Post on 17-Apr-2015
Profa Gabriela MacedoTA 514
Velocidade = produto formadotempo de reação
P
Tempo (t)
vo
reação inicial(mais elevada)
reação mais lenta
A velocidade de uma reação química, quer seja catalisada ou não, é uma medida da conversão de reagente(s) em produto(s) por unidade de tempo, em condições controladas. Em cinética enzimática os reagentes designam-se substratos. A conversão de um substrato S num produto P, catalisada por um enzima E
Se [S] é muito grande, Km torna-se insignificante e v=Vmax
Se [S] = Km V = ½ Vmax
V = K[S] ou cinética de primeira ordem quando[S]0,01Km
Na prática: tenta-se cinética ordem zero: atividade enzimática diretamente proporcional a concentração da enzima e independe da concentração de substrato.
Km depende do pH, temperatura e força iônica do meio Km = mol ou mol de substrato/L Vmax = mol de produto formado/minuto/mg proteína
É a parte da enzimologia que estuda a velocidade das reações enzimáticas, e os atores que influenciam nesta velocidade.A cinética de uma enzima é estudada avaliando-se a quantidade de produto formado ou a quantidade de substrato consumido por unidade de tempo de reação
S1: maior afinidade
S2: menor afinidade
KM1KM2
E + S <==> [ES] ==> E + P
A partir deste modelo, estes pesquisadores criaram uma equação, que nos permite demonstrar como a velocidade de uma reação varia com a variação da concentração do substrato
1/Vo = Km Vmax
. 1[S]
+ 1Vmax
Esta equação pode ser expressa graficamente, e representa o efeito da concentração de substrato sobre a velocidade de reação enzimática. O Km de um substrato para uma enzima específica é característico, e nos fornece um parâmetro de especificidade deste substrato em relação à enzima. Quanto menor o Km, maior a especificidade, e vice-versa.
Se os valores experimentais se ajustarem na curva teórica, o valor de Km pode ser determinado pela fórmula:
V = Vmax . [S]
Contudo, as reações geralmente são complicadas: Inibição ou ativação pelo substrato em alta concentração ou pela insolubilidade do substrato
Km + [S]
Utilização de métodos gráficos: dados transformados em forma linear
Valores experimentais de Km e Vmax: obtidos dentro da região do Km teórico
Velocidades iniciais: devem ser obtidas em 6 a 10 concentrações do substrato na faixa de 0,1Km a 10Km
Bons resultados: 0,3Km a 3Km Tratamento estatístico dos dados (desvio padrão)
Lineweaver-BurkV = Vmax . [S] Inverso 1 = Km + 1
Gráfico
A equação é uma reta onde: Y = 1/V, X = 1/[S], b = 1/Vmax, = Km/Vmax
Km + [S] V Vmax[S] Vmax
O valor de Km indica a afinidade da enzima pelo substrato: quanto menor Km, maior a afinidade.
Vmax indica a velocidade máxima de formação de produto em condições de saturação de substrato
V é igual a velocidade máxima quando [S]100Km ( cinética de ordem zero)
Com concentração fixa de enzima, de início temos um rápido aumento na velocidade de reação.
A medida que a concentração do substrato continua a crescer, o aumento na velocidade da reação começa a diminuir até que, com grande concentração de substrato, não se observa aumento da velocidade de reação.
vo3
vo2
vo1
4
A velocidade de uma reação enzimática depende diretamente da concentração da enzima, na presença de excesso de substrato.
Gráficos
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Tempo
[P]
1. Enzimas Monoméricas: Possuem apenas uma cadeia polipeptídica, no qual se situa o sítio Ativo.
Enzima PM Resíduos de a a
Lizosima (clara de ovo)
14600 129
Papaína (protease de
mamão)
13700 124
Tripsina (protease
pancreática
23800 203
2. Enzimas Oligoméricas: Contém no mínimo 2 ou até 60 subunidades firmemente associadas para formar a enzima ativa
Enzima SubunidadesNúmero
SubunidadesPM
PM da Enzima
Fosforilase 4 92500 370000
Hexoquinase 4 27500 102000
Fosfofrutoquinase
2 78000 190000
Enzimas que estão fortemente associadas e estão envolvidas em uma série sequencial de reações. Qualquer tentativa de dissociar as enzimas resulta em inativação.
Exemplos: Complexo piruvato desidrogenase (metabolismo de
carboidratos) Complexo -cetoglutarato desidrogenase (Ciclo de Krebs) Complexo ácido graxo sintetase (biossíntese de ácido
graxos)
3. Isoenzimas: Têm múltiplas formas moleculares no mesmo organismo e catalisam a mesma reação.
Ác. Pirúvico Ác. LácticoLactato desidrogenase
Zimogênio Agente ativador
Enzima
Pepsinogênio H+ ou pepsina pepsina
Tripsinogênio Enteroquinase ou tripsina
tripsina
Quimotripsinogenio A
tripsina Alfa quimotripsina
Proelastase tripsina elastase
Moléculas ou íons que se associam a algumas enzimas para promover atividade catalítica:
Coenzimas: cofator orgânico Enzima + cofator = Grupo prostético Enzima + grupo prostético = Holoenzima
São compostos que são necessários para a enzima catalisar a reação
Podem ser classificados em:1. Íons metálicos2. Coenzimas3. Grupos protéticos
Grande número de enzimas exigem cátions mono ou divalentes (K+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Zn2+) como ativadores metálicos.
Esses íons podem estar presos à porção protéica forte ou fracamente, através da formação de quelatos com grupos fenólicos, amino, fosfato ou carbonilo
Enzimas que contém íons metálicos, presentes em frutas e vegetais, que causam deteriorações oxidativas
Enzima Íon Ação da Enzima
Peroxidase Fe3+ Ação deteriorativa em frutas e vegetais, formação de sabor e aromas estranhos
Polifenoloxidase Cu2+ Escurecimento enzimático em frutas e vegetais
Ácido ascórbico Oxidase
Cu2+ Oxidação da Vit. C
Catalase Fe3+ Decomposição de peróxido de hidrogênio
Coenzima: Molécula orgânica pequena, termoestável que se dissocia facilmente da proteína enzimática
Pode ser separada por diálise Ex. CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO+NADH+H+
Cofator firmemente ligado à proteína enzimática e não pode ser separado sem destruir a enzima
Exemplo: FAD+ (Flavina adenina dinucleotídeo)
A especificidade permite modificar seletivamente compostos individuais dos alimentos sem afetar
outros.
Amido Amido liquefeito (glicose,maltose, maltotriose,-limite
dextrina)
Proteína Peptídeos, aminoácidos
Triglicerídeos Diglicerídeos+monoglicerídeos+ácidos graxos
-amilase
Protease
Lipase pancreática
1,3 específica
A especificidade torna as enzimas importantes como um instrumento analítico.
Determinação Enzimática de Glicose
Glicose Ácido glucônico + H2O2
2H2O2 + o-dianizidina+peroxidase Complexo colorido
(Vermelho-Marrom)(450nm)
Glicose Oxidase
A especificidade das enzimas distingue-as dos catalisadores não biológicos
Mistura de
500g de glicose
500g de frutose
500g de galactose pormL de amostra
Arseniato de sódio+Molibdato de amônio+H2SO4( SN II)
CuSO4 em meio alcalino
(SN I)
1500g açúcares redutores/mL amostra
Mistura de
500g de glicose
500g de frutose
500g de galactose pormL de amostra
Determinação Enzimática de Glicose 500g de glicose/mL
de amostra
(Kit glicose oxidase)
Glicose oxidase reage especificamente com glicose
Especificidade de Grupo: Uma enzima pode apresentar especificidade de grupo, ou seja, um grupo de compostos pode servir como substrato
Ex: Glicose + ATP Glicose-6P Frutose + ATP Frutose-6P Manose + ATP Manose-6P
Hexoquinase
Hexoquinase
Hexoquinase
A enzima atua sobre um único substrato e catalisa uma única
reaçãoEx: R-arginina-glicina-R R-arginina +
glicina-R (fibrina+2 peptídeos)
Trombina
Fibrinogênio
A enzima não discrimina o substrato e exibe somente especificidade em relação a ligação a ser rompida
Caseína Peptídeos+Aminoácidos
Miosina e Actina Peptídeos+Aminoácidos
(Proteína do Leite)
Pepsina(protease do estômago)
Pepsina(protease do estômago)
(Proteínas da Carne)
Muitas enzimas apresentam esteroespecificidade por um isômero óptico ou geométrico em particular
L-aminoácidos -cetoácidos+NH3+H2O2
D-aminoácidos -cetoácidos+NH3+H2O2
L-aminoácido oxidase
D-aminoácido oxidase
De acordo com a regra internacional, uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima que causa a transformação de 1,0 mol de substrato por minuto a 25ºC sob condições ótimas de ensaio.
Atividade: Refere-se ao total de unidades de enzimas em uma solução
Atividade específica: É o número de unidades de enzima por miligrama de proteína
A atividade específica é uma medida da pureza da enzima: aumenta durante as etapas de purificação de uma enzima e se torna máxima ou constante quando a
enzima está pura.