Prof. Dr. Mehmet KAYAProf. Dr. Mehmet KAYAİstanbul İstanbul ÜniversitesiÜniversitesiİstanbul Tıp Fakültesiİstanbul Tıp Fakültesi

Fizyoloji Anabilim Dalı Fizyoloji Anabilim Dalı Çapa/Fatih/İstanbulÇapa/Fatih/İstanbul

E-Posta: E-Posta: mehkaya@istanbul.edu.tr

1

Tarihçe

Planlama

Uygun model ve denek seçimi

Uygun model sonuçlarının insana yansıması

2

EU; 2005: Deneysel çalışmalarda 12.1 milyon omurgalı hayvan “ AB Komisyon Raporu-2007”.

ABD, 2005; 1.2 milyon omurgalı hayvan, fare sıçan bu rakama dahil değil, “Ziraat Bakanlığı verileri”

3

Tıbbi araştırmalardaki iyileşmelerin hayvan çalışmaları

sonucu başladığı, geliştiği ve insan araştırmalarını

desteklediği bilinmektedir.

Bilimsel araştırma ve eğitimde hayvanlar“Tarihçe”

4

Araştırma ve eğitim için hayvana niçin ihtiyacımız var ?

Hücre/doku/organ/sistem bağlamında fizyolojik ve patolojik

mekanizmaları anlamak,

Sistem ve sistemler arası ilişkiyi öğrenmek,

Hastalıklara karşı tedavi yolları bulmak,

Hastalık ve/veya hasara karşı bir test geliştirmek,

Geleceğin bilim insanı ve hekimini yetiştirmek.

5

Hayvan verileri insana uygulanabilir mi?

“İnsan ve hayvanlar arasında birçok benzerlik vardır”

İmmün fonksiyonlar: İnsan-Fare

Kardiyovasküler fonksiyonlar: İnsan-Köpek

Çocuk felci (Polio); Landsteiner and Popper (1908-Maymun), Jonas Salk

(1952-insanda test)

Diabetes; Banting and Best (1921) köpeklerde insulinin önemini göstermiş

Obesite; Fare ve Zucker obese sıçan modelleri; leptin çalışmaları.

6

“Hipertansiyon” sıçan, kedi ve köpek çalışmaları ile tedavi yolları

“Bebek Ölümleri” koyun/kuzu çalışmalarıyla hiyalin membran hastalığının bebeklerde en önemli ölüm nedeni olduğunu gösterildi

“Sistik fibrozis” genç erişkinlerde ana ölüm nedeni ile ilgili olarak fare modellerinde klorid kanallarının rolü ortaya konuldu

“Gen tedavi yaklaşımları” genetik fare modellerinde çalışılmaktadır.

7

Hayvan verileri insana uygulanabilir mi?

Uygun hayvan modeli seçmeden önce “Alternatifler” hayvan

dışı modeller (3R: Replacement-Reduction-Refinement)

Zorunlu ise hayvan modeli düşünülmeli!!!!!

Hayvan çalışmalarında deneysel planlama

8

Deneyler; çeşitli düzeyde organize edilen parametrelere ait etkilerin

hayvan üzerinde uygulanması ve sonuçlarının elde edilmesidir.

SistemEtkili Faktörler Ölçülen/Elde Edilen Cevap

Kontrol Faktörleri

Hayvan çalışmalarında deneysel planlama

Araştırmacının “temel hedefi” deneysel süreci anlamak!

9

Kaynak (İnsan, ekipman vs.,)

Zaman

Materyal

Hayvan çalışmalarında deneysel planlama “Deneyin maliyeti”

10

1. Planlama

2. Uygulama

3. Tamamlama

Hayvan çalışmalarında organizasyon

11

1. Planlama

Problem belirlenmeli ve hedef/ler tanımlanmalı

Araştırma ile ilgili bilgi toplanmalı

Özgün hipotez kurulmalı

Hayvan çalışmalarında organizasyon

12

2. Uygulama

Zaman/Maliyet boyutu ve kaynağı

Etik kurul onayı

Uygulanabilirliğin teyidi/Deney planlama

Uygun veri analiz yöntemlerinin belirlenmesi

Sorumlulukların dağıtılması

Personel eğitimi /Esas araştırmaya geçiş/Veri toplama/işlenmesi.

Hayvan çalışmalarında organizasyon

13

3. Tamamlama

Verilerin anlamlandırılması,

Çıktıların tamamlanması ve teslim edilmesi,

İdari işlerin tamamlanması

Deneyimlerin değerlendirilmesi ve bunlardan ders çıkarılması.

Sonuçların bilim dünyası ile paylaşılması.

Hayvan çalışmalarında organizasyon

14

Hayvanlar bireysel varyasyonlara sahip olduklarından;

Çalışmalar, tekrarlanabilir ve doğrulanabilir olmalı,

Geçerli testler kullanılmalı,

Standardize alet ve prosedür kullanılmalı ve uygulanmalı,

Teknik veya yöntemler; çalışmalar ve türler arasında karşılaştırma yapmak için yeteri kadar duyarlı olmalı,

Uygulanan maddenin tipi/dozu ve yolu ile elde edilen sonuçlar kıyaslanabilir olmalıdır.

Hayvan çalışmalarında deneysel planlama “Hayvan kuralı ile “Doğrulama”

15

Hayvan Modeli;

Normal biyoloji ya da davranışların çalışılabileceği,

Kendiliğinden ya da indüklenmiş bir patolojik durumun araştırılması,

Bir biyolojik işlev yönünden insan ya da diğer hayvan türlerine

benzerlik gösteren hayvanların kullanıldığı model olarak tarif edilir.

Bilimsel araştırma ve eğitimde hayvanlar

16

Uygun hayvan modeli seçiminde;

Planlanan türe ait;

Anatomik,

Fizyolojik,

Davranış karakterlerinin iyi bilinmesiAraştırmanın amacına uygun devamı ve tamamlanabilmesi için gereklidir.

Deneysel model seçiminde dikkat edilmesi gereken adımlar

17

Model hayvan seçiminde dikkatli ve titiz davranılmalı,

Araştırmalar önceden ayrıntılı bir şekilde planlanmalı,

Planlanan deneye ait özellikteki hayvanlar seçilmeli,

Tür, soy, spontan, transgenik ve saf döl gibi özelliklere dikkat edilmeli,

Minimal hayvan sayısı ile ideal veri elde edilmeli,

Kontrol (vehicle-treated control group) kullanılmalı.

Deneysel model seçiminde dikkat edilmesi gereken adımlar

18

Genç sağlıklı erkek veya dişi (tek seks) seçilmeli

Doğum yapmamış dişi tercih edilmeli

Parazit ve patojen free olmalı

Çalışmanın başlangıcındaki hayvan ağırlıkları, çalışma sırasında ± %20’yi aşmamalıdır.

“Çalışmalarda genelde sıçan veya fare tercih edilmektedir”

Deneysel modelde dikkat edilmesi gereken noktalar

19

Hedef türdeki normal yaşam şartlarını temsil etmeli,

Seçilen model ne olursa olsun, çok iyi tanımlanmalı,

Diğer araştırmacılara modelin yol gösterici olması için soy, alt soy ve

mümkünse genetik özellikleri ifade edilmeli,

Hayvanın mikrobiyolojik durumu ve florası dikkate alınmalı,

“Normal fare” ile “patojen-free fare”nin çeşitli ajanlara verdikleri

yanıt birbirinden farklıdır.

Hayvan modeli ve türü seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar

20

Hayvan modeli seçiminde etkili faktörler

Uygun plan ve istatistiğe göre kullanılacak hayvan sayısı,

Önerilen çalışmada model veya organ sisteminin uygunluğu,

Modelin genetik durumu,

Deneysel olarak oluşturulan modellerin doğası,

Uygulamalara hayvanın cevabı,

Çevrenin spesifik hayvan modeli üzerine etkisi,

Kullanılan hayvan ile ilgili önceki bilgiler.

21

Tür seçimi sadece imkan, deneyim ve maliyete dayandırılmalı,

Araştırmacı modele aşina değilse, deneyim sahibi kişi ile gerekirse temasa geçmeli,

Deneyimli bilim insanı yayınlarında belirtmediği “püf noktaları”

hakkında bilgi verebilir veya öneride bulunabilir.

Deneysel modelde dikkat edilmesi gereken noktalar

22

Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler

Hayvan faktörü

Fiziki ve çevresel faktör

Bakım yeri

Hayvan bakımı ve yaklaşımıHayvan özel bakım gerektiriyorsa (Genetik modeller veya domuz, maymun vs.);

Bakım koşullarıTecrübeli bakıcı

23

Vücut hacmi

Yaşam süresi/Yaş/ Seks/Hamilelik durumu

Genetik; Inbred/Outbred/Mutant/Genetik olarak modifiye edilme

Biyolojik Ritim

Mikrobiyolojik ortam/Latent (subklinik veya sessiz) enfeksiyonlar

Stres varlığı/Hastalık

Fiyat ve bakımı

Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler“Hayvan faktörleri”

24

Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler

25

Bakım Yeri;

Hayvanın normal yaşamı (diyet, barınma olanakları),

“Patojen-free hayvanların” yaşadıkları alanlar ile “normal

laboratuvar hayvanlarının” yaşadıkları alan şartları farklı olup, bu

durumun çalışma sonuçlarını etkileyebileceği dikkate alınmalı.

Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler“Deney hayvanlarının yaşam kalitesi”

26

Metabolizmayı etkileyen değişkenler kontrol edilmeli;

Diyet alışkanlıkları/ cins /yaş,

Uygulama yolu/zamanı/doz miktarı,

Örnekleme yeri ve zamanı,

Yılın hangi mevsimi olduğu,

Günlük vücut ısısı ve diürnal varyasyonlar

Kemirgende metabolizma insandan hızlı (örn. Sıçanda kalp fr. 325-350),

Metabolizmanın kontrolü ve işleyişi vücut büyüklüğü arttıkça yavaşlar ve ilaç dozları buna göre ayarlanmalıdır.

Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler“Deney hayvanlarının yaşam kalitesi”

27

Cinsiyet, ilacın kan yarı ömrünü etkileyebilir.

Aynı çevre koşullarında genç “erkek” sıçanlar “dişi” sıçanlara

göre daha hızlı bir şekilde kilo alır.

Deney verilerini etkileyen deney dışı faktörler“Cinsiyet ve gelişim”

28

Uygun hayvan seçiminde en iyi örneklerden biri “vasküler

restenoz” ile ilgili çalışmalarda görülmektedir.

Domuz ve maymunda anjiyoplasti sonrası “restenoz” ile ilgili

sonuçlar küçük hayvanlardan elde edilen verilere kıyasla

insandakine daha yakın.

“Yeni model tanımlanması için literatür taraması yapıp,

hangi modelin mümkün ve gerçekçi olduğuna karar

verilmelidir.”

Hayvan modeli ve türü seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar

29

Hayvan modelinde seçim kriterleri; – Tür

– Patogenez

– Gerekli işlemler

– Maliyet

Test Sistemi

– Aşı / Terapötik Doz

– Ajanın özelllikleri

– Ajanın uygulanması

– Etken doz

Bir hayvan modelinde temel veri elemanları

30

Ajanın özelliği – Etki yolu insandaki gibi olmalı; inhalasyon, oral, vs.,

– Etki kantite edilebilmeliEtken doz tekrarlandığında aynı sonuçlar alınabilmeli,Doz ve sonuç arasındaki ölçeklenebilir bir ilişki gösterilmeli,

– Hastalık nedeni ajan insanda hastalığa sebep olan ajanın aynısı olmalı,

– Patojenik tayin edicilerBir ajan patolojiye nasıl sebep olur? – Bakterinin toksin üretimi – Bir organı hedefleme ve zarar verme

Deneysel modelde dikkat edilmesi gereken noktalar

31

Patogenez – İnsandaki hastalık seyrine benzerlik

SEB (Staphylococcal enterotoxin B): İnsan ve maymunda kusma ve ateş Yüksek dozlarda ölüm,

Anthrax (Bacillus anthracis): İnsan ve maymunda genişlemiş mediasten,

Q-Fever (Coxiella burnetii): İnsan ve maymunlarda pnömoni,

Botulinum (Clostridium botulinum): Yaklaşık tüm türlerde paralizi nedeni.

Deneysel modelde dikkat edilmesi gereken noktalar

32

Gerekli işlemler Daha büyük hayvan modeli Alınacak kan miktarı

Vücut ağırlığında limit

Akciğer röntgen filmi çekimleri

Sabit fizyolojik izleme vs., klinik gözlemler

Telemetri vs.,

Etki yoluİnhalasyon (Baş, Burun- veya tüm vücut) Parenteral/Oral /Dermal

Solunum sistemi araştırmasında uygun hayvan seçimi

33

Deneysel protokole uygun hayvan seçimi “Örnek deney planı”

Hedef: X hastalığının belirtilerini yok etmek için bir ilaç geliştirmek

Spesifik hedefler: X hastalığına maruz bırakılan sıçanlarda akciğer fonksiyon değişkenleri üzerine bir ilacın etkisini araştırmak

Deneysel Tasarım: Toplam 4 grupta 32 hayvan (her grup için; n=8)

3 gruptaki hayvanlar karsinojenin farklı düzeyine maruz bırakılacak,

Bir grup kontrol olarak kullanılacak.

Akciğer fonksiyon değişkenleri tüm gruplardaki herbir sıçanda ölçülecektir.

34

Hayvan test sonuçlarına güvenmemek yanlışlara yöneltebilir ve

binlerce insanın yaşamı ya da sağlığına mal olabilir.

Bir deney hayvanına zehirli veya etkisiz olan bir madde, insan için

zehirsiz veya etkili olabilir.

Filogenetik ilişki veya anatomik uygunluk fizyolojik davranışlar için

güvenilir bir özellik değildir.

Astım ve bronşit çalışmalarında sıçanlar “prediktif bir model” olarak

yetersiz kalmaktadır.

Hayvan modeli ve türü seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar

35

Hayvan modeli her zaman orijinal durumu tam olarak temsil etmez.

Modeller kesinlikle son sözü söylemez, fakat yaklaşık bir fikir verir.

Hayvan modeli ve türü seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar

36

İndüklenmiş hayvan modelleri

Cerrahi veya kimyasal ajanlarla indüklenen hastalık modelleri

STZ ile diyabet ya da CCl4 ile karaciğer yetmezliği oluşturmak gibi

Bilim insanları, bir türden diğerine bilgiyi aktarabilmek için bu türlerin

insana benzemesini isteselerde “filogenetik benzerlik” çıkarılan

sonucun uygunluğunu garanti kılmaz.

37

Transgenik modeller de “genomlarına yapay olarak yerleştirilmiş yabancı bir DNA

içeren hayvanlar” indüklenmiş modeller grubuna girer.

Son zamanlarda “knock-out” modeller gündeme girmeye başlamış,

Pratikte transgenik modeller için tercih edilen tür fare, ancak diğer türleri de bu amaçla kullanmak eğilimi giderek artmakta,

Transgenik hayvanlarda şimdiye kadar bilinmeyen hastalıklar geliştirilebildiği ya da distres bulguları göstermek zor olduğu için bu hayvanların bakımına özel bir özen göstermek gerekir.

İndüklenmiş hayvan modelleri

38

Spontan hayvan modelleri

Genetik olarak kendiliğinden gelişen ve insanlardaki hastalığa

benzer patoloji ve semptomlar gösteren hayvanlarda geliştirilen

modellerdir.

Çeşitli hastalıklarla ilgili spontan modelleri oluşturmak için doğal

olarak genetik varyantlardan yararlanılır.

39

Negatif hayvan modelleri

Fizyolojik bir olayı aydınlatmak için karşılaşılan zorlukları

aşmak için kullanılırlar

Bazı hayvan tür/soylarında bazı hastalıklar hiç görülmez

Tavşanda gonokok enfeksiyonu gibi özel bir durumun

geliştirilemediği negatif model sözkonusu

Hayvan bilinen bir uyarıya reaksiyon vermez.

40

Olası modeller (Orphan modeller)

Bazı hastalıklar, öncelikle hayvanlarda tanımlanmış daha sonra

insanlarda benzeri tanımlanabilir amacı ile çalışılan

modellerdir.

Daha sonra benzer bir hastalık insanlarda görülürse model

adapte edilir.

Örneğin, Papilomatozis, Marek hastalığı ve Deli Dana

Hastalığı.

41

Laboratuvar hayvanlarının genetiğine göre sınıflandırılması

İNBRED HAYVANLAR;

Kardeşlerin çiftleşmesinden en az 20 jenerasyon sonra elde edilen hayvanlardır.

Tüm hayvanlar genetik olarak benzerdir, çünkü kardeşlerin çiftleşmesi ile genetik mutasyonlar ortadan kalkar.

OUTBRED HAYVANLAR;

Kardeş olmayan hayvanların çiftleşmesiyle elde edilirler.

Çok yavru verebilen bu hayvanlar aynı görünümdedir, ancak genetik olarak farklılık gösterirler.

42

F1 Hibridler ve mutant soylar

F1 HİBRİDLER

İki farklı inbred soyun ilk çaprazlaması sonucu elde edilir.

Genetik olarak benzerdirler, ancak üreme yetenekleri yoktur.

MUTANT SOYLAR

Farelerde 500’den fazla mutasyon bildirilmiştir.

Sıçan, hamster, tavşan, kobay, kedi, köpek ve domuzda mutantlar

vardır.

43

Sık kullanılan deney hayvanları

FARE, SIÇAN, KOBAY, TAVŞAN....

Anatomik olarak küçük olmaları, yaşam sürelerinin kısalığı,

manipulasyon kolaylığı ve kolayca üretimlerinden dolayı

deneysel çalışmalarda tercih edilirler.

Özellikle, bu memeli omurgalılar insanlarda görülen pek çok

spesifik hastalık için birebir model olabilirler.

44

Küçük gövdeli oluşu ve genetik yapıları en iyi bilinen omurgalı türü olması biyomedikal çalışmalarda en fazla tercih nedeni,

İnbred ve transgenik olmak üzere 500’den fazla değişik soyu mevcut,

İnbred soyları arasında hem anatomik hem de fizyolojik açıdan farklılıklar mevcut,

Çok sayıda mutasyonlarının varlığı genetik çalışmalarda tercih nedenidir.

Sık kullanılan deney hayvanları; “Fare”

45

Davranış, embriyoloji, teratoloji ve viroloji ile ilgili çalışmalarda,

İmmünosupresif ajanlar ve ilaçların incelenmesinde,

Farmasötik ürünlerin güvenliği ve etkinliğinin belirlenmesinde,

Kısa ömürlü olduklarından kronik toksik çalışmalara uygun bir hayvan modeli olarak kabul edilirler.

Deneylerde kullanılan tüm hayvanlarının %70-80’ini oluşturur.

Sık kullanılan deney hayvanları; “Fare-Mouse”

46

Anatomik yapısı fareye benzer ve fareden sonra en çok kullanılan omurgalı,

Fizyolojik olarak insanlara da büyük benzerlik gösterir,

İnbred soylarının pek çoğu ilk sıçan soyu olan “Wistar albino” elde edilmiş,

Büyük uyum gücü ve dayanıklılığı bu hayvanları birçok deneysel araştırma için en uygun model yapar,

Fizyo/patolojik mekanizmaların izahında ve besin yoksunluğuna karşı yüksek

toleransa sahip olduklarından beslenme araştırmalarında kullanılırlar.

Sık kullanılan deney hayvanları; “Sıçan-Rat”

47

Ucuz, bakımı kolay ve uysal olmaları çalışmalarda tercih nedeni,

Başlıca serum, aşı ve diğer biyolojik maddelerin üretiminde,

İmmün yanıt ve anaflaktik şok çalışmalarında,

Toksikolojik çalışmalarda,

Mikroorganizmalar için iyi bir konak olduklarından “tbc, difteri ve brusella” gibi hastalıklarla ilgili çalışmalarda kulanılırlar.

Sık kullanılan deney hayvanları; “Kobay-Guinea pig”

48

Vücut ağırlığı 2 kg’dan daha az “Alman soyu” ve 2-5 kg olan “Beyaz Yeni Zelanda soyu” tercih edilir.

Aterosklerozda kullanılan ilk hayvan modeli,

Hipertansiyon ve İmmünolojik çalışmalarda tercih nedeni,

Çinçilla tavşanları “von Willebrand’s_ von Willebrand factor yetmezliği-bir tür

hemofili.” hastalığı özelliği taşır,

Ayrıca antiserum üretimi, kalıtsal glokom çalışmaları, rutin toksikolojik ve pirojen testlerinde tercih edilirler.

Sık kullanılan deney hayvanları; “Tavşan-Rabbit”

49

Deneysel hayvan modellerinden elde edilen sonuçlar;

İnsan için kalitatif ya da kantitatif olarak uyarlanabilir olmakta,

Farmakokinetik ve/veya dinamiği üzerinden insanda bir etkili doz

seçimine katkı sağlamakta,

İnsanda hastalık ve ölüm oranında azalmaya yol açmakta,

Aşikar bir şekilde insan sağlığına fayda sağlamaktadır.

Deneysel modellerdeki sonuçların insana yansıması

50

Hayvandan elde edilen bilginin insana doğrudan aktarılabilmesi

bir sonraki adıma kalmakta ve garanti edilememektedir.

Buğünün hayvan deney sonuçları yarının doğru veya yanlışları

olmaya devam edecektir.

Deneysel modellerdeki sonuçların insana yansıması

51

SONUÇ OLARAK;

Deneysel çalışmalarda temel koşul, hayvan haklarına riayet

ederek insanlığa yararlı bilgiler sağlamak için “Hayvan Modelleri”

şimdilik geçerliliğini korumaya devam etmektedir.

Deneysel modellerdeki sonuçların insana yansıması

52

M.Ö: 3000; ; Anadolu’da Hititler & Hitit’li genç bayan

53