Post on 10-Aug-2015
GMGM20052005
Kolegij Genetičko inženjerstvo
Transgenične biljkedoc. dr. sc. Gordana Maravić
Zavod za biokemiju i molekularnu biologijuFarmaceutsko-biokemijskog fakulteta
GMGM20052005
Definicija pojmova
Transgenični organizamOrganizam koji nosi slijed DNA koji inače nije prirodno prisutan u njegovom genomu
TransgenCiljni gen uključen u stvaranje transgeničnog organizma
Genetički modificirani organizam (GMO)
Organizam u kojem je učinjena genetička promjena Termin kojim se opisuju transgenične biljke i životinje
OPREZ!Uža definicija
Uključuje isključivo uvođenje stranih gena u organizam genetičkim inženjerstvom
Šira definicijaUključuje i križanje i mutagenezu
GMGM20052005
Važne metode za poboljšanje svojstava biljaka
KrižanjeKrižanjem dviju individua iste ili različitih vrsta nastaje nova, poboljšana varijantaNije biotehnološki postupak
TransformacijaUnošenje gena iz druge vrstetemeljni biotehnološki postupak u proizvodnji transgenične biljke
MutagenezaModifikacija normalnog genaNe uključuje unos transgena
GMGM20052005
Križanje vrstapšenica raž
X
hibrid tritikala
Bolji prinos i sadržaj proteina nego u roditeljskih vrsta
GMGM20052005
Stvaranje transgenične biljke
Koraci:Kreirati rekombinantnu DNA za uvođenje strane DNA
Kao vektori se najčešće koriste virus mozaične bolesti duhana i plazmid Ti (tumor inducing) iz bakterije Agrobacterium tumefaciens
Uvesti stranu DNA u biljku i selektirati transformanteRazviti čitavu biljku u laboratorijuIspitati biljku izvan laboratorija
GMGM20052005
Plazmid Ti
Prirodni plazmid u A. tumefaciensNosi gene za tumorigenezu (biljni hormoni), virulenciju i sintezu i uporabu derivata neobičnih aminokiselina –opinaRegija s genima za tumorigenezu – T-DNAT-DNA je omeđena ponavljajućim sljedovima pomoću kojih se nasumično ugrađuje u genom biljkeT-DNA se može zamijeniti stranom DNA za unos u biljku
GMGM20052005
Trodijelno križanje
prikladni soj A. tumefaciens s rekombinantnom DNA kreira se miješanjem triju bakterijskih sojeva
Jedan soj E. coli nosi vektor s ciljnim genomDrugi soj E. coli nosi vektor koji potiče konjugaciju (vektor pomagač)soj A. tumefaciens nosi derivat plazmida Ti
Vektor poimagač prenosi vektor s ciljnim genom u A. tumefaciens gdje dolazi do rekombinacije s plazmidom Ti
GMGM20052005
2 pristupa dizajnu Ti-plazmida
Sustav binarnih vektoraU A. tumefaciens se istovremeno ubacuju vektor s ciljnim genom i sljedovima za rekombinaciju i vektor s genima za virulencijuKomplementacija in trans
Kointegracija
pBR
pBR
vir
Razoružani kointegrirani Ti plazmid
insert
GMGM20052005
GMGM20052005
Unos strane DNA u biljke
Infekcija bakterijom A. tumefaciensElektroporacija protoplastaBiolistika (“genski pištolj”)
GMGM20052005
Laboratorijski dio
GMGM20052005
Testiranje u polju
Otpornost na herbicide
“obične biljke”
transgenične biljke
GMGM20052005
Završni test – prihvaćanje potrošača
Kukuruz otporan na herbicid Roundup
prije poslije
GMGM20052005
Zašto su važne transgenične biljke?
Možemo razviti organizme s novim svojstvima
Rajčica koja dulje ostaje svježa
Soja otporna na herbicid
GMGM20052005
Ciljevi stvaranja transgeničnih biljaka
Povećati prinos usjevaSmanjiti uporabu pesticida
Povećati otpornost na korovePovećati toleranciju na pesticide Smanjiti ovisnost o pesticidima
Poboljšati hranjivu vrijednost namirnicaOdgoditi propadanje (truljenje) hraneSniziti cijenu hraneProizvesti jestive vakcine
GMGM20052005
Transgenične biljke na tržištu
Pamuk otporan na insekte – Bt (Bacillus thuringiensis) toksin ubija nametnike (Helicoverpa zea)•transgen = Bt protein
Kukuruz otporan na insekte – Bt toksin ubija nametnika Ostrinia nubilalistransgen = Bt protein
Normalan Transgenični
GMGM20052005
Biljke otporne na herbicide
Soja, kukuruz (na tržištu poznati kao “Roundup ready”usjeviUskoro šećerna repa, salata, malina, pšenica...)
Gliofozat i glufozinat – najčešće klase herbicida u uporabi (komercijalno ime “Roundup”)Transgen - modificirana EPSP sintaza ili fosfinotricin-N-acetiltransferaza
GMGM20052005
Usjevi osjetljivi na glifozat ne mogu sintetizirati aromatske ak
X
X
Glifozat –inhibitor biljne EPSP sintaze
šikimska kiselina+ fosfoenolpiruvat
5-Enolpiruvil šikimat-3-fosfat(EPSP)
Aromatske aminokiseline
Bez aminokiselina biljka umire
X
GMGM20052005
Usjevi otporni na glifozat sadrže bakterijsku EPSP sintazu
Glifozatne inhibira bakterijsku EPSP sintazu
šikimska kiselina+ fosfoenolpiruvat
5-Enolpiruvil šikimat-3-fosfat(EPSP)
Aromatske aminokiseline
Biljka se normalno razvija
GMGM20052005
Biljke otporne na viruse
Potivirusi uzrokuju štetu na usjevima papaja, lubenica, tikvica...PRSV - papaya ringspot virusWMV2 - watermelon mosaic virus-2 ZYMV - zucchini yellows mosaic virus
Protein virusnog omotača unosi se kao transgen u biljkuprotein se proizvodi u biljci, ona aktivira zaštitne mehanizme i postaje otporna na virus
GMGM20052005
Nova generacija transgeničnih biljaka
Zlatna riža – povećana količina vitamina Atransgen = tri enzima u biosintetskom putu vitamina A
suncokret– otpornost na bijelu plijesanBijela plijesan proizvodi toksične oksalatetransgen = oksalat oksidaza iz pšenice
GMGM20052005
Nova generacija transgeničnih biljaka
Nova varijanta transgenične traveTurfgrass:otpornost na herbicidepolakši rast (manje učestala košnja)
GMGM20052005
Biljke kao jestive vakcine
Biljke su jeftini, sigurni i učinkoviti sustavi za proizvodnju i uzimanje vakcinavakcina dolazi u krvotok razgradnjom biljke u probavnom traktu – eliminacija industrijskog procesiranja i pročišćavanja
Rani pokusi – ekspresija površinskog antigena bakterije Streptococcus mutans u duhanu
S. mutans proizvodi kiselinu koja uzrokuje karijesStimulacija imunog odgovora u mukozi usne šupljine spriječila bi nastanjivanje bakterija
GMGM20052005
Biljke kao jestive vakcineBiljke kao jestive vakcine
Antigen Domaćin Referenca
Površinski antigen herpes virusa B
duhan Mason et al. 1992.
Glikoprotein virusa bjesnoće
rajčica Mcgarvey et al. 1995.
Antigen hepatitisa B salata Ehsani et al. 1997.
Podjedinica kolera toksina
krumpir Arakawa et al. 1998.
GMGM20052005
Zlatna riža
Nedostatak vitamina A je veliki zdravstveni problem
Uzrokuje sljepoćuPogoršava druge bolesti (diareja...)
Procjenjuje se da oko milijun djece umire prerano a dodatnih 350 000 oslijepiU brojnim zemljama ne postoji mogućnost unosa vitamina A putem tabletaPovećan sadržaj vitamina A u osnovnim hranjivim namirnica je privlačna alternativa
Proizvodnja transgenične riže
GMGM20052005
Sintetski put β-karotena ne postoji u biljaka
IPP (izopentil-difosfat)
Geranilgeranil difosfat
Fitoen
Likopen
β -karoten(prekursor vitramina A)
fitoen sinthaza
fitoen desaturaza
Likopen-beta-ciklaza
ξ-karoten desaturaza
Problem:Riži nedostaju
ovi enzimi
Normalna riža bez
vitamina A
GMGM20052005
Zlatna riža sadrži gene za biosintetski put vitamina A
Gen iz sunovrata
Jedinstveni bakterijski gen obnaša obje
funkcije
Biosinteski put vitamina A je
potpun i funkcionalan
Zlatna riža
IPP (izopentil-difosfat)
Geranilgeranil difosfat
Fitoen
Likopen
β -karoten(prekursor vitramina A)
fitoen sintaza
fitoen desaturaza
Likopen-beta-ciklaza
ξ-karoten desaturaza
Gen iz sunovrata
GMGM20052005
Zlatna riža 2 – veći sadržaj β-karotena
Premda zlatna riža sadrži β-karoten, njegova količina nije dovoljna da bi se normalnim unosom zadovoljile potrebe za vitaminom AZbog premalog sadržaja β-karotena, enzim fitoen-sintaza iz sunovrata zamijenjen je enzimom iz kukuruza koji značajno povećava sintezu β-karotena
(Nature Biotechnology, May 2005)
GMGM20052005
GMO u SAD
u SAD se nalazi 66% svjetskih GMO usjevaOd toga:
75% pamuk71% soja34% kukuruzOstali usjevi: rajčica (cherry tomato), krumpir, šećerna repa...
GMGM20052005
Prednosti i nedostaci GMO
NEDOSTACIPREDNOSTIMogući nepredvidivi zdravstveni problemiAlergijeNarušavanje ekološke ravnoteže
BioraznolikostRazvitak rezistencije
Redukcija uporabe pesticida za tretiranje usjevaPoboljšana hranjiva vrijednost Odgođeno vrijeme truljenja Niža cijenaProizvodnja usjeva koji bi rasli u nepovoljnim uvjetima
Trenutno ne postoje jednoznačni rezultati znanstvenih istraživanja!
GMGM20052005
Potrebno je biti oprezan...
“As we know, there are known knowns.There are things we know we know.
We also knowthere are known unknowns.That is to say,we know there are some thingswe do not know.
But there are also unknownunknowns,
the ones we don't knowwe don't know.”
Donald Rumsfeld, ministar obrane SAD na konferenciji za
tisak o pitanju iračkog oružja za masovno
uništenje
GMGM20052005
...ali i strpljiv i optimističan
“There is a great day dawning if only we can get through the night.”