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AGENZIA REGIONALE PER LA PROTEZIONE AMBIENTALEDELLE MARCHE
Prove Prove biotossicologichebiotossicologichenella valutazione della nella valutazione della salubrità degli alimentisalubrità degli alimenti
Dr.ssa Gabriella Giorgi
Il Ministero della Sanità con decreto n° 38 del 25/05/1997 ai sensi dell’art.12 del D.Lgs.
N°116/92 ha autorizzato il S.M.S.P. di Pesaro ora
Dipartimento Provinciale ARPAM
come stabilimento utilizzatore di animali
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I saggi biotossicologiciARAARA
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sostanze tossiche di
natura biologica o chimica
potere patogeno di alcuni microrganismi
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I tossici alimentari
Agenti tossici Agenti tossici naturalmente presenti naturalmente presenti
negli alimentinegli alimenti
Contaminanti:Contaminanti:
Sostanze che possono essere Sostanze che possono essere addizionate addizionate volontariamentevolontariamente..
Sostanze che possono pervenire nSostanze che possono pervenire nei ei prodotti alimentari prodotti alimentari accidentalmenteaccidentalmente, , durante le fasi che dalla raccoldurante le fasi che dalla raccolta ta -- produzione produzione portano gli alimenti sulla nostrportano gli alimenti sulla nostra tavola a tavola
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Tossici naturalmente Tossici naturalmente presenti negli Alimentipresenti negli Alimenti
nei nei vegetalivegetali
in numerose specie ittiche
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AltreAltreteobromina, saponine di spinaci e asparagi, ecc.
Ittiotossine Ittiotossine
(tetraodontotossine, istamina)
Tossine presenti nei funghiTossine presenti nei funghi(muscarine, falloidine)
Sostanze tossiche presenti nelle spezieSostanze tossiche presenti nelle spezie(safrolo, estragolo ecc.)
Contaminanti degli Alimenti
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Possono avere un’origine:Possono avere un’origine:
chimicachimica biologicabiologica
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La contaminazione chimica può dipendere:
Pratiche agronomiche (pesticidi)Pratiche agronomiche (pesticidi)
Pratiche zootecniche (ormoni, Pratiche zootecniche (ormoni, chemioantibioticichemioantibiotici))
Contaminanti di processo e da imballaggio Contaminanti di processo e da imballaggio ((nitrosamminenitrosammine,IPA, monomeri di materiali di ,IPA, monomeri di materiali di
confezionamentoconfezionamento))
Contaminazione ambientale (metalli pesanti es. Contaminazione ambientale (metalli pesanti es. mercurio, cromo e cadmio, PCB, IPA)mercurio, cromo e cadmio, PCB, IPA)
Gli alimenti interagendo con l’ambiente e con l’uomo finiscono per veicolare dei microrganismi che possono essere patogeni. La mancata adozione di adeguate misure igieniche o l’adozione di processi di produzione inadeguati favoriscono la contaminazione, la moltiplicazione dei microrganismi e la produzione di tossine.
Contaminazione biologica
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Effetti tossici sull’organismoEffetti tossici
sull’organismo
TOSSICITATOSSICITA’’ ACUTA: ACUTA: ll’’effetto si manifesta effetto si manifesta rapidamente dopo rapidamente dopo
ll’’esposizioneesposizione
TOSSICITATOSSICITA’’CRONICA:CRONICA:ll’’effetto si effetto si
manifesta a manifesta a lungo termine lungo termine ((micotossinemicotossine))
Botulismo alimentareARAARA
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Sindrome neuroparalitica dovuta ad ingestione di alimenti contenenti la tossina botulinica preformata
Il C. botulinum è un microrganismo ubiquitario, presente sotto forma di spore, principalmente nel suolo e nell’acqua.
Le spore possono contaminare gli alimenti sia di origine animale (salsicce, insaccati, pesce e le loro uova) che vegetale (spinaci, olive, funghi).
Le spore se sopravvivono ai processi termici, possono trovare condizioni adatte alla loro germinazione (anaerobiosi) e così in fase germinativa produrre la tossina.
trattate termicamente ad una trattate termicamente ad una temperatura e per un tempo temperatura e per un tempo
insufficientiinsufficienti
contaminate dalla contaminate dalla terraterra
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leggermente leggermente acide acide
((pHpH > 4,5)> 4,5) con valori con valori di di AAww > 0,93> 0,93
conservate conservate fuori fuori
frigoriferofrigorifero
gli alimenti pigli alimenti piùù a rischio sono le a rischio sono le conserve vegetali:conserve vegetali:
LL’’utilizzazione degli animali utilizzazione degli animali nellnell’’ambito del controllo degli ambito del controllo degli alimenti alimenti èè specificata dalla specificata dalla normativa ufficiale oppure normativa ufficiale oppure èènecessaria quando non vi necessaria quando non vi sono metodi alternativi sono metodi alternativi altrettanto efficaci altrettanto efficaci scientificamente validi, scientificamente validi, ragionevolmente e ragionevolmente e praticamente applicabili.praticamente applicabili.
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Saggi Saggi biotossicologicibiotossicologicinel controllo degli nel controllo degli
alimenti
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alimenti
Tossine Tossine botulinichebotuliniche
Topi albini razza Topi albini razza SwissSwiss
Iniezione Iniezione intraperitonealeintraperitoneale
Rapporti ISTISAN Rapporti ISTISAN 96/3596/35
TOSSINETOSSINEBATTERICHEBATTERICHE
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D.M. 31/07/95D.M. 31/07/95Decreto 16 Decreto 16
maggio 2002maggio 2002DSPDSPTopi albini Topi albini
razza razza SwissSwiss1818--20g20g
Iniezione Iniezione intraperitonealeintraperitoneale
BiotossineBiotossinealgalialgali
PSPPSP
D.M. 31/07/95D.M. 31/07/95Decreto 16 maggio Decreto 16 maggio
20022002
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n°5 Topi albini razza Swiss
16-18gIniezione
intraperitoneale
O.M.
07/12/93
Infezioni batteriche (Listeria monocytogenes)
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Tossicità acutaTossicità acutaSostanze Sostanze tossiche tossiche
sconosciutesconosciute
Topi Topi
RattiRattiGavaggioGavaggio / / inieziniez. I.p. / . I.p. /
alimentazione alimentazione normalenormale RapportoRapporto
ISTISAN 90/2ISTISAN 90/2
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Determinazione della tossicità acutaDeterminazione della tossicità acuta(sostanze tossiche sconosciute)(sostanze tossiche sconosciute)
la tossicità di una sostanza dipende dalla
dose introdotta, dalla via, dal veicolo di
somministrazione e dallo stato di salute pregresso
dell’organismo
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AGENZIA REGIONALE PER LA PROTEZIONE AMBIENTALEDELLE MARCHE Metodica
somministrazione della somministrazione della pipiùù alta quantitalta quantitàà di alimento di alimento
sospetto allsospetto all’’animale da animale da esperimento, in modo da esperimento, in modo da evidenziare gli eventuali evidenziare gli eventuali
effetti tossicieffetti tossici
osservazione degli effetti osservazione degli effetti sugli animali utilizzati per 24sugli animali utilizzati per 24--48 h massimo 72h, poich48 h massimo 72h, poichéésono richieste decisioni sono richieste decisioni rapiderapide
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Valutazione dei risultati: esclusa la responsabilità di fattori accidentali, la presenza di segni clinici o di lesioni significative anche in un solo animale (con assenza di manifestazioni nel gruppo di controllo), può essere considerata come indice della presenza di sostanze tossiche.
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Alimenti solidi omogenizz.(sol.fiologica)/ liquidi
centrifugazione a 3000 r.p.m. per 15’
somministrazione per gavaggio o per via alimentare o inoculazione i.p.
osservazione giornaliera degli animali con particolare attenzione ai sintomi
Ogni animale morto durante il trattamento o entro il successivo periodo di osservazione verrà sottoposto ad autopsia → I.Z.S.
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-- Facile da eseguire e Facile da eseguire e non richiede particolari non richiede particolari mezzimezzi
-- Possibilità di una Possibilità di una parziale parziale classificclassific. della . della tossinatossina
-- Rivela sempre l’effetto Rivela sempre l’effetto tossico del campione tossico del campione inoculato qualsiasi sia inoculato qualsiasi sia la tossina presentela tossina presente
VantaggiVantaggi
--Relazione logaritmica tra Relazione logaritmica tra dose e tempo di morte dose e tempo di morte (possibilità di compiere (possibilità di compiere errori specialmente in morti errori specialmente in morti rapide o molto lente)rapide o molto lente)
-- Risposte immunitarie Risposte immunitarie dipendenti dalla razzadipendenti dalla razza
-- Variabilità del +/Variabilità del +/-- 20%20%
-- Problemi eticiProblemi etici
SvantaggiSvantaggi
Prova biologicaProva biologica
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La necessità di una regolamentazione in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici, ha determinato l’emanazione della direttiva 89/609/CEE del 24/11/1986, che è stata recepita con il D.Lgs.n. 116 del 27/01/1992.
Il decreto disciplina tutte le attività connesse all’utilizzo di animali vivi con finalità sperimentali e/o scientifiche, individuando il concetto di “benessere animale”, che viene inteso come “assenza di stress, dolore, angoscia e sofferenza”.
FINALITA’ strettamente etica
OGGETTO attività sperimentale nel suo insieme di
PROCEDURE- allevamento -mantenimento dell’animale - sperimentazione in senso stretto
RISULTATO ridurre gli esperimentiridurre il n° di animali utilizzatiridurre la sofferenza.
NormativaNormativa
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AGENZIA REGIONALE PER LA PROTEZIONE AMBIENTALEDELLE MARCHE Il Decreto:
• individua tre tipi di stabilimento:• di allevamento• fornitore• utilizzatoreper ognuno dei quali sono presenti adempimenti specifici. Viene previsto che le attività sperimentali possono essere svolte solo presso stabilimenti utilizzatori regolarmente autorizzati e sotto la diretta responsabilità del ricercatore.A questo proposito, ricordiamo che il S.M.S.P. di Pesaro, ora Dipartimento Provinciale ARPAM, èstato autorizzato con Decreto del Ministero della Sanità n. 38/97 del 25/05/1997,ai sensi dell’art. 12 del D.Lgs. n. 116/92 come stabilimento utilizzatore di animali ed è l’unico Dipartimento Provinciale ARPAM autorizzato nella Regione Marche.
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sia implementato un sistema di AUTOCONTROLLO:- personale qualificato e in numero sufficiente ad assicurare il benessere ed il controllo degli animali: individuazione del responsabile o dei responsabili della gestione e organizzazione dello stabilimento e di riconosciuta esperienza di animali; personale tecnico in numero adeguato addetto alla cura ed al trattamento degli animali ed alla sanificazione degli ambienti e di tecnici addetti alla manutenzione degli impianti;- controllo sanitario permanente di un medico veterinario (dipendente dello stabilimento o libero professionista).STABILISCE I REQUISITI STRUTTURALI ED AMBIENTALI DELL’AREA DI PERMANENZA DEGLI ANIMALI- Area di permanenza degli animali, suddivisa nelle seguenti zone:a. zona di stabulazioneb. zona di trattamento degli animalic. zona di osservazione degli animali trattati.- Area di servizio (zona lavaggio materiali, zona deposito, zona raccolta carcasse e scarti animali.)
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Requisiti richiesti per i locali di permanenza
degli animali:ventilazione (15ventilazione (15--20 ricambi
20 ricambiaria/h)aria/h) temperatura( 20-24 °C)
rumore (isolamento da rumori intensi) rumore (isolamento da rumori intensi)
e(controllo delle(controllo dell’’intensitintensitàà luminosa e del ciclo
luminosa e del ciclo
ce/buio nel rispetto delle esigenze biologiche degli animali)
ce/buio nel rispetto delle esigenze biologiche degli animali)
illuminazionilluminazionlulu
umidità relativa, 55% (deve essere
compresacompresa tra 40-70%)
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INDIVIDUA LE CONDIZIONI DI MANTENIMENTO DEGLI INDIVIDUA LE CONDIZIONI DI MANTENIMENTO DEGLI ANIMALI:ANIMALI:
ARRIVO ALLO STABILIMENTO UTILIZZATORE
- Accettazione alla consegna
- Ispezione dei contenitori
- Ispezione degli animali (stato di salute apparente, numero, peso)
- Trasferimento in gabbie pulite, alimentati e dissetati
- Segnalazione di qualunque aspetto anomalo
REGISTRAZIONE
- Registri vidimati dal Ministero della Sanità
- Indicazioni: specie, numero, provenienza, data, lotto
- Movimenti di ciascun animale
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STABULAZIONE- Libertà di movimento
- Grandezza gabbie: stabilite misure minime
- Alimentazione adeguata alla specie
- Acqua potabile in permanenza
- Acclimatazione prima dei saggi
MODALITÀ E PRECAUZIONE DURANTE L’ESECUZIONE DEI SAGGI:Effettuare una corretta standardizzazione della preparazione dell’inoculoControllo dello stato di salute degli animali ed utilizzare per ogni saggio animali omogeneiControllo del peso
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Un altro elemento fortemente innovativo introdotto dal D.L. gsN°116/92 incoraggia l’utilizzo di metodi “alternativi”all’uso degli animali e sancisce in modo preciso che “gli animali possono essere utilizzati solamente quando non è possibile ricorrere ad altro metodo scientificamente valido, ragionevolmente e praticamente applicabile”.
Può essere definita “alternativa” qualunque tecnica che sostituisca l’uso di animali, che riduca il numero di animali necessario per un particolare test o che riduca la sofferenza provocata agli animali.
Allo stato attuale esistono pochi metodi alternativi: sono statistudiati saggi ELISA, RIA, tuttavia problemi legati alla purezza dei reagenti, alla frequenza dei risultati falsamente positivi che taluni davano e quelli legati alla sensibilità ne hanno limitato l’uso per un’applicazione routinaria.
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CARATTERISTICHE CHE DEVE POSSEDERE UN METODO
ALTERNATIVO:
Più
riproducibilità
Maggiore rapidità
Minor costo Più accettabile dal punto di vista etico
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A tuttA tutt’’oggi non sono ancora oggi non sono ancora disponibili test disponibili test validativalidati che che
sostituiscono lsostituiscono l’’uso di animali uso di animali da laboratorio nel controllo da laboratorio nel controllo
ufficiale dei prodotti alimentari ufficiale dei prodotti alimentari
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Saggi biotossicologici anno 1997
24660
63 5tossine botuliniche
DSP
PSP
sostanze tossichesconosciute
Saggi biotossicologicianno 1998 10
35
35
46tossine botuliniche
DSP
PSP
sostanze tossichesconosciute
Saggi biotossicologici
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Saggi biotossicologici - anno 2000
29
12
32 DSP
PSP
sostanze tossichesconosciute
Saggi biotossicologicianno 1999 10
40
39
9
15
tossine botuliniche
DSP
PSP
listeriamonocytogenes
sostanze tossichesconosciute
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Saggi biotossicologici anno 2001
4513
13 2
tossine botuliniche
DSP
PSP
sostanze tossichesconosciute
Saggi biotossicologicianno 2002
191
7tossine botuliniche
DSP
sostanze tossichesconosciute
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FineFine