Post on 09-Apr-2019
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir datam Penelitian Sainsdon Tekrwlagi Menuju Era Tinggal Landas
Bandzmg, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BATAN
PEMBUATAN INULIN BERTANDA TEKNESIUM-99m, SEBAGAISEDIAAN UNTUK STUD I LAJU FILTRASI GLOMERULUS
Nanny Kartini H., A.Hanafiah Ws.Pusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional
ABSTRAK
PEMBUATANINULIN BERTANDATEKNESIUM-99m SEBAGAI SEDIAAN UNTUKSTUDI LAJU FILTRASI GLOMERULUS. Clearance inulin dalam penetapan fungsi ginjalberdasarkan analisis laju filtrasi glomerulus (LFG) telah dijadikan standar pengukuran.Inulin karboksil- 14C,inulin metoksi- 3H, inulin- 1311dan inulin- 5lCr telah diusulkan sebagaisediaan untuk mengukur LFG. Namun demikian radionuklida yang digunakan dianggapkurang ideal untuk studi penyidikan. Sediaan yang disenangi adalah inulin bertanda teknesium-99m. Proses pembuatan serta penetapan biodistribusi sediaan ini telah dilakukan.Efisiensi penandaan dicapai 85 ± 5,7%pada pH 6,5.Uji biologi menunjukkan bahwa sediaanini 15, 30 dan 45 menit setelah penyuntikan intra vena terakumulasi berturut-turut sebesar98,9 ; 99,02 dan 99,92% organ ginjaJ.
ABSTRACTPREPARATION OF INULIN LABELLED TECHNETIUM-99m FOR THE
GLOMERULAR FILTRATION RATE STUDY. The clearance of inulin for measuringglomerular filtration rate (GFR) has been accepted as a standard. Inulin-carboxyl)4C, inulinmethoxy- 3H, inulin_131 I, inulin- 51 Cr have all been suggested as agents for the measurementof GFR. Howeve~ all of these are not ideal radionuclides for imaging purposes. The preferedagent is inulin- 9 rnTc.The labelling process and the determination of its biodistribution havebeen carried out. The highest labelling yield was 85 ± 5.7 % at pH 6.5. Biological experimentsshowed that accumulation of the labeled inulin- 99mTcafter 15, 30 and 45 minutes postinjection were 98.9 % ; 99.02 % and 99.92 % in the kidney.
PENDAHULUAN
Inulin adalah suatu polisakarida yang terdiri dari unit-unit fruktosa, dan sejak dulu biasa digunakan untuk menentukan laju filtrasiglomerulus (GFR = glomerular filtration rate).Hal ini disebabkan karena inulin tidak dimeta
bolisma oleh tubuh, kurangdari 2% terikat padaprotein plasma, tidak diserap kembali olehtubuli ginjal dan diekskresikan melalui urinedalam bentuk utuh [1]. Untuk tujuan tersebutinulin disuntikkan secara intravena karena absorpsinya melalui intramuskular dan subkutantidak menentu, dan pemberian secara oral akanmenyebabkan terhidrolisanya inulin dalam saluran pencernaan [1].
Kesulitan yang ditemui pada penggunaaninulin untuk penentuan LFG adalah perlu penggunaan peralatan infus yang konstan, sertakesulitan analisis cuplikan darah dan urine.Selain itu juga tidak memberikan kenyamananpada penderita selama proses diagnosis berlangsung. Karena faktor tersebut maka beberapa substansi lain sebagai pengganti inulin
telah dikembangkan terutama sediaan yangbertanda radionuklida [2].
Inulin bertanda 14C, 1311, 3H dan 51Crtelah diusulkan untuk dipergunakan dalam penentuan LFG, tetapi sediaan ini dianggap kurang ideal karena selalu memberikan cacahanlatar belakang (background) yang tinggi sehingga menyulitkan para pemakai dalam mengevaluasi hasil penyidikan dan radionuklidayang digunakan dianggap kurang ideal untukpenggunaan in vivo. Sediaan radiofarmasi lainnya yang dapat digunakan adalah 1251_iothalamat dan 99mTc-Sn-DTPAyang diberikansecara intravena atau subkutan [1]. Lambat laun pemakaian 125I-iothalamat ditinggalkankarena selain harganya yang relatifmahaljugamemberikan resiko radiasi yang lebih besarterhadap penderita, bila dibandingkan dengan99mTc-Sn-DTPA [1). Sampai sekarang penggunaan 99mTc-Sn-DTPA masih dianggap yang paling ideal untuk tujuan penentuan LFG ini.Masalah yang dihadapi dengan penggunaan
198
Proceedings Seminar Reaktor Nllklir dalam PenelitiaJt Sainsdan TeklWlogi Menujll Era Tinggal Landas
radiofarmaka ini adalah pengukurannya tidakkuantitatif karena adanya ikatan senyawa inidengan protein yang besarnya sukar untuk diketahui. Dalam studi yang terbaru (C.D.Russell,1985), dilakukan pengukuran secara eksplisitdengan koreksi terhadap ikatan protein tadi,menggunakan 169yb_ DTPA (ytterbium-169DTPA)sebagai pembanding [3].
Mengacu kepada permasalahan di atas,timbul pemikiran untuk menggabungkan sifatsifat ideal inulin sebagai substansi dalam penentuan LFG dengan sifat radionuklidateknesium-99m sebagai peru nut yang saat inidapat dikatakan paling baik dalam bidang ke-dokteran nuklir [1]. \
Dalam penelitian ini dilakukan penandaan inulin dengan radionuklida teknesium99m, dan dipelajari parameter-parameter yangmempengaruhinya, untuk memperoleh kondiBioptimum yang dapat dijadikan standar padapembuatan radiofarmaka 99mTc-inulinsebagais'ediaan untuk studi laju filtrasi glomerulus. Kemudian dipelajari pula hasil penyidikan dalamtubuh tikus jenis Wistar, danbiodistribusi didalam tubuh mencit jenis Swiss.
BAHAN DAN PERALATAN
Bahan yang diperlukan adalah asam klorida, alkohol, timah(II) klorida, natrium hidroksida, semuanya mempunyai kualitas analisis(E.Merck), air suling untuk injeksi, larutanNaCI fisiologis (IPHA), inulin (William &Hopkins), kertas Whatman 1 dan larutannatrium 99ffiTc-perteknetat buatan PPTNBATAN,Bandung.
Alat yang diperlukan : isotop kalibrator(Nuclear Associates), neraca analisis (AugustSauter KG), alat penatah hewan(Metrohm-Herisau E), pencacah sa lurantunggal (C.Sclumberger) dan seperangkat alatelektroforesa (Boujou).
TATAKERJA
Optimasi penandaan inulin dengan teknesium-99mPenandaan sangat dipengaruhi oleh jum
lah (kadar) timah (II) klorida sebagai reduktor,jumlah inulin, pH dan lamanya proses penandaan berlangsung. Dalam percobaan ini dipelajari pengaruh parameter- parameter tersebutterhadap hasil penandaan.
ntmdung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BATAN
Pengaruh kadar timah (II) klorida terhadap penandaan
Dibuat bermacam-macam larutan timah(lI) klorida sehingga larutan ini mengandung 25,50, 100, 125, 150dan 200 !!g/ml.Laru!an ini kemudian dicampurkan dengan 5-6 mCi./ml larutan natrium perteknetat- 99mTc.Ihulinsebanyak 100 mg dilarutkan dalam natriumklorida 0,9%dengan sedikit pemanasan sampaiterlarut sempurna.
Larutan inulin ini dicampurkan ke dalamlarutan 99mTc-perteknetat yang telah mengandung timah (II) tersebut dengan pengocokanselama 5 menit. Kemud;an pH larutan diaturdengan penambahan natrium hidroksida 0,1 Natau asam klorida 0,1 N sampai mencapai 7,5.Selanjutnya larutan disimpan pada suhu kamarselama 30 menit, kemudian disaring denganpenyaring bakteri.
Hasil penandaan dapat ditentukan dengancara elektroforesa kertas menggunakan kertal5Whatman 1 ukuran 2x37 cm dan pelarut yangdipakai adalah dapar fosfat 0,05 M pH 9. Tegangan antara 2 katoda 450 mV dan lamanyaelektroforesa 1jam. Kertas elektrogram setelahdikeringkan, dipotong-potong tiap 1 cm dan dicacah.
Pengaruh kadar inulin terhadap hasi/ penandaanDari hasil pereobaan yang pertama dapat
diketahui berapa kadar timah(Il) klorida yangoptimal. Berdasarkan hal tersebut dilakukanpenandaan seperti pada pereobaan pertama dengan memvariasikanjumlah inulin yaitu 25, 50,75, 100, 125, 150 dan 200 mg. Sedangkan pHtetap dipakai 7,5 dan kadar timah klorida yangdipakai adalah kadar yang optimum dari pereobaan pertama.
Selanjutnya pereobaan dilakukan sarna seperti pada pereobaan pertama, sehingga diketahui besarnya efisiensi penandaan.
Pengaruh pH terhadap hasi/ penandaanPenandaan dilakukan pada pH 5,5 ;6,5 ;7,fi
dan 8,5. Sedangkan kadar inulin dan ka¥r ti·mah(II) klorida digunakan dari hasil pereobaansebelumnya, yaitu yang memberikan hasil yangterbaik. Cara melakukan pereobaan sarna seperti pereobaan pertama dan kedua.
Eva!uasi sediaan secara in vivo pada tikus putih(Wistar).
Sediaan yang digunakan adalah sediaanyang dibuat pada kondisi optimum seperti yang
199
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas
diberikan oleh percobaan sebelumnya, yaitu dengan kadar inulin 125 mg, timah(II) klorida 75~tgdan pH penandaan 6,5.
Kemudian sediaan disuntikkan melalui vena ekor sebanyak 0,2-0,4 ml dengan aktivitas~:-3mCi. Setelah itu tikus dibius dengan eterEampai pingsan dan dilakukan penyidikan dengan alat penatah hewan.
Penentuan penimbunan sediaan dalam tubuhmencit putih.
Sediaan yang dibuat sarna seperti percohaan sebelumnya. Setelah itu sediaan disuntikkan sebanyak 0,2-0,4 mCi/0,2-0,4 ml secaraintra-vena kedalam tubuh mencit putih, melaluivena ekor. Pada 15, 30 dan 45 setelah penyuntikan mencit kemudian dibius dengan eter sampai mati dan dibedah, dan organ yang diperlukan diambil dan dicacah.Besarnya penimbunan relatif per gram organdapat dihitung.
HASILDAN PEMBAHASAN
Hasil penandaan ditentukan dengan caraelektroforesa kertas dimana 99mTc-inulinakant.erpisah dari pengotornya, karena mereka bergerak dengan kecepatan yang berbeda. 99mTc_inulin mempunyai Rf=0,19 sedangkan Rf99mTctereduksi = 0, dan Rf 99mTcO4 = 0,46. Dari hasilelektrogram tersebut persentase hasil penandaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut:
HC13il penandaan '"'
_L 99m", I rcucw£an ,c- nu In X 100 %cucahan. ( 99mTc_Inulin + 99mTc_red + 99mTc04 )
'rabel 1. Pengaruh kadar timah (II) kloridaterhadap penandaan inulin ( Kadar inulin =100 mg; pH = 7,5 )
No. Kadar Sn(II)CIHasil penandaan(J.,tg)
dalam persen
1
25 22,6 ± 5,42
50 47,0 ± 3,13
75 52,8 ± 4,74
100 52,3 ± 2,45
125 52,4 ± 4,26
150 42,5 ± 4,17
200 17,5 ± 3 6
Hasil diperoleh dari tiga kali pengulangan(n=3).
Bcmdung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BATAN
Percobaan mencari kadar timah(II) kloridayang optimal dalam penandaan, hasilnya terlihat pada Tabel1.
Ternyata yang memberikan hasil penandaan yang terbaik adalah pada kadar SnCl2 75~g sampai dengan 125 ~g. Pada percobaan inidigunakan inulin sebanyak 100mg dan pH pada7,5. Perhitungan statistik memakai uji rentangNewman-Keuls membuktikan bahwa perlakuan nomor 3-5 berbeda nyata dari perlakuannomor 2 dan 6.
Dari hasil di atas dilakukan percobaanselanjutnya mencari kadar inulin yang optimal.Timah(II) klorida yang digunakan 75 ~g dan pHtetap 7,5. Pada Tabel 2 terlihat bahwa mulaidengan kadar inulin 125 mg memberikan hasilpenandaan yang berbeda nyata dari pada sebelumnya (kadar inulin <100 mg).
Tabel 2. Pengaruh kadar inulin terhadap hasilpenandaan ( Kadar timah(II) klorida = 75 ~g;pH = 7,5 ).
Hasil penandaan dalamNo.Inulin ( mg) persen (%)
1
25 14,6 ± 3,02
50 25,0 ± 3,73
75' 34,3 ± 3,14
100 49,7 ± 1,85
125 61,9 ± 2,06.
150 64,2 ± 1,37
200 64,6 ± 1,5
Hasil diperoleh dari empat kali pengulangan
Ini dibuktikan dengan uji statistik, ternyataharga F percobaan lebih besar dari F tabel
pada derajat kepercayaan a=0,05. (Fexp 13,00> Ftabel7,67). Sedangkan dengan kenaikan kadar inulin sampai 200 mg kenaikan hasil penandaan tidak berbeda n,yata (Fex 1,35 <Ftabel7,67) pada nilai a yang sarna. Da~i percobaanini dapat disimpulkan walaupunjumlah inulindiperbesar lebih dari 125 mg tidak akan mempengaruhi hasil penandaan.
Hasil dari percobaan berikutnya yaitumencari pengaruh pH terhadap penandaan diterakan pada Tabel 3 (halaman berikut ). Penandaan terbaik diperoleh pada pH 6,5, di atas dandi bawah pH itu memberikan hasil yang lebihkecil. Hal ini menunjang pendapat pustaka [6]
200
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Pen<!litian Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas .
Bandung, 8- 10 Oktober 1991PPTN - BATAN
Tabel 3. Pengaruh pH terhadap hasil penandaan. ( Kadar timah{II)klorida = 75 J,tg;kadar inulin= 125 mg )
Nomor pH Hasil penandaan dalam persen (%)99mTc-Inulin
99mTc-tereduksi99mTcO1
5,5 63,7 j: 1,918,5 j: 1,818,5 j: 1,92
6,5 84,8 j: 4,9 7,3 j: 2,07,1 j: 2,93
7,575,4 j: 1,412,1 j: 1,712,4 j: 2,14
8,5 56,3 j: 3,813,1 j: 2,730,7 j: 2,2
Hasil diperoleh dari empat kali pengulangan.
yang menyatakan bahwa larutan inulin palingstabil pada pH 4,5 - 7, sehingga hampir semuasediaan injeksi inulin dibuat pada pH 5-7 (USP)dan 5,5-6,5 (BP).
Walaupun Richards dan Steigman [3] menunjukkan bahwa afinitas dari senyawa-senyawa gula terhadap 99mTcsangat tinggi pada pH10-12 dan lemah pada pH netral, tapi padapercobaan ini memberikan hasil yang agak bertentangan dengan pendapat tersebut. Hal inididuga karena Sn2+ pada pH basa akan segeramengendap menjadi Sn{OH)2sehingga sifatnyasebagai reduktor berkurang, dan menyebabkan penghambatan dalam proses penandaan.
Penentuan hasil penandaan dengan caraelektroforesa kertas memberikan hasil yang baik, karena selain diketahui besarnya hasil penandaanjuga sekaligus mengetahui kemurnianradiokimia dari senyawa tersebut. Hasil penandaan terbaik diperoleh sebesar 84,8 j: 4,9% de-
.• k"oduOJf keocioJf
Gambar 1. Hasil penyidikan sediaan 99mTc_Inulin pada tikus putih (Wistar) 10-30 menitpas~a injeksi. Kemurnian sediaan = 84,7 %,konsentrasi penyuntikaan = 2,7 mCi.
ngan pengotor berupa 99mTc-tereduksi 7,3 j:2,0% dan 99mTc-perteknetat7,1 j: 2,9% (Tabel a).
Hasil penyidikan scdiaan 99mTc-inulinpada hewan percobaan tikus putih jenis WlStardapat dilihat pada Gambar 1.Setelah 10-30 menit penyuntikan secara intravena diperoleh gambaran ginjal dan kandungkencing yang sangat jelas.
Biodistribusi 99mTc-inulindalam tubuh binatang mencit putihjenis Swiss setelah penyuntikan intravena menunjukkan bahwa hampir
Tabel 4. Biodistribusi sediaan 99mTc-Inulindalam mencit putih
Persentase relatif per gramNo.Organ organ
15 menit30 menit45 menit
1
Otot 0,00,00,02
Kulit 0,00,00,03
Tulang 0,00,00,04
Darah 0,40,10,15
Usus 0,40,80,06
Hati 0,20,10,07
Limpa 0,00,00,08
Ginjal 98,999,099,99
Jantung 0,0.0,00,010
Otak 0,00,00,011
Paru- 0,10,00,0paru 12
Tiroid 0,00,00,0
semua (berkisar sekitar 99 %) masuk ke dalamginjal baik pada waktu 15, 30 maupun setelah45 menit. Pada organ-organ kritis lainnya seperti darah, usus, hati dan tiroid tidak menunjukkan adanya penimbunan aktivitas (Tabel 4).
201
Proceedings Seminar Reakwr Nuklir cialam Penelitian Sainsdan Teknawgi Menuju Era Tinggal Landas
KESIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil percobaan dapat disimpulkanbahwa penandaan inulin dengan radionuklidat'3knesium-99m dapat dilakukan dengan menggunakan inulin sebanyak 125 mg, timah(II)klorida sebagai reduktor sebanyak 75 lAgdan pH= 6,5. Walaupun hasil penandaan yang diperoleh hanya sekitar 85% tetapi ternyata padapenyidikan dan percobaan biodistribusi di da-
DAFTAR PUSTAKA
Bandung, 8 - 10 Okwber 1991PPTN - BATAN
lam tubuh hewan percobaan tidak menunjuk. kan aktivitas latar belakang (back ground) yang
dapat mengganggu penyidikan.Disarankan agar sediaan ini dibuat dalam
bentuk kit kering, kemudian dilakukan studiperbandingan dengan sediaan 99mTc-DTPA dalam menentukan uji laju filtrasiglomerulus(LFG).
1. BARBOUR, G.R., CRUMB, C.K. and BOYD, C.M. Comparison of Inulin, Iothalamate and9~c-DTPA for measurement of glomerular filtration rate, J.Nucl.Med. 16 (1976) 317-320.
2. SAHA, G.M. Fundamentals of Nuclear Pharmacy, Springer Verlag, New York (1979) 117-139.
3. RUSSELL, C.D., BISCHOFF, P.G. and KONTZEN, F.N. et.al., "Measurement of glomeruralfiltration rate," Single Injection Plasma Clearance Method without Urine Collection,J.Nucl.Med. 26 (1985) 1243-1247.
4. WINCHELL, H.S., Radiopharmaceuticals in evaluation of Kidneys, Proceeding 2 International Symposium on Radiopharmaceuticals, Seatle, Washington (March 1979) 19-22.
5. ECKELMAN, W.E., S.M. LEVENSON, Radiopharmaceuticals labelled with Technetium, International Journal of Applied Radiation and Isotopes,28 (1977) 67-82.
6. MARTINDALE, W. The extra pharmacopoeia, The Pharmaceutical Press, XXVIII (1982) 520.
DISKUSI
Swasono R. Tamat :Karena judul mengenai GFR, mohon dijelaskan berapa GFR normal dalam kaitan pengamatanscanning dengan tikus ( satu gambar pada menit ) dan tabel biodistribusi 15, 30 dan 45menit.
Barangkali topik GFR kurang tepat.Nanny Kartini H.:GFR pada orang dewasa normallaki-laki = 125 - 130 ml/menit, wanita = 108 - 110 mljmenit.Pengamatan scanning pada tikus dilakukan pada 15 menit setelah penyuntikan, dan padakenyataannya bila melakukan uji LFG (GFR) dilakukan mulai saat penyuntikan sampai 17 - 20menit setelah itu. Jadi menurut kami bahwa percobaan ini masih cukup relevan kalau di lihatdari waktu. Tapi walaupun demikian, masukan itu akan kami perhatikan untuk penelitianselanjutnya yang akan dilakukan pada volunter ( manusia).
Sukiyati Dj. : ,1. Dari penayanga n senya wa 99mTc_in ulin da pa t digunakan untuk uji fungsi dan pena tahan ginjal?
2. Apakah ada perbedaan pada penggantian radionuklida 99Tc pada 99~c-inulin dengan 51Crdalam kegunaannya untuk penatahan.Nanny Kartini H. :1. Ya, senyawa 99~c-inulin dapat digunakan untuk uji fungsi ginjal, terutama untuk melihatlaju filtrasi glomerulus. Jadi seandainya dokter merasa perlu untuk melajukan uji GFR ( lajufiltrasi glomerulus), maka diharapkan mereka dapat menggunakan senyawa ini sebagairadiofarmakanya.
2. Perbedaan penggunaan in vivo dari 9~c dan 51Cr ini adalah perbedaan yang umum, yaitu51Cr selalu memberikan resiko radiasi yang tinggi untuk penderita, karena selain memancarkan
202
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalcun Penelitia/~ Sainsdan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Lal~das
B~dung, 8 -10 Oktober J{i91PPTN - BAT/IN
y juga sinar 13. Selain itujuga 51Cr-Inulin memberikan back ground yang tinggi. Tetapi percobaanyang benar-benar membedakan antara 99mTc-Inulin dengan 51Cr-Inulin belum ada yang melakukan.
Gunandjar :
Pada penambahan SnCl2lebih dari 75 IAgjustru % penandaan turun. Pada hal mestinya prosesredukai Tc juatru akan tetap tetjaga jika SnCl2 berlebih. Mohon dijelaskan mengapa justru %penandaan turun !Nanny kartini H. :Seperti telah diterangkan, bahwa SnCl2 disini berfungsi selain sebagai reduktor untukmenurunkan tingkat valensi teknesium dari Tc(VII) ke tingkat yang lebih rendah ( bentuktereduksi), tetapi juga Sn ini akan ikut dalam pembentukan kompleks antara Tc dengan inulinmembentuk senyawa Tc-Sn-Inulin. Jadi dari hasil tersebut, kami menduga bahwa setelahjumlahSn ini cukup untuk mereduksi Tc dan turut membentuk kompleks, dia sebagai reduktor kuatakan merusak inulinnya sendiri, sehingga menyebabkan penurunan % penandaan.
203