INTERFERENCIA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA CON RNA

Tema 1

RNA Interferencia (iRNA)

Fragmentos de RNA que se unen al RNAm interrumpiendo su traducción silenciando el transcripto.

Formación iRNA

1. Generación del iRNA.2. Efector iRNA: Interrupción del RNAm.

Generación de iRNAs

– Componentes:Proteina Descripción Función

DICER Enzima RNAasa III, procesa dsRNA en siRNA de 25 pares de bases (pb), con dominio helicasa, dominio catalítico y de unión a dsRNA.

Clivar la cadena de RNA formadora de iRNAs.

RISC Dos proteínas de unión al RNA, RNA/DNA helicasa, Factor de iniciación de traducción RdRP (Proteína transmembránica).

Amplificar las secuencias de iRNA formadas.Transportador del iRNA hasta target RNAm.

DROSHA Enzima RNAasa III clase II. Corta la molécula de miRNA.Regulariza los genes de interacción RISC/iRNA.Inducción de la clivación del target RNAm.

Generación de iRNA por acción de la DICER y amplificación de los fragmentos por RISC.

Interrupción de la expresión de RNAm por siRNA transportada por RISC.

Interrupción de la expresión de RNAm por siRNA transportada por RISC.

Tipos de iRNA

1. siRNA.2. shRNA.3. miRNA.

1. siRNA• Longitud: 19-22 pb.• Síntesis por PCR.• Transcripción in vitro.

2. shRNA– Interference RNA Short Hairpin (shRNA).• Longitud: hasta 25 pb.• Transfección vía plásmidos.• Síntesis in vitro.

3. miRNA• Longitud: 22 pb.• Dos tipos de RNAasa: DROSHA y DICER.• Transfección por plásmido y vector.

TIPO DE iRNA VENTAJAS DESVENTAJAS

siRNA Método rápido. Síntesis escaladas. Capacidad de marcaje de

siRNA. Fácil transfección. Control de cantidad de iRNA

por factores.

Poco efectivo, no específico. No buena transfección (a

veces). Expresión no inducible. Corto tiempo de vida siRNA. No útil en tiempo. Eficacia baja en proteínas muy

expresadas. Costoso.

shRNA No se trabaja con RNA. Expresión estable y transitoria. Costo efectivo. Expresión inducible. Screenings en pools.

Requiere clonación y verificación de inserto.

Sitios de integración al genoma.

miRNA No se trabaja con RNA. Expresión estable o transitoria. Costo-efectiva para

experimentos largos. Vía de llegada directa para

células difíciles de transfectar. Screening por pools.

Requiere clonación y verificación de inserto.

Sitios de integración al genoma inciertos en muchas ocasiones.

Transfección de iRNA

– Vectores:• Plásmidos• Virus

Estudio de la Función Génica de los iRNAs:

– Screening en pool– Screening en placas multipozos

– Microarrays– Detección de redes genéticas

Screening en pool– Screening en placas multipozos

Microarrays

Detección de redes genéticas