SÉCRÉTION DESFACTEURS DEVIRULENCE CHEZ LESBACTÉRIES GRAMNÉGATIVESSOPHIE BLEVES, ROMÉ VOULHOUX

NAWEL ADJEROUD

Sécrétion

Protéines

Enzymes

Toxines

ExcrétionEliminatio

n de

Déchets

Survie et Adaptation

M. Externe

Périplasme

M. Interne

Cytoplasme

Extérieure

Processus Complexe Nécessite

six systèmes de sécrétion

Type VI

Vibrio cholerae

• Vibrio cholerae bactérie à gram négatif

(bacille virgule en français)

• Forme: bâtonnet incurvé, mobile

• responsable du choléra chez l‘homme, une maladie épidémique contagieuse, par sécrétion de toxines (altère le transport mbnaire).

Sécrétion membranaire de toxine

AB5

S/unité

A

S/unité

B5

Système de

sécrétion type 2

Type II secretion system of V. cholerae: . ATPase: EpsE . Plateforme MI: EpsE, L, F, M .

EpsD

PetidaseEps

O

Pseudopilins

Pseudopilus

(assemblageG)

Sécrétion

Exportation

TYPE II TYPE IV

Homologie T2SS-T4SS

Pseudopilus Pilus

Pseudopilins Pilins

Bibliographie: Rôle de EpsG

++++ +

Apparition Pseudopilus à la surface

eps G

All eps genes

Proteines Platforme

MI

ATPase:EpsE

epsOpero

n

[EpsG]

Surexpression G Constants

Comment?EpsG---EpsE

G G G

The Question is

EpsLLien

possible

Lien Direct/Indirect

???

Pourquoi L: Linker ?

Bibliographie: Mutation en E supprime mutation en G

Etude structurale E: a un site d’interaction avec L:

E interagit avec G via L

E

L

GLienE-G

? G-L

Méthodologie

Pour déterminer interaction EpsG-EpsL:

1- Pontage chimique (DSP)/Cross-Linking

2- Co-immunprécipitation

1. Pontage chimique (DSP)

Molécules en interaction « faible »

(difficile à détecter) (électrostatiques, hydrophobe...),

Ou simplement à proximité l’une de l’autre

Pontage covalent entre les 2 molécules

Agents de pontage

DSP,

imidoester bifonctionnel,

glutaraldéhyde, formaldéhyde.

Figer / immobiliser

ces molécules

Principe: N-hydroxysuccinimide (NHS) à chaque extrémité réagit avec les amines primaires.

DSP+Pro1 Liaisons amides covalentes

DSP-Pro1

Libération NH-ester

DSP-Pro1(intermédiaire) Cross-Linked Product

+Pro2 Pro1-DSP-Pro2

Libération NH-ester

Crosslinker DSP (dithiobis succinimidyl propionate) = réactif de

Lomant

Réaction avec amine

primaire

DSP

EpsG

EpsL

1

2

2. Co-immunoprécipitation

Technique d’identification des interactions protéine-protéine:

Principe simple: montrer que les deux protéines EpsG-EpsL interagissent ensemble. Avec un anticorps dirigé contre G ou L pour purifier non seulement G mais aussi L, et inversement!

EpsG

EpsL

SDS-PAGE+Immunoblott AC anti G/L couplés à la

biotine

RESULTATS

Sans EpsG ou L

Absence G-L:

Il existe bien interaction

EpsL -- EpsG

60kDa

35kDaDimère EpsG

15Kda

Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG

Mutation résidu G: Gly-Val Asp-Glu Thr-Leu

Mutations epsL et epsG

pas de sécrétion de protéase: complexe

G-L nécessaire sécrétion

Contrôle:Mesure activité Protéase

Confirmation

Délétion d’epsG ou

epsL Absence du

complexe EpsL-EpsG

Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG

Co-immunoprecipitation 1. Anticorps anti-EpsG: Immunoblott pour EpsG

Lanes 4, 6Augmentation

EpsG et complexe G-L

Lanes 7, 9Apparition

EpsG-EpsL ???

ConfirmationL est lié à G

60kDa=EpsG-EpsL

2. Immunoblott pour EpsG

3. Immunoblott pour EpsL

Lanes 7, 9Augmentation

EpsL et complexe G-L

Lanes 4, 6Apparition

EpsG-EpsL ???

ConfirmationL est lié à G

60kDa=EpsG-EpsL

4. Immunoblott pour EpsL

1- Clivage par PilD: Immunoblott pour EpsG

Mutation pilDPas de

complexe G-L

EpsG non clivée de PM

élevé

Clivage PilDNécessaire

au G-L

2-Clivage par PilD: sur Mutant G

Clivage EpsG par PilD est

nécessaire au cross-link avec

EpsL

Dans pEpsGG-1V

Pas de G-L, pas de clivage sur G nonfonctionnel, pas de sécrétion

Lien direct/indirect1. Rôle des autres membres T2S….???

Seule EpsL est essentielle à la formation G-L

EpsL EpsGInteragissent Directement

2. Rôle de Protéines spécifiques à V. cholerae….???

Immunoblott pour G

E. coliG-L formé

En présence deEpsG EpsL

Aucune protéine de

V.cholerae est impliquée

G se lie de préférence à L

qd L est présent

3. Rôle Protéines spécifiques à V. cholerae….???

Immunoblott pour L

Association EpsG-EpsLspécifique

Liaisons HAsp91-Thr112

Effet Mutation T112, D91 de EpsG…???

G devient moins stable

Substitutions T112 D91de EpsGWT mutantG+Plasmides: Immunoblott pour EpsG

Absence G-L si résidus G substitués

(D91E, T112L)

Pas de Sécrétion si

Résidus substitués:domaines conservés

Chez ts homologues

Conclusion

Etude interactions EpsG-EpsL cross-

link(1pseudopilin

Majeur-le reste duT2SS)

Etudes antérieures: Interactions entre les 5 pseudopilins Interactions EpsE-EpsL

Apport de l’article…?

EpsL: Scaffoldtransduction de

signaux entre E-G ‘‘Linker’’ de

l’ATPase:EpsE-EpsG: conversion énergie

EpsG clivée par PilD devient mature et interagit avec EpsL.

L’association EpsL-EpsG est

spécifique: sans aucun autre

composé T2SS.

L’hydrolyse ATP:Changement

dynamique de EQui affecte LQui permet

assemblage de G

Rôle des G,L,E dans la sécrétion de toxines (GSP)

ATP ADP +Pi

OM

IM

EpsD

EpsE

EpsF EpsL

M

C

PeptidasePilD

TT

T

G

G

G

G

G

Clivage PilD

GG

G

G

Pseudopilins

Sec

The conversion of chemical energy to mechanical work:Polymérisation des G

Sécrétion

G G

Pseudopilus

filaments en Hélice

T

Exportation de toxine

Sécrétion de toxine chez V. cholerae

Piston

Futures Etudes.…?

Déterminer le site précis d’interactions entre EpsG et EpsL.

Déterminer le rôle des autres pseudopilins (H-K), sont ils ‘‘recrutés’’ eux aussi par EpsL par hydrolyse d’ATP? Pour être incorporer dans le pseudopilus.

Comprendre réelement l’implication des interactions EpsG-EpsL (hydrolyse d’ATP et ???)

Des questions???....Des commentaires???....

De votre attention