Post on 18-Oct-2020
Aus dem Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
Direktor: Prof. Dr. R. Müller
Rolle des Onkoproteins Bmi-1 im Neuroblastom
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin
Dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von
Daniel Fehr
aus Ludwigshafen
Marburg, 2007
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am 30.08.2007. Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs. Dekan: Prof. Dr. B. Maisch Referent: PD Dr. W. Lutz Korreferent: Prof. Dr. E. Schultz
Meiner Familie gewidmet.
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 7
1.1 Das Neuroblastom 7 1.1.1 Histologie 7 1.1.2 Klinik 8 1.1.3 Diagnostik 9 1.1.4 Stadieneinteilung 10 1.1.5 Genetische Einflüsse 11 1.1.6 Therapie 12 1.1.7 Prognose 13
1.2 Die E2F-Transkriptionsfaktoren 13 1.2.1 Die E2F-Familie 14 1.2.2 p16/pRb als Tumorsuppressoren 16 1.2.3 E2F-1 als Onkogen und Tumorsuppressor 17 1.2.4 Funktionen von E2F in Neuroblastomen 18
1.3 Das Onkogen BMI1 18 1.3.1 Die Gruppe der Polycombproteine 19 1.3.2 Funktionen von Bmi-1 und Beziehung zum Zellzyklus 19 1.3.3 BMI1 als Zielgen von E2F-1 20 1.3.4 Kooperation zwischen Bmi-1 und Myc 21 1.3.5 BMI1-Expression in Neuroblastomen 22
2 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 23
3 MATERIAL UND METHODEN 24
3.1 Material 24 3.1.1 Zelllinien 24 3.1.2 Materialien für die Zellkultur 25 3.1.3 Fertige Lösungen und Chemikalien 26 3.1.4 Kits 26 3.1.5 Puffer 27 3.1.6 PCR und quantitative Realtime-PCR 28 3.1.7 Bakterienstämme 28 3.1.8 Plasmide 28 3.1.9 Oligonukleotide 28 3.1.10 Enzyme 29 3.1.11 Western Blot 30 3.1.12 Verbrauchsmaterial 31
3.2 Zellbiologische Methoden 31 3.2.1 Zellkultur 31 3.2.2 Einfrieren von Zellen 32 3.2.3 Auftauen von Zellen 32
3.3 Molekularbiologische Methoden 33 3.3.1 RNA-Extraktion 33 3.3.2 cDNA-Synthese 33 3.3.3 PCR 34 3.3.4 Quantitative Realtime-PCR 35 3.3.5 Agarose-Gelelektrophorese 36 3.3.6 Restriktionsendonukleasen-Verdau 37 3.3.7 Aufreinigung von PCR-Produkten 37 3.3.8 Ligation 38 3.3.9 Transformation von ultrakompetenten E.coli-Bakterien 39 3.3.10 Mini-Präparation von Plasmid-DNA 39 3.3.11 Maxi-Präparation von Plasmid-DNA 40 3.3.12 Sequenzierung 40 3.3.13 Transfektion 41 3.3.14 Herstellung und Expansion von Zellklonen 41 3.3.15 FACS-Analyse zur Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen 42
3.4 Methoden zur Analyse von Proteinen 43 3.4.1 Bradford-Assay 43 3.4.2 Luciferase-Assay 43 3.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von Proteinen 44 3.4.4 Western Blot 45
3.5 Geräte 46
3.6 Statistische Auswertungen 47
4 ERGEBNISSE 50
4.1 Funktionsprinzip der verwendeten Neuroblastom-Zelllinien 50 4.1.1 SK-N-SH-EP-Zelllinie 1A3 50 4.1.2 SK-N-SH-EP-Zelllinie TOR 50 4.1.3 SK-N-SH-EP-Zelllinie Tet21 50
4.2 Neuroblastomzellen mit induzierbarer Expression von Bmi-1 51 4.2.1 Klonierung von BMI1 in Tetrazyklin-regulierbare Vektoren 51 4.2.2 Das dominant negative BMI1-Allel 53 4.2.3 Untersuchung der Neuroblastom-Zelllinie Tet21 auf Induzierbarkeit durch Tetrazyklin 54 4.2.4 Transfektion und Selektion der Zelllinien TOR und Tet21 mit BMI1-tragenden Vektoren 55 4.2.5 Nachweis der Tetrazyklin-abhängigen Expression von Bmi-1 56
4.3 Induktion von Bmi-1 in induzierbaren Neuroblastomzellen 57 4.3.1 Tetrazyklin-abhängige Induktion von BMI1 auf mRNA-Ebene 57 4.3.2 Tetrazyklin-abhängige Induktion von Bmi-1 auf Proteinebene 59 4.3.3 Einfluss der erhöhten Bmi-1-Aktivität auf Zellzyklus und Apoptose 60 4.3.4 Expression von Bmi-1 im Verlauf des Zellzyklus 62
4.4 Induktion der Polycombproteine Hpc2 und Ring1 durch E2F-1 65
5 DISKUSSION 67
5.1 Etablierung eines Zellsystems mit induzierbarer Bmi-1-Expression 67
5.2 Bmi-1-Überexpression ohne Auswirkung auf S-Phase und Apoptose 69
5.3 Bmi-1-Expression verläuft unabhängig von Zellzyklus-Progression 70
5.4 Hpc2 und Ring1 werden nicht stabil durch E2F-1 induziert 72
5.5 Ausblick 73
6 ZUSAMMENFASSUNG 75
7 LITERATURVERZEICHNIS 77
8 ABKÜRZUNGEN 90
9 VERZEICHNIS DER AKADEMISCHEN LEHRER 93
10 DANKSAGUNG 94
1 Einleitung
1.1 Das Neuroblastom
Das Neuroblastom wurde 1863 zum ersten Mal von Rudolf Virchow beschrieben
und geht als häufigster extrakranieller, bösartiger Tumor des Kindesalters vom
sympathischen Grenzstrang, dem Nebennierenmark und den sympathischen
Ganglien aus (Klöppel, 2004). Obwohl bei rechtzeitiger Diagnose in vielen Fällen
im Säuglingsalter eine kurative Therapie durchgeführt werden kann, ist das
Neuroblastom insgesamt für etwa 15% der Todesfälle durch maligne, pädiatrische
Erkrankungen verantwortlich. Die Prävalenz der Neuerkrankungen beträgt 1/7000,
und die Inzidenz liegt bei 0,8-0,9 auf 100.000 Kinder unter 15 Jahren, wobei das
Durchschnittsalter des Erkrankungsbeginns bei 22 Monaten liegt (Miller, 1995;
Gurney, 1996; Brodeur, 1997a). Bei einer histopathologischen Untersuchung
fötaler Nebennieren Anfang der 1960er fand man jedoch 200mal häufiger ein sog.
Neuroblastoma in situ, als sich später klinisch manifestiert, so dass man von einer
relativ häufigen Anlage ausging, die sich in den meisten Fällen spontan
zurückbildet (Beckwith, 1963). Eine weitere Studie ergab 1974, dass es sich
hierbei um Reste der fötalen adrenalen Entwicklung handeln könnte, wobei eine
endgültige Klärung bis heute aussteht (Turkel, 1974).
1.1.1 Histologie
Die makroskopische Morphologie lässt einen lobulierten, weichen Tumor
erkennen, der leicht zerfällt, und dessen Schnittfläche durch Blutungen, Nekrosen
und Verkalkungen rotgrau erscheint. Die feingewebliche Untersuchung zeigt kleine
und unreife, basophile Tumorzellen mit schmalem Zytoplasmasaum, die durch
fibrovaskuläre Septen voneinander getrennt sind, sowie Neurofibrillen. Als Zeichen
der Malignität ist die Kern-Plasma-Relation zugunsten der hyperchromatischen
Kerne verschoben. Die Zellen, die sich typischerweise zu Pseudorosetten
zusammenlagern, lassen sich durch eine Färbemethode für die neuronspezifische
8 1 Einleitung
Enolase (NSE) darstellen, wobei eine weitere Charakterisierung durch bestimmte
Antikörper möglich ist (Bachmann, 1990; Klöppel, 2004). Das unreife
Neuroblastom kann ausreifen, so dass sich neben unreifen auch reife Zellen
finden. Bei diesem Ganglioneuroblastom wird die Prognose aber weiterhin durch
die unreifen Zellen bestimmt. In einigen Fällen reift das Neuroblastom auch
vollständig zu einem Ganglioneurom aus, das als gutartig zu werten ist
(Bachmann, 1990; Stallmach, 2004).
Abbildung 1.1: Histologisches Bild eines Neuroblastoms. Lockere Ansammlungen differen- zierter, kleiner Neuroblasten bilden sog. Pseudorosetten (Pfeil).
1.1.2 Klinik
Pränatal werden Neuroblastome gelegentlich zufallsbedingt bereits bei der
Sonographie während der Spätschwangerschaft diagnostiziert. Ein weiterer,
bedeutender Anteil symptomloser Kinder wird im Rahmen der
Vorsorgeuntersuchungen entdeckt. Sind bereits Symptome vorhanden, so teilt
man diese in lokale und allgemeine ein (Lentze, 2003).
Lokalisierte Beschwerden äußern sich neben auffälligem Tastbefund abhängig von
der Tumorausbreitung beispielsweise in Bauch- und Halsschmerzen, Obstipation
oder Durchfall. Respiratorischer Stridor mit Husten und Dysphagie oder
therapieresistente Bronchitiden und Pneumonien sind Hinweise auf den Sitz eines
1.1 Das Neuroblastom 9
Tumors im hinteren Mediastinum. Bei Komprimierung des Rückenmarks durch das
Neuroblastom, was bei 15% der betroffenen Kinder der Fall ist, kommt es zu
neurologischen Ausfällen, die bis zur kompletten Querschnittssymptomatik reichen
können. Die Manifestation einer arteriellen Hypertonie bei einem Teil der Patienten
ist durch die erhöhte Katecholaminproduktion des neuroendokrinen Tumors
bedingt.
Allgemeine Beschwerden, die durch Neuroblastome hervorgerufen werden
können, sind v.a. Knochenschmerzen, Kopfschmerzen, Fieber und generalisierte
Lymphknotenschwellungen. Auch zur sog. B-Symptomatik zählende klinische
Auffälligkeiten wie Gewichts-, Leistungs- und Appetitverlust sowie allgemeines
Unwohlsein kennzeichnen den konsumierenden Tumor. Bisweilen zeigt sich die
fortgeschrittene Erkrankung außerdem durch beidseitige Vorwölbung des
Orbitainhaltes sowie Einblutungen im Lidbereich (Brodeur, 1997a; Wargalla-Plate,
1995; Klöppel, 2004; Lentze, 2003).
1.1.3 Diagnostik
Die Labordiagnostik zeigt bei disseminiertem Befall eine erhebliche Erhöhung der
Blutkörpersenkungsgeschwindigkeit und eine normochrome Anämie. Die
Laktatdehydrogenase und das Ferritin im Serum, sowie Dopamin,
Homovanillinsäure und Vanillinmandelsäure im 24-h-Urin sind erhöht, wobei die
beiden erstgenannten Parameter weniger zur Sicherung der Diagnose, sondern
eher als prognostische Faktoren bzw. als Verlaufsparameter anzusehen sind
(Brodeur, 1997a; Stallmach, 2004). Desweiteren ermittelt man die
Serumkonzentration der neuronspezifischen Enolase (NSE), die auch als
Tumormarker bei kleinzelligen Lungentumoren eingesetzt wird. Eine
Blutdruckerhöhung findet sich nicht bei allen Patienten (Wargalla-Plate, 1995).
Mit Hilfe der Sonographie lässt sich der Tumor des Nebennierenmarks meist
deutlich von der Nebenniere abgrenzen und das Abdomen auf Metastasen in
Leber und Milz untersuchen. In der Computer- und Kernspintomographie findet
man eine Raumforderung, die von der Nebenniere ausgeht bzw. im
10 1 Einleitung
retroperitonealen Bereich lokalisiert ist (Lentze, 2003). Die unscharfe Außenkontur
erscheint durch Nekrosen und Blutungen inhomogen, während man in der
Binnenstruktur Verkalkungen erkennen kann. Die Einschätzung zur Ausdehnung
und Beziehung des Tumors zu Nachbarorganen sind ebenfalls präoperativ und
prognostisch von großer Bedeutung. Desweiteren führt man Lumbalpunktionen zur
Liquordiagnostik, Knochenmarkspunktionen und Technetium- bzw. Meta-
Jodobenzylguanidin-Szintigraphien durch (Bachmann, 1990; Brodeur, 1997a).
Abbildung 1.2: Deutlich erkennbare, inhomogene Raumforderung der rechten Nebenniere als Ausdruck des tumorösen Wachstums (MRT, T2-Wichtung, transversal).
1.1.4 Stadieneinteilung
Die Einteilung der Krankheitsstadien richtet sich nach klinischen und anatomischen
Gegebenheiten und lässt Rückschlüsse auf die Prognose zu (Brodeur, 1988).
Kann man den Tumor operativ vollständig entfernen, spricht man vom Stadium I,
während er im Stadium II die Begrenzung des Entstehungsorgans bereits
überschritten hat. Findet sich der Tumor auf beiden Seiten der Mittellinie, liegt ein
Stadium III vor, bei Metastasierung bzw. Generalisation ein Stadium IV. Eine
Sonderform des Stadium IV stellt das Stadium IV-S dar, das trotz Knochenmarks-,
Leber- oder Hautbefall eine gute Prognose aufweist und meist bei Kindern im
ersten Lebensjahr auftritt.
1.1 Das Neuroblastom 11
Die Patientenzahlen verteilen sich wie folgt auf die verschiedenen Stadien
(Wargalla-Plate, 1995; Matthay, 1998):
I 15,5%
II 11,8%
III 20,9%
IV 43,6%
IV-S 8,3%
1.1.5 Genetische Einflüsse
Die hereditäre Form des Neuroblastoms tritt in 30-40% in Zusammenhang mit
einer Deletion auf Chromosom 1 (1p36.3) und eventuellem Verlust von
Tumorsuppressorgenen in diesem Bereich auf (Fong, 1989). Hier befindet sich
auch das Protein von CHD5, einem Mitglied der CHD-Familie, das u.a. an
posttranlationellen Chromatinmodifikationen beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden,
dass in 137 Neuroblastomen die CHD5-Expression deutlich erniedrigt oder nicht
messbar war. Darüber hinaus ergab sich eine deutlich Korrelation mit einer 1p-
Deletion und fortgeschrittenem Krankheitsstadium (White, 2005; Thompson, 2003).
Dieser Verlust an genetischer Information (LOH = loss of heterozygosity) korreliert
entsprechend mit einer schlechten Prognose der Patienten (Christiansen, 1994;
Brodeur, 1997b).
Neben einer vermuteten familiären Veranlagung durch autosomal-dominante
Vererbung (Maris, 1997; Knudson, 1972) ist außerdem der DNA-Gehalt der
Tumorzellen von klinischer Bedeutung, wobei hyperploide Neuroblastome meist in
niedrigeren Stadien vorkommen und besser auf die Chemotherapie ansprechen
(Christiansen, 1998; Brodeur, 1997a).
Bei etwa 25% aller Neuroblastome kann eine Amplifikation des Protoonkogens
MYCN beobachtet werden, was regelhaft mit einem fortgeschrittenen Stadium und
einer schlechten Prognose für die Patienten einhergeht (Brodeur, 1984). Bei N-
Myc handelt sich um ein Mitglied der Myc-Familie, die als bedeutende
Transkriptionsfaktoren in die Onkogenese involviert sind (Hurlin, 2005). Im Stadium
12 1 Einleitung
IV-S bedeutet eine MYCN-Amplifikation ein hohes Risiko für eine baldige
Progression zum Stadium IV und damit eine Verringerung der 5-Jahres-
Überlebensrate (5-JÜR).
Einen weiteren Einfluss auf den Verlauf der Neuroblastom-Erkrankung hat die
Expression des Neurotrophin-Rezeptor-Gens TRKA. An diesen Rezeptor bindet
der Nervenwachstumsfaktor NGF, der in Zusammenhang mit der Induktion der
Zelldifferenzierung zu stehen scheint. Eine hohe Amplifikation von TRKA wirkt sich
positiv auf den Verlauf aus, zumal die Expression mit anderen Prognose-
verbessernden Parametern wie niedrigem Erkrankungsalter, fehlender MYCN-
Amplifikation und begrenzter Tumorausdehnung einhergeht (Castleberry, 1997).
1.1.6 Therapie
Bis auf das Stadium IV, wo Risikofaktoren nur die Prognose, nicht aber die
Therapie bestimmen, erfolgt die Behandlung der Neuroblastom-Patienten in den
Stadien I-III und IV-S nach Einteilung in definierte Risikogruppen nach den
Richtlinien der Neuroblastomstudie NB 97 (Laufzeit: 30.09.1998 - 30.09.2004). Für
die Stadien I-III gelten MYCN-Amplifikation und ein Patientenalter von >1 Jahr bei
Diagnosestellung als Risikofaktoren, wohingegen beim Stadium IV-S eine
Thrombozytenzahl von <150/nl und ein schwerstkranker Allgemeinzustand die 5-
JÜR am stärksten beeinflussen. Abhängig von der Anzahl der Risikofaktoren wird
eine Einteilung der Patienten in die Gruppen (Standard-, mittleres und Hochrisiko)
vorgenommen, um ihnen dann die entsprechende Therapie zuteil werden zu
lassen (Brodeur, 1997c). Die Behandlung reicht von Null- bzw. Minimaltherapie bei
Fehlen einer MYCN-Amplifikation im Stadium I bis hin zu operativen Eingriffen,
Hochdosischemotherapie und Megatherapie mit autologer Stammzellrekonstitution
und monoklonalen Anti-GD-2-Antikörpern als Konsolidierungsbehandlung im
Stadium IV. Auch eine Megavolttherapie von 15-30 Gy auf das Tumorbett
abhängig von Patientenalter, Tumormasse und -lokalisation ist möglich
(Bachmann, 1990). Laut Neuroblastomstudie NB 97 wurden 98% aller Patienten in
1.2 Die E2F-Transkriptionsfaktoren 13
der Bundesrepublik nach diesen einheitlichen Richtlinien kooperativ multizentrisch
behandelt (Brodeur, 1997a; Wargalla-Plate, 1995; Berthold, 2003).
1.1.7 Prognose
Durch moderne, stadiengerechte und nach international vereinbarten Protokollen
durchgeführte Behandlungsstrategien konnten in den letzten 10 Jahren Fortschritte
bei der Therapie des Neuroblastoms insbesondere im Stadium IV erzielt werden.
Dennoch liegt die Überlebenswahrscheinlichkeit für dieses Stadium immer noch
bei ca. 20%, während sie in den niedrigeren Stadien bis zu 90% beträgt
(Castleberry, 1997). Neben genetischen Parametern spielt vor allem das Alter der
Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine große Rolle bei der Prognose.
So überleben insgesamt 72% aller Patienten mit einem Erkrankungsalter unter 12
Monaten, 28% aller Patienten mit einem Erkrankungsalter zwischen 12 und 24
Monaten und nur 12% der Patienten, die über 24 Monate alt sind (Breslow, 1971).
1.2 Die E2F-Transkriptionsfaktoren
Seit ihrer Identifizierung als Bindungspartner und Aktivator des adenoviralen E2-
Genpromotors im Jahre 1986 wurden fortwährend neue Mitglieder der E2-
Faktor(E2F)-Familie mit teils synergistischen, teils antagonistischen
transkriptionellen Eigenschaften entdeckt (Dyson, 1998; Kovesdi, 1986). Sie sind
Effektoren im Retinoblastoma-Tumorsuppressor-Signalweg (pRb), spielen eine
bedeutende Rolle in der Zellteilung und sind bislang als positive Regulatoren von
Genen angesehen worden, die für die DNA-Synthese benötigt werden. Darüber
hinaus üben sie jedoch auch großen Einfluss auf die Proliferation und
Differenzierung von Zellen aus und besitzen neben ihrer Fähigkeit, den
programmierten Zelltod auszulösen, sowohl onkogenes als auch
tumorsuppressives Potential (Helin, 1998; Nevins, 1998; DeGregori, 2002;
Trimarchi, 2002).
14 1 Einleitung
1.2.1 Die E2F-Familie
Nach derzeitigem Wissensstand besteht die E2F-Familie bei Säugetieren aus 8
verschiedenen Transkriptionsfaktoren, E2F-1 bis E2F-8, die mit Ausnahme von
E2F-7 und E2F-8 in einem heterodimeren Komplex mit einem Mitglied der DP-
Familie, DP1 bis DP4 (DP2Mensch entspricht DP3Maus), die Aktivität von Promotoren
regeln, die über eine entsprechende E2F-Bindedomäne verfügen (Milton, 2006;
Dyson, 1998; Di Stefano, 2003). E2F-1 bis E2F-5 können gemäß ihrer
zellzyklischen Eigenschaften und der Interaktion mit ihren negativen Regulatoren,
den sog. Pocketproteinen (pRB, p107 und p130) in 2 Untergruppen eingeteilt
werden. E2F-1 bis E2F-3a sind starke transkriptionelle Aktivatoren, die
ausschließlich mit pRB interagieren und Zellzyklus-ahängig exprimiert werden. Sie
sind in der Lage, Zellen in die Apoptose zu treiben, wobei diese Fähigkeit
offensichtlich auf der E2F-1-Aktivität beruht (Denchi, 2005). Im Gegensatz dazu
besitzen E2F-4 und E2F-5 vorwiegend reprimierende Eigenschaften, zumal sie in
G0/G1-Zellen hauptsächlich im Nukleus lokalisiert und dort an Pocketproteine
gebunden sind. Während E2F-4 alle 3 Pocketproteine an sich binden kann,
interagiert E2F-5 lediglich mit p130 (Nevins, 1998; Müller, 1997; Sardet 1995;
Verona, 1997). Allgemein spielen E2F-1 bis E2F-3a eine große Rolle im Fortlauf
des Zellzyklus, E2F-4 und E2F-5 dagegen sind für die Differenzierung von Zellen
von Bedeutung. Der Transkriptionsfaktor E2F-3b entstammt dem gleichen
Genlokus wie E2F-3a, unterscheidet sich von diesem jedoch in seinem N-
Terminus, so dass er wie E2F-4 und E2F-5 die Aufgabe eines transkriptionellen
Repressors übernimmt (He, 2000; Leone, 2000).
Die Transkriptionsfaktoren E2F-6 bis E2F-8 treten ebenfalls durch reprimierende
Eigenschaften in Erscheinung, wobei sie aber weder über eine entsprechende
Transaktivierungsdomäne noch eine Bindestelle für die Pocketproteine an ihrem
Carboxy-Terminus verfügen. Sie unterdrücken die Transkription in Verbindung mit
der Grupppe der Polycombproteine und verhindern bzw. verzögern den Fortlauf
des Zellzyklus, wobei E2F-7 und E2F-8 eine auffallende Ähnlichkeit aufweisen
(Logan, 2005; Trimarchi, 2002). Wie auch die anderen E2F bildet E2F-6 ein
1.2 Die E2F-Transkriptionsfaktoren 15
Heterodimer mit DP1 bis DP4 (Gaubatz, 1998; Morkel, 1997; Trimarchi, 1998),
während E2F-7 und E2F-8 über keine DP-Bindestellen verfügen und über ihre
beiden DNA-Bindedomänen DP-unabhängig an die DNA binden (de Bruin, 2003;
Logan, 2004; Di Stefano 2003).
Die Aktivität von E2F kann über verschiedene Mechanismen gesteuert werden
(Muller, 2000). Die bislang am detailliertesten untersuchte Möglichkeit ist jedoch
die direkte Bindung von E2F-1 bis E2F-5 durch die Pocketproteine pRB, p107 und
p130, was zur Unterdrückung von Transaktivierung (Dynlacht, 1994) und Apoptose
(Qin, 1994; Hsieh, 1997) sowie zum Schutz vor Degradierung (Hateboer, 1996;
Hofmann, 1996) führt. Heterodimere aus Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen
(CDK) lösen während der G1-Phase durch Phosphorylierung die Pocketproteine
von den E2F, die dann ihre Zielgene aktivieren können, wobei hier CDK4 und
CDK6 eine herausragende Rolle in der Phosphorylierung von pRB spielen. Der
ebenfalls durch CDK katalysierte Übergang von einer Phase des Zellzyklus zur
nächsten wird bei Säugetieren zudem durch die Aktivität zweier verschiedener
Familien von CDK-Inhibitoren (CDKI) kontrolliert. Die Mitglieder der ersten Familie
(p21, p27 und p57) binden an verschiedene Cyclin/CDK-Komplexe, während sich
die Mitglieder der zweiten CDKI-Familie (p15, p16Ink4a, p18 und p19ArfMaus bzw.
p14ArfMensch) nur CDK4 und CDK6 anlagern (Sherr, 1995). Die Deregulierung einer
der genannten und miteinander verketteten Komponenten führt häufig zur
Deregulierung der nächsten. Die Störung dieser Abfolge des pRB-Signalwegs und
Mutationen finden sich sehr häufig in menschlichen Tumorzellen und werden
mittlerweile als eine der Vorbedingungen für die Tumorentstehung angesehen
(Sherr, 1996).
Die derzeit am besten verstandene Aufgabe der E2F ist die Regulierung des G1/S-
Übergangs während des Zellzyklus. Dies ist möglich durch die transkriptionelle
Aktivierung von Genen, die für den Eintritt in die S-Phase notwendig sind.
Komplexe aus reprimierenden E2F und Pocketproteinen herrschen in der G0- und
der frühen G1-Phase vor, während in der späten G1-Phase aktivierende E2F die
Transkription von Cyclin-abhängigen Kinasen steuern, die zur Phosphorylierung
16 1 Einleitung
der Pocketproteine und damit zur Auflösung der o.g. Komplexe führen (DeGregori,
2002; Stevaux, 2002; Trimarchi, 2002).
1.2.2 p16/pRb als Tumorsuppressoren
p16Ink4a ist Mitglied der CDKI-Familie, die ausschließlich die Cyclin-abhängigen
Kinasen 4 und 6 inhibieren, die ihrerseits als Dimere mit Cyclinen durch
Phosphorylierung und damit Lösung von pRb die Aktivierung der E2F und ihrer
Zielgene zur Folge haben. Somit ist p16Ink4a durch die Inhibierung in der Lage,
Zellen am Eintritt in die S-Phase zu hindern und damit auch ihre Proliferation zu
unterdrücken. Die häufige Störung des p16Ink4a-Cyclin D1/CDK4-pRb-Pfads als
Ursache menschlicher Tumoren kommt entweder durch den Funktionsverlust von
p16Ink4a oder pRb oder die Überexpression einer der beiden Proto-Onkogene
Cyclin D1 oder CDK4 zustande (Weinberg, 1995; Sherr, 1996; Ruas, 1998).
CDK4 Cyclin D1
pRb
p16Ink4a
E2F1-4 DP1-4E2F-Zielgene
Abbildung 1.3: E2F als integraler Bestandteil des p16/Rb-Signalwegs. p16 inhibiert das CDK4-Cyclin D1-Dimer und damit die Phosphorylierung von pRb. Unphosphoryliert kann das Pocketprotein pRb an die heterodimeren Komplexe aus E2F1-4 und DP1-4 binden und die Transkription der E2F-Zielgene unterdrücken.
1.2 Die E2F-Transkriptionsfaktoren 17
Ein weiterer wesentlicher Grund für die Entstehung von Tumoren ist die
Ausschaltung des Tumorsuppressorgens p53, beispielsweise durch die fehlende
Abbau- oder Inaktivierungshemmung aufgrund einer gestörten Expression von
p19Arf (Jacobs, 1999a; Weber, 1999; Pomerantz, 1998), da p53 in seiner
Eigenschaft als Transkriptionsfaktor den regulären Ablauf des Zellzyklus
verhindern oder als Antwort auf eine DNA-Schädigung Apoptose induzieren kann
(Ko, 1996; Levine, 1997; Giaccia, 1998). Das enge Ineinandergreifen von pRb- und
p53-Effekten wird bei der Beobachtung deutlich, dass ein Funktionsverlust von
pRb zwar den p53-vermittelten Arrest von Zellen in der G1-Phase umgehen kann
(Demers, 1994; Slebos, 1994), jedoch derselbe Verlust auch zur E2F- und p53-
induzierten Apoptose führt (Wu, 1994).
1.2.3 E2F-1 als Onkogen und Tumorsuppressor
E2F-1 als Mitglied der aktivierenden E2F verhält sich, wie in Transformations-
Assays gezeigt werden konnte, wie ein übliches Onkogen (Bell, 2004). Die
Überexpression von E2F-1 führt in transgenen Mäusen zu Tumorwachstum
(Pierce, 1998), während andererseits E2F-1-Knockout-Mäuse eine große
Bandbreite an Tumoren wie Lymphome und Adenokarzinome der Lunge
entwickeln (Yamasaki, 1996). Gemäß der Rolle, die E2F-1 im Fortlauf des
Zellzyklus spielt, lässt sich seine Onkogenität nachvollziehen; wie E2F-1 jedoch
gleichzeitig eine tumorsuppressive Wirkung haben kann, ist weniger leicht zu
verstehen. Zwei Modelle versuchen, dieses Paradoxon zu erklären: 1. Die E2F-
Bindedomänen können sowohl die Aktivierung als auch die Repression von E2F-1-
Zielgenen vermitteln. Hierbei führt E2F-1 das gebundene pRB an die DNA heran
und erlaubt so pRB, die Expression von bestimmten, kritischen Zielgenen zu
unterdrücken. 2. Dereguliertes E2F-1 induziert Apoptose in Zellen in
Tumorvorstadien. Die Inaktivierung von E2F-1 könnte somit im Umkehrschluss
eine Tumorentstehung fördern, indem es das Überleben von unnatürlich
proliferierenden Zellen zulässt (Yamasaki, 1998; Dyson 1998).
18 1 Einleitung
1.2.4 Funktionen von E2F in Neuroblastomen
Etwa 25% aller Neuroblastome weisen eine Amplifikation von MYCN auf, was zu
einer deutlich verschlechterten Prognose dieser Patienten führt (Savelyeva, 2001;
Brodeur, 1984). Die MYC-Gene in ihrer Gesamtheit kodieren für eine Gruppe von
Transkriptionsfaktoren, die Teil eines Netzwerkes sind, welches einen
bedeutsamen Einfluss auf die Tumorentstehung hat. Hierzu zählen die
Zellzykluskontrolle, Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren und Apoptose, so dass
die Überexpression der Myc-Gene eine zentrale Rolle in der Entstehung vieler
verschiedener Tumoren spielt (Lutz, 2002; Eisenman, 2001). Die
Transkriptionsfaktoren E2F-1 bis E2F-3 aktivieren in Neuroblastomzellen über
E2F-Bindedomänen und in Kooperation mit Sp1/Sp3 den proximalen MYCN-
Promoter in vivo. Die Überexpression von p16Ink4a und damit die Inhibition der E2F-
Aktivität führen zu einer verminderten Expression von endogenem MYCN
(Strieder, 2003; Kramps, 2004). Darüber hinaus liegen Hinweise vor, dass trotz nur
seltener Defekte im p16Ink4a/pRb-Pfad bei Neuroblastomen es zu einem
Kontrollverlust der normalen E2F-Aktivität kommt (Takita, 1998). Neben der
Tatsache, dass mehrere Produkte von E2F-Zielgenen wie z.B. Skp2 in vielen
menschlichen Tumoren überexprimiert werden und dort mit der Malignität
korrelieren (Latres, 2001; Bloom, 2003; Oliveira, 2003), verschlechtert ein weiteres
direktes Zielgen von E2F, das mitotische Kontrollpunkt-Gen MAD2, direkt die
Prognose von Neuroblastom-Patienten, so dass die Aktivität der E2F-
Transkriptionsfaktoren und der von ihnen kontrollierten Gene für den klinischen
Verlauf von Krebserkrankungen von entscheidender Bedeutung sein könnten
(Hernando, 2004).
1.3 Das Onkogen BMI1
Das Onkogen BMI1 (B cell-specific Moloney murine leukaemia virus integration
site 1) kodiert für einen Transkriptionsfaktor aus der Gruppe der Polycomb-
Proteine und spielt eine Rolle in der Embryonalentwicklung sowie der
1.3 Das Onkogen BMI1 19
Selbsterneuerung von Stammzellen. Über die Faktoren, welche die Bmi-1-
Expression beeinflussen, ist jedoch bislang nur wenig bekannt.
1.3.1 Die Gruppe der Polycombproteine
Als transkriptionelle Repressoren regulieren die Proteine aus der Polycomb-
Gruppe (PcG) die Aktivität von Zielgenen, von denen die bislang bekanntesten die
Homeobox(=HOX)-Gene sind, die für die Entwicklung während der
Embryonalphase von Bedeutung sind (Alkema, 1997). Sie binden an spezielle
chromosomale Bindestellen, die sog. PRE (polycomb response elements) und
führen dort zu einer Umgestaltung des Chromatins. Mindestens zwei Komplexe der
PcG-Proteine mit ungleichen Aufgaben und Zielgenen können sowohl in
Drosophila-Fliegen als auch in Säugetieren voneinander unterschieden werden
(Sewalt, 1998). Einer dieser Komplexe (PRC2) enthält die PcG-Proteine Eed,
EzH2 und EzH1, wohingegen der andere Komplex (PRC1) die PcG-Proteine Bmi-
1, Mel18, Mph1, Ring1 und Hpc2 enthält (Shao, 1999; Francis, 2001; Jacobs,
2002). Die Proteine beider Komplexe spielen auch eine Rolle in der menschlichen
Hämatopoese und werden dort streng reguliert exprimiert. Während Eed in allen
Stadien von Knochenmarkszellen in etwa gleichen Konzentrationen zu messen ist,
steigert sich die Expression der meisten PcG-Proteine im Laufe der
Differenzierung. Lediglich die Höhe der Bmi-1-Expression nimmt, ausgehend von
primitiven Knochenmarkszellen, kontinuierlich ab (Lessard, 1998; Lessard, 1999).
1.3.2 Funktionen von Bmi-1 und Beziehung zum Zellzyklus
Das Protein des Onkogens BMI1 konnte als erstes Mitglied eines PcG-
Proteinkomplexes (PRC1) identifiziert werden und wird in vielen Geweben wie
embryonalen Stammzellen, Plazenta, Thymus, Herz, Hoden und Gehirn exprimiert
(van Lohuizen, 1991). Bmi-1 verhindert die Zellalterung, immortalisiert embryonale
Maus-Fibroblasten und führt in Kombination mit aktiviertem H-ras zu
neoplastischer Transformation. Bmi-1-/--Mäuse erfahren schwere
Proliferationsdefekte im Bereich des hämatopoetischen Systems,
20 1 Einleitung
Skelettmissbildungen sowie Schäden im Bereich des zentralen Nervensystems,
die sich in sporadischen Krampfanfällen und einer ataktischen Fortbewegung
abzeichnen (Jacobs, 1999a; van der Lugt, 1994). Als negativer Regulator des
Ink4a-Arf-Lokus führt Bmi-1 dosisabhängig zu einer Inhibition der
Tumorsuppressorgene pRb und p53 (Alkema, 1997) und nimmt daher eine
mögliche Rolle in der Tumorentstehung ein. Beim Menschen wird eine Bmi-1-
Überexpression bislang bei schlecht-differenzierten Non-Hodgkin-Lymphomen
(Bea, 2001), Mammakarzinomen (Dimri, 2002), nicht-kleinzelligen
Bronchialkarzinomen (Vonlanthen, 2001), kolorektalen Karzinomen (Kim, 2004)
und in Medulloblastomen (Leung, 2004) gefunden. Dabei haben mehrere Studien
eine mögliche Abhängigkeit der genetischen Deregulation und damit auch eine
eventuelle Onkogenese von der Zusammensetzung der verschiedenen PcG-
Komplexe aufgezeigt. Demnach führt die unkontrollierte Expression von PcG-
Untereinheiten zu einem Ungleichgewicht zugunsten eines PcG-Proteins und
nachfolgend zu verändertem Zellverhalten (van Kemenade, 2001).
Wie nachfolgend dargelegt wird, ist BMI1 ein Zielgen von E2F-1, das seinerseits
bestimmte genetische Programme, darunter den Eintritt von Zellen in die S-Phase
des Zellzyklus, induzieren kann. BMI1 wird jedoch anders als viele andere E2F-1-
Zielgene Zellzyklus-unabhängig exprimiert, was im experimentellen Teil noch
einmal belegt werden wird. Auch wird die BMI1-Expression nicht durch eine
Blockierung Zellzyklus-regulierter E2F-Zielgene durch Überexpression des CDKI
p16Ink4a beeinflusst (Nowak, 2006).
1.3.3 BMI1 als Zielgen von E2F-1
BMI1 ist ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors E2F-1. Dies konnte durch
cDNA-Microarrays und Induktion von BMI1 mittels E2F-1 unter gleichzeitiger
Proteinbiosynthesehemmung gezeigt werden. Der Promoter des humanen BMI1
enthält eine mutmaßliche E2F-Bindedomäne, an die sowohl E2F-1, -2 und -3
binden können. Für E2F-4 und -5 konnte im Reporterassay keine Aktivierung
gezeigt werden (Nowak, 2006). Während im PRC2 die Gene mehrerer
1.3 Das Onkogen BMI1 21
Untereinheiten durch E2F-1 induziert werden können (Muller, 2001; Bracken
2003), ist eine Induktion im PRC1 bislang nur für BMI1 nachgewiesen worden.
1.3.4 Kooperation zwischen Bmi-1 und Myc
Bmi-1 kooperiert mit c-Myc, ein Mitglied der für viele zelluläre Prozesse
entscheidenden Myc-Familie, in der Genese von Lymphomen in doppeltransgenen
Mäusen (Haupt, 1991; van Lohuizen, 1991). Dieser Synergismus von Bmi-1 und c-
Myc in der Tumorentstehung wird bestätigt durch BMI1/MYC-doppeltransgene
Mäuse, die bereits als Neugeborene an Leukämie versterben. Als wahrscheinliche
Ursache hierfür liegt die Inhibition der c-Myc-induzierten Apoptose durch Bmi-1
zugrunde (Haupt, 1993; Alkema, 1997). Die Überexpression von Myc in
Mausembryofibroblasten führt zu einem deutlichen Anstieg von p19Arf, der die
Ursache des programmierten und durch p53 vermittelten Zelltods ist. Dieser
Anstieg wird jedoch von überexprimiertem Bmi-1 unterbunden, so dass die
Kollaboration zwischen den beiden E2F-Zielgenen MYC und BMI1 hauptsächlich
auf ihre gegenteiligen Effekte auf den Ink4a-Arf-Lokus zurückzuführen ist (Jacobs,
1999b). In Neuroblastomen macht das c-Myc-homologe N-Myc die Zellen
empfindlicher für verschiedene apoptotische Stimuli (Lutz, 1998; Fulda, 1999), und
Myc kann seinerseits die E2F-Aktivität stimulieren (Leone, 2001; Beier, 2000). Dies
führt zu dem bedeutsamen Effekt, dass die E2F-Zielgene MYC und BMI1 entweder
direkt (MYC) oder durch Unterdrückung des Ink4a-Gens und damit Unterstützung
der pRb-Phosphorylierung (BMI1) ihren eigenen Stimulus verstärken und somit
unter Umständen zur Entstehung von Neuroblastomen beitragen (Nowak, 2006;
Abb. 1.4).
22 1 Einleitung
Abbildung 1.4: E2F-1 als Schaltstelle der Kooperation zwischen Bmi-1 und Myc. Überexprimiertes Bmi-1 verhindert die durch Myc initiierte und durch p19 vermittelte Apoptose. Myc und Bmi-1 können ihren eigenen Stimulus (E2F-1) auf direkte bzw. über p16 und pRb auf indirekte Weise verstärken und fördern unter Umständen so ein Tumorwachstum.
1.3.5 BMI1-Expression in Neuroblastomen
Nachdem mittlerweile mehrere E2F-Zielgene (MYCN, MAD2) identifiziert werden
konnten, die mit einer sehr schlechten Prognose von Neuroblastom-Patienten
einhergehen (Hernando, 2004; Strieder, 2003), konnte für das ebenfalls durch E2F
induzierte BMI1 in über 90% von 68 untersuchten primären Neuroblastomen
unterschiedlicher Tumorstadien eine starke Expression nachgewiesen werden
(Nowak, 2006). Diese stellte sich sowohl vom Stadium als auch von der MYCN-
Amplifikation unabhängig dar, was sich trotz jeweiliger Induktion durch E2F-1
dadurch erklären lässt, dass für die MYCN-Expression eine E2F-Aktivität zwar
Voraussetzung, diese aber allein nicht ausreichend ist (Kramps, 2004).
E2F-1 Bmi-1
p16
p19Myc Apoptose
pRb
2 Zielsetzung der Arbeit Das Onkogen BMI1 ist ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors E2F-1, der
selbst eine ambivalente Rolle als Onkogen und Tumorsuppressor spielt. Im
Mittelpunkt meiner Dissertation stand die Frage, ob und welche der bekannten
E2F-1-Funktionen von der Expression des Proteins Bmi-1 abhängen, und ob diese
Funktionen durch die Überexpression von BMI1 rekapituliert werden können.
Ein weiterer Aspekt war, eine mögliche Abhängigkeit der BMI1-Expression vom
Zellzyklus zu überprüfen, wie dies bereits für andere E2F-Zielgene gezeigt wurde.
Darüber hinaus sollte untersucht werden, welche Auswirkungen durch eine
verstärkte Bmi-1-Anreicherung in humanen Neuroblastomzellen in Bezug auf das
Zellverhalten zu beobachten sind, zumal eine Überexpression von BMI1
mittlerweile in einer Vielzahl von Tumoren beim Menschen, darunter auch
Neuroblastomen, nachgewiesen werden konnte.
Als Grundlage für die durchgeführten Experimente dienten von mir hergestellte
Neuroblastomzellen, in denen die Expression von BMI1 reversibel induziert werden
kann.
3 Material und Methoden
3.1 Material
Allgemeine Chemikalien in Analysequalität oder Qualität für die Molekularbiologie
wurden, wo nicht anders vermerkt, über die Firmen Sigma-Aldrich (München),
Merck (Darmstadt) und Applichem (Heidelberg) bezogen. Feinchemikalien mit
höchstem Reinheitsgrad wurden entweder von Sigma oder Gibco-Life
Technologies geliefert. Zellkulturmedien und andere Chemikalien für die Zellkultur
wurden ebenfalls von Gibco-Life Technologies bezogen. Andere Lieferanten
werden in Klammern mit dem jeweiligen Material genannt.
3.1.1 Zelllinien
Sämtliche verwendete Zelllinien entstammen der humanen Neuroblastom-Zelllinie
SK-N-SH-EP.
Um eine Regulierbarkeit des Transkriptionsfaktors E2F-1 zu erreichen, wurde der
SK-N-SH-EP-Klon 1A3 eingesetzt, der ein Fusionsprotein aus E2F-1 und einem
Teil des Östrogenrezeptors überexprimiert, welches durch das Östrogenderivat 4-
Hydroxytamoxifen (4-OHT) aktiviert werden kann (Verena Strieder, persönliche
Mitteilung).
Die für die Experimente herangezogenen TOR-Klone entsprachen stabil
transfizierten 1A3-Zellen, die einen Tetrazyklin-abhängigen Repressor, die Tet21-
Zellen (SK-N-SH-EP-Klon) dagegen einen Tetrazyklin-abhängigen Aktivator
exprimieren. Die Selektion erfolgte bei den 1A3- und den Tet21-Zellen mit G418,
bei den TOR-Zellen mit Puromycin.
3.1 Material 25
3.1.2 Materialien für die Zellkultur
Vollmedium für Säugerzellen 500 mL RPMI (mit Phenolrot)
50 mL FCS wärmeinaktiviert (30 min bei 56°C)
5 mL Penicillin (10.000 U/mL) / Streptomycin
(10 mg/mL)
Einfriermedium 6 mL RPMI (s.o.)
3 mL FCS (s.o.)
1 mL DMSO
Transfektionsmedium 500 mL DMEM
50 mL FCS (s.o.)
Penicillin / Streptomycin (s.o.)
10% L-Glutamin (200 mM)
Trypsin-EDTA 1 x Trypsin-EDTA, gebrauchsfertige Lösung
PBS pH 7,4 130 mM NaCl
3 mM KCl
6,4 mM Na2HPO4
1,5 mM NaH2PO4
ad pH 7,4 mit HCl justiert
DMSO Merck, Dimethylsulfoxid (100%)
4-Hydroxytamoxifen 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) (Sigma)
Stammlösung 1 mM in Ethanol
Endkonzentration für Induktion: 200 nM
Hygromycin B Calbiochem, Stocklösung 397 mg/mL
Selektion bei 90 µg/mL
Puromycin Sigma, Stocklösung 20 mg/mL
Selektion bei 0,8 µg/mL
Zeocin Calbiochem, 100 µg/mL
Tetrazyklin 10 µg/mL
G418 (Neomycin) Calbiochem, 200 µg/mL
26 3 Material und Methoden
3.1.3 Fertige Lösungen und Chemikalien
LB-Medium 10 g Trypton
5 g Hefeextrakt
5 g Glucose
ad 1000 mL H2O, pH 7,0
LB-Agar LB Medium
1,5% (w/v) Bacto-Agar
TRIzol Reagenz Invitrogen
DEPC-H2O 0,1% (v/v) Diethylpyrocarbonat in H2O
DTT 1M
Desoxynukleosid- Sigma (100 mM je dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Triphosphat (dNTP)
Ethidiumbromid Roth (Stammlösung 10 mg/mL in H2O)
Luciferase-Substratmix 0,2 mM D-Luciferin (Applichem)
25 mM Gly-Gly pH 7,8
Propidiumjodid Lösung Sigma (Stammlösung 1 mg/mL)
(FACS-Analyse)
Bradford Reagenz 0,01% (w/v) Coomassie Brillant Blue G-250
(Sigma)
4,75% (v/v) Ethanol
10% (v/v) Ortho-Phosphorsäure in H2O; filtrieren;
lichtgeschützt lagern
3.1.4 Kits
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen
Rapid DNA Ligation Kit Roche
Qiagen-tip 500 Maxi-Präparation, Qiagen
3.1 Material 27
3.1.5 Puffer
TE-Puffer 10 mM Tris/HCl
1 mM EDTA
pH 8,0
2 x HBS-Puffer 280 mM NaCl
1,5 mM Na2HPO4
50 mM Hepes-KOH
pH 7,05
TAE-Puffer 40 mM Tris-Acetat
1 mM EDTA
pH 8,0
STET-Puffer 8% (w/v) Saccharose
0,5% (v/v) Triton X-100
50 mM EDTA
50 mM Tris-HCl
pH 8,0
Kaliumphosphatpuffer 100 mM KHPO4
1 mM DTT
pH 7,8
First-Strand-Puffer 5x Gibco
Dilution-Puffer 5x MobiTec GmbH
Elution-Puffer 1% SDS
0,1 m NaHCO3
E1A-Puffer 50 mM HEPES pH 7,0
250 mM NaCl
0,1% NP-40
5 mM EDTA
1 mM DTT
+ Leupeptin
+ Aprotinin
28 3 Material und Methoden
3.1.6 PCR und quantitative Realtime-PCR
dNTP je 2,5 mM, Stratagene
H2O autoklaviert
Hot GoldStar Enzym Eurogentec
MgCl2 2,5 mM
MgSO4 20 mM
Pfu-Puffer 10x Stratagene
Pfu-Turbo-Polymerase Stratagene, 2,5 U/µL
Reaktionspuffer 10x Eurogentec
SYBR® Green Eurogentec
3.1.7 Bakterienstämme
Kompetente E.coli (IMT Marburg)
Ultrakompetente E.coli (IMT Marburg)
3.1.8 Plasmide
pcDNA 4/TO, 5078 Nukleotide (Invitrogen)
pBI, 4358 Nukleotide (BD Biosciences)
3.1.9 Oligonukleotide
Die verwendeten Oligonukleotide wurden, soweit nicht anders angegeben, von
MWG erstellt. Die eingesetzte Konzentration betrug jeweils 100 pmol/µL.
PCR: BMIfw 5’-CTT CAT CTG CAA CCT CTC CTC TAT-3’
BMIrev 5’-AAT TAG TTC CAG GGC TTT TCA A-3’
bmiwtRF3 5’-CCG GAT CCC GAG TCT CAG GTA TCA ACC-3’
deltaRFBMI5new 5’-CCG GAT CCA GAA ATG CAT TTC TTT GAC CAG
AAC AGA TTG G-3’
3.1 Material 29
Quantitative Realtime-PCR:
BMIfw 5’-CTT CAT CTG CAA CCT CTC CTC TAT-3’
BMIrev 5’-AAT TAG TTC CAG GGC TTT TCA A-3’
S14 5'-GGC AGA CCG AGA TGA ATC CTC-3'
5'-CAG GTC CAG GGG TCT TGG TCC-3'
Cyclin E 5‘-ACG TTC TAC TTG GCA CAG GAC-3‘
5‘-TGA GAC CTT CTG CAT CAA CTC-3‘
HPC2 5’-TCG CGG TGG AGA GCA TCG AGA AGA-3’
5’-AGC TGC TCC TGC CGT TCC CTG TTC-3’
Ring1a 5’-GGG GGT GCC GGA GGA GGT G-3’
5’-CCA GGG TCA GCG AGC CAT TCA AC-3’
Random Primer
Sequenzierung: CMVforward 5’-CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-3’
BGHreverse 5’-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3’
3.1.10 Enzyme
Alkalische Phosphatase (Shrimp) Roche
BstX I Stratagene
EcoR I Stratagene
EcoR V Stratagene
Hind III Stratagene
Reverse Transkriptase SuperScript, Gibco
RNAse A Boehringer (10 mg/mL)
RNAsin Promega
Xba I Stratagene
30 3 Material und Methoden
3.1.11 Western Blot
4x Sammelgelpuffer 0,5 M Tris/HCl
0,4% (w/v) SDS
pH 6,8
4x Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl
0,4% (w/v) SDS
8 mM EDTA
pH 8,8
Laufpuffer 25 mM Tris/HCl
0,2 M Glycin
0,1% (w/v) SDS
pH 8,3
Acrylamid Stammlösung 30% (w/v) Acrylamid (Applichem)
(SDS-PAGE) 0,8% (w/v) N, N´-Methylen-Bisacrylamid (Sigma)
in H2O; Lagerung: 4°C, lichtgeschützt
3x SDS-Probenpuffer 4,8 mL 4x Trenngelpuffer
600 mg SDS
426 mg Dithiothreithol
1 Spatelspitze Bromphenolblau
3,5 mL Glycerin
ad 10 mL mit H2O
Ammoniumperoxodisulfat 10% (w/v) APS in H2O
TEMED Tetramethylethyldiimin (Gibco)
Transferpuffer 10-20% (v/v) Methanol
192 mM Glycin
25 mM Tris-Base
0,03% SDS
TBS 50 mM Tris/HCl
150 mM NaCl
pH 7,4
3.2 Zellbiologische Methoden 31
Blocklösung 5% (w/v) Magermilchpulver (Merck) in TBS-T
TBS-T TBS
0,2% (v/v) Tween-20
Methanol 100%, zur Behandlung der PVDF Membran
Blotting Membran Immobilon-P, PVDF Membran (Millipore)
Film ECL Hyperfilm (Amersham)
Gel-Blotting Papier Schleicher und Schuell
ECL+-Lösung 1 und 2 Amersham
anti-Bmi-1, monoklonaler Mausantikörper Upstate Biotechnology, F6
anti-CDK2, polyklonaler Kaninchenantikörper M2 St. Cruz, sc-163
Sekundärantikörper anti-Maus Amersham
Sekundärantikörper anti-Kaninchen Amersham
3.1.12 Verbrauchsmaterial
Plastikwaren Kulturschalen sowie andere Einwegartikel für die
Zellkultur wurden entweder über die Firmen
Greiner oder Nunc bezogen.
3.2 Zellbiologische Methoden
3.2.1 Zellkultur
Die Arbeiten mit eukaryontischen Zellkulturen entsprachen im Wesentlichen den
Standardmethoden, wie sie z.B. bei Spector (Cold Spring Harbour Laboratory
Press, 1998) beschrieben sind. Alle verwendeten Neuroblastomzelllinien wurden in
Adhäsionskultur auf Polystyrol-Zellkulturschalen mit den Durchmessern 6 cm, 10
cm oder 15 cm gehalten und in HEPES-gepuffertem Vollmedium in Heräus BBD
6220 Begasungsbrutschränken bei 37°C, 96% relativer Feuchte und 5% CO2
kultiviert. Alle Zellexperimente und Kulturarbeiten wurden unter sterilen
Bedingungen an einer Steril-Arbeitsbank (Heräus HeraSafe) durchgeführt.
Je nach Wachstumsrate der Zellen wurden die verwendeten Zelllinien alle 3-5
Tage verdünnt und erneut auf frischen Zellkulturschalen plattiert. Die Verdünnung
32 3 Material und Methoden
lag je nach Zelldichte zwischen 1:5 und 1:20. Zum Ablösen der Zellen von den
Kulturschalen wurden sie mit einer Trypsin/EDTA Lösung behandelt. Dazu wurde
das Kulturmedium abgesaugt und der Zellrasen einmal mit PBS pH 7,4
gewaschen, um die im Serum enthaltenen Proteaseinhibitoren zu entfernen.
Danach wurden die Zellen mit 1-2 mL Trypsin/EDTA-Lösung 5 min bei 37°C
inkubiert, bis sie sich völlig von der Kulturschale gelöst hatten. Anschließend
wurden die Zellen in Medium verdünnt und in Zellkulturschalen überführt, die mit
frischem Medium vorbereitet waren.
3.2.2 Einfrieren von Zellen
Zunächst wurde das Medium der Zellschale abgesaugt, und die Zellen wurden
unter Einwirkung von Trypsin abgelöst und in ein Falcon-Röhrchen überführt.
Anschließend wurde das Röhrchen in einer Heraeus Fresco Biofuge-Zentrifuge bei
4°C und 1200 U/min für 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das
Zellpellet wurde in 1 mL Einfriermedium resuspendiert und in einem Cryoröhrchen
für 20 min auf Eis gelagert. Nach weiteren Abkühlungsschritten (45 min bei -20°C,
72 h bei -80°C) wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff konserviert.
3.2.3 Auftauen von Zellen
Zum Auftauen von in flüssigem Stickstoff gelagerten Zellen wurde ein Falcon-
Röhrchen mit Vollmedium befüllt und eisgekühlt. Das Cryoröhrchen mit den darin
befindlichen Zellen wurde in einem 37°C-Wasserbad rasch erwärmt und als
Suspension in das gekühlte Medium überführt. Anschließend wurde das Falcon-
Röhrchen bei 4°C und 1200 U/min für 5 min zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das Zellpellet wurde in 10 mL normalen Mediums resuspendiert und
auf einer Zellschale ausplatiert.
3.3 Molekularbiologische Methoden 33
3.3 Molekularbiologische Methoden
3.3.1 RNA-Extraktion
Zunächst wurde das Vollmedium der jeweiligen Zellschalen entfernt und nach
Waschen mit PBS nochmals sorgfältig abgesaugt. Nach Hinzufügen von 1 mL PBS
wurde der Zellrasen mit Hilfe eines Zellschabers vorsichtig vom Boden der Schale
gelöst und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die Suspension wurde für 2
min bei 4°C und 2200 U/min zentrifugiert, und anschließend der Überstand
vollständig abgesaugt. Das Zellpellet wurde in 1 mL TRIzol-Reagenz gelöst, und
die Probe für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 200 µL
Chloroform wurden die Eppendorf-Reaktionsgefäße 15 s lang kräftig geschüttelt und
weitere 3 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zentrifugation bei 10000 U/min
für 15 min bei 4°C führte zu einer Phasenschichtung, wobei die obere, wässerige
Phase die extrahierte RNA enthielt und in ein weiteres Eppendorf-Reaktionsgefäß
transferiert wurde. Um RNA-Präzipitate zu erhalten, wurden 500 µL
Isopropylalkohol zugefügt und die Proben für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert
und anschließend für 10 min bei 10000 U/min und 4°C zentrifugiert. Der Überstand
wurde entfernt und das RNA-Präzipitat mit 1 mL 75%igem Ethanol gewaschen.
Nach weiterer Zentrifugation für 5 min bei 6000 U/min und 4°C und Verwerfen des
Überstands wurde das RNA-Pellet vorsichtig getrocknet und in 30 µL Elution Puffer
für 10 min bei 55°C auf dem Heizblock gelöst. Anschließend wurden die Proben
bei -80°C eingelagert.
3.3.2 cDNA-Synthese
Für die Erststrangsynthese wurden die als Matritze verwendeten RNA-Proben
zunächst auf die Konzentration 1 µg/µL gebracht und anschließend 2 µg jeder
RNA-Probe mit 8 µL DEPC-H2O im PCR-Gerät für 10 min bei 65°C inkubiert.
34 3 Material und Methoden
Nach kurzer Abkühlung auf Eis wurden jeder Probe dann 40 µL des
Reaktionsgemisches hinzugefügt, bestehend aus:
• 10 µL First Strand Puffer 5x
• 5 µL 0,1 M DTT
• 1,25 µL 10 mM dNTP
• 2 µL Random Primer
• 1 µL Reverse Transkriptase
• 0,2 µL RNAsin
• 20,55 µL DEPC-H2O
Die Programmierung des PCR-Geräts erlaubte nach 15 min Inkubation bei
Raumtemperatur eine kontrollierte Erwärmung der Proben für 50 min auf 37°C
und abschließend für 5 min auf 65°C. Die entstandenen cDNA-Proben wurden bei
-20°C eingelagert.
3.3.3 PCR
Zur Vervielfältigung der cDNA wurde folgender Ansatz für die PCR in geeignete
und beschriftete Röhrchen pipettiert und mit einem Deckel luftdicht verschlossen:
• 1 µL (=100 ng) cDNA
• 5 µL Pfu Puffer
• 1 µL MgSO4
• 1,5 µL dNTP
• 2 µL Pfu Polymerase
• 1 µL Primer
• 38,5 µL H20
3.3 Molekularbiologische Methoden 35
Nach Aufheizen des Primus Thermocyclers (MWG) auf 95°C zur Denaturierung
der DNA fand über 28 Zyklen die Primeranlagerung jeweils für 60 s bei 56°C und
die Vervielfältigung des komplettierten DNA-Strangs bei 72°C für 90 s statt.
3.3.4 Quantitative Realtime-PCR Die quantitative Realtime-PCR (qRT-PCR) beschreibt die Ermittlung der benötigten
PCR-Zyklusanzahl, bei der die Fluoreszenz einer amplifizierten und markierten
DNA-Menge einen festgelegten Schwellenwert (treshold cycle; CT) überschreitet.
Der Schwellenwert wird manuell so festgelegt, dass die ermittelten CT-Werte der
exponentiellen Phase der einzelnen PCR-Reaktionen entsprechen. Die Detektion
erfolgt mittels SYBR® Green, das durch einen nicht vollständig geklärten
Mechanismus mit der doppelsträngigen DNA interagiert, und dessen
Fluoreszenzeigenschaft durch das ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System
gemessen wird. Je höher hierbei die eingesetzte DNA-Menge ist, desto früher
kommt es zu einem Anstieg der Fluoreszenz über den Schwellenwert, und umso
kleiner ist der sich ergebende CT-Wert. Unter optimalen Bedingungen verdoppelt
sich bei jedem PCR-Zyklus die Menge der genomischen DNA, so dass durch die
exponentielle Funktion ein ∆∆CT-Wert von -1 in etwa der doppelten, ein ∆∆CT-Wert
von -2 in etwa der vierfachen, eingesetzten DNA-Menge entspricht (Erläuterungen
zur Berechnung finden sich unter 3.6).
Zur Durchführung wurden je 2 µL der zu analysierenden cDNA bzw. des Leerwerts
in Form einer gleichen Menge an Elution Puffer in spezielle, für die
Fluoreszenzmessung geeignete und beschriftete Röhrchen pipettiert.
Anschließend wurde der abgedunkelte Reaktionsansatz hinzugegeben und die
Röhrchen mit Deckeln verschlossen.
36 3 Material und Methoden
Der Reaktionsansatz für 10 Proben bestand aus:
• 180 µL Elution Puffer
• 25 µL Reaction Puffer
• 17,5 µL MgCl2
• 10 µL dNTP
• 10 µL Primer
• 7,5 µL SYBR® Green
• 1,25 µL Hot Gold Star Enzym
Das ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System erlaubte anschließend die
automatische Abfolge der 40 PCR-Zyklen sowie die Analyse der Fluoreszenzen für
die parallel gemessenen Proben, wobei für den Leerwert ein CT-Wert von 40
erwartet wurde.
3.3.5 Agarose-Gelelektrophorese
Die analytische und präparative Agarosegelelektrophorese wurde nach den in
Standardwerken veröffentlichten Protokollen durchgeführt (Sambrook, 1989).
Hierzu wurden in einem Erlenmeyerkolben 2,25 g Agarose in Pulverform in 150 mL
TAE-Puffer durch Erhitzen in einem Mikrowellengerät gelöst und anschließend 4,5
µL Ethidiumbromid hinzugefügt. Das noch flüssige Gel ließ man in einer
vorbereiteten Form erkalten, wobei ein Kammeinsatz als Platzhalter für die
Probentaschen diente. Um das verfestigte Gel für die Probenbefüllung
vorzubereiten, wurde es mitsamt der Form in die mit TAE-Puffer angefüllte
Gelelektrophorese-Apparatur eingesetzt, so dass das Gel vollständig mit TAE-
Puffer bedeckt war. Nach der Entnahme des Kammes wurden abhängig von der
Probenanzahl einseitig oder an beiden Seiten des Gels je eine Probentasche mit 4
µL eines Größenmarkers befüllt, der als Referenz für die Größenabschätzung der
Probenfragmente eingesetzt wurde. Anschließend wurden die verbliebenen freien
Probentaschen mit je 10 µL der Proben, die zuvor im Verhältnis 1:6 mit einem
3.3 Molekularbiologische Methoden 37
Farbmarker versetzt worden waren, beladen. Für den Probenlauf wurde an das
Agarosegel für 60 min eine Spannung von 120 V angelegt und das Gel
abschließend unter ultraviolettem Licht dem analytischen bzw. präparativen Zweck
zugeführt.
3.3.6 Restriktionsendonukleasen-Verdau
Der Verdau von Plasmid-DNA durch Endonukleasen hatte zum Ziel, die
ringförmige DNA innerhalb des Bakteriums an einer vorher definierten Stelle zu
spalten, um anschließend einen weiteren DNA-Abschnitt einfügen zu können.
Hierzu wurde bei beiden verwendeten Plasmiden (pBI und pcDNA 4/TO) folgender
Ansatz verwendet:
• 5 µg Plasmid-DNA
• 1 µL EcoR V Endonuklease
• 2 µL SHRIMP (Alkalische Phosphatase)
• 1 µL Puffer React 2 10x
• H2O zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 10 µL
Die Ansätze wurden anschließend für 2 h bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Die
Endonuklease EcoR V spaltet beide DNA-Stränge auf gleicher Höhe, so dass ein
gerader Abschluss ohne einseitige Überhänge von Nukleotiden entsteht.
Gleichzeitig wurde bei diesem Reaktionsschritt eine Dephosphorylierung der
Plasmid-DNA vorgenommen.
3.3.7 Aufreinigung von PCR-Produkten
Die Aufreinigung von PCR-Produkten erfolgte zum einen direkt durch das QIAquick
PCR Purification Kit, wobei hier das reine PCR-Produkt als Ausgangsmaterial
eingesetzt wurde. Zum anderen wurde im Rahmen der präparativen
Gelelektrophorese, d.h. unter ultraviolettem Licht kontrolliert ausgeschnittene
38 3 Material und Methoden
Gelfragmente, mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kits auch eine indirekte
Aufreinigung der PCR-Produkte vorgenommen.
3.3.8 Ligation
Die Ligation bakterieller Plasmid-DNA mit einem externen DNA-Abschnitt in Form
eines PCR-Produktes wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kits (Roche)
durchgeführt. Um diesen Schritt zu ermöglichen, musste jedoch das PCR-Produkt
ebenso wie die zuvor mit Endonukleasen aufgetrennte Plasmid-DNA einen
geraden Abschluss beider DNA-Stränge ohne einseitige Überhänge aufweisen.
Hierfür wurde für 30 min bei RT zunächst folgende Auffüllreaktion durchgeführt:
• 42 µL PCR-Produkt
• 5 µL Klenow-Puffer 10x
• 2 µL dNTP’s (2,5 mM)
• 1 µl Klenow Polymerase
Nach Aufreinigung mit dem QIAquick PCR Purification Kit wurde das PCR-Produkt
durch folgenden Reaktionsschritt für 1 h bei 37°C im Wasserbad phosphoryliert:
• 50 µL PCR-Produkt
• 6 µL Polynukleotidkinase Puffer 10x
• 1 µL ATP (1 mM)
• 1 µl T4 Polynukleotidkinase
Für die Ligation wurde folgender Ansatz erstellt:
• 25 ng Plasmid-DNA
• 25 ng PCR-Produkt
• 2 µL Dilution Puffer 5x
• 10 µL DNA Ligation Puffer
3.3 Molekularbiologische Methoden 39
Dem Ansatz wurde nach gründlichem Mischen 1 µL DNA Ligase hinzugefügt, und
die Reaktion für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden nach
Ende der Ligation bei -20°C eingefroren.
3.3.9 Transformation von ultrakompetenten E.coli-Bakterien
Die Transformation von Bakterien bezeichnet das Einschleusen von Plasmid-DNA
in die Bakterienzelle. Hierzu wurden bei -80°C gelagerte, ultrakompetente E.coli-
Bakterien aufgetaut und ebenso wie die ligierte Plasmid-DNA auf Eis gelagert.
Nach dem Vermischen von 200 µL E.coli-Bakterien mit 2 µL Plasmid-DNA wurde
die Suspension weitere 15 min auf Eis belassen, um sie dann für 90 s einem
Hitzeschock von 42°C im Wasserbad auszusetzen. Nach 1-minütiger Abkühlung
auf Eis wurde der Suspension 800 µL LB-Medium beigefügt und diese
anschließend für 45 min bei 37°C auf dem Schüttler mit 700 U/min in
Rotationsbewegung versetzt. Nach Zentrifugation für 30 s bei 3000 U/min wurde
der Überstand verworfen, das Restvolumen resuspendiert und mit dem über der
offenen Flamme sterilisierten Glasspatel auf LB-Agarplatten ausgesät. Die
Inkubation fand für 24 h bei 37°C in Brutschränken statt, wobei die Agarplatten
nach 30 min mit der Oberseite nach unten gedreht wurden, um
Kondensationstropfen zu vermeiden.
3.3.10 Mini-Präparation von Plasmid-DNA
Erfolgreich gewachsene Klone wurden mit Hilfe von autoklavierten Pipettenspitzen
von der Oberfläche der Agarplatten entfernt und einzeln in Reagenzgläser
überführt, die mit jeweils 2 mL LB-Medium befüllt waren. Mit Metalldeckeln
verschlossen wurden die Reagenzgläser für 24 h bei 37°C in Brutschränken
gelagert, um anschließend mit jeweils 2 mL der enthaltenen Kultur Eppendorf-
Reaktionsgefäße zu befüllen. Nach Zentrifugation bei 12000 U/min für 3 min wurde
der Überstand abgesaugt, das Zellpellet in 110 µL STET-L-Puffer resuspendiert
und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Eppendorf-Reaktionsgefäße
wurden für 45 s in einem Heizblock bei 95°C erhitzt und dann bei 4°C für 15 min
40 3 Material und Methoden
bei 12000 U/min zentrifugiert. Das weiche Sediment wurde mit autoklavierten
Zahnstochern aus dem Eppendorf-Reaktionsgefäß entfernt und dem Inhalt 110 µL
Isopropanol zugesetzt. Nach vorsichtiger Resuspension und Zentrifugation für 15
min bei 4°C und 12000 U/min wurde der Überstand entfernt und das Pellet mit 300
µL 70%igen Ethanol gewaschen. Nach weiterer Zentrifugation für 2 min wurde der
Überstand sorgfältig entfernt und das Pellet in 25 µL TE-Puffer und 1 µL RNAse A
gelöst.
3.3.11 Maxi-Präparation von Plasmid-DNA
Die Maxi-Präparation wurde zur Herstellung größerer Mengen an Plasmid-DNA
verwendet. Hierzu wurden 2 µL des Ausgangsplasmids in 200 µL kompetente
E.coli-Bakterien pipettiert und nach Vermischen für 15 min auf Eis belassen. Durch
kurzzeitige Erwärmung für 90 s auf 42°C im Wasserbad nahmen die Bakterien die
Plasmide auf. Nach einer Abkühlungsphase von 1 min auf Eis wurden die
Bakterien in 1 mL LB-Medium überführt und anschließend für 45 min bei 37°C auf
einem Schüttelinkubator bei 700 U/min belassen. Dem Transformationsansatz
wurde 300 mL LB-Medium beigefügt, das 0,1% Ampicillin enthielt, bevor er für
weitere 16 h bei 37 °C auf einem Schüttelinkubator mit 200 U/min in gleichmäßige
Rotationsbewegungen versetzt wurde. Nach Abzentrifugation des Ansatzes wurde
gemäß des vorgegeben Protokolls für das Maxi-Präparation-Kit Qiagen-tip 500 von
Qiagen in mehreren Schritten die vervielfältigte Plasmid-DNA freigesetzt und
filtriert.
3.3.12 Sequenzierung
Die Sequenzierungen zur Kontrolle der ligierten DNA-Abschnitte auf Vollständigkeit
und korrekte Orientierung wurden sämtlich von SeqLab, Sequence Laboratories
Göttingen GmbH durchgeführt.
3.3 Molekularbiologische Methoden 41
3.3.13 Transfektion
Die Transfektion bezeichnet den Vorgang des Einschleusens fremder DNA in
eukaryontische Zellen. Um den bei der verwendeten Kalziumphosphat-
Transfektion in RPMI-Medium andernfalls entstehenden Kalziumpräzipitaten
vorzubeugen, wurden die zu transfizierenden Zellen zuvor auf DMEM-Medium
umgesetzt. Für jede 10 cm-Schale wurde folgender Ansatz erstellt:
• 50 µL CaCl2 (2,5 M)
• 30 µg ligierte Plasmid-DNA
• 5 µg Resistenz-Marker (Zeocin / Hygromycin)
• H2O auf ein Gesamtvolumen von 500 µL
Dieser Ansatz wurde langsam unter Luftblasenentwicklung mittels Pipettierhilfe in
ein Falconröhrchen überführt, das bereits 500 µL 2x HBS enthielt. Nach Zugabe
des gesamten Ansatzes zu den Zellschalen wurden diese für 12 h im Brutschrank
inkubiert und anschließend das DMEM-Medium durch RPMI-Medium ersetzt. Nach
weiteren 24 h wurde mit der Selektion der erfolgreich transfizierten Zellen
entsprechend ihrer plasmideigenen bzw. kotransfizierten Resistenzmarker
begonnen.
3.3.14 Herstellung und Expansion von Zellklonen
Nach erfolgreicher Selektion, die zwischen 10 und 20 Tagen andauerte, wurde
jeder einzelne Zellklon aus der ursprünglichen Zellschale in eine kleinere, mit
Medium gefüllte Zellschale überführt. Hierzu wurde das Medium zunächst
abgesaugt und die Zellklone mit Hilfe sterilisierter Metallringe und ebenfalls
sterilisierter Vaseline gegenüber der Umgebung abgedichtet. Durch Zugabe von 50
µL Trypsin wurden nach einer Inkubation von 1 min die von der Zellschale gelösten
Zellen des jeweiligen Klons mit einer sterilen Pipette abgesaugt und in eine, mit je
1 mL RPMI-Medium pro Well befüllten 24-Well-Platte überführt. Nach Wachstum
bis zu einer ausreichenden Dichte wurden die Zellklone in eine, mit je 2 mL
42 3 Material und Methoden
Medium pro Well befüllten 12-Well-Platte und anschließend in eine, mit je 4 mL
Medium pro Well befüllten 6-Well-Platte transferiert, von wo aus die weitere
Expansion der Klone mit Hilfe von 6 cm- und 10 cm-Zellschalen durchgeführt
wurde. Ab diesem Zeitpunkt wurde auch die abwechselnde Selektion je nach
Zelltyp und plasmideigenen bzw. kotransfizierten Resistenzmarkern
wiederaufgenommen.
Folgender Zeitplan wurde eingehalten, um die Zellklone nicht einem gleichzeitigen
Selektionsdruck durch verschiedene Antibiotika auszusetzen:
Hygromycin / Zeocin 7 Tage
G418 7 Tage
Puromycin 3 Tage
3.3.15 FACS-Analyse zur Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen
Zur Analyse der Zellzyklusverteilung wurde der DNA-Gehalt einer Zellpopulation
mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Zellen wurden dazu zunächst einmal in
PBS gewaschen und dann nach Absaugen und nochmaliger Zugabe von 1 mL
PBS mittels Zellschaber in Falcon-Röhrchen überführt. Daraufhin wurden die
Zellen in einer Heraeus-Megafuge bei 1500 U/min und 4°C für 5 min abzentrifugiert
und einmal in 8 mL PBS gewaschen. Das Pellet wurde nach erneutem
Zentrifugieren in 0,5 mL PBS aufgenommen, mit 4,5 mL eiskaltem 70%igen
Ethanol zur Fixierung versetzt und mindestens 30 min auf Eis stehend fixiert.
Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert, in 0,5 mL PBS aufgenommen und
nach Zugabe von 5 µL RNAse A für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden
in die speziell dafür vorgesehenen FACS-Röhrchen überführt und unter
Lichtausschluss mit 15 µL Propidiumiodid versetzt. Mit einem Becton-Dickinson
FACScalibur-Gerät wurde der DNA-Gehalt pro Zelle bestimmt. Dazu wurden pro
Ansatz 50.000 Zellen analysiert. Die erhaltenen Daten wurden unter Verwendung
des Programms „Modifit“ (Verity Software House) ausgewertet.
3.4 Methoden zur Analyse von Proteinen 43
3.4 Methoden zur Analyse von Proteinen
3.4.1 Bradford-Assay
Die Bestimmung der Proteinkonzentration in den Zelllysaten wurde nach der von
Bradford beschriebenen Methode durchgeführt (Harlow und Lane, 1988). Hierzu
wurden in Küvetten zur photometrischen Messung jeweils 7 µL des Zellextrakts
und im Fall des Leerwerts 7 µL des 100 mM Kaliumphosphatpuffers vorgelegt.
Daraufhin wurden je 100 µL 150 mM NaCl und 1 mL der Bradford-Lösung
hinzugefügt und die Proteinmenge bei einer Wellenlänge von 595 nm relativ zum
Leerwert gemessen. Die Bestimmung der absoluten Menge an Protein erfolgte
anhand einer Standardreihe, die für die benutzte Bradford-Lösung ermittelt worden
war.
3.4.2 Luciferase-Assay
Mit Hilfe eines Luciferase-Assays kann die Proteinproduktion von Zellen, die durch
eine Transfektion das Luciferase-Reportergen erhalten haben, quantifiziert werden.
Hierbei macht man sich die in der Natur als Biolumineszenz bekannte Eigenschaft
der Luciferase zunutze, Luciferin in Verbindung mit Sauerstoff zu modifizieren, so
dass es zu einer Lichtemission kommt. Die Zellen wurden 36 h nach der
Transfektion mit kaltem PBS gewaschen. 1 mL kaltes PBS wurde zu den Zellen
gegeben, die mit einem Plastikschaber geerntet und in der Kühlzentrifuge bei 2200
U/min und 4°C für 2 min pelletiert wurden. Das Zellpellet wurde in 120 µL 0,1 M
Kaliumphosphatpuffer pH 7,8 / 0,2% Triton aufgenommen und durch dreimaliges
Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen bei 37°C aufgeschlossen. Das Lysat
wurde durch Zentrifugation bei 14.000 U/min für 10 min bei 4°C von den
unlöslichen Bestandteilen befreit und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß
überführt. 50 µL des Überstands wurden mit 350 µL Reaktionspuffer versetzt und
die Lichtemission im Luminometer nach Zugabe von 150 µL Substratmix
gemessen.
44 3 Material und Methoden
3.4.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von
Proteinen Die Auftrennung von Proteinen durch diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese
erfolgte nach Laemmli (1970) unter denaturierenden Bedingungen. Grundlage
hierfür bildeten Acrylamidgele, die aus einem oberen Sammelgel und einem
unteren Trenngel bestanden, und sich wie folgt zusammensetzten.
Sammelgel: 650 µL Acrylamidlösung
• 1,2 mL Sammelgelpuffer
• 50 µL SDS (10%), auf 5 mL mit Aqua dest. aufgefüllt
• 5 µL TEMED
• 150 µL APS (10%) zur Initialisierung der
Gelpolymerisation
Trenngel: 3,83 - 5,1 mL Acrylamidlösung
• 3,75 mL Trenngelpuffer
• 150 µL SDS (10%), auf 15 mL mit Aqua dest. aufgefüllt
• 12 µL TEMED
• 50 µL APS (10%) zur Initialisierung der
Gelpolymerisation
Das Trenngel wurde in den Zwischenraum zweier Glasscheiben, die in eine
Apparatur eingespannt waren, gegossen und anschließend mit Isopropanol
überschichtet. Nach erfolgter Polymerisation wurde das Isopropanol abgegossen
und verbliebene Reste mittels Whatman-Papier enfernt. Unmittelbar nach der
Überschichtung des Trenngels durch ein Sammelgel wurde ein geeigneter Kamm
eingesetzt, um die entsprechenden Aussparungen für die Geltaschen zu schaffen.
Vor dem Beladen der Gele wurden die Proben mit 3x SDS-Probenpuffer versetzt
und für 5 min bei 95°C denaturiert. Die Proteine wurden auf das im SDS-Laufpuffer
stehende Gel aufgetragen und durch das Anlegen einer gleichmäßigen Spannung
3.4 Methoden zur Analyse von Proteinen 45
(80 V im Sammelgel, 120 V im Trenngel) aufgetrennt. Der Transfer auf eine
Nylonmembran und die Analyse der Proteine erfolgte im anschließenden Western
Blot.
3.4.4 Western Blot
Der Western Blot bezeichnet den Transfer von mittels SDS-PAGE getrennten
Proteinen auf eine Membran und den dortigen Nachweis durch markierte
Antikörper. Hierzu lässt man die Proteine durch ein transversal zur Oberfläche des
Gels angelegtes elektrisches Feld auf der anodischen Seite aus dem Gel austreten
und transferiert sie auf eine Nylonmembran. Dort nehmen die Proteine dieselbe
Position ein, die sie schon im Gel belegten. Die auf der Oberfläche der PVDF-
Membran immobilisierten Proteine sind nun immunologischen Reaktionen
zugänglich. Dazu wird die Membran in einer Lösung, die gegen das
nachzuweisende Protein gerichtete Antikörper enthält, inkubiert. Nach Abwaschen
des nicht gebundenen Antikörperüberschusses wird ein Zweitantikörper, der gegen
die konstanten Domänen der schweren Kette des Erstantikörpers gerichtet ist,
hinzugegeben. Dieser Zweitantikörper ist mit einer Markierung gekoppelt, hier mit
einer Horseradish-Peroxidase. Deren Enzymreaktionen erlauben den
hochspezifischen Nachweis des erwünschten Proteins.
Zunächst wurde die PVDF-Membran jeweils unter Vermeidung von
Verunreinigungen auf die Größe des Acrylamid-Gels zurechtgeschnitten.
Anschließend wurde die Membran für 1 min in 100% Methanol, für 2 min in H2O
und für 5 min in Blot-Puffer inkubiert. Der elektrophoretische Transfer der Proteine
wurde in einer “semi-dry“-Blot-Apparatur vorgenommen. Drei Whatman-3M
Papiere, in ihrer Größe der PVDF-Membran entsprechend, wurden in Blot-Puffer
getränkt und luftblasenfrei übereinander auf die Anode der Blot-Apparatur gelegt.
Darauf wurde dann die vorbehandelte PVDF-Membran, das Polyacrylamidgel und
schließlich nochmals drei Blot-Puffer getränkte Whatman-3M Papiere gelegt. Der
Proteintransfer auf die Membran erfolgte dann für 90 min bei konstanten 200 mA.
Zur Vermeidung von unspezifischer Bindung der Antikörper an die Membran wurde
46 3 Material und Methoden
diese anschließend in Blocklösung überführt und über Nacht bei 4°C auf einem
Schüttler inkubiert. Dadurch wurde die Membran abgesättigt. Danach wurde die
Blocklösung durch frische ersetzt und dieser der primäre Bmi-1-Antikörper in einer
Verdünnung von 1:1000 zugesetzt. In dieser Lösung wurde die Membran 2 h bei
RT inkubiert. Anschließend wurde 2 x 5 min und 3 x 15 min mit TBS-T gewaschen.
Der sekundäre Antikörper wurde 1:3000 in Blocklösung verdünnt. Hierin erfolgte
die Inkubation der Membran für 1 h bei RT. Danach wurde erneut 2 x 5 min und 3 x
10 min mit TBS-T gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit ECL-
Reagenzien entwickelt. ECL+ Lösung A und B wurden im Verhältnis 40:1 gemischt
und die Membran hiermit für 5 min bei RT inkubiert. Die ECL-Reagenzien
erzeugen zusammen mit der Horseradish-Peroxidase eine Chemolumineszenz, die
sich mit geeigneten Filmen nachweisen lässt. Die Membran wurde zur Exposition
in Klarsichtfolie verpackt. Die Expositionszeit auf einen ECL Hyperfilm erfolgte je
nach erwarteter Signalstärke zwischen 10 s und 10 min. Die Schwärzung des
Films ist in gewissen Grenzen der Menge an gebundenem Antikörper und damit
der Menge an nachzuweisendem Protein proportional. Aufgrund der
Schwärzungsintensität der jeweils resultierenden Banden wurde die Expression
von Bmi-1 als nicht oder kaum nachweisbar, deutlich nachweisbar und erhöht
klassifiziert. Die Höhe der Signale wurde dabei in Relation zu der Signalstärke des
jeweilig als Ladekontrolle parallel bestimmten CDK2-Signals beurteilt.
3.5 Geräte
ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems
Begasungsbrutschränke, BBD 6220, Heraeus
FACScalibur, Becton-Dickinson
Kamera, CF 1/8 FMC CCD, Kappa
Kühlzentrifuge, Centrifuge 5417R, Eppendorf
Lumat LB 9507, Berthold
Megafuge 1.OR, Heraeus
Mikroskop DMIRB, Leica
3.6 Statistische Auswertungen 47
Primus Thermocycler, MWG
Schüttelinkubatoren Model G25, New Brunswick Scientifik Co. INC
Spektrophotometer, Pharmacia
Steril-Arbeitsbank, Heraeus HeraSafe
Tankblotapparatur, Trans-blot, Biorad
Tischzentrifuge, Biofuge pico, Heraeus
Zentrifuge, Sorvall RC-5B, DuPont
3.6 Statistische Auswertungen
Die Berechnung der relativen Expression in der quantitativen Realtime-PCR
basiert auf der arithmetischen Grundlage der vergleichenden CT-Methode und wird
wie folgt abgeleitet.
Die Gleichung, die die exponentielle Amplifikation der PCR beschreibt, lautet:
!
Xn
= X0" (1+E
X)n (3.1)
wobei: Xn = Anzahl der Probenmoleküle bei Zyklus n
X0 = anfängliche Anzahl der Probenmoleküle
EX = Effizienz der Probenamplifikation
n = Anzahl der Zyklen
Der CT-Wert (treshold cycle) markiert den Bruchwert der Zyklenanzahl, bei dem die
amplifizierte Probenmenge einen festgesetzten Schwellenwert überschreitet:
!
XT
= X0" (1+E
X)CT ,X = K
X (3.2)
wobei: XT = Schwellenwertanzahl der Probenmoleküle
CT,X = Schwellenwertzyklus für die Probenamplifikation
KX = konstant
48 3 Material und Methoden
Für die Berechnung der eingesetzten Referenzreaktion wird eine ähnliche
Gleichung verwendet:
!
RT
= R0" (1+E
R)CT ,R = K
R (3.3)
wobei: RT = Schwellenwertanzahl der Referenzmoleküle
R0 = anfängliche Anzahl der Referenzmoleküle
ER = Effizienz der Referenzamplifikation
CT,R = Schwellenwertzyklus für die Referenzamplifikation
KR = konstant
Die Division von XT durch RT ergibt folgenden Ausdruck:
!
XT
RT
=X0" (1+E
X)CT ,X
R0" (1+E
R)CT ,R
=K
X
KR
= K (3.4)
Die Effizienzen sind verschiedenen Einflüssen unterworfen und müssen nicht
gleich 1 sein. Wenn man jedoch gleiche Effizienz für Probe und Referenz als
gegeben ansehen kann, dann ist EX = ER = E:
!
X0
R0
" (1+E)CT ,X #CT ,R = K (3.5)
oder:
!
XN" (1+E)
#CT = K (3.6)
wobei: XN = X0/R0, die normalisierte Probenmenge
ΔCT = CT,X-CT,R, die Differenz der Schwellenwertzyklen
3.6 Statistische Auswertungen 49
Durch Umstellen ergibt sich:
!
XN
= K " (1+E)#$C
T (3.7)
Im letzten Schritt dividiert man die XN für jede Probe q durch die XN des Kalibrators
cb:
!
XN ,q
XN ,cb
=K " (1+E)
#$CT ,q
K " (1+E)#$CT ,cb
= (1+E)#$$CT (3.8)
wobei: ΔΔCT = ΔCT,q-ΔCT,cb
Unter Beachtung der vorgegebenen Richtlinien für die Durchführung einer qRT-
PCR liegt die Effizienz nahe 1. Somit errechnet sich die anhand eines eingesetzten
Referenzwertes normalisierte und in Relation zu einem Kalibrator gesetzte
Probenmenge (relative Expression) wie folgt:
!
XN ,q
XN ,cb
= 2"##CT (3.9)
4 Ergebnisse
4.1 Funktionsprinzip der verwendeten Neuroblastom-Zelllinien
Die für die Experimente verwendeten Zelllinien sind Derivate der humanen
Neuroblastom-Zelllinie SK-N-SH-EP, deren durch stabile Transfektion modifizierte
Funktionen im Folgenden beschrieben werden.
4.1.1 SK-N-SH-EP-Zelllinie 1A3
Der SK-N-SH-EP-Klon 1A3 exprimiert konstitutiv ein Fusionsprotein aus dem
Transkriptionsfaktor E2F-1 und einem Teil des Östrogenrezeptors (E2F-1-ER),
dessen Bindung an einen Komplex aus Hitzeschockproteinen unter dem Einfluss
des Östrogenderivats 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) aufgehoben werden kann. Dies
ermöglicht es dem Fusionsprotein, in den Zellkern einzudringen und seine
regulatorische Funktion auf die E2F-1-Zielgene wie z.B. BMI1 auszuüben, den
Eintritt der Zellen in die S-Phase zu stimulieren sowie den programmierten Zelltod
(Apoptose) zu induzieren (Kramps, 2004).
4.1.2 SK-N-SH-EP-Zelllinie TOR
Der 1A3-Klon TOR (Kornelius Kerl, persönliche Mitteilung) exprimiert dauerhaft
einen Repressor, der unter dem Einfluss von Tetrazyklin seine Bindung an eine
Tetrazyklin-spezifische Operatorgensequenz aufgibt und somit die Ablesung des
nachfolgenden Genabschnitts ermöglicht (T-REx-System; Yao, 1998). Es wurden
zwei verschiedene, funktionstüchtige TOR-Klone (TOR7 und TOR27) eingesetzt,
um im Verlauf der Transfektion den Klon mit der besseren Effizienz zu ermitteln.
4.1.3 SK-N-SH-EP-Zelllinie Tet21
Der SK-N-SH-EP-Klon Tet21 dagegen exprimiert einen Aktivator, der an eine
Tetrazyklin-spezifische Operatorgensequenz bindet und somit in Abwesenheit von
Tetrazyklin die Ablesung des nachfolgenden Genabschnitts erlaubt (Lutz, 1996).
4.2 Neuroblastomzellen mit induzierbarer Expression von Bmi-1 51
Unter dem Einfluss von Tetrazyklin löst der Aktivator jedoch seine Bindung und
verhindert somit eine Ablesung (Tet-Off-System).
4.2 Neuroblastomzellen mit induzierbarer Expression von Bmi-1
Um die Auswirkungen einer erhöhten Bmi-1-Produktion in Neuroblastomzellen zu
messen, wurden zum einen Zellen benötigt, bei denen die Herstellung der
entsprechenden mRNA reversibel gesteuert werden konnte. Zum anderen war die
mengenmäßig ausreichende Synthese an Protein bzw. mRNA Voraussetzung für
eine zuverlässige Beurteilung der ermittelten Daten. Darüber hinaus wollte ich
überprüfen, ob die erhöhte BMI1-Expression geeignet ist, bestimmte Teilaspekte
der bekannten E2F-Effekte nachzuahmen. Um diese Ziele zu erreichen, wurden
die 1A3-Klone TOR, bei dem die Regulation des Transkriptionsfaktors E2F-1
bereits möglich war, und Tet21 als Ausgangszellen verwendet, um sie durch ein
Tetrazyklin-abhängiges System mit der Fähigkeit zur solitären Bmi-1-Produktion zu
erweitern. Ich entwickelte zwei voneinander unabhängige Systeme, um ihren
Wirkungsgrad miteinander zu vergleichen und das erfolgreichere System für die
Messung und Auswertung zu verwenden.
4.2.1 Klonierung von BMI1 in Tetrazyklin-regulierbare Vektoren
Voraussetzung für die exogene Produktion des Bmi-1-Proteins in
Neuroblastomzellen war die Amplifikation des entsprechenden, vollständigen
Genabschnitts aus nativer Neuroblastom-cDNA. Für die Herstellung der TOR-
Zellen wurde der Vektor pcDNA 4/TO, für die Klonierung der Tet21-Zellen der
Vektor pBI ausgewählt. Der Vektor pcDNA 4/TO besitzt neben Resistenzmarkern
für Ampicillin und Zeocin eine Schnittstelle, die einem viralen Promotor (CMV) und
einer doppelten Tetrazyklin-Operatorgensequenz nachgeschaltet war. Der Vektor
pBI besitzt lediglich einen Ampicillin-Resistenzmarker und zwei Schnittstellen, die
von einer gemeinsamen, zentralen Tetrazyklin-Operatorgensequenz und einem
viralen, bidirektionalen Minimalpromotor (CMV) getrennt werden, wobei sowohl die
Schnittstelle des Vektors pcDNA 4/TO als auch eine der Schnittstellen des Vektors
52 4 Ergebnisse
pBI je eine Bindesequenz für die Restriktionsendonuklease EcoR V aufweist, die
für die verwendete „blunt-end“-Klonierstrategie geeignet war. Nach erfolgter
Ligation, also dem Einfügen der isolierten BMI1-Gensequenz in die Vektoren, und
Transformation in ultrakompetente E.coli-Bakterien wurden jeweils etwa 25 Klone
ausgewählt, bei denen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen zum einen die
berechnete Fragmentgröße kontrolliert und zum anderen, soweit dies möglich war,
auch die Richtung der in den Vektor klonierten BMI1-Gensequenz bestimmt wurde.
Abbildung 4.1: Vektorkarten von pBI und pcDNA 4/TO. Die Multiple Cloning Site (MCS) I von pBI weist ebenso wie der Klonierbereich von pcDNA 4/TO eine Schnittstelle für EcoR V auf, an der die beiden DNA-Stränge des Vektors auf gleicher Höhe gespalten werden.
4.2 Neuroblastomzellen mit induzierbarer Expression von Bmi-1 53
Abbildung 4.2: Kontrollverdau der klonierten Plasmide. Nur die markierte Probe (Pfeil) zeigt die, bei richtiger Orientierung des in den pBI-Vektor klonierten BMI1-Wildtyp- Genabschnitts (980 bp) zu erwartenden Fragmentgrößen bei 0,6 kb, 1 kb und 3,8 kb nach Verdau mit den Restriktionsendnukleasen Xba I und Hind III.
Die Plasmide, die das richtige Bandenmuster zeigten, wurden zur endgültigen
Überprüfung der Vollständigkeit sowie der Orientierung der BMI1-Gensequenz
sequenziert. Die Bezeichnungen der erfolgreichen Klonierungen lauteten gemäß
ihrer Nummerierungen für die ausgewählten Mini-Präparationen:
BMI1-WT → pcDNA 4/TO: BMI1-WT21/pcDNA
BMI1-WT → pBI: BMI1-WT6/pBI
BMI1-ΔRF → pcDNA 4/TO: BMI1-ΔRF13/pcDNA
BMI1-ΔRF → pBI: BMI1-ΔRF2/pBI
4.2.2 Das dominant negative BMI1-Allel
Das Bmi-1-Protein besitzt an seinem Amino-Terminus eine Zn-Bindedomäne, den
sog. RING-finger (RF), der für die onkogenen Funktionen von Bmi-1 notwendig ist
(Alkema, 1997). Eine Deletionsmutante von Bmi-1, der die RF-Domäne fehlt (Bmi-
4072 bp 3054 bp
2036 bp 1636 bp 1018 bp 506 bp
3800 bp 1000 bp
600 bp
Größen- standard
pBI-BMI1-WT + Xba I, Hind III
54 4 Ergebnisse
1-ΔRF), geht vorzeitig in die Seneszenz (Itahana, 2003). Demnach wirkt Bmi-1-
ΔRF dominant negativ.
Die Vektoren, die dieses Allel enthielten, wurden für weitere Versuche innerhalb
der Arbeitsgruppe verwendet. Hierbei sollte untersucht werden, welche
Auswirkungen das Fehlen von funktionellem Bmi-1 für die E2F-1-Funktionen hat.
Diese Vektoren finden im Folgenden keine Erwähnung mehr.
4.2.3 Untersuchung der Neuroblastom-Zelllinie Tet21 auf Induzierbarkeit durch Tetrazyklin
Um die Zelllinie Tet21 auf ihre Funktionstüchtigkeit zu überprüfen, führte ich einen
Luciferase-Assay durch.
Hierzu wurden je zwei semikonfluente Tet21-Zellschallen entweder mit dem Vektor
puHC 13-6 oder dem Vektor puHD 13-3, die sich in ihrem Minimalpromotor
unterschieden aber beide ein tetrazyklinabhängiges Luciferase-Reportergen
besaßen, transfiziert. Bei der durchgeführten Kalziumphosphat-Transfektion wurde
neben der Vektor-DNA auch GFP eingesetzt, um eine optische Einschätzung des
Transfektionserfolgs vornehmen zu können. Nach Durchführung des Bradford- und
Luciferase-Assays zeigte sich, dass beide Vektoren bei fehlender Reprimierung
durch Tetrazyklin mit einer deutlichen Steigerung der relativen Luciferase-Aktivität
reagierten, wobei der Vektor puHD 13-3 die stärkere Antwort lieferte (Abb. 4.3).
4.2 Neuroblastomzellen mit induzierbarer Expression von Bmi-1 55
Abbildung 4.3: Luciferase-Assay für die Vektoren puHC 13-6 und puHD 13-3 nach Entzug von Tetrazyklin. Beide Vektoren zeigen eine deutliche Antwort des Tetrazyklin- abhängigen Luciferase-Reporters bei Wegfall der reprimierenden Tetrazyklinwirkung.
4.2.4 Transfektion und Selektion der Zelllinien TOR und Tet21 mit BMI1-tragenden Vektoren
Nachdem die Funktionsfähigkeit beider verwendeter Zelllinien sichergestellt war,
und die BMI1-Gensequenzen der zur Transfektion eingesetzten Plasmide auf
Vollständigkeit und Orientierung überprüft sowie Mutationen ausgeschlossen
waren, wurden je vier semikonfluente Zellschalen der TOR7- und TOR27-Zellen
und zwei semikonfluente Zellschalen der Tet21-Zellen für die Transfektion
vorbereitet. Nachdem bei vorangegangenen Selektionsversuchen Probleme bei
der Verwendung von Zeocin aufgetaucht waren, wurden jeweils zwei Zellschalen
der TOR-Zellen zusätzlich zu dem, auf dem Vektor pcDNA 4/TO befindlichen
Resistenzmarker für Zeocin mit dem Resistenzmarker für Hygromycin
kotransfiziert. Die beiden Zellschalen der mit dem Vektor pBI zu transfizierenden
Tet21-Zellen wurden aufgrund fehlender andersweitiger Resistenzen mit dem
Resistenzmarker für Zeocin in Form des pcDNA 4/TO-Leervektors kotransfiziert.
56 4 Ergebnisse
Jeweils eine Schale eines gleichen Transfektionsansatzes wurde anschließend
unverdünnt auf RPMI-Medium umgesetzt, die andere im Verhältnis 1:3 gesplittet
und deren Nährlösungen ebenfalls durch RPMI-Medium ersetzt. Hierdurch sollte
das evtl. bessere Ansprechen der Selektion auf die unverdünnten bzw. die 1:3
verdünnten Zellen getestet werden. Nach weiteren 48 h wurde mit der Selektion
der Zellen mit Hygromycin bzw. Zeocin begonnen, die zwischen 10 und 20 Tagen
andauerte und lichtmikroskopisch kontrolliert wurde. Nach erfolgreicher Selektion
wurden die 30 bis 40 verbliebenen Klone jeder Zellschale in 24-Well-Platten
überführt und von dort aus bei ausreichender Zelldichte in größere Platten bzw.
Schalen umgesetzt. Die Bezeichnung der Zellklone beinhaltete den Zelltyp, den
eingesetzten Resistenzmarker und die fortlaufender Nummer (z.B. TOR7 Zeo2).
4.2.5 Nachweis der Tetrazyklin-abhängigen Expression von Bmi-1
Jeder expandierte Zellklon wurde abschließend auf je drei 6 cm-Zellschalen
ausplattiert, wobei eine Zellschale als Mutterschale weiterverwendet wurde und die
beiden anderen Schalen einem Western Blot zugeführt wurden, wobei auch hier
auf semikonfluentes Wachstum zu achten war. Den Zellschalen mit zu
induzierender Bmi-1-Expression wurden im Falle der TOR-Zellen (T-REx-System)
10 µg/mL Tetrazyklin zugesetzt, im Falle der Tet21-Zellen (Tet-Off-System)
entsprechend den Zellschalen, bei denen eine Unterdrückung der Bmi-1-
Expression hervorgerufen werden sollte. Da sich bei den Tet21-Zellen eine
Expansion unter Selektionsdruck als äußerst schwierig erwies, und die TOR-Zellen
sehr stabile Ergebnisse lieferten, wurde auf eine weitergehende Untersuchung
einzelner Zellklone verzichtet und stattdessen eine globale Einschätzung der
Tet21-Zellen mittels Western Blot der gepoolten Zellklone der Mutterschale
vorgenommen (Mischklon).
Die drei TOR-Klone Hygro1, Zeo1 und Zeo2 zeigten eine deutliche Antwort auf die
Induktion mit Tetrazyklin im Sinne einer erhöhten Expression von Bmi-1 (Abb. 4.4).
Auch der Tet-21-Mischklon reagierte unter der Induktion mit Tetrazyklin wie
erwartet mit einer verminderten Expression von Bmi-1, wobei aufgrund der
4.3 Induktion von Bmi-1 in induzierbaren Neuroblastomzellen 57
besseren Selektionsfähigkeit für die nachfolgenden Experimente ausschließlich die
o.g. TOR-Klone verwendet wurden.
Abbildung 4.4: Tetrazyklin-abhängige Expression von Bmi-1. Verschiedene Klone wurden für 30 Stunden in Medium mit bzw. ohne Tetrazyklin kultiviert. Anschließend wurden Zelllysate hergestellt, und mit einem Bmi-1-spezifischen Antikörper wurde das Protein Bmi-1 nachgewiesen.
4.3 Induktion von Bmi-1 in induzierbaren Neuroblastomzellen
Diejenigen Zellklone, die im ersten Western Blot positive Ergebnisse lieferten,
wurden in weiteren Western Blots kontrolliert und für die Untersuchung der Bmi-1-
Überexpression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene expandiert. Neben
der Frage nach den Auswirkungen einer direkten und indirekten Induktion der Bmi-
1-Expression durch Tetrazyklin bzw. 4-OHT untersuchte ich, ob es bei
gleichzeitigem Einsatz der beiden Induktionssysteme zu Behinderungen des
jeweils anderen Systems kam.
4.3.1 Tetrazyklin-abhängige Induktion von BMI1 auf mRNA-Ebene
Die Mutterschale jedes zu untersuchenden Zellklons (TOR7 Zeo1, TOR7 Zeo2,
TOR7 Hygro1) wurde im Verhältnis 1:9 in 10 cm-Zellschalen gesplittet, wobei
neben einer neuen Mutterschale zwei Ansätze zu je 4 Zellschalen für die mRNA-
Ernte und den Western Blot entstanden. Diese wurden jeweils auf semikonfluentes
Wachstum gebracht und die Zellschalen dann zeitgleich für die Dauer von 30
CDK2-Ktr.
Bmi-1
TOR7 Hygro1 TOR7 Zeo1 TOR7 Zeo2 Tet21 (Mischklon)
- Tet - Tet - Tet - Tet
58 4 Ergebnisse
Stunden (Tetrazyklin) bzw. 18 Stunden (4-OHT) den angegebenen Bedingungen
ausgesetzt. Nach gleichzeitiger Ernte der Zellschalen jedes Zellklons wurde eine
quantitative Realtime-PCR bzw. ein Western Blot durchgeführt. Nach erfolgter
Erststrangsynthese wurde bei der quantitativen RT-PCR neben einer Leerkontrolle
die cDNA sämtlicher Zellschalen in Doppelansätzen sowohl mit den geeigneten
Primern für BMI1 als auch für S14 eingesetzt.
Abb. 4.5 zeigt die, anhand von S14-mRNA normalisierten, durchschnittlichen
Ergebnisse für BMI1 der einzelnen Zellklone sowie die relative Expression. Die
starke, plasmidgesteuerte Expression von BMI1 durch Tetrazyklin übertraf dabei
jeweils deutlich die durch 4-OHT induzierte Expression des endogenen BMI1. Bei
kombinierter Induktion wurden allerdings keine höheren, teilweise auch nur etwas
geringere Werte erreicht als bei alleiniger Induktion mit Tetrazyklin, was besonders
bei den Zellklonen TOR7 Zeo1 und Zeo2 auffiel. Eine Erklärung hierfür könnte eine
vermehrte Bildung des Tet-Repressors durch freigesetztes E2F-1 oder eines
seiner Zielgene bzw. die Förderung der Bindung an die Operatorsequenz sein.
Somit könnte der durch Tetrazyklin bedingte Effekt bei gleichzeitigem Einsatz von
4-OHT abgemildert worden sein.
4.3 Induktion von Bmi-1 in induzierbaren Neuroblastomzellen 59
Abbildung 4.5: Gesteigerte Expression von BMI1 nach unterschiedlicher Induktion in relativer Darstellung. Aus Zellen, die zuvor für 30 Stunden mit Tetrazyklin bzw. für 18 Stunden mit 4-OHT induziert worden waren, wurde die mRNA extrahiert und die relative BMI1-Menge in der qRT-PCR bestimmt.
4.3.2 Tetrazyklin-abhängige Induktion von Bmi-1 auf Proteinebene
Der Proteingehalt an Bmi-1 der einzelnen Zellklone nach 30 h (Tetrazyklin) bzw. 18
h (4-OHT) unter den oben beschriebenen Bedingungen wurde mittels Western Blot
gemessen. Auch hier zeigte sich die stärkere Expression von Bmi-1 unter dem
Einfluss von Tetrazyklin im Vergleich zur indirekten Induktion durch 4-OHT, wobei
nach optischer Einschätzung die Bmi-1-Expression bei den Klonen TOR7 Hygro1
und Zeo1 nach 4-OHT nicht die entsprechenden Werte aus der qRT-PCR erreichte
(Abb. 4.6). Ebenfalls auf Proteinebene bestätigt wurde die gemessene gleiche
bzw. etwas geringere mRNA-Menge in der qRT-PCR bei gleichzeitiger Induktion
durch Tetrazyklin und 4-OHT, was wiederum Folge einer möglichen, verstärkten
60 4 Ergebnisse
Bindung des Tet-Repressors an die Operatorsequenz gewesen sein könnte. Diese
zellulären Werkzeuge, deren Grundlage eine getrennte Kontrolle von reiner Bmi-1-
Expression und E2F-1-Aktivität mit nachfolgender Bmi-1-Steigerung ist, wurden als
Grundlage der folgenden Experimente verwendet.
Abbildung 4.6: Nachweis der gesteigerten Bmi-1-Menge im Western Blot nach unterschiedlicher Induktion. Der Proteingehalt von Zellen, die zuvor entweder keine Induktion, eine Induktion über 30 Stunden mit Tetrazyklin bzw. über 18 Stunden mit 4-OHT oder eine kombinierte Induktion durchlaufen hatten, wurde mit Hilfe eines Antikörpers gegen das Bmi-1-Protein bestimmt.
4.3.3 Einfluss der erhöhten Bmi-1-Aktivität auf Zellzyklus und Apoptose
Die Aktivierung von E2F-1 induziert in SK-N-SH-EP Neuroblastomzellen Apoptose.
Um zu überprüfen, ob auch nur die erhöhte Expression des E2F-1-Zielgens BMI1
ausreicht, den programmierten Zelltod auszulösen, wurde der Zellklon TOR7 Zeo2
ausgewählt und für die FACS-Analyse vorbereitet, wobei die Induktionsdauer wie
bei den vorherigen Experimenten bei 30 Stunden für Tetrazyklin und bei 18
Stunden für 4-OHT lag. Es wurde der DNA-Gehalt von jeweils mindestens 50.000,
nach der Ernte in 70%igem Ethanol fixierten Zellen durch ein Becton-Dickinson
FACScalibur-Gerät ermittelt und somit eine Zuordnung der Zellen in ihre Phase im
Zellzyklus vorgenommen.
TOR7 Hygro1 TOR7 Zeo1 TOR7 Zeo2
Bmi-1
CDK2-Ktr.
- Tet 4-OHT Tet - Tet 4-OHT Tet - Tet 4-OHT Tet 4-OHT 4-OHT 4-OHT
4.3 Induktion von Bmi-1 in induzierbaren Neuroblastomzellen 61
Wie Abb. 4.7 zeigt, befanden sich in den unbehandelten Populationen 68,2% der
Zellen in der G0- bzw. der G1-Phase des Zellzyklus. Der Anteil apoptotischer Zellen
mit sub-diploidem DNA-Gehalt lag bei lediglich 1,4%. Die Aktivierung des E2F-1-
ER-Fusionsproteins führte zu einem Anstieg der Zellen in den Phasen S, G2 und
M des Zellzyklus auf Kosten diploider Zellen. Zudem war der Anteil apoptotischer
Zellen mit 8,1% deutlich erhöht. Im Gegensatz dazu bewirkte die Behandlung mit
Tetrazyklin alleine keine Veränderungen im Vergleich zu unbehandelten Zellen.
Weder zeigte sich ein Anstieg an apoptotischen Zellen noch ergab sich eine
Änderung der relativen Verteilung auf die Zellzyklusphasen. Somit waren die
Zellpopulationen, in denen gleichzeitig E2F-1 aktiviert und Bmi-1 überexprimiert
wurde, in ihrer Zellzyklusverteilung nicht von Zellpopulationen zu unterscheiden,
bei denen nur E2F-1 aktiviert worden war. Diese Daten erlauben den Schluss,
dass die Überexpression von Bmi-1 nicht ausreicht, um den Einfluss von E2F-1 auf
Neuroblastomzellen nachzuahmen.
A)
Tetrazyklin + 4-OHT
4-OHT
keine Induktion Tetrazyklin
62 4 Ergebnisse
B)
Abbildung 4.7: Die Überexpression von Bmi-1 beeinflusst weder die Zellzyklusverteilung noch die Apoptose. In der FACS-Analyse wurde nach 30-stündiger Induktion mit Tetrazyklin bzw. 18-stündiger Induktion mit 4-OHT der Anteil der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen ermittelt. A) FACS-Diagramm. B) Prozentuale Verteilung der Zellen auf die einzelnen Zellzyklusphasen bzw. apoptotische Zellen.
4.3.4 Expression von Bmi-1 im Verlauf des Zellzyklus
Nach den Experimenten zur Ermittlung, ob eine erhöhte Bmi-1-Expression
Auswirkungen auf den Zellzyklus hat, wurde zur Beantwortung der Frage, ob die
Bmi-1-Expression abhängig vom Zellzyklus ist, der Arrest von TOR7-Zellen in der
G0-Phase nach Kontaktinhibition zeitgleich aufgehoben und die Zellen
anschließend zu unterschiedlichen Stundenwerten geerntet, um deren Bmi-1-
Gehalt zu bestimmen.
Voraussetzung für die Ermittlung der Bmi-1-Expression während der
unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus war eine Zellpopulation, die sich zum
Zeitpunkt der Messung nahezu vollständig in derselben Zyklusphase befinden
musste. Hierfür wurde das Verfahren der Synchronisation durch Kontaktinhibition
4.3 Induktion von Bmi-1 in induzierbaren Neuroblastomzellen 63
gewählt, für das TOR7-Zellen gleichmäßig in 10 cm-Zellschalen ausgesät und
kultiviert wurden, bis ein dichter, lückenloser Zellrasen entstand. Durch den
gegenseitigen Kontakt der Zellen wurde die Bildung zelleigener
Wachstumsfaktoren unterdrückt und somit der Austritt der Zellen aus der Phase G0
bzw. der Eintritt von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus verhindert. 48 h nach
Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen gepoolt, verdünnt ausplattiert und somit
die Kontaktinhibition aufgehoben, wobei die ersten Zellen bereits als 0 h-Wert für
die quantitative Realtime-PCR und die FACS-Analyse geerntet wurden. Die
anderen Zellen wurden entsprechend 4 h, 8 h, 12 h, 16 h und 20 h nach
Wiedereintritt in den Zellzyklus geerntet und ebenfalls für die quantitative Realtime-
PCR und die FACS-Analyse vorbereitet.
Abbildung 4.8: Zellzyklusverteilung von TOR7-Zellen 4 bzw. 20 Stunden nach Wiedereintritt in den Zellzyklus (FACS-Analyse). Die Zellen waren zuvor durch konfluentes Wachstum arrettiert worden und konnten anschließend durch verdünntes Ausplattieren in den Zellzyklus zurückkehren.
64 4 Ergebnisse
Zum Zeitpunkt der Ausplattierung der Zellen befanden sich fast 90% der Zellen im
diploiden DNA-Zustand, während in den Zellzyklusphasen S, G2 und M lediglich
9% der Zellen nachgewiesen werden konnten. Im Laufe der folgenden Stunden
verschob sich der Anteil der Zellen in der G0/G1-Phase zugunsten der anderen
Zellzyklusphasen. Allerdings war der Anteil an Zellen, die nach 20 Stunden in den
Zellzyklus zurückgekehrt waren, mit ca. 25% verhältnismäßig niedrig. Dies könnte
auf Schwierigkeiten bei der Rückführung der Zellen in den Zyklus durch evtl.
mangelnde Verdünnung bei der erneuten Ausplattierung hindeuten. Auch zeigt die
erhöhte Apoptoserate die erschwerten Kultivierungsbedingungen während der
Kontaktinhibition an, wobei sich im Zusammenhang mit den TOR-Zellen auch ein
Synchronisierungsversuch mit wachstumsfaktorfreiem Serum als problematisch
herausstellte. Hier kam es nach Entzug des wachstumsfaktorhaltigen Serums zu
einem raschen Absterben der Zellen, was auf den bestehenden Selektionsdruck
durch wechselnde Antibiotika zurückzuführen sein dürfte.
Die mRNA der zu den Stundenwerten 0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 16 h und 20 h nach
Aufhebung der Kontaktinhibition geernteten Zellen wurde der Erststrangsynthese
und anschließend der quantitativen Realtime-PCR zugeführt. Auch hier wurde
neben einer Leerkontrolle jede cDNA in einem Doppelansatz mit jeweils den
entsprechenden Primern für BMI1, S14 und für CYCLIN E als Positivkontrolle
angesetzt. Cyclin E ist eine regulatorische Untereinheit von cyclinabhängigen
Proteinkinasen und wird Zellzyklus-spezifisch während der G1- und S-Phase
exprimiert. Darüber hinaus ist CYCLIN E ein direktes Zielgen von E2F (Duronio,
1995).
Wie zu erwarten war, stieg die relative Expression von CYCLIN E mit einem
Maximum von 8,8 nach 12 Stunden stark an. Diese deutlichen Unterschiede
zeigten sich bei den Werten für BMI1 mit einer relativen Expression von 0,4 bis 1,6
nicht. Schlussfolgernd darf man davon ausgehen, dass sich die Expression von
Bmi-1 nicht im Verlauf der Progression einer Zelle aus G0 in die S-Phase ändert.
4.4 Induktion der Polycombproteine Hpc2 und Ring1 durch E2F-1 65
Abbildung 4.9: Bmi-1 wird während der G1- bzw. G0-Phase und der S-Phase des Zellzyklus gleichmäßig exprimiert. In Zellen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Kontaktinhibition und Wiedereintritt in den Zellzyklus geerntet worden waren, wurde mittels qRT-PCR der Gehalt an BMI1 und an CYCLIN E als Positiv- kontrolle bestimmt.
4.4 Induktion der Polycombproteine Hpc2 und Ring1 durch E2F-1
E2F-1 induziert mehrere Gene wie EZH2 und EED, die Untereinheiten des zweiten
Polycombprotein-Komplex PRC2 kodieren (Bracken, 2003). Dagegen ist BMI1 das
bislang einzige Gen für ein Protein aus dem PRC1 (Christoph Kramps, persönliche
Mitteilung). Es stellte sich daher die Frage, ob die Expression auch weiterer
Proteine aus dem PRC1 durch E2F-1 induziert wird, da die einzelnen Proteine des
PRC1 jeweils unterschiedliche Auswirkungen auf Zellproliferation bzw.
Zellzyklusarrest haben.
66 4 Ergebnisse
Um diese Frage zu beantworten, wurde der Einfluss von E2F-1 auf zwei
ausgewählte Gene, HPC2 und RING1, untersucht. Es wurde von 1A3-Zellen, die
mit 4-OHT induziert worden waren, in Doppelansätzen eine quantitative Realtime-
PCR erstellt, wobei neben den Primern für HPC2 und RING1 auch die Primer für
das Protein S14 eingesetzt wurden, um eine Normalisierung der Werte vornehmen
zu können. Die Zellen wurden zu unterschiedlicen Zeitpunkten nach Induktion
geerntet, um Informationen über den Expressionsverlauf zu erhalten.
Während für das Protein Ring1 keine Induktion zu erkennen war, kam es beim
Protein Hpc2 zu einer transient schwachen Induktion, die jedoch innerhalb von 12
h wieder nahezu den Ausgangswert erreichte (Abb. 4.10).
Abbildung 4.10: Transient gesteigerte bzw. unwesentlich veränderte Expression von HPC2 bzw. RING1 nach Induktion von E2F-1. Zellen, in denen zuvor das E2F-1-ER- Fusionsprotein durch 4-OHT aktiviert worden war, wurden anschließend zu unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet und mittels qRT-PCR ihr Gehalt an HPC2- bzw. RING1-RNA überprüft, um deren mögliche Rolle als Zielgene von E2F-1 zu klären.
5 Diskussion
5.1 Etablierung eines Zellsystems mit induzierbarer Bmi-1-
Expression
BMI1 wird durch E2F-1 induziert (Nowak, 2006), wobei jedoch unklar war, ob für
die bekannten Effekte von E2F-1 wie Initiation von Apoptose und S-Phaseneintritt
von Zellen BMI1 als essentieller Mediator fungiert. Um einen Teil dieser Effekte
rekapitulieren oder andere Auswirkungen einer erhöhten Bmi-1-Akkumulation in
humanen Neuroblastomzellen (SK-N-SH-EP) beschreiben zu können, wurde zu
Beginn der vorliegenden Dissertation ein Zellsystem etabliert, das als Reaktion auf
ein externes Signal (Tetrazyklin) die Expression von Bmi-1 steigerte.
Das T-REx-System des 1A3-Klons TOR (Kornelius Kerl, persönliche Mitteilung)
erlaubte eine stärkere Induktion von BMI1 und fand daher in den
Folgeexperimenten Anwendung.
Bei solitärer Induktion der endogenen Bmi-1-Expression durch 4-OHT auf das im
Mittel 4,3-fache und solitärer Induktion der exogenen Bmi-1-Expression durch
Tetrazyklin auf das im Mittel 9,8-fache wäre bei gemeinsamer Induktion ein
Summationseffekt zu erwarten gewesen, der jedoch nicht beobachtet werden
konnte. Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass durch 4-OHT freigesetztes E2F-1
oder eines seiner Zielgene unter Umständen die Bildung des Tet-Repressors oder
seine Bindung an die Operatorsequenz fördert und damit die Ablesung des
nachfolgenden Genabschnitts verhindert. Man könnte daher in weiteren
Experimenten versuchen, diesen Effekt durch eine höhere Konzentration von
Tetrazyklin und somit verstärkter Hemmung des Tet-Repressors zu umgehen.
Es erscheint zunächst naheliegend, dass keine anderen Gründe für den
reprimierenden Effekt bei simultaner Induktion vorliegen, da sich das Prinzip der
Bmi-1-Anreicherung lediglich durch die vorgeschaltete E2F-1-Induktion
unterscheidet. Außerdem übertraf die Bmi-1-Menge nach simultaner Induktion die
Menge nach solitärer Induktion durch 4-OHT, erreichte jedoch nicht die Bmi-1-
68 5 Diskussion
Akkumulation nach solitärer Induktion durch Tetrazyklin. Allerdings wäre eine
Rückkopplungsschleife denkbar, mit Hilfe derer Bmi-1 seine eigene Synthese
kontrolliert. In diesem Fall würde die exogene Bmi-1-Anreicherung einen
Schwellenwert überschreiten und in Folge die Synthese des endogenen Bmi-1
reprimieren.
Eine weitere Möglichkeit, den Effekt der unerwünschten Einflussnahme zu
umgehen, wäre die Verwendung eines anderen Zellsystems wie z.B. die o.g. Tet-
21-Zellen. Für zukünftige Experimente mit erhöhter Bmi-1-Menge in
Neuroblastomzellen sollte somit vorerst auf das rein Tetrazyklin-gesteuerte System
zurückgegriffen werden, da dieses die stärksten Ergebnisse sowohl auf mRNA- als
auch auf Proteinebene lieferte.
weitere
Zielgene
E2F-14-OHT Tet-RepressorBmi-1 Tetrazyklin
?
? ?
Abbildung 5.1: Vereinfachte Darstellung der simultanen Induktion der E2F-Aktivität und Bmi-1- Expression mit 4-OHT und Tetrazyklin in den verwendeten Neuroblastomzelllinien. Aufgezeigt werden hier mögliche Fakoren, die bei gleichzeitigem Einsatz von 4-OHT und Tetrazyklin die Bmi-1-Expression hemmen könnten.
5.2 Bmi-1-Überexpression ohne Auswirkung auf S-Phase und Apoptose 69
5.2 Bmi-1-Überexpression ohne Auswirkung auf S-Phase und
Apoptose
Die Messung der auf gleiche Weise vorbehandelten Zellen in der FACS-Analyse
ergab erwartungsgemäß jeweils einen erhöhten Anteil an Zellen in der S-Phase
sowie an apoptotischen Zellen nach Induktion mit 4-OHT und damit gesteigerter
E2F-1-Aktivität (Denchi, 2005; DeGregori, 2002; Stevaux, 2002; Trimarchi, 2002;
Kramps, 2004). Trotz bekannter Repression des Ink4a-Arf-Lokus hatte weder die
erhöhte Expression von Bmi-1 durch Induktion von E2F-1 noch die Überexpression
von Bmi-1 durch Induktion mit Tetrazyklin einen Einfluss auf die Stimulation des S-
Phaseneintritts bzw. die Apoptose-Rate der Neuroblastomzellen. Zum einen
könnte der Einfluss von E2F-1 auf S-Phase und Apoptose völlig unabhängig von
Bmi-1 ablaufen. Zum anderen ist die Bmi-1-Menge unbekannt, die für die
Ausübung aller Funktionen benötigt wird. Die natürlicherweise in den
Neuroblastomzellen vorkommende Bmi-1-Konzentration könnte also bereits
ausreichend sein, so dass das zusätzlich induzierte Protein keinen detektierbaren
Effekt zeigt. Um diese Überlegungen zu verifizieren, wäre zunächst die Etablierung
eines zellulären Systems erforderlich, in dem funktionstüchtiges Bmi-1 entweder
durch den Einsatz der Deletionsmutante Bmi-1-ΔRF oder durch RNA-Interferenz
unterdrückt wird. Letzteres wurde zwischenzeitlich bei Neuroblastomzellen
angewendet, wobei im Vergleich zur Kontrolle ein verlangsamtes Zellwachstum
und eine erhöhte Apoptoserate nach 3 Tagen beobachtet werden konnte (Liu,
2006), was die These eines relativ niedrigen Schwellenwertes für die Ausübung
der Bmi-1-Effekte unterstützen würde. Ob auch die Fähigkeit von E2F-1, in Zellen
den Übertritt in die S-Phase des Zellzyklus zu initiieren, von der Abwesenheit des
Bmi-1-Proteins beeinflusst wird, könnte in Folgeexperimente untersucht werden.
Zudem wären im Vergleich mit Zellen, in denen die Bmi-1-Expression vollständig
unterdrückt wurde, die Auswirkungen unterschiedlich hoher Bmi-1-Konzentrationen
ermittelbar. Festzustellen ist jedoch zum jetzigen Zeitpunkt, dass eine über das
70 5 Diskussion
natürliche Maß hinaus gesteigerte Bmi-1-Akkumulation in Neuroblastomzellen
nicht zu verändertem Zellzyklusverhalten führt.
E2F-1
S-Phase
Apoptose
Bmi-1
?
Abbildung 5.2: Mögliche Einflussnahme von Bmi-1 auf E2F-1-gesteuerte Funktionen.
5.3 Bmi-1-Expression verläuft unabhängig von Zellzyklus-
Progression
Bmi-1 wird unabhängig von der Progression einer Zelle aus der G0- in die S-Phase
des Zellzyklus exprimiert. Bei der durch Kontaktinhibition synchronisierten
Zellpopulation von TOR-Neuroblastomzellen wurde der Zellarrest in der G0-/G1-
Phase zeitgleich aufgehoben, wobei das synchrone Verhalten der Zellpopulation
mit Hilfe von Cyclin-E-Primern dokumentiert wurde. Die entsprechenden
Stundenwerte der relativen mRNA-Menge von BMI1 schwankten zwischen 0,4 und
1,4, so dass eine Abhängigkeit der Bmi-1-Expression von den untersuchten
Zellzyklusphasen ausgeschlossen werden kann. Dies überrascht insofern, als eine
Reihe von E2F-1-regulierten Genen eine Zellzyklus-abhängige Expression zeigen
(Dimova, 2005; DeGregori, 2002). Zudem sind auch die direkten Effekte von Bmi-1
auf den Zellzyklus durch seinen reprimierenden Einfluss auf die CDKI p16Ink4a und
p19Arf bekannt. Die Inhibition von p16Ink4a führt u.a. zur vermehrten
Phosphorylierung von pRB und damit zur Aktivierung der E2F-Zielgene, sowie der
Induktion von S-Phaseneintritt und Apoptose. Die Inhibition von p19Arf fördert
Mdm2 und hemmt damit p53, sowie die durch p53 vermittelten Effekte wie
Apoptose und Zellzyklusarrest (Pomerantz, 1998).
5.3 Bmi-1-Expression verläuft unabhängig von Zellzyklus-Progression 71
Diese Effekte könnten jedoch auch durch posttranskriptionelle
Proteinmodifikationen hervorgerufen werden. Von Bmi-1 ist bekannt, dass es
Zellzyklus-abhängig phosphoryliert wird. Hypophosphoryliertes Bmi-1 in der G1-/S-
Phase ist chromatingebunden, während hyperphosphoryliertes Bmi-1 in der G2-/M-
Phase vom Chromatin dissoziiert (Voncken, 1999). Ob weitere Modifikationen
insbesondere zwischen der G0- und der G1-/S-Phase stattfinden, und ob
fehlerhafte Modifikationen zu verändertem Zellzyklusverhalten führen, ist bislang
unbekannt und sollte in weitergehenden Experimenten untersucht werden.
Darüber hinaus findet man in der Literatur Hinweise darauf, dass sowohl bei
kontaktinhibierten als auch bei Zellen, die durch Entzug von Wachstumsfaktoren
oder Überexpression von p16Ink4a arretiert wurden, der Transkriptionsfaktor E2F-4
und das Pocketprotein p130 mit dem BMI1-Promoter interagieren und somit
möglicherweise die BMI1-Expression behindern (Cam, 2004). Dieser Effekt konnte
jedoch zumindest für die Überexpression von p16Ink4a in humanen
Neuroblastomzellen (IMR-32) nicht bestätigt werden (Nowak, 2006).
Abbildung 5.3: Vereinfachtes Schema eines möglichen Netzwerkes von onkogenen Transkriptionsfaktoren im Neuroblastom und ihre Funktionen im Zellzyklus.
E2F-1 pRbBmi-1 p16
p53p19Myc
Proliferation / Transformation
Zielgene ?
Apoptose
CyclinCDK
72 5 Diskussion
5.4 Hpc2 und Ring1 werden nicht stabil durch E2F-1 induziert
Mehrere Mitglieder des Polycomb-Proteinkomplexes 2 (PRC2) werden von E2F-1-
Zielgenen kodiert, wohingegen aus dem PRC1 bislang nur für Bmi-1 eine Induktion
durch E2F-1 nachgewiesen werden konnte (Muller, 2001; Bracken, 2003). 1A3-
Neuroblastomzellen, die zu unterschiedlichen Stundenwerten nach Induktion mit 4-
OHT und in Folge dessen gesteigerter E2F-1-Aktivität geerntet worden waren,
wurden auf erhöhte Amplifikation der beiden PRC1-Proteine Ring1 und Hpc2
untersucht.
Ring1, Hpc2 und Bmi-1 interagieren miteinander und bestimmen so die
Zusammensetzung des PRC1 (Satijn, 1999a), wobei hier besonders Ring1 (A und
B) und Bmi-1 die Funktion des PRC als Ubiquitin-E3-Ligase festlegen, die Histon
H2A am Lysin 119 monoubiquitiniert (Wang, 2004). Hpc2 interagiert mit dem Rb-
Protein und induziert einen HDAC-unabhängigen Zellzyklusarrest (Dahiya, 2001).
Es enthält zwei konservierte Domänen, bei der die N-ständige Chromodomäne für
die Bindung des Proteins an Chromatin verantwortlich ist (Muller, 1995). Die C-
ständige Domäne ist vermutlich für die Interaktion mit Ring1 mitverantwortlich und
sorgt somit für die Repression der Genaktivität (Bunker, 1994). Hpc2 und Ring1
üben darüber hinaus unterschiedliche Effekte aus. Die Überexpression von Hpc2
führte zu einer Unterdrückung von c-Myc, die Überexpression von Ring1 dagegen
resultierte in Zelltransformation und der Induktion von Tumoren in Nacktmäusen.
Diese Entwicklungen waren zudem von einer starken Erhöhung der Onkoproteine
c-Jun und c-Fos begleitet, was den Verdacht bestärkt, HPC2 als
Tumorsuppressorgen, RING1 dagegen als klassisches Onkogen anzusehen
(Satijn, 1999b).
Die relative mRNA-Menge betrug für RING1 zwischen 0,7 und 0,9, womit
ausgeschlossen werden kann, dass es ein Zielgen von E2F-1 ist. Ring1 verstärkt
also nicht das onkogene Potential von E2F-1 auf direkte Weise. Ob andere
Verbindungen zwischen ihnen existieren, oder ob kritische, regulatorische
Proteinfunktionen durch die Monoubiquitinierung durch das Zusammenspiel von
Bmi-1 und Ring1 ausgelöst werden, werden Folgeexperimente ergeben.
5.5 Ausblick 73
Die relative Expression erreichte für HPC2 auf mRNA-Ebene nach 4 h mit 5,3 ihren
Höhepunkt und kehrte nach 12 h mit 1,8 nahe zum Ausgangswert zurück. Diese
relativ schwache und lediglich transiente Steigerung der Expression lässt nicht auf
eine direkte Induktion durch E2F-1 schließen. Eher wahrscheinlich erscheint eine
Rückkopplungsschleife, bei der die kurzfristige Steigerung an HPC2-mRNA durch
andere Faktoren ausgelöst wurde und Hpc2 sich im Sinne eines negativen
Regulationsprozesses anschließend selbst hemmt. Ob diese transiente Steigerung
an Hpc2 einen Einfluss auf das Zellverhalten hat, könnte in Überexpressions- und
Funktionsverlustansätzen überprüft werden. Auch die Faktoren, die eine
Steigerung der messbaren Hpc2-Menge hervorrufen, sollten hierbei genauer
untersucht werden. Ein möglicher Erklärungsansatz wäre die verstärkte Bindung
von pRb durch das nach Induktion freigesetzte E2F-1 und damit behinderte
Komplexbildung von Hpc2 und dem Rb-Protein (Dahiya, 2001). Untersuchungen
durch den Einsatz von Microarrays könnten die Frage klären, welche Zielgene
Hpc2 induziert, und ob sich hier ein Zusammenspiel mit E2F oder Bmi-1 findet.
5.5 Ausblick
Um das bislang nur lückenhafte Verständnis des Onkogens BMI1 und seines
Proteins als Ziel und Ausgangspunkt genetischer Prozesse zu erweitern, erscheint
es sinnvoll, ein zelluläres System zu etablieren, in dem die Bmi-1-Expression durch
den Einsatz der ΔRF-Deletionsmutante oder siRNA unterdrückt wird. Hierdurch
könnten die Effekte eines fehlenden oder erniedrigten Bmi-1-Spiegels in
Neuroblastomzellen erfasst werden und in Kontext zur erhöhten Expression
gesetzt werden. Darüber hinaus könnte eine Untersuchung mit Microarrays
Hinweise auf weitere, bislang unentdeckte Zielgene von Bmi-1 geben, die
wiederum in Zusammenschau mit dem bisher bekannten Bmi-1-Netzwerk zu
betrachten wären. Dabei ist aber auch die Bmi-1-Interaktion mit anderen PcG-
Proteinen und die daraus resultierende Zusammensetzung der PRCs zu
bedenken, da nur vor dem Hintergrund dieser Komposition die Funktionsweise von
Bmi-1 nachvollziehbar sein wird. Ob diese Zusammenhänge dann jedoch auch auf
74 5 Diskussion
andere Zell- und Tumorzellsysteme als die untersuchten humanen
Neuroblastomzellen zu übertragen wären, bliebe abzuwarten. Letztendlich werden
aber nur in-vivo-Experimente klären können, ob und in wieweit die Überexpression
des Proteins Bmi-1 Auswirkungen auf die Entstehung und Malignität von
Neuroblastomen sowie weiterer Tumoren in Gesamtorganismen hat.
.
6 Zusammenfassung Der Transkriptionsfaktor Bmi-1 ist Bestandteil des Polycomb-Proteinkomplexes
PRC1 und wird beim Menschen in verschiedenen Karzinomen überexprimiert. Das
kodierende Onkogen BMI1 ist ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors E2F-
1, der eine zentrale Rolle in der Regulation von Zellzyklus und programmiertem
Zelltod spielt. Um die Frage zu beantworten, ob und inwieweit Bmi-1 an einzelnen
Teilfunktionen von E2F-1 beteiligt ist, wurde auf der Basis einer humanen
Neuroblastom-Zelllinie ein Zellsystem etabliert, in dem die Expression von BMI1
reversibel induziert werden konnte. Die Prognose des Neuroblastoms, eines
häufigen Tumors des kindlichen Nervensystems, korreliert u.a. mit der
Überexpression mehrerer E2F-Zielgene wie z.B. MYCN und MAD2.
Die Neuroblastom-Zellen zeigten nach Induktion eine bis zu 10-fache Erhöhung
der Bmi-1-Expression. Im Gegensatz zu isogenen Zellen, in denen E2F-1 aktiviert
wurde, ergab sich jedoch keine Änderung im Zellzyklusverhalten oder bei der
Apoptoserate. Dies spricht dagegen, dass die Überexpression von Bmi-1 in
Neuroblastomzellen ausreicht, um E2F-1-regulierte, genetische Programme zu
aktivieren. Andererseits könnte in diesen Zellen die Menge an endogenem Bmi-1
bereits ausreichend gewesen sein, um seine Aufgaben zu erfüllen. In zukünftigen
Experimenten sollen daher auch Ansätze verwendet werden, die die Funktion des
endogenen Bmi-1-Proteins hemmen.
Bmi-1 wirkt durch die Inhibition von p16Ink4a und p19Arf fördernd auf
Zellzyklusprozesse ein. Im Gegensatz zu vielen anderen E2F-regulierten Genen
wird BMI1 allerdings während der G1- bzw. G0-Phase und der S-Phase des
Zellzyklus gleichmäßig exprimiert, was in einer synchronisierten Population von
Neuroblastomzellen nachgewiesen werden konnte.
Die Polycombproteine Bmi-1, Ring1 und Hpc2 interagieren miteinander, üben
jedoch unterschiedliche, teilweise sogar gegensätzliche Effekte aus. Bei den von
mir untersuchten PRC1-Proteinen Ring1 und Hpc2 fand sich keine bzw. lediglich
eine transiente Steigerung nach Induktion von E2F-1. BMI1 ist demnach das
76 6 Zusammenfassung
einzige Gen für eine Komponente des Polycomb-Proteinkomplexes PRC1, das
durch E2F-1 reguliert wird. Nach vorherrschender Meinung wird die molekular-
biologische Funktion eines Polycomb-Proteinkomplexes durch seine
Zusammensetzung bestimmt. Weil E2F-1 nicht die Gesamtmenge des Komplexes,
sondern die relative Menge verschiedener Proteine im Komplex festlegt, könnte
auf diese Weise die Begünstigung von Zellproliferation durch E2F-1 erklärt werden.
Dieses Ergebnis festigt die Position von E2F-1 als herausragender Regulator
zellulärer Prozesse, dessen Einfluss sich über viele genetische Programmabläufe
erstreckt.
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8 Abkürzungen Sofern nicht hier aufgeführt, wurden Abkürzungen entsprechend den Maßangaben der IUPAC (International union of pure and applied chemistry) und denen des SI-Systems (System Internationale de l´Unité) verwendet.
Spezielle Abkürzungen für Fachtermini, die nicht in dieser Liste enthalten sind, werden jeweils im Text erläutert.
AK Antikörper
APS Ammoniumperoxodisulfat
ARF alternative reading frame
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin
C Cytosin
°C Grad Celsius
Cdc cell division cycle
CDKI cyclin dependent kinase inhibitor
Cdk cyclin dependent kinase
cDNA complementary DNA
CMV Cytomegalovirus
Cys Cystein
Da Dalton
dATP 2'-Desoxyadenosintriphosphat
dCTP 2'-Desoxycytidintriphosphat
dGTP 2'-Desoxyguanosintriphosphat
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
dTTP 2'-Desoxythymidintriphosphat
DMEM Dulbecco´s modification of Eagle´s minimal essential
medium
8 Abkürzungen 91
DMSO Dimethylsulfoxid
dn dominant negativ
DNA deoxyribonucleic acid
DTT Dithiothreitol
ECL™ enhanced chemoluminescence
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ER estrogen receptor
FACS fluoresence activated cell sorting
FCS fetal calf serum
G Guanosin
GFP green fluorescent protein
G1-Phase Gap1-Phase
G2-Phase Gap2-Phase
GTP Guanosintriphosphat
Gy Gray
HBS Hepes-gepufferte Salzlösung
HEPES N2-Hydroxyethylpiperazin-N2-Ethansulfonsäure
Ink4 inhibitor of kinase 4
5-JÜR 5-Jahres-Überlebensrate
kb Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
Ktr. Kontrolle
L Liter
LB Luria-Bertani-Medium
m milli
M molar
min Minute
Myc Myelocytomatose Protein
mRNA messenger RNA
µ mikro
92 8 Abkürzungen
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS phosphate buffered saline
PCR polymerase chain reaction
PVDF Polyvinylidendifluorid
qRT-PCR quantitative Realtime-PCR
Rb Retinoblastom
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
U/min Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
RT reverse Transkription
SDS sodium dodecyl sulfate
S-Phase Synthese-Phase
STET Sucrose Triton EDTA
TAE Tris-Acetat/EDTA-Puffer
TBS Tris-gepufferte Salzlösung
TBS-T Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween-20
TE Tris/EDTA (Puffer)
TEMED Tetramethylethyldiamin
Tet Tetracyclin
Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan
U/min Umdrehungen pro Minute
v/v volume to volume
w/o without
WT Wildtyp
w/v weight per volume
9 Verzeichnis der akademischen Lehrer Meine akademischen Lehrer waren die Damen und Herren in Marburg:
Aumüller, Austermann, Basler, Baum, Beato, Behr, Bertalanffy, Bien, Daut, Eilers,
Engenhart-Cabillic, Fruhstorfer, Fuchs-Winkelmann, Geus, Gotzen, Gress,
Grzeschik, Gudermann, Happle, Hasilik, Herrmann-Lingen, Hertl, Hofmann, Hoyer,
Jones, Kern, Kill, Klenk, Klose, Koolmann, Kretschmer, Krieg, Kroll, Lenz, Lill,
Lorenz, Maier, Maisch, Moll, Moosdorf, Mueller, Müller, Neubauer, Oertel,
Pagenstecher, Remschmidt, Renz, Rothmund, Schäfer, Schmidt, Schnabel,
Schüffel, Schulz, Seitz, Seyberth, Vogelmeier, Wagner, Weihe, Werner, v. Wichert,
Wulf
sowie in Aachen:
Borggrefe, Gatzen, Kusche, Möllhoff, Nagel, Paes
10 Danksagung Mein Dank geht an PD Dr. Werner Lutz für die Überlassung des Themas, seine
jederzeit bereitwillige Hilfe und die unermüdlichen Erläuterungen
molekularbiologischer Zusammenhänge. Seiner Unterstützung und Geduld
verdanke ich die Fertigstellung meiner Arbeit.
Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei Prof. Dr. Martin Eilers für die vorbildliche,
wissenschaftliche Leitung der Abteilung.
Für die herzliche Aufnahme in das Team und die Einführung in die Laborarbeit
danke ich der Arbeitsgruppe des Labors Nr. 117. Durch Kornelius Kerl, Sven
Gallinat, Andreas Hock, Jens-Peter Reese und Sovana Adhikary werden mir die
vielen lehrreichen, aber auch die manchmal nicht allzu ernsthaften Momente am
IMT in sehr guter Erinnerung bleiben. Auch bei den anderen Mitarbeitern der
Abteilung bedanke ich mich für die stets angenehme Atmosphäre.
Ein Dank besonderer Art geht an meine Familie, meine Freunde und nicht zuletzt
meine Freundin Silke für die Unterstützung in jeder Situation und die Motivation,
diese Arbeit zu einem erfolgreichen Ende zu führen.