PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN CÉLULAS DE

MAMÍFEROS

• En 1986 el activador de plasminógeno tisular humano (tPA, Activase; Genentech USA) fue la 1er proteína terapeúticaproveniente de células de mamífero en ser aprobada para la venta.

• Más del 70 % de las proteínas recombinantes terapeúticas de las farmaceúticas son producidas en células de mamíferos

EXPRESIÓN DE GENES EN CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Nature Biotech. Vol 22, 11, 2004

21 días

Mejoramiento en 20 años

¿Cómo se mejoró la producción en estos años?

Mejoramiento de:

Vectores

Ingeniería de la célula huésped

Desarrollo de medios de cultivo

Métodos de screening

Desarrollo e ingeniería de procesos

EXPRESIÓN

ESTABLE

TRANSITORIA

EXPRESIÓN DE GENES ESTABLE

Integración del gen de interés en genoma por recombinación no homóloga

Ubicación aleatoria

Líneas celulares: CHO (Chinese hamster ovary)NSO (mouse myeloma)BHK (baby hamster kydney)HEK-293 (human embryo kidney)

MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN

Fosfato de calcio, DEAE dextran (tansit), polietileneimina

Electroporación

Liposomas

Bombardeo con partículas

Microinyección

La linearización de los plásmidos mejora la eficiencia de la transfección estable

Fosfato de calcio: precipita con el ADN

Polietileneimina: polímero catiónico

DEAE dextran: polímero catiónico

ENDOCITOSIS

ELECTROPORACIÓN

LIPOSOMAS

Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gunJohn A O'Brien and Sarah C R Lummis Nature Protocols 1, 977 - 981 (2006)

BIOLÍSTICA

MICROINYECCIÓN

VECTORES

Origen de replicación bacteriano

Marcador de selección bacteriano

Promotor para mamíferos y elementos regulatorios

Señal de terminación de la transcripción y poliadenilación

Marcador de selección para células de mamíferos

AGENTES DE SELECCIÓN

DHFR: dihidro folato reductasa

GS: glutamina sintetasa

ANTIBIÓTICOS: G418, puromicina, higromicina

El gen de selección y el gen recombinante pueden estar en el mismo vector o en vectores separados

Para aumentar la chance de obtener líneas celulares altamente productoras el gen de selección puede estar bajo un promotor débil

DHFR: convierte DHF en THF, requerido en síntesis de glicina, purinas y timidina

Células: CHO DHFR-

Medio de selección: sin hipoxantina, timidina, ni glicina

Amplificación génica: METOTREXATE (MTX)

Metotrexate (MTX)

DHFR

Metotrexate

AMPLIFICACIÓN GÉNICA CON MTX

αMEM, FCS dializado

Clonado: dilución límite

CLONADO DE CÉLULAS RESISTENTES

GLUTAMINA SINTETASA

Células: varias, NSO (murina), CHO K1, ambas con baja actividad de GS

Medio de selección: sin glutamina

Amplificación génica: METIONINA SULFOXIMINA (MSX)

Método más rápido que DHFR

Glufosinato: herbicida. Inhibe a GS, causa aumento de NH4 que envenena a las plantas

PROMOTORES y enhancers

Virales: CMV. MPSV (myeloproliferative sarcoma virus), SV40, AdMLP (adenovirus major late promoter)

Celulares: EF Iα (factor de elongación α), βactinaRegulables: tetraciclina

El transporte citoplasmático y la traducción eficiente del RNAm en eucariotas depende del splicing, por lo tanto agregar al menos 1 secuencia intrónica entre el promotor y el ADNc

VECTORES BI CISTRÓNICOS

INTERNAL RIBOSOME ENTRY SITE

expresión balanceada de genesIRES

marcador de selección

Para aislar células productoras x FACS

Expresión estable

Sistema de expresión regulada en células de mamíferos

ON: cumermicina OFF: novobiocina

Sistema para expresión transitoria y estable

Secuencia consenso KOZAK

Elemento regulatorio pos transcripcionalWOODCHUCK: WPRE

Secuencia presente en región 3´ no traducida (3´UTR) del virus de hepatitis B

Su presencia mejora la expresión genética a nivel post transcripcional modificando: poliadenilación, exportación y/o traducción.

MEJORAMIENTO DE LA PRODUCTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS LÍNEAS CELULARES

Método de transfección/cantidad de plásmido transfectado ??

Aumentando la rigurosidad de la presión de selección: altas dosis de MTX en células DHFR-transformadas con DHFR reducción de nº de líneas celulares a examinar

Pero, altas dosis de drogas crecimiento lento de las células

Atenuación del marcador de selección

Mutación del gen para reducir su actividad

uso de codones

promotor débil

Modulación de la expresión desestabilización del ARNm: sec. ARE

desestabilización de la proteína: sec. PEST

atenuación de IRES

PEST sequences and regulation by proteolysisMartin Rechsteiner and Scott W. Rogers TIBS 21 - JULY 1996

Ingeniería celular

Generación de líneas celulares con mayor productividad y supervivencia: transformación con proto oncogenes, genes reguladores del ciclo celular, genes de factores de crecimiento (ej.IGFI), genes antiapoptóticos.

Expresión de fosfatasa alcalina, junto con p27 y bcl-xl. Vector tricistrónico inducible

Optimización del medio de cultivo

Medios de cultivo de composición definida

Cultivos sin suero

Medios libres de suero

Suplementos: transferrinafactores de crecimiento: insulina/ IGF1hidrolizados (animales, levaduras, plantas)albúmina

Problemas: adaptación celularvelocidad de crecimiento reducidamenores rendimientos

MEJORAMIENTO DE SCREENING PARA DETECTAR LAS MEJORES

PRODUCTORAS

La células en suspensión pasan en “fila india” y son iluminadas por un rayo láser. La luz dispersada o la fluorescencia emitida (si fueron marcadas con un fluorocromo) es colectada, filtrada y convertida a valores digitales que son guardados en una computadora

Citometría de Flujo

Técnica analítica que mide propiedades de célulassuspendidas en un fluido

MEJORAMIENTO DE SCREENING PARA DETECTAR LAS MEJORES PRODUCTORAS

Métodos basados en FACS: fluorescense activatedcell sorting = citofluorometría de flujo

Extensión de la citometría de Flujo

Permite la separación física de poblaciones celulares seleccionadas, para luego utilizarlas en diferentes ensayos.

Luego del análisis, el fluído es separado en una seriede gotas.

Aquellas gotas que contengan las células de interés, son electrostáticamente cargadas y desviadas haciaun receptáculo.

FACS

FACS

Coexpresión del gen de interés (GI) con GFP, células seleccionadas por fluorescencia de GFP

Coexpresión del GI con una proteína de superficie que puede ser marcada por un anticuerpo específico fluorescente

Incubación de células transformadas con DHFR con MTX fluorescente

Para aislar células productoras x FACS

ClonePix

Selector de colonias automático

Se cultivan las células en medio semi sólido para formar colonias individuales

Los clones mejores productores son aspiradosy transferidos a una nueva placa

Cell Xpress

Identifica y purifica las células mejores productoras.Lisis foto mecánica de las células que producen poco

ESTABILIDAD DE LA PRODUCCIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Silenciamiento génico: reducción o eliminación de la transcripción del gen

Mayor determinante: estructura de la cromatina en el sitio de integración (hipoacetilación de histonas, metilación de H3, aumento de la metilación CpG del promotor) heterocromatinización

Las líneas celulares candidatas deben ser cultivadas durante varios meses sin presión de selección

Experiencia con CHO-DG44: sin presión de selección½: silenciamiento en días 1/3: silenciamiento gradual en 6 meses15-25%: estables sin selección

Hacker et al, Biotech. Advances, xxx, 2009

ESTRATEGIAS PARA EVITAR EL SILENCIAMIENTO

LCR (locus control region): segmento de ADN que controla la estructura de la cromatina aumentando la expresión de genes ligados, de manera tejido específica, dependiente del nº de copias e independientemente de la posición

Insulators: elementos regulatorios de la transcripción que modulan la interacción entre enhancers y promotores y protegen a los genes del silenciamiento por cromatina adyacente de manera tejido independiente

Bloqueo de desacetilación de histonas: butirato, ac. Valproico

Inhibidores de ADN metil transferasas: azacitidina.

“Gene targeting”: dirigir inserción a zonas de eucromatina

Barras: células que expresan IL2R, promedio de 10 líneas celulares estables(blancas: 1 copia del gen , negras: multicopia)

La presencia del insulator cHS4 βglobina protege la expresión del transgen en el tiempo

Methods in Molecular Biology, vol 267: Recombinant Gene Expression

Recombinación sitio-específica

Recombinasas fago P1: cre loxSaccharomyces cerevisiae: flp FRT (Flp recombination target)fago λ: λ integrasa attP y attB

Mammalian Chromosome Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 738, 2011

Integración dirigida

ZFN: Zn finger n.

Endonucleasas TALENS: transcription activator-like effector n.

Meganucleasas

Cortan secuencias específicas de ADN se favorece la integración de genespor recombinación homóloga

Integración dirigida

Endonucleasa sitio específica que reconoce sitios de reconocimiento grandes(12-30 pb)

La frecuencia de recombinación homóloga aumenta por corte específico de la doble hebra de ADN

Locus transcripcionalmenteactivo

Gen de timidina quinasa para eliminar integraciones no deseadas con ganciclovir

Cromosomas artificiales: tecnología ACE

Fundamentalmente secuencias repetitivas, ADN satélite, ricas en AT

Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 21

Cromosomas artificiales: tecnología ACE

Transferencia de cromosomas a otras líneas celulares

Aislamiento de los ACEs por citometría de flujo. Tinción diferencial con Hoescht 33258 (AT) y cromomicina-A3 (GC).

Cultivos celulares para producción

Células adheridas

microcarriers

Roller bottles

Células en suspensión

Adaptación de las células a crecer en suspensión

Transformación de células en suspensión

Desarrollo de bioprocesos en escala pequeña, “scale down”

Spinner flask

Volúmen min. 50 ml. Densidad celular 2-3 10 6 cel/ml

TubeSpin reactors

Tubos ventilados de 50 ml . Se alcanzaandensidades celulares > 107 cel/ml en 5-20 ml

SimCell technology

EXPRESIÓN DE GENES TRANSITORIA

¿Para qué?

• Verificar la identidad del gen clonado por la expresión de una actividad

• Probar efecto de mutaciones sobre la actividad de una proteína

• Aislar genes de una biblioteca por la expresión de una actividad

• Ahorrar tiempo y dinero

CÉLULAS COS: African green monkey cellstransformadas con virus SV40 defectuoso en el origen de replicación. Producen el antígeno T grande pero no partículas virales.

Vector: ori de SV40, 10.0000 a 100.000 copias/célula.

CÉLULAS WOP: células de ratón 3T3 transformadas con virus polioma defectuoso en el origen de replicación. Producen ag. T grande pero no partículas virales.

Vector: ori de polioma.

Supresor ambar: Se propaga en E. coli que contiene el plásmido helper P3 que tiene mutaciones ambar en gen de R a tetraciclina y ampicilina

EXPRESIÓN TRANSITORIA

Células COS

Expresión transitoria: 2 sitios de clonado

CÉLULAS COS

No introducen fucosas.

En algunos casos la glicosilación es pobre

EXPRESIÓN TRANSITORIA A GRAN ESCALA

• Período: 1-14 días post transfección en cultivos en suspensión.

• Células: CHO y HEK-293 (human embryonic kidney)Sistemas episomales: HEK-293 T (Ag T SV40), HEK-293 EBNA (Ag virus Epstein Barr), CHO-T (Ag T Py).

• Desarrollo de vectores para expresión episomal(producen el Ag T)

• Volúmen hasta 2008: 100 l.

• Ahorro de tiempo y $: no hay selección

• En HEK293: se llegó hasta 1 g/l en 14 días (2008)

• No hay proteína de uso terapeútico aprobada hasta el momento.

• Transfección: fosfato de calcio, polietileneimina, DEAE dextrano o electroporación. Eficiencia: > 70 %

• Infección viral: alfavirus, adenovirus, vaccinia.