REPLIKASI DAN REPLIKASI DAN POLYMERASE CHAIN REACTIONPOLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)(PCR)Debbie S. Retnoningrum

Sekolah Farmasi, ITB

Pustaka:1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, hal. 27-28; 110-1202. Groves MJ, 2006, hal. 40 – 443. Brown TA, 2006, hal 6-7; 181-193

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 22

DOGMA SENTRAL BIOLOGI MOLEKULERDOGMA SENTRAL BIOLOGI MOLEKULER

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 33

REPLIKASIREPLIKASI

• Replikasi adalah penggandaan DNA• Sintesis 2 molekul DNA dari 1 molekul DNA• Konsep pasangan basa• Arah 5’ ke 3’ pada untai yang disintesis• Dikatalisis oleh DNA polimerase

www.uic.edu/.../lecture4/replication4.jpg

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 44

KomponenKomponen –– komponenkomponen ReplikasiReplikasi DNADNA

Mulai pada origin of replication (ori)Protein pengikat DNA untai tunggalHelikase (pembukauntai)Primase (RNA polimerase)DNA polimerase

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 55

ReplikasiReplikasi DNADNA

• REPLIKASI DNA:– Pemanjangan untai baru

DNA– dNTP: dATP, dTTP, dGTP,

dCTP– Dikatalisis oleh DNA

polimerase

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 66

Gap filling & DNA repairPol-εReplikasi pada mitokondriaPol-γReplikasi leading strandPol-δGap filling & DNA repairPol-βReplikasi lagging strandPol-α

EukariotReplikasiPol IIIGap filling & DNA repairPol IIGap filling & DNA repairPol I

FungsiProkariot

DNA DNA PolimerasePolimerase

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 77

Polymerase Chain Reaction (PCR)Polymerase Chain Reaction (PCR)

Karry Mullis, penemu PCRPemenang hadiah Nobel

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 88

SIKLUS PCRSIKLUS PCR

94 oC

55 oC

72 oC

SIKLUS 1 SIKLUS 2 SIKLUS 3

T

WAKTU (DETIK)

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 99

SIKLUS PCR dan HASIL AMPLIFIKASISIKLUS PCR dan HASIL AMPLIFIKASI

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1010

Polymerase Chain Reaction (PCR)Polymerase Chain Reaction (PCR)

www.scq.ubc.ca/wp-content/uploads/2006/07/PCR.gif

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1111

KOMPONEN PCRKOMPONEN PCR

• cetakan DNA

• oligonukleotida pendek (primer)

• DNA polimerase termostabil :Taq Polymerase(Thermus aquaticus) & buffer

• dNTP (dATP, dTTP, dCTP dan dGTP)

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1212

Genom yang ditentukan urutannyaGenom yang ditentukan urutannyahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1313

Contoh informasi pada data genBankContoh informasi pada data genBank

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1414

Amplifikasi DNA target dalam genom organismeAmplifikasi DNA target dalam genom organisme

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1515

Amplifikasi DNA targetAmplifikasi DNA target dalam genom organismedalam genom organisme

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1616

DETEKSI PRODUK PCRDETEKSI PRODUK PCR

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1717

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1818

PCR PCR untukuntuk deteksideteksi PatogenPatogen

GEN TARGETP1

P2

PRODUK PCR: 490 pb

TARGET HARUS SPESIFIK PATOGEN

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 1919

PCR UNTUK DETEKSI PATOGENPCR UNTUK DETEKSI PATOGEN

DETEKSI Mycobacterium tuberculosisDNA TARGET: FRAGMEN TARGET IS6110 BERSALINAN TINGGI Bahan dahak

DETEKSI Chlamydia trachomatisDNA TARGET: GEN MAJOR OUTER MEMBRANE PROTEIN = MOMPBahan usap vagina (4), darah (5), mata (6)

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2020

MODIFIKASI PCRMODIFIKASI PCR

• PCR-HIBRIDISASI (PRODUK PCR DIHIBRIDISASI DENGAN PELACAK)

• PCR multipleks• Nested-PCR• PCR-sekuensing• Real-time PCR

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2121

Denaturation

Addition of probe

Hybridization

PRINSIP HIBRIDISASIPRINSIP HIBRIDISASI

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2222

lisis

PCR

denaturasi

hibridisasisubstrat

deteksi kolorimetriΣ molekul target ⇒ Σ sinyal

PCR PCR HIBRIDISASI DENGAN DETEKSI HIBRIDISASI DENGAN DETEKSI KOLORIMETRIKOLORIMETRI

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2323

DETEKSI KOLORIMETRIDETEKSI KOLORIMETRI

Produk PCRBiotin

AvidinHorse radish peroxidase

H2O2

TMB

Pelacak

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2424

PCR MULTIPLEKSPCR MULTIPLEKS

• PASANGAN PRIMER UNTUK DNA TARGET > 1• CONTOH:

– Escherichia coli: GEN TARGET gen LT1, ST1, SLT1, SLT2, VT1, VT2, VTE

– 7 PASANGAN PRIMER– 7 PRODUK PCR

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2525

LT1

ST1

SLT1SLT2VT1VT2VTE

S A B C D

HASIL PCR MULTIPLEKSHASIL PCR MULTIPLEKS

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2626

Contoh Hasil PCR multipleksContoh Hasil PCR multipleks

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2727

NestedNested--PCRPCR

GEN FLAGELIN S. typhiST1

ST2

458 pb

343 pb

PCR pertama

PCR kedua

ST3

ST4

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2828

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 2929

PCR SEKUENSINGPCR SEKUENSING

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3030

PCR REALPCR REAL--TIMETIME

• PCR KONVENSIONAL: – TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI

SECARA KONSEKUTIF

• PCR REAL-TIME– TAHAP AMPLIFIKASI DAN DETEKSI TERJADI

SECARA SIMULTAN

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3131

Deteksi pada PCR konvensionalDeteksi pada PCR konvensional

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3232

Daerah deteksi realDaerah deteksi real--time PCRtime PCR

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3333

PELACAK HIBRIDISASIPELACAK HIBRIDISASI

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3434

PELACAK HIBRIDISASIPELACAK HIBRIDISASI

Sekolah Farmasi ITBSekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi FarmasiFarmasi--FA 4202FA 4202 Replikasi dan PCR Replikasi dan PCR 3535

Contoh hasil realtime PCRContoh hasil realtime PCR