Enrique Jaimovich

Instituto de Ciencias

Biomédicas,

Facultad de Medicina

Universidad de Chile

Regulación de la expresión de genes

en células musculares

Frequency of recruitment

Loa

d

inactivity

controls

strengthtrained

endurancetrained

Continuum of Physical Activity

El músculo es plástico!

El músculo se “adapta” para cumplir con el nivel de exigencia que se le impone; la exigencia está representada por el ejercicio

El nivel de actividad físicaestá determinado por elreclutamiento y la carga

El músculo se usa más con – entrenamiento de resistencia– entrenamiento de fuerza(no existe un entrenamientoque optimice ambas)

El músculo se usa menos con– reposo prolongado en cama– inmovilización de extremidades– denervación– vuelos espaciales

Mayor utilización: entrenamiento de fuerza

El aumento inicial en la fuerza parece explicado fundame ntalmente porun mayor reclutamiento de fibras.

Mejoras de largo plazo se explican exclusivamente por hi pertrofia

Entrenamiento de resistencia

Poca hipertrofia pero grandes cambios bioquímicos en la adaptación.

Aumenta el número y concentración de mitocondrias y la actividad de encimas oxidativas.

Control 12-weekstreadmill running

Succinate dehy-drogenase (SDH)activity: Low activity lightHigh activity dark

Control Reposo prolongado

Falta de uso:causa atrofia -- USE IT OR LOSE IT!Atrofia individual de fibras (pérdida de miofibrillas)sin pérdida de fibras.

Efecto más pronunciado en fibras tipo II

“Completamente reversible” (en individuos jóvenes y sanos)

Actividad ATPasa

Fibras tipo I claro

Fibras tipo II oscuro

Fibra “fantasma” 3 dias post daño

Reparacion por activacion de celulas satelites

Myology (Sanes, McGraw-Hill, 1994)

Perry and Rudnicki (2000) Frontiers in Bioscience 5:D750-67.

4 días post daño

2 semanas post daño

4 semanas post dañocon irradiación

Ratón knockout para miostatina y F66

Se-Jin Lee, PLos ONE, 2007

Histología del Músculo Esquelético – Tipos de Fibras

Tipo de fibra

Tipo I(lentas)

Tipo II(rápidas)

Rapidez de contracción

lenta

rápidarápidarápida

Tipo de metabolismo

oxidativo

oxidativooxidativo/glicolíticoglicolítico

MyHC

I

IIAIIXIIB

Resistencia a la fatiga

alta

medianamedianabaja

Nomenclatura

Type I / Slow-oxidative (SO) fibers

Type IIA / Fast-oxidative (FO) fibersType IIX / Fast-oxidative glycolytic (FOG) fibersType IIB / Fast-glycolytic (FG) fibers

Fibras lentasSlow-twitch (type I)

myofibersFalta de uso

Entrenamiento de resistenciaEnvejecimiento

Plasticidad del Músculo EsqueléticoEntrenamiento de fuerza

Cambios hormonales

Fibras rápidasFast-twitch (Type II)

myofibers

Control Reposoprolongado

Falta de uso

Actividad ATPasa

Fibras tipo I claro

Fibras tipo II oscuro

Entrenamiento de resistencia

Control 12-semanascorrer en cinta

Actividadsuccinatodehidrogenasa(SDH): Claro: baja act.Oscuro: alta act

Regulación de la transcripción

Regulatory mechanisms that control calcium-dependent c-fos transcription inneurons. At least two separate cis-acting regulatory elements are critical forcalcium-dependent c-fos transcription: the CaRE and the SRE. These elements,as well as the protein complexes that are recruited to each of these elements, areshown. The transcribed region (dark green) and the c-fos mRNA produced bythe c-fos gene (dark green) are also shown.

Favell & Greenberg, Annu. Rev. Neurosci. 2008. 31:563–90

Bers (2002)Nature 415: 198-205

Estimulación hormonal, músculo cardíaco

Regulación de la contracción

Webb (2003) Adv Physiol Edu 27: 201

Músculo liso

ROS Ca2+

MAPK CaM kinase

Calcineurin

HIF-1αααα PPARαααα/d

NFAT

PGC-1αααα

Músculo Esquelético – Vías de Señalización

Oxidative phosphorylation

& mitochondrial function

Glucose Uptake

Fiber Type Transformation

Faty Acid Uptake

& Oxidation

MEF2

? ?

A number of energy-sensing molecules have been shown to sense variations in energy homeostasis and trigger regulation of

gene expression. The AMP-activated protein kinase, hypoxia-inducible factor 1, peroxisome proliferator-activated receptors,

and Sirt1 proteins all contribute to altering skeletal muscle gene expression by sensing changes in the concentrations of

AMP, molecular oxygen, intracellular free fatty acids, and NAD(+), respectively.

Sirt1

AMPKAMP

O2 FFA

NAD+

Wang et al. PLoS Biol v.2(10); Oct 2004

Fibra de músculo esquelético

We have used cultured myotubes as models of muscle cell

plasticity upon electrical and hormone stimulation

Upon membrane depolarization, muscle cells loaded with a

calcium sensitive dye (fluo-3), show two types of signals:

A fast calcium signal associated to contraction

A slow calcium signal, not related to contraction and with a

distinct, long lasting nuclear component

Interval between imáges: 130 ms

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Flu

ores

cenc

e (

∆∆ ∆∆F/

Fo)

Time (s)

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Flu

ores

cenc

e (

∆∆ ∆∆F/F

o)

Time (s)

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Flu

ores

cenc

e (

∆∆ ∆∆F/

Fo)

Time (s)

Myotubes loaded with Fluo-3,Stimulated 45 Hz 400, 1ms pulses

Fast (e-c coupling) and slow (e-t coupling) signals

Nucleus

SR

T-tubule

Estímulo

Sensor

mRNA

TranscriptionFactor

DNA

Excitación-Transcripción

Ca2+

Nucleus

SR

T-tubulePLC

DHPR

IP3R

IP3R

Ca2+

IP3

DAGGβγβγβγβγ

+-+-PV-NES-DsRed

600Time (min)

Activation of STAT3 by electrical stimulation ofMyotubes

p Y705 STAT3

STAT3 total

a) pSTAT3 induction by electrical stimulation is dependenton Intracellular Ca2+

b) Inhibition of JAK2 by 50 µµµµM HBC suppress theincrease in pSTAT3 levels

pSTAT3

ββββ-actin

Time (min) 0 60 60 + 50 uM HBC

0 60 60 + HBC

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5

n=2

0.000 60.0000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0 ControlPV-NES *

**

n=3** p<0,001** p<0,01

Time (min)

Control DepolarizedRNA samples

cDNA labeling withCy3 or Cy5-dUTP

Oligonucleotide Microarray(Compugen 22K oligomouse)

Hybridization at 55ºC O.N.

ComputationalAnalysis

Dual-laserscanner

(635 and 532nm)•Software GenePixPro3.0•MicroArray database

Genes modulated in C2C12 myotubes after K+

depolarization. 127 genes were found whose

expression changed at least 1.7-fold up or down

under depolarizing conditions. Starting from these

selected genes, functional classification was done

with Tier3 biological process analysis.

Functional clasification of genes

modified after depolarization

N° of genes Tier 3 Biological Process58 metabolism34 cell growth and/or maintenance20 cell communication9 response to external stimulus9 response to stress8 morphogenesis6 cell death6 death4 cell motility2 cell differentiation2 embryonic development2 response to endogenous stimulus1 pattern specification1 bone remodeling1 pigmentation

-30

-20

-10

0

10

20

30

Time (hrs)

Num

ber o

f gen

es

2 4 18 24

Up-regulated genes

Down-regulated genes

Maximal expression or repression of genes at different times

Depolarization-induced slow calcium transients incr easeIL-6 mRNA levels in skeletal muscle cells

U73122 - + - + - +

K+ (h) 0 3 4

GAPDHIL-6

A. K+ (h) 0 2 3 4

2-APB - + - + - + - +

GAPDHIL-6

0

100

200

300

400

500

IL-6

mR

NA

(%

of c

ontr

ol)

***

K+

2-APBU73122

---

-+-

+--

++-

---

--+

+--

+-+

Skeletal muscle excitation-transcription coupling

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

∆∆ ∆∆F/F

0

Time (s)

original signal double exponential fit

18.02 s2.1s

ττττ2ττττ1

Is the slow calcium signal present inadult muscle fibers?

What about the whole muscle stimulating the nerve…

ATP is released after stimulus …and it is degraded

E-T complex

PLC

PI3K

miofilamentos

Matrizextracelular

citoesqueleto

• Estas proteínas se localizan en el citoplasma, núcleo, citoesqueleto, sarcolema, y MEC.

Cohn and Campbell (2000) Muscle Nerve 23:1459-1471.

• Desde el descubrimiento de la distrofina, se han descrito numerosas genes y susproteínas-producto, llevando a los fenotipos celulares y generando modelos para el estudiode las patogénesis de las distrofias.

Distrofias Musculares:Patologías a menudo fatales de deterioro muscular•En el pasado, las distrofias musculares se clasificaron de acuerdo a los síntomas, diferenciassutiles en la presentación clínica como la edad de inicio, músculos involucrados, velocidad de progresión, forma de herencia.