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La citometría de flujo es una herramienta de análisis que permite discriminar partículas de diferente tamaño y color . Esta técnica de análisis es utilizada de forma rutinariaen muchos laboratorios clínicos y de investigación para medir y cuantificar propiedadesfenotípicas, bioquímicas y/o moleculares de células individualizadas mediante la utilizaciónde sondas fluorescentes específicas de uno o varios parámetros celulares.

 La principal característica de la citometría es que puede ofrecer de forma muy rápida

información simultánea de varios parámetros de cada una de las partículas analizadas asícomo la relación entre dichos parámetros. Los parámetros analizables por citometría de flujoson! i" los relacionados con las características físicas de la partícula! el tamaño y lacomplejidad y ii" las distintas fluorescencias asociadas a la partícula. El análisis se realiza avelocidades de miles de células#segundo lo que permite obtener datos de elevada fiabilidadestadística así como identificar poblaciones representadas en baja frecuencia dentro de lapoblación global. $tra importante característica de la citometría de flujo es que el análisis serealiza en una suspensión de partículas individualizadas, por lo que las partículas o célulasobjeto de análisis deben encontrarse en suspensión y en forma de partícula %célula" &nica.'inalmente es importante destacar que e(iste una restricción respecto al tama)o de laspartículas objeto de análisis ya que estas deben tener tama)os comprendidos entre las *.+,-**um.

Representación de datos

La información obtenida por técnicas de análisis de citometría de flujo se representaen forma distribuciones de frecuencia o histogramas de una o dos dimensiones. En loshistogramas de una dimensión o parámetro se representa el n&mero de células o partículas %enel eje de ordenadas" frente a la intensidad de fluorescencia de un parámetro %en el eje deabcisas" %figura ". Las distribuciones de frecuencia de dos parámetros también denominadascitogramas representan en cada eje la intensidad de fluorescencia de un parámetro diferente.Las más comunes son las distribuciones de frecuencia de puntos %/dot plots0" donde cadapunto representa a una partícula analizada y la distribución de los puntos permite visualizar lascontribuciones relativas de cada región de rangos de intensidad de fluorescencia. 1ambién seutilizan distribuciones de frecuencia o de densidad de dos dimensiones en los que la proporciónde las células en cada región se definen por una escala de color  o por gradientes de curvas decontorno. La utilización de representaciones en dos dimensiones permite establecer de maneravisual cual es la correlación entre cualesquiera dos parámetros %figura 2". $tra característicapropia del análisis de datos de citometría de flujo es la utilización de ventanas de análisis %/gates0" %figura 3". El establecimiento de ventanas de análisis se utiliza tanto para seleccionarde manera específica la población de células o partículas de interés normalmente en base alos parámetros de dispersión frontal y ortogonal de la luz como para simplificar el análisis depoblaciones heterogéneas en las que se analizan simultáneamente un n&mero elevado deparámetros. 

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Cell Sorting La separación celular por citometría de flujo o /cell sorting0 es el proceso de

separación física de partículas en base a la e(presión diferencial de uno o varios parámetrosanalizables por técnicas de citometría de flujo analítica. Las separaciones de células opoblaciones celulares homogéneas se realizan con objeto de llevar a cabo posteriormenteensayos bioquímicos moleculares o de diferenciación celular de poblaciones de interés yrequieren de la utilización de sofisticados aparatos de citometría de flujo denominados /cellsorters0. E(isten varios modos de /sorting 0 que se ajustan en función de cuales sean losrequisitos de cada separación. Los distintos ajustes permiten por ejemplo optimizar la purezade la población separada optimizar la recuperación celular de la población separada o separarn&meros e(actos de células en placas multipocillo.

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a citometría de flujo en el an!lisis funcional de las plaquetas"

##" $plicaciones clínicas

%aría&do&C'u %onteiro(, %arcial %artínez((, )os' *nrique +Connor(((

45epartamento de 2ioquímica 6nstituto 7olitécnico de 8a&de,9orte :;ndra 7ortugal.

44alencia.

4443entro de 3itometría 5epartamento de 2ioquímica y 2iología ?olecular 'acultad de?edicina y $dontología

alencia Espa)a.

Palabras Clave: ctivación plaqueta agregación glicoproteinas calcio citometría de flujo.

Key words: ctivation platelet aggregation glycoproteins calcium flo@ cytometry.

Aecibido! -*,6,*B ceptado! +,>6,*B

Correspondencia- 5ra. ?aría,do,3éu ?onteiro5epartamento de 2ioquímica 6nstituto 7olitécnico de 8a&de,9orteAua 3entral de :;ndra -C-D +F+,--G :;ndra 7A5 7ortugal

Subvenciones- yuda 7A$5E7 ?inistério de EucaH;o 7ortugal para la realización del5octorado de ?aría,do,3éu ?onteiro. 3onvenio alencia,6zasa para la

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3reación y ?antenimiento del 3entro de 3itometría en la alencia. 7rimer7remio de Laboratorios Lab?ed 7ortugal.

#ntroducción

Las alteraciones en la función plaquetaria están asociadas a condiciones patológicas que llevantanto a disfunciones tromboembólicas como hemorrágicas.

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Las partículas a analizar %células microorganismos cromosomas orgánulos celulares opartículas inertes" deben constituir una suspensión y son introducidas en un sistemahidrodinámico que crea un flujo laminar de modo que las células son forzadas por una capade líquido envolvente %Isheath fluidI" a fluir en una fila &nica en el centro de la corriente lo quese denomina Ienfoque hidrodinámicoI. Las partículas transportadas por el flujo de líquido

interceptan el haz de luz causando una dispersión de la luz incidente. La mayor o menordispersión de luz seg&n diferentes ángulos permite cuantificar el tama)o relativo y lacomplejidad %morfología de la superficie granulosidad interna" de la célula. pesar de que laluz se dispersa en todas las direcciones la cantidad de luz dispersa en ángulos peque)oshasta -*,B*J %I'or@ard 8catterI '8" alrededor del eje del haz de láser está relacionada con eltama)o relativo de la célula %cuanto mayor es la partícula mayor la dispersión". Las plaquetaspor ejemplo tienen valores de '8 inferiores a cualquier otra célula de la sangre debido a supeque)o tama)o lo que normalmente permite su distinción. 8in embargo la correlación entreel tama)o de la célula y el valor de '8 está afectada por diversos factores concretamente porla simetría de la célula la viabilidad y la presencia de componentes celulares que absorben laluz incidente. Este aspecto debe ser considerado cuando se usa la medición de '8 paraestimar tama)os relativos de células en poblaciones de células heterogéneas.

La intensidad de la luz del láser que se dispersa ortogonalmente en relación al haz de luz%I8ide 8catterI 88" representa principalmente la luz reflejada por estructuras internas o de lasuperficie de la célula y es interpretada como un índice de granularidad. La distinción entre

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diferentes tipos de células de sangre humana es más fiable cuando se utiliza la combinaciónbiparamétrica de '8 y de 88 que con cada uno de los parámetros solos %'igura B".

La utilización de fluorocromos permite detectar y cuantificar un gran n&mero de parámetroscelulares. La fluorescencia emitida por estas moléculas cuando son e(citadas por el haz deluz genera información acerca de su presencia en células o partículas individuales. Ladeterminación de la fluorescencia permite una detección sensible de diferencias cuantitativasentre células o partículas. 7or ejemplo diferencias menores de B.*** moléculas defluorescencia por célula o partícula pueden ser detectadas con los fluorocromos más comunes.

 l igual que la dispersión de luz la fluorescencia se emite en todas las direcciones pero esmonitorizada por un detector óptico en posición ortogonal con respecto al haz de iluminación%'igura -". 7ueden ser cuantificadas separadamente emisiones de varios fluorocromosdiferentes en la misma célula usando espejos dicroicos que son separadores del haz

luminoso y filtros que seleccionan longitudes de onda adecuadas.

El análisis multiparamétrico de células individuales permite que sean discriminadassubpoblaciones de células. 5urante la adquisición de los datos es posible definir ventanaselectrónicas %IgatesI" que permiten cuantificar otros parámetros solo sobre la subpoblación deinterés.

En el análisis de la fluorescencia emitida por fluorocromos a)adidos a las células debe tenerseen cuenta la fluorescencia celular intrínseca o autofluorescencia que es causadaprincipalmente por nucleótidos de pirimidina y flavina. Estas moléculas confieren fluorescenciaazul o verde de baja intensidad a las células cuando son e(citadas por luz ultravioleta o azul.La autofluorescencia también puede ser usada como un parámetro discriminador! por ejemplola fluorescencia emitida por moléculas tales como 95= y '?9#'5 proporciona un marcador del estado de o(idación,reducción de las células.

http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0034-79732002000300001&script=sci_arttext#f2http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0034-79732002000300001&script=sci_arttext#f1http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0034-79732002000300001&script=sci_arttext#f2http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0034-79732002000300001&script=sci_arttext#f1

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En la interpretación y en la validación de los datos de la citometría de flujo son de particularimportancia la linealidad y la estabilidad del aparato. La inestabilidad y#o irreproductibilidadpueden resultar de fluctuaciones en la potencia del láser o en el flujo de muestra y eldesalineamiento de los sistemas de lentes. La no linearidad puede surgir de limitaciones en lalinearidad de respuestas del fotomultiplicador o defectos en otros procesadores de se)aleselectrónicos y de la e(tinción %IquenchingI" dependiente de la concentración de los

fluorocromos. La linearidad del aparato puede con todo ser evaluada usando microesferasfluorescentes u otras partículas de referencia.

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e(isten anticuerpos monoclonales disponibles. lgunos antígenos se e(presan en la superficietras la activación plaquetaria pero no en la plaqueta en reposo.

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moléculas de :766b#666a de los gránulos a hacia la superficie de la membrana durante elproceso de secreción-B.

 l contrario de :766b#666a y :76> cuya e(presión aumenta tras la activación de la plaqueta launión a la superficie de la plaqueta de anticuerpos monoclonales para diferentes epítopos delcomplejo :76b#6N#> disminuye. Estudios realizados en sangre entera demuestran que la

trombina induce una disminución acentuada de la unión de los anticuerpos monoclonales G5-específico para el factor de >on Oillebrand % vO'" ligado a :76bK '?3B+ específico para :76Ny P- específico para el complejo. $tros agonistas tales como el 57 adrenalina y colágenoejercen un efecto similar sobre la e(presión de :76b#6N#> pero en menor gradoC.

21 *stados conformacionales de 30##b/###a y de sus ligandos-

El anticuerpo 73,- se dirige al lugar de unión del fibrinógeno en el complejo :766b#666a. Estelugar de unión no está e(puesto en las plaquetas en reposo. La activación de las plaquetas poragonistas %57 adrenalina y trombina" resulta en alteraciones conformacionales de :766b#666aque e(ponen el lugar de unión del fibrinógeno. sí 73- solamente se une a plaquetasactivadas permitiendo detectar la conversión del complejo :766b#666a en un receptor funcionalpara el fibrinógeno+,D. Esta alteración conformacional se ha determinado también por

transferencia de fluorescencia %'AE1 'luorescence Aesonance Energy 1ransfer" entrefluoróforos dadores y receptores unidos a anticuerpos anti,:766b y anti,:7666aF. 3uando secompara este fenómeno con la secreción de serotonina y 7' no se observa una relacióndirecta lo que sugiere que la unión del 73,- puede ser independiente de la secreción-.

5espués de la activación del complejo :766b#666a éste se une a moléculas de adhesión%fibrinógeno vO' vitronectina y fibronectina" y esta unión puede ser monitorizada conanticuerpos específicos para cada uno de los ligandosM. lgunos anticuerpos monoclonalesreconocen preferencialmente el ligando acomplejado-*. Estos sitios de unión para losanticuerpos se designan genéricamente por IA628I %Aeceptor,6nduced 2inding 8ites". E(istenademás anticuerpos que reconocen alteraciones en el receptor inducidas por la interacción conel ligando--. Los anticuerpos contra tales IL628I %Ligand,6nduced 2indig 8ite" reconocenepítopos en :7 66b#666a que son e(presados cuando un ligando que contiene la secuencia rg,

:ly,sp se une al receptor. 7or ejemplo el anticuerpo monoclonal 5C reconoce un lugar deunión L628 en :7666a cuya e(presión es inducida por fibrinógeno y vO'-B-C. El anticuerpomonoclonal 7?6,- reconoce un epítopo de :766b#666a que es e(puesto después de la unión delfibrinógeno al complejo. La utilización del anticuerpo 7?6,- puede ser más ventajosa que 73,- para detectar alteraciones conformacionales de :766b#666a y la consiguiente agregación todavez que la unión del fibrinógeno no bloquea el lugar de unión de este anticuerpoD.

$tro aspecto importante de la aplicación de esta técnica es la posibilidad de analizar diversasetapas de la secuencia fisiológica de la activación. 7or ejemplo con los anticuerposmonoclonales actualmente disponibles se puede evaluar secuencialmente el proceso dee(posición de lugares receptores para el fibrinógeno en el complejo :766b#666a la unión delfibrinógeno las alteraciones inducidas por esta unión tanto en el complejo como en la moléculade fibrinógeno y finalmente la agregación.

C1 *4presión de componentes de la membrana de los gr!nulos plaquetarios-

$tra alteración que ocurre en la superficie de la membrana durante la activación es la fusión delas membranas de los gránulos a con la membrana plasmática. Este proceso puede serdetectado con los anticuerpos 8-B y P3 que reconocen la glicoproteína de la membrana delos gránulos a denonimada 7,selectina %35GB7"-. 35GB7 es la glicoproteína de la membranade los gránulos mejor caracterizada y se han obtenido diversos anticuerpos monoclonalesespecíficos para esta proteína muchos de los cuáles inhiben sus funciones adhesivas-+,-D %'igura +". ?ás recientemente se ha identificado y caracterizado otra proteína asociada a lamembrana de los gránulos a denominada :?7,CC. El uso del anticuerpo monoclonal A

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La membrana de los lisosomas contiene la glicoproteína :7+C conocida también como 35GCo proteína integral de la membrana lisosomal %L6?7" y dos proteínas homólogas referidascomo L?7,- y L?7,B %Lysosome,ssociated ?embrane 7roteins" que se e(presan en la

superficie de la membrana después de la activación. El anticuerpo específico B.BF permitedetectar la e(presión de 35GC tras la estimulación de la célula con trombina-F-M.

.1 *4presión de proteínas solubles liberadas durante la secreción-

1ras la activación diversas proteínas de los gránulos a liberadas al medio e(tracelular puedenunirse a la superficie de la membrana en cantidad suficiente para ser detectadas poranticuerpos monoclonales apropiados. Estas proteínas incluyen las cuatro proteínas adhesivasque ligan :766b#666a es decir fibrinógeno vO' fibronectina y vitronectinaK la trombospondina yel 7'B*,BC.

*1 *4presión de una superficie procoagulante-

Las plaquetas activadas proporcionan una superficie procoagulante que permite la activacióndel factor N y de la protrombina. La aparición de lugares de unión los factores de la coagulaciónestá asociada a la e(posición de fosfatidilserina en la capa e(terna de la membrana plasmáticay a la formación de peque)as vesículas membranares %micropartículas" a partir de la superficiede la membrana.

Las micropartículas pueden distinguirse de las plaquetas por citometría de flujo combinando lautilización de un discriminador de tama)o y un marcador para un antígeno específico de laplaqueta. La unión de los factores >666a y >a a las plaquetas y micropartículas puede serdetectada usando anticuerpos monoclonales específicos para estos factores. 7ara la deteccióndel factor >a se ha utilizado el anticuerpo >BCD y para el factor >666a el anticuerpo -2C DB.

La e(presión de fosfatidilserina tanto en las micropartículas como en las plaquetas activadaspuede ser detectada directamente por la unión de ane(ina,> conjugada con un fluorocromo%'ig. G". Esta proteína en presencia de concentraciones fisiológicas de calcio se une

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específicamente y con gran afinidad a los fosfolípidos aniónicos que pasan de la capa interna ala capa e(terna de la membrana tras la activación plaquetariaB+BG.

1 0ar!metros intracelulares bioquímicos de activación-

En las respuestas bioquímicas que median la activación están implicadas numerosasalteraciones intracelulares detectables y cuantificables por citometría de flujo. La aplicación dela citometría de flujo al estudio de estos mecanismos de transducción de la se)al está limitadapor la posibilidad de marcar con un colorante fluorescente específico las moléculas a analizar.

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La cinética de las variaciones de 3aBQ intraplaquetario inducidas por diferentes agonistas sehan analizado por citometría de flujo y por espectrofluorimetría. ?ientras que mediante laespectrofluorimetría se obtiene un valor promedio de la respuesta de todas las células de lamuestra analizada la citometría de flujo permite clasificar la población seg&n las respuestas encélulas individuales y distinguir subpoblaciones que responden de modo diferente. sí se hademostrado que algunas células presentaban respuesta má(ima a +*R de la dosis saturantede trombina mientras que otras no respondían completamente. Esta fracción no estimuladaera con todo capaz de responder a dosis más elevadas de trombinaBMCC.

Los fluorocromos 23E3'C y 89A',-C+ ofrecen la posibilidad de medir el p= intracelular. Lascélulas mantienen su p= intracelular %p=i" en un estrecho rango de valores. 8in embargo seproducen cambios en el p=i en respuesta a la se)alización celular. Las mencionadas sondas

de p= son ácidos débiles con pPs pró(imos a D* y sus formas protonadas tienen diferentesespectros de emisión de la base conjugada. ?idiendo el cociente de las dos emisionesresultantes se obtiene una se)al proporcional al p=i e independiente del contenido intracelulardel fluorocromo %'ig. F". Las formas aceto(imetil ester %?" de los fluorocromos penetran en lascélulas intactas y son hidrolizadas por esterasas inespecíficas intracelulares para generar elfluorocromo libre retenido en el interior celular CC. En diversos estudios de espectrofluorimetríautilizando 23E3' se observó un incremento del p=i en plaquetas estimuladas con trombinaCG,CF.

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La polimerización de la actina globular %:,actina" en actina filamentosa %',actina" es uno de losacontecimientos más tempranos de la activación de la plaqueta y está implicada en el cambiode forma la centralización de los gránulos y la retracción del coágulo. La ',actina puede serdetectada utilizando como sondas la falacidina o faloidina fluorescentes %'igura M". 8iguiendoesta apro(imación $da et al.CM lograron determinar el contenido en ',actina por citometría deflujo en plaquetas mantenidas a diferentes temperaturas estimuladas con 57 y adrenalina yen presencia de citocalasina un inhibidor de la polimerización de actina. En paraleloefectuaron mediciones de la concentración de 3aBQ citosólico y evaluaron la e(presión de 7,selectina.

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La mepacrina ha sido utilizada en algunos estudios como indicativa de tinción y secreción delos gránulos densos*.

$tros marcadores intracelulares potenciales de activación plaquetaria para los cuáles no hayreferencias de su estudio por citometría de flujo son los cambios de potencial de membranacitoplasmática-B y mitocondrial y la producción de radicales libres y peró(ido de hidrogenoC,+.

$n!lisis citom'trico del proceso de trombopoyesis

En condiciones caracterizadas por un elevado recambio de plaquetas como en la p&rpuratrombocitopénica idiopática se observa un incremento de plaquetas reticuladas en circulación.Las plaquetas reticuladas por analogía con los reticulocitos eritroides representan lassubpoblación plaquetaria más joven. Estas plaquetas recién liberadas de la medula óseasiguen conteniendo A9 y pueden ser distinguidas de las plaquetas maduras por citometría deflujo tras el marcaje fluorescente del contenido en A9. Los colorante fluorescentes naranja detiazol y auramina $ cuya fluorescencia aumenta después de la unión al A9 han permitido elanálisis por citometría de flujo del contenido en A9 de células anucleadas incluyendo lasplaquetas.

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indirectamente tras la incubación con plaquetas problema para el IscreeningI de anticuerposdirigidos contra la plaqueta.

5entajas y limitaciones de la citometría de flujo en el estudio de las plaquetas

Ventajas

La citometría de flujo permite determinar rápidamente características específicas de un grann&mero de células individuales. En comparación con otras metodologías la citometría de flujotiene la ventaja de permitir analizar poblaciones plaquetarias en que las plaquetas sonevaluadas una a una posibilitando la identificación de subpoblaciones mientras que los otrosmétodos reflejan la activación media de la población plaquetariaD.

Esta metodología permite evaluar tanto el estado de activación de las plaquetas circulantescomo la reactividad plaquetaria. En la determinación de la activación plaquetaria in vivo lasdificultades resultantes de la posible activación e( vivo pueden ser evitadas por la fijacióninmediata de las muestras de sangre antes de proceder a su manipulación. sí pueden serdetectadas subpoblaciones parcialmente activadas menores del -R.

 ctualmente se dispone comercialmente de muchos anticuerpos y fluorocromos que permitendetectar numerosos parámetros plaquetarios incluyendo diversos marcadores de activación.Los nuevos anticuerpos monoclonales desarrollados contra nuevos epítopos funcionalespueden ser incorporados fácilmente en los ensayos.

Los estudios de citometría requieren peque)as cantidades de muestras que pueden sersangre entera suspensiones de plaquetas lavadas filtradas en gel o 7A7.

Los estudios clínicos en que se utilizan suspensiones de plaquetas aisladas tal como otrosensayos de la función plaquetaria son potencialmente susceptibles de activación artefactual invitro resultante de los procedimientos de separación necesarios. En contraste en el análisis desangre entera la manipulación es mínima evítando la activación artefactual y la posible pérdidade subpoblaciones plaquetarias.

i!itaciones

Los citómetros de flujo son aparatos muy caros no estando a&n disponibles en muchoslaboratorios principalmente en los de investigación básica.

La citometría de flujo no permite con facilidad una cuantificación absoluta de los antígenosdetectados. 8in embargo hay métodos actualmente disponibles para la cuantificación deln&mero de anticuerpos unidos por célula.

Las plaquetas son muy peque)as y los se)ales de '8 y 88 pueden no distinguirse bien deldebris. La se)al de fluorescencia también es más débil con respecto a marcajes fluorescentede otras células. 7or esa razón la adquisición de los datos debe de ser efectuada con

amplificación logarítmica. 8in embargo los citómetros más recientes presentan resolucionessuperiores que permiten distinguir y estudiar con gran e(actitud la población plaquetaria.

En ocasiones hay dificultades en preservar el marcador por ejemplo la 7,selectina no sepreserva bien especialmente si es fijada.

La citometría de flujo solo mide la función de las plaquetas circulantes mientras que losensayos plasmáticos de S,1: y 7' y los ensayos de metabolitos de 1(B plasmáticos yurinarios también reflejan la activación plaquetaria en la pared del vaso y de las plaquetasrecién separadas de circulación.

La elección de los parámetros adecuados para analizar el fenómeno de interés y la valoraciónde los resultados teniendo en cuenta las condiciones e(perimentales subyacentes serán

posiblemente las principales limitaciones de la citometría de flujo en el estudio de la funciónplaquetaria.

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Citometría de flujo en el estudio clínico de las plaquetas- $plicaciones al .iagnóstico

La citometría de flujo proporciona una apro(imación multiparamétrica para caracterizar laspropiedades estructurales y funcionales de las plaquetas en condiciones normales. Estopermite establecer los rangos de normalidad reconocer las plaquetas con comportamiento

anormal y en algunos casos determinar el mecanismo de sus alteraciones. El n&mero elevadode plaquetas analizado normalmente en una muestra permite la detección y cuantificación desubpoblaciones alteradas que representan una peque)a fracción de la población total.

En los &ltimos a)os la citometría de flujo empieza a ser aplicada como técnicamultiparamétrica para analizar el fenotipo y la función plaquetaria incluyendo la activación. 8inembargo los aspectos metodológicos y la elección de los parámetros biológicos adecuadosestán todavía en discusión.

"n!unofenotipaje de tro!bastenias

La citometría de flujo puede ser usada junto con anticuerpos monoclonales para cuantificar eln&mero de complejos :766b#666a y :76b#6N#> y así evaluar la homozigosia o heterozigosia en la

enfermedad de 2ernard 8oulier y en la 1rombastenia de :lanzmannF

. 7ermite ademásdistinguir entre algunas variantes de trombastenia. 7or ejemplo las plaquetas de indivíduos conla variante IcamI de la trombastenia contienen cantidades casi normales de :766b#666a. 8inembargo se agregan deficientemente. Estas plaquetas no unen el anticuerpo 73,- y tampocose unen al anticuerpo contra L628 tras la adición de péptidos que contienen la secuencia rg,:ly,spD.

 Ano!alías funcionales

Las disfunciones plaquetarias incluyen las hereditarias y adquiridas. Estas anomalías soncausas comunes de hemorragias especialmente asociadas a traumatismos y cirugía.

La funcionalidad de las plaquetas se evalua tradicionalmente mediante ensayos de

agregometría y adhesión. 8in embargo estos ensayos solo indican si la función está inhibida.7or citometría de flujo pueden ser analizados varios parámetros bioquímicos de activacióninducida por agonistas apropiados proporcionando una información más especifica. dicionalmente la adhesion y agregación pueden ser seguidas por citometría de flujo midiendola disminución de concentración de plaquetas individuales o la formación de agregados a travésde cambios de las se)ales de '8 y 88 de partículas positivas para un marcador específico dela plaqueta %por ejemplo el 35-".

Las plaquetas de pacientes con trombastenia de :lanzmann presentan agregación reducida oausente en respuesta a todos los agonistas mientras que en el síndrome de 2ernard 8oulierlas plaquetas presentan adhesión anormal. La citometría de flujo además de constituir latécnica de elección para la detección de la e(presión alterada o deficiente de glicoproteinas enla superficie plaquetaria permite investigar los defectos funcionales consecuencia de las

mismas.

La deficiencia hereditaria del acervo de almacenamiento de los gránulos densos es una causarelativamente com&n de hemorragias moderadas que no puede ser diagnosticada fiablementepor un ensayo normal de agregometría. El método convencional para establecer el diagnósticoes marcar las plaquetas con el colorante fluorescente mepacrina especifico para losnucleotidos de adenina y medir la fluorescencia de las plaquetas por microscopía. Este tipo deensayo no son los ideales para la práctica clínica porque son tediosos subjectivos y e(aminanun peque)o n&mero de plaquetas. En contraste esta deficiencia del almacenamiento de losgránulos densos puede ser detectada con precisión por un ensayo sencillo y rápido porcitometría de flujo. Los resultados presentan una buena correlación con aquellos obtenidos pormétodos de microscopía óptica de fluorescencia pero la detección es mejorada porque lafluorescencia se determina en un gran n&mero de plaquetas.

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El síndrome de plaquetas grises caracterizado por trombocitopenia y una marcada disminucióno ausencia de gránulos a normales puede ser diagnosticada por una baja e(presión de 7,selectina o trombospondina en la superficie plaquetaria tras la estimulación con agonistasfuertes.

La citometría de flujo también puede ser informativa en el estudio del síndrome de 8cott unadeficiencia en la actividad procoagulante de la plaqueta. Las plaquetas de estos individuos sondeficientes en la formación de micropartículas y en la e(presión de lugares de unión para elfactor >a tanto en las micropartículas como en las plaquetas. En contrapartida la activaciónde :7 66b#666a y la e(presión de 7,selectina son normalesD.

Las plaquetas hiperreactivas y# o activadas in vivo asociadas a la hipercoagulabilidad ytrombosis son también una categoría de plaquetas con función anormal a la cual se haráreferencia más adelante.

 Aloanticuerpos y autoanticuerpos

Las trombocitopenias %disminución de la cifra de plaquetas sanguíneas por debajo de

-+*(-*M#L" pueden ser producidas por diversos factores etiológicos. Entre ellos los másfrecuentes son los de naturaleza inmunitaria. En enfermedades como la trombocitopeniaautoinmune %16" la trombocitopenia neonatal aloimune %19" p&rpura trombocitopeniapostransfusional %717" refractariedad a las transfusiones de plaquetas y en la trombocitopeniainducida por fármacos los anticuerpos anti,plaquetarios son los principales responsables de laeliminación acelerada de plaquetasM.

Los aloanticuerpos se dirigen contra determinantes antigenicos alotípicos que están presentesen la membrana plaquetaria de algunos individuos y ausentes en la de otros. Estos incluyen losanticuerpos para los aloantígenos clasificados en el sistema =7 %=uman 7latelet ntigen" yanticuerpos contra moléculas del sistema =L. 7or ejemplo el antígeno =7,- se encuentraimplicado en la mayoría de las 19 y 717M.

Los autoanticuerpos reconocen determinantes antigénicos que se e(presan en las plaquetas detodos aquellos individuos que no presentan anomalías en las :7s de la membrana plaquetariaLa mayoría de los anticuerpos en pacientes con p&rpura trombocitopénica autoinmunereconocen uno o más epítopos localizados en :766b#666a. $casionalmente estos anticuerposreconocen epítopos en :76b :76a etc.M.

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Estas anomalías pueden ser investigadas convenientemente por citometría de flujoestimulando las plaquetas con cantidades definidas de agonistas. La utilización de agonistastotalmente sintéticos y por eso altamente controlables como el 57 1A7s o los análogosestables del trombo(ano B permiten la activación in vitro con elevado grado dereproducibilidad. Estos ensayos pueden ser realizados en sangre entera diluída en condicionesno agregantes posibilitando el análisis de grados altos de activación sin la pérdida de

subpoblacionesG

. 6ncluso la activación inducida por la trombina uno de los activadoresfisiológicos mas importantes puede ser determinada directamente en sangre entera usando eltetrapéptido sintético glicil,L,prolil,L,arginil,L,prolina %:7A7". El :7A7 inhibe la polimerizaciónde fibrina y la agregación plaqueta,plaqueta++ permitiendo el análisis de plaquetas individuales.

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se beneficien de un tratamiento preventivo con otro agente antiplaquetario.

$# Control de calidad de plaquetas al!acenadas:

>arios estudios por citometría de flujo en los que se determinó la e(presión de 35GB7 35GC y:766b666a en plaquetas almacenados en el banco antes de la transfusión revelaron que se

produce activación plaquetaria dependiente del tiempoGBGC

. Estas alteraciones estáncorrelacionadas con cambios en la morfología plaquetaria y liberación de b,1:GB. 8e sugirió quela presencia de 35GB7 en la superficie de la plaqueta puede ser &til como una medida decontrol de calidad basado en correlaciones entre la e(presión basal de 35GB7 en la superficieplaquetaria y en las plaquetas almacenadas en el banco y por otra parte con la cifra deplaquetas posttransfusión la sobrevida plaquetaria y el aclaramiento del receptor de lasplaquetas 35GB7 positivasGB.

Las plaquetas almacenadas presentan defectos funcionales como se demostró por citometríade flujo puesto que durante el almacenamiento disminuye la movilización de 3aBQ citosólicoinducida por la trombina y se forma una subpoblación completamente insensibleC*.

 

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