Purificação e caracterização do

anticorpo anti-DRG11

Alunas:•Cristina Pinto•Diana Trigo

Sistema Nociceptivo

Injury

Peripheral Nerve

Dorsal Root

Ganglion Dorsal Horn

Lateral Thalamus

Somatosensory Cortex

percepção do estímulo

condução do estímulo

processamento da resposta

DRG11: papel na nocicepção• Identificação do local de

expressão da proteína DRG11 por hibridação com RNAm

• Observação do fenótipo de ratinhos knockout [Chen et al, 2001]

Importância da proteína DRG11

no desenvolvimento

do sistema nociceptivo

Gentilmente cedido pela Prof. Sandra Rebelo

DRG11, factor de transcrição com 30 DRG11, factor de transcrição com 30 kDa da família das proteínas kDa da família das proteínas homeodomainhomeodomain

11 263263HomeodomainHomeodomain

DNA bindingDNA binding

OAROAR

Interacção Proteína-proteínaInteracção Proteína-proteína

Anti-drg11Anti-drg11

OAROAR

Interacção Proteína-proteínaInteracção Proteína-proteína

Anti-drg11Anti-drg11

Glutationa S-transferaseGlutationa S-transferase

GSTGST

Proteína Recombinante (46kDa)Proteína Recombinante (46kDa)

103103

•Obtenção dos anticorpos anti DRG11

Proteína de fusão GST-DRG11 (C-terminal)

Soro

Purificação e caracterização do anticorpo:

SoroPurificação dos anticorpos por Cromatografia de Afinidade

Doseamento de IgG anti-DRG11

Imunoblotting

Imunofluorescência

Cromatografia de AfinidadeLavagens da resina desefarose + GST-DRG11

Incubação da resina com soro “overnight”

Separação do sobrenadante

Montagem da Coluna

Cromatografia de Afinidade

Eluição por adição de solução de Glicina a pH 2,3

Recolha de 10 amostras com bomba peristáltica

Neutralização com Tris a pH 8,5

Doseamento Proteico: Método de Bradford

• Princípio: o reagente de Bradford (corante de azul de Coomassie em àcido fosfórico) liga-se covalentemente às proteínas , numa reacção acompanhada de alteração da cor do reagente em meio ácido. [Bradford MM (1976)]

Doseamento Proteico:• Determinação da recta padrão:

– Prepararam-se 5 amostras com diferentes concentrações de “bovine serum albumin”(BSA) e reagente de Bradford

– Mediram-se as respectivas absorvâncias num espectrofotómetro a 595nm

– Traçou-se a curva de calibração

Recta Padrão

y = 33,895x - 14,067

R2 = 0,9846

05

10152025

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Absorvância

Qu

anti

dad

e B

SA

(u

g)

Gráfico 1

Doseamento Proteico:

• Preparar 10 eppendorfs com:– cada amostra do

anticorpo purificado– água– reagente de Bradford

• Medir as absorvâncias

• Determinar as concentrações das amostras a partir da equação da recta padrão

imunopurificação anti-drg11

0

200

400

600

800

1000

0 2 4 6 8 10 12

fracções

Qu

anti

dad

e (u

g)

Gráfico 2

Western Blotting:Montagem da cassete (sistema vertical)

Colocou-se 5µg de proteína de fusão em cada um dos poços

Electroforese

Montagem da cassete de blotting

Transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose

Revelação com Ponceau S

Cortou-se a membrana às tiras (1 tira para cada fracção)

kDa

97

5645

36

Imunoblotting Bloqueio em solução de leite em pó

Incubação com o anticorpo primário (anti-DRG11 de cada fracção )

Incubação com o anticorpo secundário conjugado com Fosfátase Alcalina (AP)

Revelação com NBT + BCIP (substratos da AP)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Conclusão:•Verificou-se a ligação do anticorpo à proteína de fusão através do aparecimento de um precipitado de cor azul, produto da actividade da AP.

•Nas fracções que possuíam uma maior quantidade de anticorpo verificou-se um sinal mais intenso.

imunopurificação anti-drg11

0

200

400

600

800

1000

0 2 4 6 8 10 12

fracções

Qu

anti

dad

e (u

g)

Gráfico 2

Imunoblotting

• Conclusão: O anticorpo encontrava-se funcional, apesar

de ter sido sujeito a condições agressivas aquando da sua purificação.

• O anticorpo revelou-se funcional para proteínas desnaturadas, contudo havia

necessidade de testar a sua actividade em relação a proteínas nativas in loco.

Imunofluorescência

Imunofluorescência

• Usaram-se cortes transversais da região do fígado de embriões de ratinhos com 18dias normais e “knockout”.

• Procedimento:– bloqueio com soro de cabra;– incubação com anti-DRG11 (1/200) da fracção 3;– incubação com anticorpo secundário (anti-rabbit)

conjugado com fluorocromo vermelho (Alexa 594);– observação dos locais de expressão da proteína

usando microscopia confocal;

Imunofluorescência• A proteína apresentou como locais

de expressão o corno dorsal da medula espinhal e gânglios raquidianos, estruturas envolvidas no processamento de estímulos nóxicos.

+/+ -/-

• Concluiu-se que os anticorpos estavam funcionais para futuros trabalhos de investigação.

NOTA: Os anticorpos já foram utilizados em experiências realizadas pelo orientador.

Bibliografia:

• Alberts B. et al., Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Garland Science

• Bradford MM (1976).Anal Biochem. 72: 248-54. • Chen et al (2001).Neuron.31:59-53• http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/

protein.html• http://www.mpibpc.gwdg.dc/abtcilungcn/140/confo

cal/main.html• http://www.roche.appliedscience.com• www.bioscience.com• www4.amerishambioscience.com

Agradecimentos:

• Prof Doutor Carlos Reguenga• Serviço de Histologia e Embriologia

de Abel Salazar • Drª. Sandra Rebelo