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7/31/2019 Practica 12 Identificacion de Bacterias x PB Micro
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UNIVERISIDAD NACIONAL AUTNOMA DE
MXICO
FES ZARAGOZAMEDICO CIRUJANO.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIAIDENTIFICACION DE BACTERIAS POR PRUEBAS
BIOQUIMICAS
CABALLERO GONZALEZ ANDREA ALEJANDRACALDERON RAMIREZ MARIANA ITZEL
CASTILLO JAIMES ELSA ATENASCASTILLO MEJIA VALERY LARETHDE LA PEA GUTIERREZ VALERIA
MIGUEL SANTIAGO EDGAR
OCHOA CONTRERAS ERICK CESAR
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OBJETIVO
Identificar losmicroorganismos que
crecieron el los agaresmediante pruebasbioqumicas toando en cuenta
sus caractersticas
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Pruebas
Bioqumicas
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Introduccin
A partir de losmedios selectivosde la practicaanterior se debenrealizar pruebas
bioqumicas parala identificacinde los gneros y
especies aisladas
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IntroduccinLas caractersticas
morfolgicas delas colonias en losmedios de cultivo
selectivos, latincin de Gramaplicada a los
microorganismosinicia ladiferenciacin de
gnero y especie
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IntroduccinLas pruebasbioqumicas son de
vital importancia
para diferenciarentre una especie ygnero patgeno,
de los nopatgenos, pormedio de
reacciones
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Pruebas bioquimicas
Agar TSIAgar LIA
Citrato de SimmonsPrueba catalasa
Caldo ureaMedio mio
Prueba de catalasa
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AGAR TSI
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Medio universalmenteempleado para ladiferenciacin deenterobacterias, en base a lafermentacin de glucosa,
lactosa, sacarosa y a laproduccin de cido
sulfhdrico
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FUNDAMENTO
En el medio de cultivo,el extracto de carne y lapluripeptona, aportanlos nutrientesadecuados para el
desarrollo bacteriano.La lactosa, sacarosa y
glucosa son los hidratos
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El tiosulfato de sodio es elsustrato necesario para la
produccin de cidosulfhdrico, el sulfato dehierro y amonio, es la
fuente de iones Fe3+ , loscuales se combinan con el
cido sulfhdrico y
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El rojo defenol es el
indicadorde pH, y el
cloruro desodiomantiene el
balance
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Por fermentacin de
azcares, se producencidos, que se detectanpor medio del indicadorrojo de fenol, el cual vira alcolor amarillo en medio
cido
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El tiosulfato de sodio sereduce a sulfuro de
hidrgeno el que reaccionaluego con una sal de hierro
proporcionando el tpicosulfuro de hierro de colornegro.
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Formula en gramos por litroExtracto de carne 3.0
Pluripeptona 20.0Cloruro de Sodio 5.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0Glucosa 1.0Sulfato de hierro y
amonio
0.2
Tiosulfato de sodio 0.2Rojo de fenol 0.025
Agar 13.0 =
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SiembraA partir de un cultivopuro, sembrar en TSI,picando el fondo yextendiendo sobre lasuperficie del medio.
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IncubacinA 35-37C durante 24horas, en aerobiosis.
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Resultados1-Pico alcalino/fondocido (pico rojo/fondo
amarillo): elmicroorganismo
solamente fermenta laglucosa.
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3-Pico alcalino/fondo alcalino(pico rojo/fondo rojo): el
microorganismo es nofermentador de azcares.
4-La presencia de burbujas, oruptura del medio de cultivo,
indica que el microorganismo
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5-El ennegrecimiento delmedio indica que el
microorganismo producecido sulfhdrico.
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MicroorganisPico /fondo Produccin Produccin
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Microorganismo
Pico /fondo Produccinde gas
Produccinde acidoSulfihidrico
E.coli A/A + -K.pneumoniae
A/A + -
P. mirabilis K/A + +S.typhimurium
K/A - +
S. enteritidisK/A + +
S. flexneri K/A - -
P.aeruginosa
K/K - -
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Agar LIA
A A Li i
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Agar Agar LisinaHierro)
En el medio de cultivo, lapeptona y el extracto de
levadura aportan losnutrientes para el desarrollobacteriano. La glucosa es el
hidrato de carbonofermentable, y la lisina es elsustrato utilizado paradetectar la resencia de las
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Agar LIA
El citrato de hierro y amonio,y el tiosulfato de sodio, sonlos indicadores de laproduccin de cido
sulfhdrico.
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El purpura de bromocresol,es el indicador de pH, el
cual es de color amarillo apH igual o menor a 5.2, yde color violeta a pH igual o
mayor a 6.8.
Es muy utilizado par
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PROCEDIMIENTO
Inocular la cepa haciendouna puncin central hasta
el fondo del tubo y estra ensuperficie.
Se deja incubar a una
temperatura de 37c por 24
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produccin de H2S
prueba positiva :
ennegrecimiento del medio
Prueba negativa: no hayformacin de precipitadonegro
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D i i d l
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Desaminacion de lalisina
Prueba positiva: pico rojizo
Prueba negativa: pico
purpura
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D b il i d
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Descarboxilacion dela lisinaReaccion positiva: Fondo ysuperficie del medio de
color purpura
Reaccion negativa : fondoamarillo
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microorga Color en el Color en Ennegrecimi
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microorganismo
Color en elpico de laflauta
Color enbase deltubo
Ennegrecimiento delmedio
Salmonellatyphimurium
Purpura Purpura Positivo
Salmonellaenteriditis
Purpura Purpura Positivo
Providencia spp.
Rojo Amarillo Negativo
Klebsiella
pnemonia
Purpura Purpura Negativo
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CITRATODE
SIMMONS
CITRATO DE
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CITRATO DESIMMONS
FUNDAMENTOEl citrato de sodio es una sal
acido ctrico, compuestoorgnico simple que se
encuentra como uno de losmetabolitos del ciclo de loscidos tricarboxilicos (ciclo de
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Algunas bacterias puedenobtener energa de fuentes
distintas de lafermentacin de loshidratos de carbono, con elcitrato como nica fuentede carbono.
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La medicin de estacaracterstica es importante
para identificar muchosmiembros de la familia
enterobacteriaceae.
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Cualquier medio usado paradetectar la utilizacin del
citrato por las bacterias quese van a probar, debe carecerde protenas e hidratos de
carbono como fuente decarbono.
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La utilizacin del citrato por labacteria que se va a probar se
detecta en el medio de citratopor la produccin desubproducto alcalinos..
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El medio contiene citratode sodio, que es un anin
como nica fuente decarbono, y fosfato deamonio como nica fuentede nitrgeno
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Las bacterias que pueden utilizarel citrato tambin pueden extraer
nitrgeno de la sal de amonio,con produccin de amoniaco(NH+) lo que produce la
alcalinizacin del medio porconversin del NH +, a hidrxido
de amonio
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.El indicador es el azul debromotimol que es
amarillo por debajo de pH6 y azul por encima de pH7.6
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Fosfato de amoniodihidrgenado
1 g
Fosfato dipotasico 1g
Cloruro de sodio 5gCitrato de sodio 2g
Sulfato de
magnesio
0.20 g
Agar 15 gAzul de
bromotimol
0.08 g
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RESULTADOS
La prueba positiva estarepresentada por la
produccin de color azuloscuro en el termino de 24 a48 hrs, que indica que elorganismo en prueba ha sidocapaz de utilizar el citrato en
el medio con formacin de
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La prueba
tambien debeconsiderarsepositiva sin que
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microorganis citrato Color del
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microorganismo
citrato Color delmedio
Klebsiellapneumoniae
Positovo Azul
S.typhimurium
Positivo Azul
Escherichiacolli
Negativo Verde
s. Flexneri Negativo Verde
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CALDO
UREA
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Es un medio de cultivo en tubos seutiliza para detectar la actividad de la
ureasa, enzima bacteriana quehidroliza a la urea convirtindola en dosmolculas de amonaco que finalmenteforman carbonato de amonio.
CALDO UREA
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Los microorganismos que tiene la
enzima ureasa hidrolizan la urea,liberando amoniaco y produciendoun cambio de color de rojo -
rosado en el medio.
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Extracto deLevadura..................................0.1
Fosfato de Potasio,Monobsico.................9.1Fosfato de Potasio,
Dibsico.......................9.5Urea,Difco...............................................
Frmula Ingredientes
por litro.
i i
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RpidaEjm.:Proteus
mirabilis
Retardada
Ejm.:Klebsiellapneumon
iae
rea positiva
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rea negativa
Ej.:Escherichia coli
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Bacterias urea + rpida: Proteus yProvidencia
Bacterias urea + retardada: Klebsiella,Citrobactery Enterobacter.
Bacterias urea negativa: Escherichia coli,Salmonella, Shigella
PRUEBA DE CATALASA
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PRUEBA DE CATALASA
La catalasa es una enzima quedescompone el perxido dehidrogeno en agua y oxigeno .
Qumicamente es una hemoproteina
de estructura similar a lahemoglobina, salvo por que loscuatro tomos de hierro de sumolcula estn en estado oxidado en
lugar de estado reducido
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Excepto los estreptococos,
la mayora de las bacteriasaerobias y anaerobiasfacultativas tienenactividad catalasa.
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El perxido de hidrogenose forma como uno de
los productos finales de
oxidacin delmetabolismo aerobio de
los hidratos de carbono.
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Si se permite que seacumule, resulta letal para la
clula bacteriana. La catalasaconvierte el perxido dehidrogeno en agua y oxigeno
segn la siguiente reaccin.
R i
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Reaccin
2H2O2 2H2O + O2( BURBUJAS DE GAS)
La prueba de la catalasa se
usa con mucha frecuenciapara diferenciar los miembrosde la familia Micrococos delos miembros de la familia
estreptococos
R ti
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Reactivos
Perxido de hidrogeno al 3%almacenado en frascos colorcaramelo en frio.
Un cultivo de 18 a 24 hrs delmicrorganismo por probar
P di i t
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Procedimiento
perxido de hidrgeno al 3% en un tubode ensayo previamente esterilizadotomamos una asada de la muestra de la
cepa del microrganismo a estudiar
Introducir al tubo de ensayo, la muestra
solamente debe acercarse a la muestra dela solucin liquida de perxido dehidrogeno y debemos observar la reaccinde esta.
Res ltados
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Resultados
La aparicin rpida y sostenida deburbujas o de efervescenciaconstituye una reaccin positiva.
Como algunas bacterias tienenenzimas distintas de la catalasa quepueden descomponer el perxido dehidrogeno la formacin de unaspocas burbujas pequeas despus e20 segundos no se considera unresultado positivo.
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La prueba se considera como positivasi observamos burbujas de
oxgeno.
Resultados:
(+) Staphylococcus aureus
( - ) Streptococcus spp.
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MEDIO MIO
MOVILIDAD INDOL ORNITINA
MEDIO MIO (MOVILIDAD
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MEDIO MIO (MOVILIDADINDOL ORNITINA)
El medio MIO se utiliza para a
identificacin de enterobacteriassobre la base de movilidad, laproduccin de ornitina
descarboxilasa y de indol
FUNDAMENTO
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FUNDAMENTO
En este medio las peptonas proporcionan lafuente de carbono y nitrgeno. El extracto delevadura provee las vitaminas y cofactores
requeridos para el desarrollo. La dextrosaproporciona la fuente de energa. El agar esadicionado para demostrar la movilidad. El
prpura de bromocresol acta como indicadorde cambios de pH facilitando la deteccin dela descarboxilacin de la lisina
FORMULA EN GRAMOS PORLITRO
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Extracto de levadura 2.0g
Peptona de gelatina 10.0g
Peptona de casena 10.0g
L-ornitina 5.0g
Dextrosa 1.0g
gar 2.0g
Purpura de Bromocresol 0.02g
LITRO
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Este medio se inocula por picadura y se
incuba de 18 a 24 horas a unatemperatura de 35 grados
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RESULTADOS
Primero se leen las reaccionesde movilidad y de ornitinadescarboxilasa antes deagregar el reactivo de Kovacs
para la prueba de indolLa movilidad se demuestrapor un enturbiamiento delmedio o por crecimiento que
difunde mas all de la lnea deinoculacin
La reaccin positiva a laornitina est dada por un
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ornitina est dada por uncolor prpura del medio. Laornitina negativa produce un
color amarillo en el fondoque puede ser purpura alfinal
Para la prueba de indol seaaden de 3 a 4 gotas dereactivo de Kovacs y se agitasuavemente el tubo. La
aparicin del color del colorrosa o rojo se interpretacomo prueba positiva a indol
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Prueba catalasaen
tubo plasmacitratado
Fundamento
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Fundamento
Staphylococcus aureus posee dostipos de coagulasa:* Una endocoagulasa o coagulasaligada ocuando se mezcla una
suspensin bacteriana con plasmacitratado u oxalatado.
Constitucin
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Constitucin
Coagulasa en tubo:
Colocar volmenes iguales de plasma
citratado y de cultivo de caldo deStaphylococcus mezclar suavemente eincubar durante 4hs a 37C controlando
cada 30min, si se produce la coagulacin.
Resultados
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ResultadosPositivo: coagulo total, parcial:
cualquier grado de coagulacin
Negativo: suspensinhomognea (Staphylococcus
epidermidis u otro organismo
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MATERIAL
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MATERIAL1 tubo con agar TSI1 tubo con agar LIA
1 tubo con Citrato de Simmons1 tubo plasma citratado
1 tubo con caldo urea
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1 tubo con Peroxido deHidrogeno
MicroscopioReactivos para la tincion
de GramMechero
Asa Bacteriolo ica
PROCEDIMIENTO
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PROCEDIMIENTO
1.-tomar colonias aisladas de lasplacas de agar sangre y agarchocolate. Observar si hay hemolisis;
reportar la presencia de estreptococosy confirmar con H2O2 para descartarestafilococos. Hacer frotis y teir por
tcnica de Gram
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2.- si hay desarrollo en agar EMB;sembrar en los tubos de pruebasbioquimicas siguiendo el
procedimiento de su practicaexudado faringeo
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3.- los tubos de LIA y TSI sesiembran por estria simple ypicadura
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4. si se obtiene desarrollo enlas cajas de agar S-110
efectuar la prueba decoagulasa (plasma citratado)
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5.- de un Diagnostico condiscusin de los resultados
obtenidos.
BIBLIOGRAFIA
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BIBLIOGRAFIA
Koneman Elmer W.DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO EditorialMdica Panamericana, 2004- 1432 pginas
v Matthew J Lynch Mtodos