Post on 31-Aug-2019
Purificarea și caracterizarea enzimelor
Etape
Alegerea sursei enzimatice
Prepararea extractului
Separarea cromatografica
verificarea purității
Metode de separare fizică / concentrare
dializa
ultrafiltrarea
centrifugarea
monitorizarea activității enzimatice
Imobilizarea enzimelor
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.1. Prepararea
extractuluimicroorganisme
plante
Alegerea sursei
Procariote
(archea, eubacterii)
Eucariote
Drojdii
Fungi
ciuperci
tirozinaza
muscată
tutun
Spanacnitroreductaza
E.Wilson,Spinach enzyme break down explosives,
Chem. Eng. News, 1998, 76 (33),40
R.Blasco,P.J. Aparicio, F. Castillo,
Archives of Microbiology,1995, 4,248–253
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.1. Alegerea sursei
plante
Alegerea sursei
Arabidopsis thaliana
glicozil transferaza
Organism model în biologia
plantelor
genom mic 114.5 Mb/125 Mb total
5 cromozomi
http://oregonstate.edu/
Tehnologia ADN-ului recombinat
bacterii, fungi
origine
animalăFicat de porcesteraza
Ficat de calAlcool dehidrogenaza
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.1. Alegerea sursei
Organisme marine superioare (mușchi)
http://fishes-images.blogspot.ro/
macrou Atka
http://wdfw.wa.gov/fishing
creveți Botan
http://www.iowadnr.gov/
crap
http://www.dpi.nsw.gov.au/
păstrăv curcubeu
http://barnegatshellfish.org/
scoici Saint-Jacques
transglutaminaza
Kevin Ahern's Biochemistry
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.1. Alegerea sursei
Organisme marine superioare
proteaze
http://www.sea-ex.com/
Crab de noroi
http://www.fao.org/figis/
sardină pion portocaliu
http://www.seafoodsource.com/
doradă
http://www.fooduniversity.com/
calcan
http://www.bim.ie/media/bim/
Pește roșu de adîncime
amilază
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.1. Alegerea sursei
Organisme marine superioare
ch
imo
trip
sin
a
pepsină
http://blog.turners-seafood.com/
cod atlantic
http://www.river2seausa.com/
Rac de râu
http://oceana.org/marine-life/
crevete alb
http://nergard.no/sites/
capelinul arctic
http://www.sciencewithmyrt.com/
Bureți marini
Bacterii asociate
cu bureți marini
(act. extracelulară)
bacterii heterotrofe
(apa de mare)
A.Feby, S. Nair,
AdvBiosciBiotech, 2010, 1,330-337
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.1. Surse de enzime din plante/animale utilizate în tehnologiile alimentare
Enzima Sursa Actiunea asupra
alimentelor
Aplicații
În industria
alimentară
-amilaza Semnițele cerealelor
(grâu, orz)
Hidroliza amidonului la
oligozaharide
Fabricarea pâinii
Fabricarea berii
-amilaza Cartofii dulci Hidroliza amidonului la
maltoza
Fabricarea
siropului din malț
papaina Latexul necopt al
fructului de papaya
Hidroliza proteinelor
alimentare sau din
industria alcoolului
Frăgezirea cărnii,
prevenirea
tulburării berii
bromelaina Tulpina sau sucul de
ananas
Hidroliza proteinelor
musculare sau din țesutul
conjunctiv
Frăgezirea cărnii
ficina latexul smochinelor Asemeni bromelainei Asemeni papainei
și bromelainei
Cost mare de
producție
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.1. Surse de enzime din plante/animale utilizate în tehnologiile alimentare
Enzima Sursa Actiunea asupra
alimentelor
Aplicații
În industria alimentară
Tripsina Pancreas
bovin/porcin
Hidroliza proteinelor
alimentare
Producerea de hidrolizate
pentru aromatizarea
mâncării (înlocuiește
proteinazele microbiene)
Chimozina Stomacul vițeilor Hidroliza k-caseinei Coagularea laptelui în
industria brânzeturilor
Pepsina Stomacul bovinelor Asemeni chimozinei și
hidroliza generală a
caseinelor din lapte
Se găsește alaturi de
chimozină în “cheag”
Lipaza
Esterază
Laringele caprelor
sau mieilor
Hidroliza trigliceridelor Intensificarea aromelor în
brânzeturi: modificarea
funcțiilor grăsimilor prin
transesterificare
Lipoxigenaza Soia Oxidarea acizilor grași
nesaturați din făinuri
Îmbunătățire a aluatului
de pâine
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.1. Surse de enzime din plante/animale utilizate în tehnologiile alimentare
Enzima Sursa Actiunea asupra
alimentelor
Aplicații
În industria alimentară
Lizozima Albușul de ou Hidroliza peretelui
polizaharidic al celulei
bacteriene
Prevenirea defectelor de
umflare din brânză de
către bacterii care
formează spori
Lactoperoxidaza Zer-stomacul
bovinelor tinere
Oxidarea tiocianatului
la hipotiocianat
(OSCN-)
Sterilizarea la rece a
laptelui
Localizarea enzimelor
- enzime solubilizate în diferite lichide biologice (sânge, urină,
lichid cerebrospinal, citoplasmă, mediu cultură microbiană);
- enzime fixate pe diverse structuri tisulare și subcelulare
Markeri enzimatici
Localizare într-o formațiune subcelulară
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.1. Surse de enzime - microorganismele
biology-igcse.weebly.com
IntracelularăSaccharomyces
Extracelulară Candida și Streptomyces
Invertaza
Intracelularădrojdie
Extracelulară mucegaiuri
β-Galactozidaza
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.2. Metode de separare
fizică / concentrare
ultrasonicarea
Omogenizarea extractului
cicli inghetare-dezghetare
Ruperea
membranelor
celulare
distrugerea enzimatica
a membranei celulare
ultrasonicare
celulele procariote
eucariote
țesuturi animale• zgomotoasă
• reproductibilitatea (denaturare)
2.2. Metode de separare fizică / concentrare
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.2. Metode de separare fizică / concentrare
presa franceza
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
celulele bacteriene P = 20.000 psi (1360 atm)
Vmin= 40mL samples• scumpă
• zgomotoasă
• timp îndelungat funcționare/curățare
Omogenizatorul
Manton-Gaulin
http://slideplayer.com/
cicli inghetare-dezghetare distrugerea membranei celulare
2.2. Prepararea extractului
joy-of-bioprocess.blogspot.com
- Utilizarea lizozimului
- Utilizarea detergentilor
www.plospathogens.org
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
celulele bacteriene
animale
+ ieftină•reproductibilitatea (denaturare)
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
A. Precipitarea la pH = pI
Papaina (papaia) pI = 8,85
Ureaza (fasole) pI = 5 - 5,1
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
EP0220921A3(1) subtilizină Carlsberg
(2) enzimă din Bacillus sușa
(3) enzimă din Bacillus sp.
(4) enzimă din Bacillus sp. filmus
(5) enzimă din Bacillus firmus
(6) enzimă din Bacillus sacchariticus
B. Precipitarea cu (NH4)2SO4
precipitat
Precipitarea fracțiunilor
care contin HSA
a) Inainte de adaugarea sarii;
b) Suspensie de precipitat proteic in
solutie 85% de sulfat de amoniu;
c) Precipitat proteic - centrifugare
60 min la 5000 rpm.
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
Precipitarea extractului de cucumisină
(serin protează din pepene galben)
Gagaoua M, Hafid K (2016) Three Phase
Partitioning System, an Emerging Non-
Chromatographic Tool for Proteolytic
Enzymes Recovery and Purification.
Biosens J, 5:134
doi:10.4172/2090-4967.1000134
B. Precipitarea cu NH4(SO4)2
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
C. Precipitarea cu PEG
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
M C, Madhusudhan, Kv, Raghavarao & Nene, Sanjay. (2008).
Integrated process for extraction and purification of alcohol
dehydrogenase from Baker’s yeast involving precipitation and aqueous
two phase extraction. Biochemical Engineering Journal. 38. 414-420.
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
D. Precipitarea cu solventi organici
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
Acetona
EtOH
Kalikreina urinară porcină
fracționare cu 50 - 75 % acetonă
Tschesche H., Mair G., Förg-Brey B., Fritz H. (1976) Isolation of Procine
Urinary Kallikrein. In: Sicuteri F., Back N., Haberland G.L. (eds) Kinins.
Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 70. Springer, Boston,
MA
M. A. Mariño, S. Freitas and E. A. Miranda,
Brazilian Journal of Chemical Engineering,
32, 02, 325 - 333, 2015
1.3. Dializa
Amestec
supus
dializei
Sac de
dializa
A B
Solutie tampon
enzima
Molecule mici
difuzie
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
http://www.spectrumlabs.com/
https://www.thermofisher.com/
Saci de dializa
(esteri celuloza)
http://static.coleparmer.com/
https://www.thermofisher.com/
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
https://www.gbiosciences.com
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
https://schoolworkhelper.net/
Ultrafiltrarea
N2 (presiune)
Sticla
sinterizata
Ultrafiltrat
Membrana
Magnet pentru
agitareSolutia de enzimă
supusa concentrarii
Agitator magnetic
Membrane semipermeabile
- Acetat de celuloza
- Nylon
- polivinilidena
Mai rapida decat dializa
Concentrarea probei
http://www.sigmaaldrich.com/
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
Membrane semipermeabile
-presiune-
www.ebay.tv
http://www.emdmillipore.com/
Membrane
semipermeabile/centrifugare
www.fishersci.com
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
Ultrafiltrarea
Centrifugarea
rPrecede operatii
sonicare
precipitare
Separarea
M
forma
densitate
natura
solventului
Viteze mici < 6000 rpm
Particule mai mari
nucleu celulele roșii
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
m0(1 – v)2r = fv = fdr
dt
Centrifugarea
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
v =dr
dt
m0(1 – v)2r
f=
Viteza de sedimentare
Coeficientul de sedimentare
s =v
2r
m0(1 – v)
f=
Ultracentrifugarea
Viteze mari > 20000 rpm
Organite celulare
mitocondrii reticulul
endoplasmatic
1 Svedberg = 1S = 1 x 10-13 s
Hemoglobina 4,5 S
Mioglobina 1,8 S
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
http://image.slidesharecdn.com/
http://www.visionlearning.com/
http://www.biologydiscussion.com/
Ultracentrifugarea
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
Ultracentrifugarea
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
https://www.slideserve.com/nira
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
anticoagulant
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
Diferențe între ser și plasmă
2. Purificarea și caracterizarea enzimelor
2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor
industrial
De să purificăm
enzimele?
Analitic
Terapeutic
Rhodosporidium babjevae
(fung, căpșuni putrezite)
Arthrographis curvata
(ascomicete, turtă ulei măsline)
student doctorand
Laboratory of Vegetal Biotechnology
and Molecular Biology
Group of Applied Mycology
Moulay Ismail University
Faculty of Science, Meknes, Marocco
Activitatea lipazei