Spremljanje E. coli, ki povzročajo črevesne

okužbe s poudarkom na spremljanju

verotoksigenih E. coli

Trkov M.1, Grilc E. 1, Andlovic A.2, Berce I.3, Štorman A.4, Ravnik M.5, Drinovec B. 6, Orešič N.7, Paragi M.1

1 Inštitut za varovanje zdravja (IVZ), Ljubljana2 Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Ljubljana

3 Zavod za zdravstveno varstvo Nova Gorica4 Zavod za zdravstveno varstvo Celje5 Zavod za zdravstveno varstvo Kranj6 Zavod za zdravstveno varstvo Koper

7Zavod za zdravstveno varstvo Maribor

Doprinos mobilnih genetskih elementov k evoluciji

patogenih E. coli

Kaper et al., 2004

Escherichia coli (E. coli) -

del normalne črevesne flore

večine živali in tudi ljudi.

E. coli zelo pogosto izmenjuje

različne gene s horizontalnim

prenosom z drugimi sorodnimi

bakterijami, kot so drugi sevi E.

coli, Salmonella, Shigella.

E. coli je pridobila virulentne

gene in druge gene povezane z

virulenco ob več različnih

dogodkih tekom evolucije.

Kaper et al, Nat Rev Microbiol, 2004

Patogene E. coli

1. ZUNAJČREVESNE OKUŢBE

E. coli, ki povzročajo okužbe sečil (UPEC)

Z meningitisom / sepso povezane E. coli (MNEC)

2. DIAREAGENE E. coli (DEC) – bolezni pri ljudeh in ţivalih

Enteropatogene E. coli (EPEC, A/EEC)

Enterotoksigene E. coli (ETEC)

Enteroinvazivne E. coli (EIEC)

E. coli, ki izdelujejo toksine Šiga ali verocitotoksigene E. coli

(STEC/VTEC)

Enterohemoragične E. coli (EHEC) – podskupina

Enteroagregativne E. coli (EAEC, EAggEC)

Difuzno adherentne E. coli (DAEC)

http://www.wadsworth.org

/databank/ecoli.htm

Enteropatogene E. coli (EPEC, A/EEC)

Definicija:

Ne izdelujejo toksinov Šiga.

Povzročajo histopatološke spremembe črevesnega epitela (“attaching and effacing

(E/A) lesion”). Proces omogoča zelo trdno pritrjevanje bakterij na črevesno sluznico.

Kaper et al. Nat Rev

Microbiol, 2004

Klinični znaki:

vodena, včasih krvava driska, vročina, bruhanje,

dehidracija, driska lahko postane kronična.

“bundle – forming” pili;Kaper et al. Nat Rev

Microbiol, 2004

Dejavniki virulence (na LEE in plazmidu EAF)

Pritrjevanje

intimin (eae, na LEE) – adhezin, ki se veže z

receptorjem Tir

proteini EspA in Tir (na LEE)

“bundle-forming” pili (BFP) (bfp geni na plazmidu

EAF- “adherence factor plasmid”) - BFP omogočajo

pritrjevanje in interakcije med bakterijami

Nekateri sevi izdelujejo različne enterotoksine

(toplotno stabilen enteroagregativni enterotoksin

EAST1, EspC)

Klasične in na novo prepoznane O skupine EPEC : O26, O39, O55, O86, O88,

O103, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128, O142, O145, O157, O158

• Poglavitni naravni vir so prežvekovalci, zlasti govedo, prašiči, ovce, koze,

domače živali (psi, mačke) in divje živali (jelenjad, srnjad, ptice).

E. coli, ki izdelujejo toksine Šiga ali verocitotoksigene E.

coli (STEC/VTEC, EHEC)

• Okužba zaradi fekalne kontaminacije hrane in vode (meso, zlasti govedina,

različni mesni izdelki, surovo mleko, sadje, zelenjava), navzkrižne

kontaminacije pri pripravi hrane, neposrednega ali posrednega stika z

živalmi, stika med ljudmi.

• Najpogostejše serološke skupine O (humani vzorci):

O157, O26, O91, O103, O111, O113, O117, O121, O128, O145

Klinični znaki:

Blaga, vodena, krvava driska (hemoragični kolitis),običajno brez vročine.

Včasih pride pri okužbi z VTEC do zapletov HUS (hemolitični uremični sindrom) in TTP (trombotična trombocitopenična purpura).

Definicija EU / ECDC: klinična in laboratorijska merila za okužbo z VTEC in HUS

Mreţa za spremljanje HUS, VTEC (poglobljeno laboratorijsko – epidemiološko spremljanje – odkriti čim več primerov HUS zaradi okužbe z VTEC in pojasniti nekatere dejavnike tveganja):

V skladu s standardno definicijo HUS zdravniki nefroloških / infekcijskih oddelkov poročajo Zavodom za zdravstveno varstvo (ZZV),

vzorec iztrebka bolnika s HUS se pošlje na ZZV;

ZZV pošlje vzorce, sumljive na VTEC na potrditveno diagnostiko v laboratorij IVZ.

Dejavniki virulence:

Izdelujejo toksine Šiga ali verocitotoksine (VT1 / VT2), zapisi na genih vtx1(stx1) in vtx2 (stx2)

Otok patogenosti LEE (eae, EHEC)

Enterohemolizin (ehxA, na velikem plazmidu pO157)

Enterotoksin EAST1 (astA)

Enterotoksigene E. coli (ETEC)

Izdelujejo toplotno stabilen (ST) in / ali toplotno

labilen (LT) enterotoksin (vsaj enega).

Okužba zaradi kontaminacije hrane in vode.

Potovalna driska. Drisko povzročajo tudi pri živalih, zlasti teličkih, ovčkah, prašičih.

Klinični znaki:

Vodena driska (blaga do obilna),bolečine v trebuhu, včasih z bruhanjem in glavobolom, običajno brez vročine.

Dejavniki virulence:

Fimbrije (pili), s katerimi se pritrjujejo na sluznico tankega črevesja (kolonizacijski faktorji – CF, na plazmidih)

Enterotoksini (LT (geni na plazmidih, podobni V. colerae) / ST (geni na plazmidih in transpozonih))

Nekateri sevi izdelujejo enterotoksin EAST1.

Kaper et al. Nat Rev

Microbiol, 2004

Enteroagregativne E. coli (EAggEC, EAEC)

Povzročajo akutno in dolgotrajno drisko pri otrocih in odraslih, potovalna

driska, tudi izbruhi.

Serotipizacija za detekcijo ni primerna, ker so vključeni zelo različni

serotipi / serološke skupine (O44, O86, O111).

Dejavniki virulence: do sedaj ni opisan DV na kromosomu, skupen vsem

EAEC (geni, povezani z virulenco, so večinoma na plazmidih; AAp)

- fimbrije (AAF – “aggregative adherence fimbriae”),

- enterotoksini: ShET1 (Shigella enterotoksin 1) in EAST1 (astA), Pet

Bielaszewska et al,

Lancet Infect Dis 2011

Ne izdelujejo enterotoksinov ST ali LT, na celice HEp-2 se

vežejo v značilnem vzorcu (“stacked-brick”). Težave z izvedbo

in interpretacijo.

Kaper et al. Nat Rev

Microbiol, 2004

Enteroinvazivne E. coli (EIEC)

Zelo podobne rodu Shigella.

Kot Shigella invazija in razmnoževanje v epitelnih

celicah.

Z virulenco povezani številni geni na kromosomu in

plazmidih.

Omejeno število serotipov EIEC.

Difuzno adherentne E. coli (DAEC)

Značilna šibka adherenca na celice HEp-2.

Dejavniki virulence: različni adhezini kot npr. fimbrije

(F1845 - adhezin družine Dr in sorodni adhezini)Diffuse adherence of DAEC on

HEp-2 cells,

(http://www.brad.ac.uk/acad/bi

omed/EAEC/introduction.php)

Splošne značilnosti seva E. coli O104:H4

(E. coli EAEC – VTEC)

Začetek maja izbruh KD in HUS v Nemčiji, okuženih okrog 3000 ljudi, nad 800 HUS, umrlo 53 ljudi.

fermentacija sorbitola: +

toksin VT 1: -

toksin VT 2: +

podtip vtx2a

intimin: -

enterohemolizin: -

aatA: +

aggR: +

aap: +

odporen na širok spekter antibiotikov

ESBL (CTX-M-15 in TEM-1): +

Odkrivanje DEC – rezultati študije

Material:- mešane bakterijske kulture, izolati E. coli: IMI in ZZV-ji poslali na IVZ

Metode:Odkrivanje VTEC, A/EEC / EPEC, ETEC, EIEC

- ipaH (EIEC)

- eltA (ETEC)

- estA (ETEC)

- eae (EPEC*, A/EEC*, VTEC)

- vtx1 (VTEC)

- vtx2 (VTEC)

* Razlikovanje med EPEC in A/EEC na podlagi serotipov.

Odkrivanje EAEC s PCR

16S rRNK

ipaH

eltA

estA

vtx2

eae

vtx1

Metode:

Tipizacija genov vtx:

- vtx1: vtx1a, vtx1c, vtx1d

- vtx2: vtx2a, vtx2b vtx2c, vtx2d, vtx2e, vtx2f, vtx2g

Serotipizacija:

- antiserumi (nad 70)

- za O104 tudi s PCR

Odkrivanje enterohemolizina:

- fenotipsko z gojiščem, ki vsebuje sprane

ovčje eritrocite

- ehxA gen (PCR)

Prijave E. coli v Sloveniji od 2001 do 2010

Leto 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Prijave 198 152 169 153 117 121 117 113 157 139

Rezultati: leto 2010 N = 528

VTEC

17%

EPEC, A/EEC

57%

ETEC

6%

EAEC

20%

EIEC

0%

VTEC EPEC, A/EEC ETEC EAEC EIEC

VTECEPEC, A/EEC

ETEC

EAEC

Negative

VTEC EPEC, A/EEC ETEC EAEC Negative

Sl. 1: Delež odkritih DEC glede na

pozitivne vzorce

Sl .2: Delež odkritih DEC glede na

vse vzorce

Genotip O sero. sk.

(št. izolatov) Regija

vtx1 vtx2 eae

O128 (1) 1 CE + + +

O157 (2) 1 NG

1MB -

+

+

+

+

+

O26 (6)

2 IMI, 2 NG

1 KR

1 IMI

+

+

-

-

-

+

+

+

+

O111 (2) 2 CE + - +

O103 (1) 1 KR + - +

O55 (1) 1 KR + - -

ND (7)

1 IMI (HUS)

1 IMI

1 IMI

1 IMI

1 IVZ

1 IVZ

1 IVZ

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Humani VTEC izolati v 2010

ND: ni določeno

Noben ND sev ni pripadal serološki sk. O104.

Tab. 4: O-serološke skupine, genotipi VTEC

Genotip O sero. sk.

(št. izolatov) Regija

vtx1 vtx2 eae

O103 (1) 1 KR + - +

O91 (1) 1 KR + - -

O26 (4) 3 IMI, 1 KR + - +

O157 (4) 1 MB, 1 IVZ, 1 IMI,

1 KR -

+

+

+

+

+

O153 (1) 1 IMI - + -

O177 (2) 1 IMI - + +

O146 (2) 1 CE

1 IVZ -

+

+

+

-

-

ND (2) 1 CE

1 IMI -

-

+

+

-

-

Humani VTEC izolati v 2011

ND:ni določeno

Noben ND sev ni pripadal serološki sk. O104.

Tab. 5: O-serološke skupine, genotipi VTEC

Leto O sero. sk. Genotip

1998 O26 ehxA, eae, vtx2

2001 O17 vtx1, vtx2

2001 O157 ehxA, vtx2

2002 O157 ehxA, eae, vtx2

2005 O145 ehxA, eae, vtx2

2005 O26 ehxA, eae, vtx2

2007 O157 ehxA, eae, vtx2

2009 O126 vtx2

2010 ND vtx2

2011 O153 vtx2

2011 O177 ehxA, eae, vtx2

2011 ND ehxA, vtx2

2011 O177 ehxA, eae, vtx2

Tab. 6: Serološke sk. O in genotipi VTEC – bolniki s HUS in / ali TTP

O serološke skupine slovenskih VTEC humanih izolatov: O157, O26, O103,

O145, O111, O113, O17, O55, O91, O126, O128, O146, O148, O153,

O177, O84, O6

Podtipi genov vtx2:

2a, 2c, 2d.

Zaključki

Slovenski izolati VTEC pripadajo različnim serotipom in genotipom.

VTEC O104:H4 ni bila ugotovljena.

Čeprav so VTEC najbolj opisana skupina DEC in povzročajo obolenja z najresnejšo klinično sliko, so druge skupine patogenih E. coli pogostejše povzročiteljice drisk.

Odkrivanje in identifikacija DEC ni enostavna in vključuje zelo veliko različnih metod.

Vendar kaže kombinacija dejavnikov virulence, značilnih za EAEC in VTEC v enem sevu (E. coli O104:H4) na pomembnost sposobnosti odkrivanja vseh skupin DEC z ustreznimi molekularnimi metodami.

Zato je nadaljnje spremljanje DEC zelo pomembno in nujno.

ZAHVALA

Sodelavcem v laboratoriju IVZ:

Toni Oražem

Vesna Malus

Maja Klopčič

Marjetka Repar

Jelka Gregorič

Andreja Šmerc

Hvala za vašo pozornost.