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ENZIMAS DE RESTRICCION
En 1978 Daniel Nathans, Hamilton Smith, y al científico suizo Werner Arber.
Fueron galardonados con el premio Nobel de Medicina por su trabajo en enzimas
de restricción que marcaron un notable avance en el campo de genètica.
La degradación del DNA extraño que ha ingresado a una célula huésped fue
descubierta por infecciones por fagos. Este fenómeno, denominado restricción, es
el resultado de la accion de endonucleasas específicas (enzimas de restricción)
que degradan el DNA extraño. Estas enzimas son codificadas por la bacteria a
nivel cromosómico o plasmidico.
Las enzimas de restricción se llaman también nucleasas de restricción,
endonucleasas de restricción y en algunas ocasiones enzimas restrictivas o
restrictasas. Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético
a partir de una secuencia que reconocen.
Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen
secuencias especificas
Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como
un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que
entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo
cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las
enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo
afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Se nombran con tres letras tomadas del genero y especie de la bacteria de la que
se aislaron originalmente, seguida a veces por una letra mas, que identifica el
serotipo (variante antigénica de la bacteria)y finalmente por numero romano que
las identifica en el caso de que en una misma variante se hayan encontrado varias
enzimas con distintas especificidad:
Ejemplo:
Eco RI à E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Las diversas enzimas de restricción se agrupan normalmente en tres familias de
acuerdo con sus propiedades:
. Tipo I y Tipo III:
a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las
Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o
río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la
secuencia que reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA,
desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
2. Tipo II:
a. Sólo tienen actividad de restricción.
b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia
que reconocen.
c. Sólo requieren Mg++ como cofactor.
d. No necesitan ATP.
¿COMO HACE LA BACTERIA PARA QUE SUS PROPIAS ENZIMAS NO
ATAQUEN SU DNA?
(PAPEL BIOLOGICO DEL SISTEMA METILACION-RESTRICCION O
RESTRICCION-MODIFICACION)
La existencia natural de las nucleasas de restricción en muchas bacterias ofrece
un mecanismo de defensa contra la entrada de material genético de otro
organismo, concretamente de virus bacteriófagos: se trata de los sistemas de
restricción-modificación o metilación-restricción. Para cada enzima de
restricción, una metilasa reconoce la misma secuencia que constituye el sitio de
restricción y une covalentemente grupos metilos a determinadas bases del DNA
en dicha secuencia. En el caso de enzimas tipo II, la metilasa es una proteína
independiente, mientras que las del tipo I y III poseen las actividades nucleasa y
metilasa en su molécula oligomerica, como subunidades que actúan
coordinadamente.
El DNA propio de la bacteria es metilado de una forma específica característica de
cada especie bacteriana. La metilación de las bases impide la unión de la enzima
de restricción, con lo que el DNA propio no es hidrolizado. Por el contrario, al
entrar a la célula DNA de otro organismo, no metilado o con un patrón de
metilación deferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de restricción.
ACCION DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO II
Son estas las reestrictasa estructuralmente mas simples y mejor estudiadas por su
utilidad en ingeniería genética, a modo de ‘tijera’ para el corte del DNA. El sitio de
restricción es a la vez lugar de reconocimiento y de hidrólisis. Se hidrolizan de
forma muy especifica enlaces fosfodiester del DNA, uno en cada hebra
generándose dos fragmentos de restricción. El enlace hidrolizado es siempre el 3’-
P (son endonucleasas de tipo a) por lo que el fosfato queda unido a 5’, dejando en
ambos fragmentos extremos 3’-OH y 5’-P. la reacción no necesita ATP, lo que la
diferencia de la catalizada por las enzimas tipo I y III.
TIPOS DE CORTES DE LAS ENDONUCLEASAS
Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:
Cohesivos o pegajosos:
Cuando la enzima de restricción actua dejando dos extremos 5´que son
complementarios entre sí:
Estos extremos son creados por las endonucleasas tipo II, sin embargo no todas
las enzimas de restricción tipo II dejan así los extremos.
2. Romos:
Diferencias entre los tipos de cortes de endonucleasas:
EcoRI BamHI HindIII
GAATTC GGATCC AAGCTT
CTTAAG CCTAGG AACGAA
SspI SmaI
AATATT CCCGGG
TTATAA GGGCCC
ENZIMASDE RESTRICCION TIPO II EMPLEADAS EN INGENIERIA GENETICA:
APLICACIONES DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
2. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern
Blot”.
3. Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en
“Southern”y “Northern” blotting.
4. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados,
creación de DNA recombinante.
FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA ACTIVIDAD DE LAS
ENDONUCLEASAS
Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y
que pueden afectar la actividad de las mismas:
1. Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza,
contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas
concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.
2. Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en
lo que respecta a su estabilidad y actividad.
3. DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .
4. Contaminantes con carga (-).
5. DNA contaminado con otro DNA.
6. Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.
7. Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es
reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej.
si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para
la enzima).
8. Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para
trabajar en condiciones óptimas.
BIBLIOGRAFIA
Geo. F. Books. Ernest Jawetz MD. ¨Microbiología medica¨. 1ª Edición.
Manual Moderno. 1996. Pag. 107
Patrick R. Murray. Ken S Resenthal. ¨Microbiología Medica¨. 5ª Edición.
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Lewis Benjamín. Genes. 2ª Edición. Editorial. Editorial REVERTE.
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