Post on 29-Aug-2019
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Thiole und Disulfide
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Redoxpotential im Cytoplasma ist negativ => reduzierende Bedingunegn
• Glutathion ist Reduktionsmittel im Cytoplasma• Glutathion reduziert Disulfide im Cytoplasma
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Redox equlibriaRedox shuffling: Einfügen von Disulfidbrücken in einem Redoxpuffer, meist Glutathion (GSH) und Glutathiondisulfid (GSSG).
Redox equlibria
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ThiolbestimmungDTNB: Dithionitrobenzoesäure: Messung bei pH 7.5-8.5Δ Absorption bei 412 nm. ε= 13,600 M-1 cm-1 pro Thiol.
Riddles P.W., Blakeley R.L., Zerner B. (1983) Reassessment of Ellman's reagent, Methods Enzymol. 91, 49-60.
ThiolbestimmungDTP: Dithiopyridin: Messung bei pH 4; Delta Absorptionbei 343 nm. ε= 7,600 M-1 cm-1 per Thiol.
Pedersen, A. O., and Jacobsen, J. (1980) Reactivity of the thiol group in human and bovine albumin at pH 3-9, as measured by exchange with 2,2'-dithiodipyridine. Eur. J. Biochem. 106, 291-5.
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DisulfidbestimmungNTSB: Nitro-sulfonobenzoesäure: Messung bei pH 9.5; Delta Absorptionbei 343 nm. ε= 13,600 M-1 cm-1 pro Dissulfid.
Thannhauser TW, Konishi Y, Scheraga HA. (1987) Analysis for disulfide bonds in peptides and proteins. Methods Enzymol. 143, 115-9.
Cofaktoren
Was kann man sehen,wie kann man Sie detektieren?
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Cofaktoren
Organische Cofaktoren Anorganische Cofaktoren
Cofaktoren
Coenzyme=Organische / Metallorganische Cofaktoren
Andere
Prostethische Gruppe, wenn fest/kovalent an das Protein gebunden.
Apo-protein/-enzym (- p. Gruppe)
Holo-protein/-enzym (+ p. Gruppe)
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Einschub Absorptionsspektroskopie
Viele organsiche Cofaktoren besitzen konjugierte ΠElektronen Systeme und absorbieren Licht im sichtbarenBereich.
Die Proben haben eine Farbe !
Ist eine Probe gefärbt => Absorptionsspektrum
Einschub Absorptionsspektroskopie• Schnell, einfach, zuverlässing• Beachte: Nur klare, partikelfreie Lösungen messen.
Lichtstreuung beinträchtigt Spektren.=> Zentrifugieren, Filtern
• Lambert- Beer: A= ε • c • d ⇒Konzentrationsbestimmung
Lambert-Beer nicht mehr linear bei zu hoher Absorption oder auchKonzentration von Molekülen (z.B. durch Lichtstreuung)
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Einschub Fluoreszenzspektroskopie• Schnell, einfach, zuverlässing
• Fluoreszenz meist sensitiver als Absorption.
Einschub Fluoreszenzspektroskopie
• Anregungswellenlänge < Emittierte Wellenlänge
Fluoreszenz
Absorption
Messprinzip
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Einschub Fluoreszenzspektroskopie
• AnregungsspektrumEmittiertes Licht wird beobachtet, Anregungswellenlängewird “abgefahren” / “abgerastert”.
• EmissionsspektrumEs wird bei einer Wellenlänge angeregt; das emittierte Lichtwird als Spektrum aufgezeichnet.
CofaktorenOrganische Cofaktoren
• Häm, Chlorophylle
Ausgeprägte Absorption, großes konjugiertes Doppelbindungssystem
Cytochrom c, ε410 nm =106 000 M-1 cm-1
Quantifizierung / Identifizierung über Absorptionsspektren
Bei Häm: Spektren oxidiert und reduziert sehr charakteristisch für unter-schiedliche Häm-Spezies. Reduktionsmittel z.B. NaDithionit
Häm b
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Häm, ChlorophylleAbsorptionsspektrenAusgeprägte Absorption, ε ≥ 100 000 M-1 cm-1
Quantifizierung / Identifizierung über Absorptionsspektren
300 350 400 450 500 550 600 650
0
200
400
600
800
1 000
1 200
1 400
Wavelength [nm]
Bsp. 9 Hämgruppen/Protein
BiopterinBiologisch aktivTetrahydrobiopterin
Bsp: NO Synthase; Aromatische Aminoäuren Stoffwechsel, DOPA Synthese
Nicht kovalent gebunden
Oxidation an Luftsauerstoff zuDihydropterin
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BiopterinBiologisch aktivTetrahydrobiopterin
Oxidation an Luftsauerstoff zuDihydropterin
HPLC• High Performance Liquid Chromatography
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HPLC• High Performance Liquid Chromatography
HPLC: RP = Reversed Phase
• Historisch: “Normal Phase”Normalphase bezeichnet polare StationärePhase und unpolare Mobile Phase; z.B. Dünnschichtchromatografie
• Reversed Phase bezeichnet unpolareStationäre Phase und polare/mittelpolareMobile Phase.
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BiopterinOxidation zu Dihydropterin = Biopterin
Detektion mittels HPLC und Fluorezenz, Anregung 360 nm, Emission 450 nm.
Thiamin -pyrophosphat/-diphosphat
• TPP/TDP Bindung Mg2+ abhängig
C-Umlagerungen
Bsp. Oxidative Decarboxylierung durch Pyruvatdecarboxylase
Nicht kovalent gebunden
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Thiamin -pyrophosphat/-disphosphat
Detektion, Quantifizierung: reine Thiamin-species über Umwandlung in Thiochrom und Fluoreszenzdetektion oder Gemische über HPLC mitFluoreszenzdetektion; Anregung 377 nm, Emission 450 nm.
Ref. J Chromatogr. 307:283-94 (1984)
Flavine
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Flavine
Flavine
FMN FAD
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FlavineFlavine (Flavus, lat. gelb)
Meist FMN oder FAD in Proteinen nicht kovalent abersehr fest gebunden.
Sehr sehr wenige Enzyme mit Riboflavin.
Flavoprotein sind meist Redoxenzyme.
Manche Enzyme binden Flavine kovalent.
1. Nachweis: per Auge und Absorptionsspektrum.
Flavin fungiert als Redoxkatalyst.
Kovalent gebundene Flavine
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Flavine: Absorption
Flavine: Absorption
Absorption Flavin und andere Cofaktoren überlagern sich oft. Hier z.B. 4Fe-4S Cluster und FAD
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Flavine
Flavine / Redoxwechsel
z.B. Reaktion mit NADH
Chemischreduziert mitNaDithionit
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Flavine: Redoxmediatoren
• Flavine können je nach Proteinumgebung1 e- und/oder 2 e- Elektrontransferkatalysieren.
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Flavine
Flavine: Analyse
•Proteinfällung mit z.B. Trichloressigsäure,
•Abzentrifugieren
•Überstand abnehmen und neutralisieren mit K2HPO4
oder Na2CO3.
•Entsalzen
•Reversed Phase HPLC, Fluoreszenzdetektion
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Flavine: AnalyseFMN vs FAD Fluoreszenz
FMN (0.27) hat eine höhere Quantenausbeute als FAD (0.03).
Isoalloxazin Fluoreszenz ist gequench’t durch Adenin.
Flavine: AnalyseFMN vs FAD Fluoreszenz
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Flavine: AnalyseFMN vs FAD Fluoreszenz
Flavine: AnalyseFMN vs FAD Fluoreszenz