Post on 08-Feb-2018
Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Precipitación
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
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Precipitación
En la precipitación se concentra el soluto de una solución convirtiéndolo en sólido
mediante la acción de un agente precipitante.
Teóricamente la precipitación debe producir un soluto concentrado y puro, por lo que es una operación que se utiliza al inicio de un proceso de bioseparación
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Ventajas
1. Operación que se adapta fácilmente a gran escala
1. Puede realizase en forma continua
2. El equipo que se utiliza es sencillo
3. Se dispone de diversos agentes precipitantes y en muchos casos éstos son baratos
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Fundamentos
Principio Agente precipitante
Disminución de la solubilidad Sales (Sulfato de amonio)
pH (precipitación isoeléctrica)
Solventes (etanol)Solventes (etanol)
Polímeros no iónicos
Desnaturalización selectiva Temperatura
pH
Solventes
Afinidad Ligandos
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Precipitación por disminución de la solubilidad
+ +
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
--
-
--
--
---
-
-
-
Al agregar un agente
precipitante
Las proteínas con mayor hidrofobicidad superficial precipitan primero
Precipitación de proteínas por disminución de la solubilidad
� Precipitación con sales� Precipitación isoeléctrica� Precipitación con solventes� Precipitación con polímeros no iónicos
++
++ +
+
+ +-
--
-
-
--
Regiones hidrofóbicas
precipitan primero
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Precipitación con sales
Insolubilización
por salado
Solubilización
por salado
S
(Salting-out)(Salting-in)
[Sal]
Mecanismo
La adición de sales elimina el agua de la proteína hidratada, dejando las regiones hidrofóbicas en libertad de combinarse intermolecularmente
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Precipitación por incremento de la fuerza iónica(“Salting-out”)
Proteína totalProteína de interés
Concentración relativa (%) 80
100
Concentración de Sal (% Saturación)
0 20 40 60 80 100
Concentración relativa (%)
0
20
40
60
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Ecuación de la precipitación con sales
[ ]Sallog mAS −=Donde:S = Solubilidad de la proteína a un valor dado de concentración salina.
A = Constante que depende fuertemente del pH y la temperatura. Esta constante usualmente toma un valor mínimo en el punto isoeléctrico, es característica de cada proteína e independiente del tipo de sal.
m = Pendiente de la curva de solubilización por salado. Ésta es independiente del pH y la temperatura, pero varía con el tipo de sal y de proteína. Las sales que contienen aniones polivalentes tales como sulfatos y fosfatos tienen valores de mmayores que las sales univalentes. Los cationes polivalentes como el calcio y el magnesio disminuyen el valor de m.
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Naturaleza de la sal
1. Los aniones son más efectivos en el siguiente orden (Series de Hofmeister):
−−−−−−−
−−−−−−
>>>>>>
>>>>>>
IClO�OBrClOClCOOCH
POHIOFSO
4333
423
2
4
23 tartratocitrato
2. Los cationes son efectivos en el siguiente orden:
3. Seleccionar una sal que sea barata debido a las altas concentraciones que requiere el método.
4. Seleccionar una sal que produzca un precipitado cuya densidad sea diferente a la de la solución para facilitar su separación.
5. Añadirla sal en forma sólida y no como solución, para minimizar la dilución.
>>>>>> IClO�OBrClOClCOOCH 4333
+++ >> �aK�H 4
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Precipitación isoeléctrica
Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad en el punto isoeléctrico
Mecanismo
Las proteínas por su naturaleza anfotérica presentan una carga neta negativa a pH altos y una carga neta positiva a pH bajos. Existe un pH llamado pH isoeléctrico al cual la carga neta de la proteína es cero. A este pH la molécula es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico
+ + ++++++
+
+
+ ++
+ ++
+ ++ +
++ +
++
++
++
+
+
----
-
--
-
-
---
-
-
--
-
Repulsión
Atracción
Baja interacción
en el punto
isoelécrico
Efecto de las fuerzas electrostáticas sobre la proteína
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Precipitación con solventes
Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad mediante la adición de un solvente orgánico ligeramente polar
Mecanismo
El agua se caracteriza por su alta constante dieléctrica, lo cual significa que los iones ensolución acuosa presentan interacciones más débiles que con otros medios.La adición de un solvente orgánico (etanol o acetona) produce agregados de moléculasproteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una
Mecanismoproteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta unaconstante dieléctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en lasfuerzas de atracción entre cargas opuestas y una disminución en el grado de ionizaciónde los radicales de las proteínas, y en consecuencia una disminución en la solubilidad deésta.
Líquido D
Agua 80.0
Matanol 33.0
Etanol 24.0
Acetona 21.4
Benceno 2.3
Hexano 1.9
Constantes dieléctricas de algunos líquidos a 20⁰C
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Ecuación de la precipitación con solventes
donde:S = Solubilidad de la proteína
20loglogSD
KSS +=
S = Solubilidad de la proteínaDS = Es la constante dieléctrica de la mezcla solvente-agua, misma que varía
dependiendo de la cantidad de solvente agregada.K = Es una constante que toma en cuenta la constante dieléctrica original del
medio acuoso.S0 = Es la solubilidad extrapolada
Selección
del solvente
El solvente debe ser completamente miscible en aguaNo debe reaccionar con las proteínasDebe ser un buen agente precipitanteDebe ser seguro (flamabilidad del solvente)
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Precipitación con polímeros no iónicos
La precipitación de proteínas también puede realizarse utilizando polímeros neutros como el polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes.
El mecanismo no está claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos
Mecanismo
Ogston y Laurent sugieren que los polímeros excluyen a las proteínas de parte de la solución y reducen la cantidad efectiva de agua disponible para su solvatación.
El modelo de Ogston se basa en la teoría termodinámica y concluye que los sistemas pueden ser explicados en términos de los coeficientes de interacción proteína-polímero, y proteína-proteína de las especies presentes.El modelo de Laurent se basa en un mecanismo de exclusión geométrica de regiones hidratadas de la proteína por el polímero.
El mecanismo no está claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos propuestos.
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Ecuaciones de la precipitación con solventes
Modelo de Laurent: KCkS −= loglogS = Solubilidad de la proteína
C = Concentración del polímero
k = constante de proporcionalidad
3
+
= ps rrvK
= Volumen parcial específico del polímero
r = Radio de la molécula de proteína
v
303.2
+=
p
ps
r
rrvK rS = Radio de la molécula de proteína
rP = Radio del cilindro del polímero
Modelo de Ogston: aCXS −=logS = Solubilidad de la proteína
C = Concentración del polímero
a = coeficiente de interacción proteína-polietilen glicol
RTX ii
0µµ −=
= Potencial químico de la proteína en presencia del polímero
= Potencial químico de la proteína en el estado estándar
R = Contante de los gases ideales
T = Temperatura absoluta
iµ0
iµ
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Precipitación de proteínas por desnaturalización
selectiva
El objetivo de la desnaturalización selectiva es crear las condiciones en las cuales la proteína de interés no se desnaturaliza o su desnaturalización es mínimala proteína de interés no se desnaturaliza o su desnaturalización es mínima
Si la proteína que se desea purificar presenta estabilidad en condiciones extremas de temperatura, pH, o en solventes orgánicos, puede utilizarse esta propiedad en
las primeras etapas del proceso de purificación
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Desnaturalización por temperatura
El proceso de desnaturalización de la proteína por efecto de la temperatura puede ser descrito como un proceso de primer orden
[ ] [ ]Pkdt
Pd−=
[P] = Concentración de la proteína disueltat = tiempot = tiempok = Velocidad específica de desnaturalización
−=RT
Ekk exp0
La dependencia del proceso de desnaturalización con la temperatura está dado por:
[ ] [ ]PRT
Ek
dt
Pd
−−= exp0
k0 = Constante característicaE = Energía de activación de la desnaturalizaciónR = Constante de los gasesT = Temperatura
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Desnaturalización por pH
Debido a que ciertas proteínas son estables a pH’s extremos, se ha utilizado esta propiedad para purificarlas mediante su precipitación por desnaturalización selectiva de
las proteínas contaminantes.
La velocidad de desnaturalización a pK’s extremos ya sea ácidos o básicos depende del tiempo que tarde la proteína en abrirse y perder su conformación.
Desnaturalización por solventes orgánicos
tiempo que tarde la proteína en abrirse y perder su conformación.
La estabilidad que presentan algunas proteínas en una solución con solventes orgánicos es una propiedad que ha sido utilizada en procesos de purificación, mediante la
precipitación de proteínas contaminantes.
El pH y la temperatura de la solución deben definirse y manejarse cuidadosamente con el fin de maximizar el rendimiento y la pureza de la proteína de interés, y de lograr la
máxima precipitación de las proteínas contaminantes.
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Precipitación por afinidad
La precipitación de proteinas por afinidad es un método de preciptación selectivo que se basa en la capacidad que tienen las proteínas para unirse con ligandos por medio
de sus sitios activos.
En el caso de la afinidad bioespecífica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o En el caso de la afinidad bioespecífica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o un anticuerpo.
En el caso de la pseudoafinidad los ligandos utilizados son colorantes o metales.
Nota: La simple adición de ligandos a una solución proteica generalmente no es suficiente para que ocurra la precipitación. Es necesario que el ligando propicie un estado de agregación de los complejos ligando-proteína.
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Equipos de precipitación
La operación de precipitación puede llevarse en diferentes tipos de reactores entre los que se encuentran los:
Intermitentes Continuos tipo tanque agitado
Alimentación
Producto
Alimentación Producto
Tubulares
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Diseño de Precipitadores
Precipitación a gran escala
En el diseño de un proceso de precipitación debe tomarse como base el comportamiento
cinético de las partículas en solución. El conocimiento de este comportamiento permite
hacer la selección adecuada de la geometría en la que se realizará el proceso.
“Gran escala” significa procesos los cuales son 10 veces o más que los métodos de laboratorio existentes. En otras palabras se está interesado en el escalamiento.
La solubilidad de un soluto particular en un proceso a gran escala no es diferente al del proceso a pequeña escala. Lo que se puede cambiar en un proceso a gran escala es la cinética. Se desea que ambas cinéticas sean las mismas.
Se demuestra que la precipitación se obtiene con mejor éxito a una potencia por unidad de volumen constante (P/V).
Precipitación a gran escala
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Se puede idealizar la precipitación como un mecanismo de 6 etapas:
1. Mezclado inicial: La alimentación conteniendo el soluto es mezclada con el no-solvente o la sal
2. Nucleación: Aparecen pequeñas semillas e inicia la precipitación
3. Crecimiento limitado por difusión: El precipitado crece por difusión3. Crecimiento limitado por difusión: El precipitado crece por difusión
4. Crecimiento influenciado por flujo: Nuevo crecimiento es ayudado por mezclado
5. Floculación: Partículas coloides se agregan en flóculos grandes
6. Centrifugación: Los flóculos son separados por los métodos ya descritos
Alguno de estos procesos ocurrirán simultáneamente, pero se discutirán como si ocurriesen secuencialmente
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Mezclado Inicial:
El tiempo requerido para producir homogeneidad puede ser estimado de la ecuación:
D
lt
4
2
=
donde: l es el tamaño promedio de los “eddies” turbulentos causados por el mezclado y donde: l es el tamaño promedio de los “eddies” turbulentos causados por el mezclado y D es el coeficiente de difusión del soluto.
El tamaño de estos “eddies” puede ser estimado de la ecuación:
4
13
/
=
VPl
ρν
donde: ρ es la densidad de la solución, ν es la viscosidad cinemática, y P/V es la potencia por volumen de la agitación.
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Nucleación:
La nucleación es la parte del proceso donde pequeñas partículas aparecen y empiezan a crecer:
� En sistemas inorgánicos, la nucleación puede ser lenta y la sobresaturación puede persistir por largos periodos
� Para sistemas coloides, este proceso es efectivamente instantáneo
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Crecimiento limitado por difusión (Crecimiento Pericinético):
Después de la nucleación, las partículas del precipitado crecen cuando el soluto disuelto difunde hacia ellos de la solución circundante. Este crecimiento usualmente sigue un proceso de segundo orden:
2
ii ky
dt
dy−=
dt
donde: yi es la concentración de partículas de soluto, y k es la constante de la tasa del proceso.
La constante k es una función del coeficiente de difusión D:
DdÑk π8=donde: d es el diámetro del soluto, y Ñ es el número de Avogadro.
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La ecuación de segundo orden puede ser fácilmente integrada:
ktyy ii
+=0
11
donde: yio es la concentración inicial de soluto. Sin embargo, frecuentemente es más difícil medir yi que determinar el peso molecular Sin embargo, frecuentemente es más difícil medir yi que determinar el peso molecular promedio del precipitado. La ecuación anterior se puede escribir en términos del peso molecular mediante un balance de masa
M
00MyMy ii =
donde: es el peso molecular del soluto inicial.Combinando las dos ecuaciones previas:
0M
( )ktyMM i010 +=
Así las mediciones del peso molecular promedio contra el tiempo provee valores de la constante k.
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Crecimiento influenciado por flujo (Crecimiento o agregación ortocinética):
La difusión limita el crecimiento de pequeñas partículas pero es menos importante que el crecimiento de partículas grandes.
Para estas partículas grandes, el crecimiento usualmente involucra coalisión entre especies las cuales son barridas junto con el mezclado.
El crecimiento en esta región obedece a una cinética de segundo orden:
2
ii ky
dt
dy−=
donde la constante de la tasa está dada por:
2/1
3 /
3
2
=
ρνα
VPÑdk
donde: α es un coeficiente de pegamiento, un factor insertado para considerar el hecho de que no todas las coaliciones producen crecimiento .
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La integración directa de esta ecuación es complicada por el hecho de que el diámetro de la partícula y la constante de la tasa k son función del tiempo.
Se puede resolver la complicación considerando una fracción de volumen del soluto ψ
Ñyd i
= 3
6
1πψ
Esta fracción de volumen es independiente del tiempo. Así podemos reescribir las Esta fracción de volumen es independiente del tiempo. Así podemos reescribir las ecuaciones anteriores en términos de ψ
ii y
VP
dt
dy
=−
2/1
/4
ρναψ
π
Integrando encontramos:
−= t
VP
y
y
i
i
2/1
/4exp
0ρν
αψπ
Ejemplo 9.3
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Floculación:
Los flujos altos para el crecimiento de partículas pequeñas puede destruir los flóculosmás grandes, así esta etapa es algunas veces llevada a cabo en tanques no agitados.
Los polielectrolitos sintéticos pueden algunas veces ayudar a la floculación, tal como ocurre en la filtración.
Nota: Recuerde que si el precipitado es el producto deseado, el polielectrolito debe ser removido después.