laser é uma sigla que corresponde “Light Amplification by
Stimulated Emission of Radiation, a qual significa “Amplificação da Luz por
Emissão Estimulada por Radiação” (Maluf, et al., 2006; Lins et al., 2010).
A ação do laser consiste na absorção da luz pelos tecidos, resultando
em modificações no metabolismo celular. Quando o laser é aplicado nos
tecidos a luz é absorvida por fotorreceptores localizados nas células, sendo
capaz de modular as reações bioquímicas específicas dentro da célula e
estimular uma série de reações em cadeia mitocondrial, resultando em síntese
de ATP (Dortbudak, 2000; Stein, et al.,2005; Rénno et al.,2011).
A radiação laser, também denominada de terapia fotodinâmica pode
influenciar as células individualmente através da energia emitida pelo laser e
absorvida pelas células (Hawkins-Evans, 2008; Szymanskj et al., 2013.). As
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
21
estruturas celulares possivelmente envolvidas nesses mecanismos são as
mitocôndrias, as quais fornecem energia para as células, e que possuem uma
série de enzimas que participam nas reações redox que ocorrem na cadeia
respiratória, e que possivelmente constituem o principal mecanismo envolvido
nas reações metabólicas que ocorrem em uma célula (Szymanskj et al., 2013.).
Adicionalmente, a terapia a laser de baixa potência (LBP) é considerada
como um recurso bioestimulante em tecidos, por meio de seus efeitos
biológicos, tais como analgésicos, antiinflamatórios e cicatrizantes (Lins, et al.,
2010).
Irradiação por laser de baixa potência são amplamente utilizados no
tratamento de doenças crônicas e também como terapia de reabilitação
(Vladimirov, 2012). O laser vermelho e infravermelho pode ser usado in vitro
para estimular a função das células, por promover um aumento no número de
células, e estimular a síntese de RNA, promovendo também a diferenciação
das células (Firestone et al, 2012; Dortbudak, 2000).
Khanna et al (1999), examinaram a influência de radiação laser de He-
Ne (632,8 nm) sobre o proliferação celular e sobre fatores angiogênicos de
VEGF e secreção de TGF-β por cardiomiócitos. Os resultados desse estudo in
vitro mostram aumentos estatisticamente significativos na proliferação celular
com potência de 5 W/cm2 e tempo de radiação de 15 e 20 minutos em
comparação com o grupo de controle. A expressão de VEGF e TGF-β
aumentou significativamente quando expostos a 10, 15 e 20 minutos de
radiação com LBP.
Igualmente, o efeito estimulante do LBP tem sido amplamante estudado
sobre proliferação de células endoteliais humanas, além do aumento nos níveis
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
22
de VEGF e TGF-β de secreção (Arany et al, 2007; Hakki et al, 2012; Kipshidze
et al, 2001). As conclusões dos estudos demonstram claramente a capacidade
da irradiação com o LBP para modular a expressão do gene e a liberação de
fatores de crescimento e citocinas a partir de células em cultura (Khanna et al,
1999).
4.1. LBP e acidentes ofídicos
Até o momento, poucos trabalhos foram publicados utilizando o LBP
para a avaliação do efeito local causado por veneno ofídico. Dourado, et al.,
estudou o efeito da irradiação laser Ga-As (Arseneto de Galium), em
mionecrose, induzida pelo veneno de serpente Bothrops moojeni. Esses
autores observaram que o tratamento com esse laser diminuiu
consideravelmente a mionecrose, inibindo a habilidade do veneno de desfazer
a integridade da membrana plasmática (Dourado et al., 2003).
Ainda, Barbosa, et al., demonstraram a eficácia do LBP na resposta
inflamatória local após lesão por veneno de Bothrops jararacussu no músculo
gastrocnêmio de ratos, onde foram submetidos à laserterapia combinada com
antiveneno, resultando em diminuição de edema e redução do influxo
leucocitário após a lesão (Barbosa et al., 2008). Doin-Silva, et al. (2009),
utilizaram a aplicação do LBP, no músculo tibial anterior de ratos 60 minutos
após a administração do veneno de B. jararacussu, e observaram que houve
diminuição na concentração de creatina quinase e redução das áreas de
mionecrose do músculo.
Ademais, dados do nosso grupo também demonstram uma redução
significativa de mionecrose induzida por veneno de B. jararacussu e as
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
23
miotoxinas BThtx I e II, após tratamento utilizando LBP, (Barbosa, et al., 2009;
Barbosa, et al., 2010). Além disso, demonstramos que o LBP reduz a
hemorragia e dor induzidas pelo veneno de B. moojeni (Nadur-Andrade, 2012,
2013). Estes dados sugerem o LBP como uma ferramenta terapêutica eficaz
para o tratamento local em casos de envenenamento botrópico.
4.2. Laser e células em cultura
Ao correlacionar a utilização do LBP em células de cultura, Alghamdi, et
al., (2011), corrobora que o LBP foi capaz de causar aumento no número de
células, síntese de DNA e RNA e aumento na taxa de ATP em células-tronco e
em outras linhagens celular. Ainda, foi sugerido utilizar o valor da densidade de
energia entre 0.5 a 4.0 J/cm2 e um espectro visível entre 600 e 900 nm de LBP
demonstrando ser úteis para melhorar a proliferação celular (Alghamdi, et al.,
2011).
A aplicação do LBP Arseneto de Gálio Alumínio em osteoblastos
cultivados em disco de Titânio, utilizando o comprimento de onda de 780 nm e
dose de 3 J/cm2 , demonstrou estimular a diferenciação osteoblástica (Petri, et
a.,l 2010). O uso desta técnica terapêutica demonstrou ser também eficaz no
crescimento de células epiteliais de rim de macaco cultivado em situação de
carência nutricional (2% de SFB), quando aplicadas irradiações repetidas de
LBP (InGaAlP) (Eduardo, et al., 2007).
Por tais motivos, determinar parâmetros como comprimento de onda,
densidade de energia, potência e tempo de aplicação do laser é importante
para se obter uma resposta celular adequada ao tratamento. Hawkins et al.
(2006), também relataram que a aplicação do LBP apresentou um efeito
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
24
estimulante na resposta celular de fibroblastos alterados, resultando no
aumento de migração celular, viabilidade e proliferação celular e atividade de
ATP.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
25
5. OBJETIVOS
5.1. Geral
Analisar a influência da laserterapia de baixa potência sobre células
endoteliais tEnd, após lesão com o veneno de Bothropoides jararaca.
5.2. Específicos
Através de ensaios in vitro, foram avaliados os efeitos da irradiação laser
de baixa potência sobre células endoteliais submetidas aos efeitos do veneno de
Bothropoides jararaca quanto a:
I- Viabilidade das células (MTT);
II- Integridade;
III- Liberação de marcador de lesão celular (LDH)
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
26
6. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi realizado no laboratório de cultivo celular do curso de
Mestrado em Medicina da Universidade Nove de Julho (UNINOVE).
6.1. Veneno de serpente Bothropoides jararaca (VBj): Os venenos
utilizado foram extraídos de vários exemplares adultos de serpentes B.
jararaca, provenientes do Instituto Butantan. Os venenos foram reunidos em
um mesmo tubo, homogeneizados, submetidos à liofilização e mantidos a
- 20oC até o momento de sua utilização.
6.2. Células endoteliais (CE): Utilizou-se células endoteliais murinas
(hibridomas) da linhagem tEnd (thimic endothelium), gentilmente cedidas pelo
Dr. Bruno Lomonte, do Instituto Clodomiro Picado, da Universidade da Costa
Rica, Costa Rica.
6.3. Cultivo Celular: As CE obtidas foram cultivadas em frascos de
poliestireno de 25 cm² (COSTAR), contendo 5 mL de meio de cultura DMEM
(SIGMA), suplementado com soro fetal bovino (SFB) 10%, gentamicina (40
πg/mL) e L-glutamina (2 mM/L) e mantidas em incubadora, em atmosfera de
5% C02, a 37°C. O meio de cultura foi trocado a cada 24 horas e as células
foram, então, subcultivadas. Para tanto, o meio de cultura DMEM foi aspirado
com pipeta Pasteur e as células lavadas com 2 mL de uma solução salina
balanceada (PBS). Em seguida, 2 mL de uma solução de tripsina 0.05%/
EDTA 0.02% foram adicionados ao frasco de cultura, o qual retornou à estufa
de cultura (5% CO2), a 37°C, por um período de até 5 minutos. Decorrido esse
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
27
período, as células foram observadas ao microscópio de luz invertida (Carl
Zeiss), para a verificação do destacamento das mesmas. Em seguida, as
células, tripsinizadas e homogeneizadas, foram colocadas em um tubo de 50
mL (COSTAR) e centrifugadas a 1200 x g, por 5 minutos. O sobrenadante foi
descartado e as CE foram ressuspendidas em meio DMEM/SFB. A partir daí,
as células foram semeadas em frascos de cultura de 75 cm² com meio
DMEM/SFB, previamente ambientalizado na estufa de cultura.
6.4. Condições de tratamento: Os experimentos foram realizados em
um ambiente com obscuridade parcial para não sofrer interferência da luz
externa. A cultura de células endoteliais foram divididas em oito grupos,
conforme tabela abaixo:
Tabela 03- Grupos experimentais e aplicabilidade
NOME GRUPOS CELULARES TRATAMENTO
Grupo 1 Controle Células + meio de cultura
DMEM
Grupo 2 Células + LBP Células + 660nm
Grupo 3 Células + LBP Células + 780nm
Grupo 4 Veneno Células + Veneno Bj
Grupo 5 Veneno irradiado Veneno irradiado 660nm
+ células
Grupo 6 Veneno irradiado Veneno irradiado 780nm
+ células
Grupo 7 Células + Veneno
+ Laser
Células + veneno- tratadas
com laser 660nm
Grupo 8 Células + Veneno
+ Laser
Células + veneno- tratadas
com laser 780nm
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
28
Conforme supracitado, os grupos 1, 2 e 3 foram avaliados como
controle. Para avaliação do efeito do veneno sobre as células endoteliais
tEND, foram divididos os grupos 4, em que somente o veneno foi adicionado
às células; grupo 5 e 6, em que o veneno foi previamente irradiado a 660nm e
a 780nm, respectivamente, e posteriormente adicionado às células, sem
tratamento posterior; no grupo 7 e 8, o veneno sem irradiação foi adicionado
às células e as mesmas foram tratadas com o laser a 660nm e a 780nm,
respectivamente.
A cultura foi irradiada imediatamente após a adição do veneno na
cultura, e foi aplicada, no poço, de forma pontual inferior, de modo a atingir a
monocamada de células endoteliais, conforme a figura:
6.4. Irradiação com laser de baixa potência: Utilizou-se o Laser da
marca DMC® modelo Twin Laser, com comprimento de onda de λ 660 nm,
potência de 70 mW (densidade de potência de 105 W/cm2), área do feixe de
0,028cm2, e, comprimento de onda de λ 780 nm, potência de 40 mW
(densidade de potência de 0,60 W/cm2), área do feixe de 0,028cm2, em meio
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
29
ativo de Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAI), com densidade de energia
de 4 joules/cm2 e tempo de 10 segundos, conforme resumo na tabela abaixo:
Tabela 2- Protocolo para aplicação do laser
vemelho e infra-vermelho
Equipamento: Twin Laser ®
Parâmetros Laser Vermelho Laser Infra-vermelho
Comprimento de onda (nm) 660 780
Densidade de energia(J/cm2) 4 5
Energia total (J) 1,3 2
Potência (mW) 70 20
Densidade de Potência
(W/cm2)
105 90
Área irradiada (cm2) 0,3 0,3
Área do feixe (cm2) 0,028 0,028
Modo de aplicação Pontual Pontual
Tempo de irradiação (s) 10 10
6.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT): Após a incubação das células
(1X104cel/poço) com o veneno nas respectivas concentrações (5, 10, 12,5, 25
e 50 g/mL), em meio de cultura (controle), e posteriormente irradiadas e
incubadas por 30, 60 e 120 minutos, foram avaliadas a viabilidade celular pelo
método MTT. As células foram lavadas com 200 µl de PBS 1X. Em seguida,
foram adicionados 50 µl de MTT (0,5 ug/ml em tampão) (3-[4,5-Dimethylthiazol-
2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue –SIGMA) e incubadas por
3h a 37°C. Terminado o tempo de incubação, a solução foi removida
cuidadosamente e foram adicionados 100 µl de isopropanol para ressuspender
e solubilizar o precipitado. Por fim, será realizada a leitura da absorbância a
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
30
620nm com auxilio de um leitor de placas (2020, Anthos, Eugendorf, Áustria)
(Mosmann, 1983).
Após a determinação da curva dose-resposta, o repetiu-se o método de
viabilidade celular (MTT), utilizando-se a dose de 10µl/mL, em grupos divididos
conforme a Tabela 03.
6.6. Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de
células endoteliais – Descolamento Celular: As células endoteliais foram
plaqueadas 1x104 cel/poço em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas
para adesão celular. Após esse período as células receberam o veneno nas
concentrações supracitadas, em meio de cultura (controle) e imediatamente
foram irradiadas com laser, em seguida as células foram incubadas por 30, 60
e 120 minutos. Após cada período de incubação, os sobrenadantes das
culturas foram retirados e as monocamadas lavadas com 100 µl de PBS 1X.
Em seguida, foram adicionados 40µL de cristal violeta (0,5%) em ácido acético
(30%) por poço. Decorridos 15 minutos, as placas foram lavadas e colocadas
para secar. A seguir, 100µL de metanol absoluto (MERCK) foram adicionados
em cada poço e a leitura da densidade óptica (D.O.) foi realizada em leitor de
ELISA a 620 nm. A lesão causada foi definida como a porcentagem de
descolamento celular, observada na monocamada submetida à ação do
veneno em relação à monocamada endotelial não estimulada pelos mesmos.
6.7. Análise da liberação da lactato desidrogenase (LDH): A atividade
enzimática da LDH, presente no sobrenadante das culturas, foi tomada como
parâmetro de lesão celular (Thomas, et al., 1993; Yildiz, et al., 1999; Zhao et al,
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
31
2013; Wang et al, 2013). Após cada período de incubação, descritos no item
6.5, o sobrenadante foi retirado e centrifugado a 200 x g, por 6 minutos. A
seguir, 20 µL do sobrenadante foram adicionados a outras placas de cultura de
96 poços, acompanhados da adição de 130 µL do substrato/poço, em tampão
fosfato contendo: NaCl 200mM, NADH 0,2 mM, piruvato 1,6 mM/poço. Foi feita
então, a leitura da D.O., a 340 nm, no intervalo de tempo entre 0 e 10 minutos.
Os resultados foram expressos pelo decréscimo da D.O., resultante da
oxidação do NADH, na presença de piruvato, em relação ao tempo zero.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
32
7. ANÁLISE ESTATÍSTICA:
Os resultados obtidos foram expressos como média ± desvio padrão da
média e analisados estatisticamente pelo teste “t” de Student ou Análise de
Variância (ANOVA), complementado por testes de significância apropriados.
Os dados foram analisados com auxílio do software “GraphPad Prism
5.0”, considerando que nos experimentos curva dose-resposta adesão,
viabilidade e descolamento celular foi utilizado o pós teste Dunnet e a
significância estatística aceitável quando p ≤ 0,05.
Foram realizados três experimentos independentes e todas as amostras
foram feitas em triplicata.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
33
8. RESULTADOS
8.1. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de células
endoteliais tEND
A capacidade do VBj em afetar a integridade das monocamadas das
células endoteliais tEND, em cultura, foi avaliada pelo descolamento das
monocamadas, após sua incubação com a tEND, por 30, 60 e 120 minutos, em
diferentes concentrações (5, 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL) em comparação às
monocamadas contendo apenas meio de cultura (controle). Na concentração
de 5 µg/mL, o veneno causou um descolamento da ordem de 32 %, aos 120
minutos; nos demais períodos de tempo, não houve alteração da integridade
das monocamadas. Nas concentrações de 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL, o veneno
foi capaz de causar descolamento das monocamadas em todos os períodos de
tempo analisados. No tempo de 120 min as concentrações de 25 e 50 µg/mL
causaram um descolamento das monocamadas, que foi estatisticamente
significante, das concentrações 5, 10 e 12,5 µg/mL (Fig. 4).
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0
20
40
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C 5 10 12,5 25 50
VBj (g/mL)
*
30 min
* *
*
Desco
lam
en
to c
elu
lar
(%)
0
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60
80
100
C 5 10 12,5 25 50
60 min
VBj (g/mL)
* **
* #
Desco
lam
en
to c
elu
lar
(%)
0
20
40
60
80
100
C 5 10 12,5 25 50
120 min
VBj (g/mL)
* *
**# *#
Desco
lam
en
to c
elu
lar
(%)
Figura 4. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de células endoteliais tEND. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período, foi adicionado veneno nas concentrações de 5, 10, 25 e 50 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A integridade celular foi determinada pelo método Cristal Violeta. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes. Anova *p<0,05 vs controle;
#p<0,05 vs 5
µg/mL; p< 0,05 vs 10 µg/mL ; p< 0,5 vs 12,5 µg/mL .
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
35
8.2. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de células
endoteliais tEND
A viabilidade celular foi avaliada aos 30, 60 e 120 minutos após a
incubação das células tEND com o veneno, em diferentes concentrações (5,
10, 12,5, 25 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle). Os resultados
demonstraram a diminuição estatisticamente significativa na integridade celular
em todas as concentrações (5, 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL) e nos períodos de
tempo de 60 e 120 minutos, quando comparado com o grupo controle No
tempo de 30 min não houve alteração na viabilidade das células quando
incubadas com o veneno. Não houve diferença estatística da viabilidade celular
entre as concentrações estudadas, no tempo de 60 min. Aos 120 min, as
concentrações de 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL causaram a diminuição na
viabilidade celular em comparação com a concentração de 5 µg/mL (Fig. 5).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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C 5 10 12,5 25 50
VBj (g/mL)
30 min
Via
bilid
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e c
elu
lar
(%)
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*
C 5 10 12,5
60 min
25 50
VBj (g/mL)
* * *
*
Via
bilid
ad
e C
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lar
(%)
0
20
40
60
80
100
120
*
C 5 10 12,5
120 min
25 50
VBj (g/mL)
*
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
(%)
# * ##* #*
Figura 5. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de células endoteliais tEND Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período, foi adicionado veneno nas concentrações de 5, 10, 25 e 50 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova, *p<0,05 vs controle, # p<0,05 vs 5 µg/mL.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
37
8.3. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa
Potência na integridade das células endoteliais tEND.
Para o estudo da ação do laser de baixa potência, foi escolhida a dose
de 10 µg/mL de VBj. Esta foi a concentração o qual causou um efeito na
integridade e viabilidade das células sem ser máximo, sendo que um eventual
efeito do LBP pode ser verificado.
Para avaliar se a irradiação LBP seria capaz de modificar componentes
do veneno, o veneno foi irradiado antes de ser incubado com a tEND. Para
isso, também utilizou-se como grupo controle, células irradiadas a 660 e
780nm, sem receber inoculação de veneno.
Os experimentos demonstraram que não houve diferença estatística no
grupo incubado com o veneno e o grupo veneno irradiado, em ambos os
comprimentos de onda, sugerindo que a irradiação não afeta as moléculas do
veneno (Fig. 6).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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0
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VBj (10 g/mL)
* * *
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Controle
laser 660 nmlaser 780 nm
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+-
-+
--
+-
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en
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* * *
VBj (10 g/mL)
60 min
Controle
laser 660 nmlaser 780 nm
--
+-
-+
--
+-
-+
Desco
lam
en
to c
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0
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* * *
VBj (10 g/mL)
120 min
Controle
laser 660 nmlaser 780 nm
--
+-
-+
--
+-
-+
Desco
lam
en
to c
elu
lar
(%)
Figura 6. Efeito do veneno B. jararaca (VBj) irradiado sobre a integridade de células
endoteliais. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e
incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período o veneno foi
previamente irradiado nos comprimentos de onda de 660 nm e 780 nm e,
posteriormente, foi adicionado à células tEND na concentração de 10 µg/mL ou somente
meio de cultura (controle) e células com meio de cultura irradiadas nos mesmo
comprimentos de onda e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. O descolamento celular foi
determinado pelo método Cristal Violeta. Cada valor representa a média ± EPM de três
experimentos independentes, Anova, *p<0,05 em relação ao controle.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
39
8.4. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa
Potência na viabilidade das células endoteliais tEND.
Da mesma maneira que avaliou-se a viabilidade das células com o
veneno irradiado antes de ser incubado com as mesmas, também avaliamos se
o veneno irradiado modificaria a viabilidade das células tEND. Para isso,
também utilizou-se como grupo controle, células irradiadas a 660 e 780nm,
sem receber inoculação de veneno.
Os resultados demonstraram a diminuição estatisticamente significativa
na viabilidade celular após exposição das células endoteliais tEND ao VBj
irradiado, em ambos os comprimentos de onda (660nm e 780nm), que não foi
diferente da viabilidade causada pelo veneno sem irradiação, mais uma vez
demonstrando que a irradiação não afeta as moléculas do veneno (Fig 7).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
40
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VBj (10 g/mL)
* * *
Laser 660 nmLaser 780 nm
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--
+-
-+
Controle
30 min
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* * *
VBj (10 g/mL)
Laser 660 nmLaser 780 nm
--
+-
-+
--
+-
-+
Controle
60 min
Via
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* * *
VBj (10 g/mL)
Laser 660 nmLaser 780 nm
--
+-
-+
--
+-
-+
Controle
120 min
Via
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e c
elu
lar
(%)
Figura 7. Efeito do veneno B. jararaca (VBj) irradiado na viabilidade de células endoteliais. Células
endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular.
Após esse período o veneno foi previamente irradiado nos comprimentos de onda de 660nm e 780nm e,
posteriormente, foi adicionado à células tEND na concentração de 10 µg/mL ou somente meio de cultura
(controle) e células com meio de cultura irradiadas nos mesmo comprimentos de onda incubadas por 30,
60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. C: controle; L: laser de baixa
potência; V: veneno; VI: veneno irradiado. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos
independentes, Anova Dunnet *p<0,01.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
41
8.5. Efeito do Laser de Baixa Potência 660 nm na integridade de
células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
Para a avaliação do efeito de LBP na integridade das monocamadas de
células, o mesmo foi aplicado diretamente na tEND, no comprimento de onda
vermelho de 660 nm, imediatamente após a adição do veneno. Nos grupos
experimentais utilizando o LBP no comprimento de onda 660 nm, verificamos
que não houve diferença significativa na integridade celular no tempo de 30
min. No entanto, a aplicação do LBP causou uma redução no descolamento
celular na ordem de 20% e 18%, nos tempos de 60 e 120 min,
respectivamente, quando comparado com o grupo veneno (Fig 8).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
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(10 g/mL)
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C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
* #
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en
to c
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lar
(%)
Figura 8. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 660 nm na integridade de células
endoteliais submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram
plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse
período foi adicionado o veneno (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com
LBP usando densidade de energia (4 J/cm2) no comprimento de 660 nm e foram incubadas por
30, 60 e 120 minutos. A integridade celular foi determinada pelo método Cristal violeta. C:
controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de
três experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 VS controle; #P<0,05 vs veneno.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
43
8.6. Efeito do Laser de Baixa Potência 780 nm na integridade de
células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
Para a avaliação do efeito de LBP na integridade das monocamadas de
células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células tEND, no comprimento
de onda infravermelho de 780 nm, imediatamente após a adição do veneno.
Nos grupos experimentais utilizando o LBP, verificamos que não houve
diferença significativa na integridade celular em nenhum dos tempos testados
após a aplicação do LBP 780 nm infravermelho, quando comparado com o
grupo veneno (Fig 9).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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* *
C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
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C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
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120 min
C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
De
sco
lam
en
to c
elu
lar
(%)
Figura 9. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 780 nm na integridade de células
endoteliais submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram
plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse
período foi adicionado o veneno (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com
LBP no comprimento de 780 nm e foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A integridade
celular foi determinada pelo método Cristal violeta. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa
potência. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova. *
p< 0,05 comparado ao grupo controle.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
45
8.7. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na viabilidade
de células endoteliais submetidas à lesão por veneno
B. jararaca.
Para a avaliação do efeito de LBP na viabilidade das monocamadas de
células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células tEND, imediatamente
após a adição do veneno. Nossos resultados demonstraram um aumento de
60 % na viabilidade celular no período de 60 minutos após a aplicação do LBP,
com comprimento de onda de 660 nm (luz vermelha). O mesmo efeito não foi
observado nos tempos de 30 e 120 min (fig. 10).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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30 min
C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
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#
60 min
C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
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e C
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lar
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0
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**
120 min
C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
Via
bilid
ad
e C
elu
lar
(%)
Figura 10. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 660 nm na viabilidade de células endoteliais
submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em
placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o
VBj (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 660 nm e
foram incubadas por 30, 60 e 120 min. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. C:
controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três
experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs veneno.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
47
8.8. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na viabilidade
de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B.
jararaca.
Para a avaliação do efeito de LBP na viabilidade das monocamadas de células,
o mesmo foi aplicado diretamente nas células tEND, imediatamente após a adição do
veneno. Nossos resultados demonstraram um aumento de 51 % na viabilidade celular
no período de 60 minutos após a aplicação do LBP, com comprimento de onda de
780 nm (luz infravermelho). O mesmo efeito não foi observado nos tempos de 30 e
120 min (fig.11).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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0
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C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
30 min
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*
#
C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
60 min
Via
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ad
e C
elu
lar
(%)
0
20
40
60
80
100
120
**
C C + LBP V V + LBP
(10 g/mL)
120 min
Via
bili
dad
e C
elu
lar
(%)
Figura 11. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 780 nm na viabilidade de células endoteliais
submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em
placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o
veneno (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 780 nm e
foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. C:
controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três
experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs ao veneno.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
49
8.9. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na liberação da
enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais
submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
A perda da integridade da membrana após incubação com veneno e
tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da
enzima citoplasmática LDH. As células que receberam o veneno apresentaram
aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, nos tempos de 30 e 60 min, comparado
ao grupo que recebeu somente meio de cultura (controle). O LBP 660 nm (luz
vermelho) foi capaz de promover uma redução na liberação de LDH de 33% e 49 %
aos 60 e 120 min, respectivamente. O mesmo efeito significativo não foi observado no
tempo de 30 min neste comprimento de onda. (fig. 12).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
50
0.0
0.5
1.0
1.5
C C + LBP V V + LBP
10 g/mL
30 min
LD
H (
D.O
.)
0.0
0.5
1.0
1.5
C C + LBP V V + LBP
10 g/mL
60 min
*
#*
LD
H (
D.O
.)
0.0
0.5
1.0
1.5
C C + LBP V V + LBP
10 g/mL
120 min
*
#
LD
H (
D.O
.)
Figura 12: Efeito do laser de baixa potência (LBP) 660 nm na liberação de LDH de células
endoteliais submetidas a lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram
plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período
o veneno foi adicionado na concentração de 10 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) as células
foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 660 nm e foram incubadas por 30, 60 e
120 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato Desidrogensase (LDH) foi
determinada pela liberação de NADH. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada
valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05
vs veneno.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
51
8.10. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na liberação da
enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais
submetidas à lesão por veneno B. jararaca.
Da mesma forma, avaliamos a perda da integridade da membrana após
incubação com veneno e tratamento com laser pela análise da liberação no
meio de cultura da enzima citoplasmática LDH. As células que receberam o
veneno apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, nos
tempos de 30 e 60 min, comparado ao grupo que recebeu somente meio de
cultura (controle). O LBP 780 nm (luz infravermelho) foi capaz de promover
uma redução na liberação de LDH de 28% e 54 % aos 60 e 120 min,
respectivamente (fig. 15). O mesmo efeito estatisticamente significativo não
foi observado no tempo de 30 min no comprimento de onda de 780 nm (fig.
13).
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
52
0.0
0.5
1.0
1.5
C C + LBI V V + LBI
10 g/mL
30 min
LD
H (
D.O
.)
0.0
0.5
1.0
1.5
C C + LBI V V + LBI
10 g/mL
60 min
*#
LD
H (
D.O
.)
0.0
0.5
1.0
1.5
C C + LBI V V + LBI
10 g/mL
120 min
*
#
LD
H (
D.O
.)
Figura 13. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 780 nm na liberação de LDH de células
endoteliais submetidas a lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram
plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período
o veneno (10 µg/mL) foi adicionado à cultura de células e foram imediatamente irradiadas com o LBI
780 (infravermelho) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação
de Lactato Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. C: controle; V: veneno;
LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos
independentes, * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs veneno.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
53
9. DISCUSSÃO
Apesar da eficiência da soroterapia em neutralizar os efeitos sistêmicos
causados pelos venenos botrópicos, as reações locais causadas por esses
venenos são apenas parcialmente ou não são neutralizadas por esse
tratamento. Isso ocorre pelo fato das manifestações locais ocorrerem
rapidamente após a picada e o soro não ser capaz de reverter às lesões já
estabelecidas ou desencadeadas (Rosenfeld, 1971). O fato da soroterapia ser
pouco eficaz no tratamento das reações locais induzidas por venenos
botrópicos estimula a procura de tratamentos complementares que possibilitem
a melhora deste quadro. Assim, este trabalho visou o melhor entendimento da
aplicação do laser de baixa potência, em células endoteliais, após lesão pelo
veneno de Bothropoides jararaca.
Estudos sugerem que os venenos e toxinas hemorrágicas isoladas
afetam, principalmente, a integridade de vasos de pequeno calibre (Ohsaka,
1979; Ownby, 1990; Borkow et al., 1993). Este efeito foi atribuído à proteólise
da membrana basal dos vasos, levando a saída de eritrócitos. Considerando
que as SVMPs de veneno de serpente são responsáveis por hemorragia local,
pelo menos nove delas foram isoladas a partir do veneno B. jararaca
(Mandelbaum et al., 1976; Maruyama et al., 1992, Maruyama et al., 1993 e
Paine et al, 1992), e concluiu-se que as toxinas hemorrágicas causam uma
série de alterações morfológicas e degenerativas em células endoteliais que
progridem para formação de fendas intercelulares permitindo a saída de
hemácias (Ownby, 1990, Lomonte et al., 1994).
Ainda, estudos revelam uma diferença significativa na produção de
hemorragia pelas SVMPs in vivo, comparado aos estudos com cultura de
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
54
células endoteliais, uma vez que o descolamento foi observado somente in vitro
(Gutiérrez et al., 2005). Neste estudo buscou-se compreender, inicialmente, os
efeitos do veneno de B. jararaca sobre a integridade e viabilidade de células
endoteliais.
Os efeitos do veneno de B. jararaca na integridade e viabilidade de
células endoteliais tEND in vitro. Os resultados obtidos mostraram que o
veneno, afetou a integridade das monocamadas de células endoteliais nas
concentrações a partir de 10 L/mL em todos os períodos de tempo analisados.
O efeito máximo ocorreu aos 120 minutos de incubação. Resultados similares
foram demonstrados a capacidade do B. jararaca em causar descolamento de
células com concentrações maiores que 10 L/mL (Gallagher et al., 2003).
Também Nishijima et al. (2009), em um estudo in vivo, buscou
determinar a dose ideal capaz de induzir a hemorragia após administração do
veneno de B. jararaca e concluiu que dose de 8,1 µg foi ideal capaz de alterar a
homeostase dos vasos sanguíneos. Adicionalmente, a BaH-1, uma SVMPs
isolada do veneno de B. asper, com potente atividade hemorrágica, causa um
descolamento moderado de células endoteliais murinas (Lomonte et. al., 1994).
Ainda, investigou-se a capacidade do veneno em afetar a viabilidade
celular, para melhor compreender a ação do veneno sobre a integridade do
endotélio. Para tanto, avaliou-se a citotoxicidade pela atividade metabólica
mitocondrial (método MTT). Os resultados obtidos mostraram que o veneno
reduziu a viabilidade celular em todas as concentrações nos tempo de 60 e 120
min após a incubação com o veneno, alterando a viabilidade das células
endoteliais e sugerindo que o descolamento das monocamadas pode estar
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
55
relacionado à citotoxicidade do veneno, provavelmente por agir nas moléculas
de adesão.
A literatura tem sugerido que a terapia com LBP é uma alternativa eficaz
para o tratamento de acidentes causados por serpentes devido a sua
capacidade de diminuir a inflamação, hemorragia e mionecrose após
envenenamento botrópico experimental (Dourado et al., 2003; Barbosa et al.,
2009; Nadur- Andrade et al., 2012). No entanto, os mecanismos biológicos
envolvidos na proteção local pela irradiação laser contra a ação local do
veneno botrópico ainda não são compreendidos.
Neste estudo, investigou-se alguns mecanismos envolvidos na
capacidade da terapia LBP em proteger células endoteliais contra o veneno da
serpente B. jararaca. O efeito da terapia com LBP na citotoxicidade causada
pelo veneno foi avaliada usando o laser na densidade de energia de 4 J/cm2
em dois comprimentos de onda, um vermelho no comprimento de onda 660 nm
e infravermelho no comprimento 780 nm, após a adição do veneno nas células
endoteliais tEND.
A dose do laser escolhida foi baseada na literatura mostrando, em
cultura celular, um efeito benéfico do laser vermelho e infravermelho em doses
baixas 3 ou 5 J/cm2. Neste mesmo estudo, os autores demonstraram que em
doses altas (16 J/cm2) pode apresentar efeito prejudicial (Huang et al., 2009;
Kim et al, 2011).
Com o intuito de verificar se o laser seria capaz de alterar os
componentes do veneno e assim diminuir sua citotoxicidade, o veneno foi
irradiado usando os mesmos parâmetros do laser usado para irradiar as células
endoteliais tEnd. O veneno B. jararaca irradiado mostrou o mesmo efeito
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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citotóxico quando comparado ao veneno não irradiado. Este resultado indica
que a irradiação laser não modificou os componentes do veneno. Resultado
semelhante foi encontrado por Barbosa et al., (2008), usando um modelo in
vivo no qual o veneno irradiado causou o mesmo nível de edema muscular
quando comparado ao veneno não irradiado.
Os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a dose usada de
4 J/cm2 reduziu o descolamento de células endoteliais melhorando assim a
integridade celular. Esse efeito foi observado nos comprimentos de onda de
660 nm nos tempos de 60 e 120 min. Porém, o mesmo efeito não foi observado
com o comprimento de onda 780 nm, sugerindo atuação do laser na matriz
extracelular e assim, protegendo a célula contra os efeitos deletérios do
veneno.
Isso porque, conforme Szymanska et al, 2013, a radiação com LBP pode
influenciar as células através da absorção da energia emitida pelos
fotorreceptores localizados no interior das células. Sugere-se que, dentre tais
fotorreceptores, as mitocôndrias, que fornecem energia para as células, contém
uma série de enzimas que participam nas reações redox da cadeia respiratória,
tornando-se o principal mecanismo das reações metabólicas ocorridas em uma
célula, além do citocromo c oxidase e superóxido dismutase- NADH, que
demonstraram alteração após emissão de fótons, alterando o nível de oxidação
e alterando a fluência dos elétrons de uma molécula, capazes de aumentar a
síntese de DNA e RNA (Karu, 1999; Szymanska et al, 2013) .
Ainda, os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a
concentração usada de 4 J/cm2 reduziu a citotoxicidade, avaliada pelo método
MTT, em células endoteliais no período de 60 min após a adição do veneno,
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
57
tanto com o laser vermelho como o infravermelho, não tendo efeito em outros
períodos avaliados. Essa diferença encontrada entre o laser vermelho e
infravermelho pode estar relacionada com a penetração da luz no tecido (El
Sayed et al., 1990; Tacon et al., 2011; Kim et al, 2011; Colombo et al, 2013)
uma vez que já foi demonstrado que o laser vermelho penetra mais no tecido
que o laser infravermelho.
Adicionalmente, investigou-se a capacidade do veneno em afetar a
viabilidade celular, pela liberação da lactato desidrogenase pelas células
endoteliais, uma enzima citoplasmática estável, utilizada como parâmetro de
lesão e/ou morte celular, quando presente no sobrenadante de culturas de
células (Thomas, et al., 1993; Yildiz, et al., 1999). Os resultados demonstraram
que o LBP causou uma redução da liberação de LDH nos tempos de 60 e 120
min pelas células endoteliais após a incubação com o veneno. Essa
discrepância nos testes avaliados para determinar a citotoxicidade poder estar
relacionada a maior sensibilidade do método LDH.
Convém ressaltar que, esta diferença é curiosa, pois estudos anteriores
de nosso laboratório demonstram um efeito protetor do LBP em células
musculares in vitro, avaliado tanto pelo método MTT como pela liberação de
LDH em todos os períodos de tempo avaliados (dados enviados a publicação).
A dose do laser utilizada foi a mesma utilizada para as células musculares, é
possível que a dose utilizada não seja a ideal para a proteção em células
endoteliais. No entanto, Szymanska et al (2013), avaliou células endoteliais in
vitro, utilizando LBP nos comprimentos de onda vermelho e infravermelho e
concluíram que a utilização do comprimento de onda de 635 nm (com
densidade de potência de 1,875 W/cm2) estava associado com um aumento
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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estatisticamente significativo na proliferação das células endoteliais. Ainda, a
utilização das densidade de energia de 2, 4 e 8 J/cm2 promoveram aumentos
significativos na proliferação, sendo que de 4 J/cm2 foi a que mais significativa
em relação a proliferação celular, sugerindo que a densitometria utilizada no
nosso trabalho é adequada para se utilizar em células endoteliais.
Além disso, os efeitos diretos ou indiretos da interferência do laser
visível vermelho e infravermelho com os componentes mitocondriais da cadeia
respiratória é parte do sinal de transdução (Tiphlova et al, 1989; Karu et al,
1993; Lubart et al, 1996; Kim et al, 2011). Nesse sentido, estudos de Kipshidze
et al, 2001; Agaiby et al, 2000, abordaram a possível indução de fatores pró-
angiogênicos pela exposição ao laser. Até o momento, tais fatores têm sido
detectados imediatamente após a irradiação do laser, e apenas em cultura de
outras linhagens celulares que não as células endoteliais.
Bouma et al. (1996), demonstraram melhora na regulação da secreção
espontânea de células endoteliais humanas, avaliada pela liberação de
citocinas, como interleucina (IL) -6 e IL-8 após a radiação pulsada de laser
infravermelho. sugerindo efeito direto na estimulação na proliferação das
células endoteliais (Schindl et al, 2003).
Em nosso estudo não avaliamos a proliferação celular, no entanto a
redução da hemorragia observada em estudo in vivo do nosso laboratório
(Nadur-Andrade et al, 2012) e proteção da mionecrose (Barbosa et al., 2008)
sugere que a proteção observada pelo LBP nas células endoteliais pode estar
relacionada a uma melhora da proliferação celular e consequente diminuição
da mionecrose.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
59
10. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em síntese, podemos concluir que o LBP λ 660nm e λ 780 nm reduziram
a citotoxicidade em células endoteliais; tornando-se capaz de exercer um
efeito protetor nas células endoteliais tEND, com redução estatisticamente
significativa na liberação de LDH e aumento na viabilidade celular,
sugerindo que os efeitos observados podem ser explicados pela possível
ação do LBP na proliferação celular, conforme tabela abaixo:
Ainda, podemos concluir que o veneno de B. jararaca é citotóxico para
células endoteliais e que o uso do laser de baixa potência, neste modelo
experimental, foi capaz de proteger a célula endotelial contra a ação do veneno
da serpente B. jararaca.
Também, as perspectivas futuras para a utilização em saúde do laser de
baixa potência sugerem a delimitação correta de parâmetros, tais como
densidade, energia, frequência, potência e área de aplicação. Com uma ampla
extensão de abordagem a, terapia com LBP, têm se tornado crescente no
cenário mundial e de modo mais importante, a combinação da utilização
apropriada do LBP, associado à um complemento com outras abordagens
terapêuticas, pode proporcionar melhores resultados clínicos e funcionais ao
paciente, e com menor período de tratamento.
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
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