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OBTENCIÓN DE UN SUSTRATO FERMENTABLE DE ORIGEN VEGETAL Y SU
EVALUACIÓN CON CÉLULAS LIBRES DE Saccharomyces cerevisiae.
JOHANNA CAROLINA BUITRAGO ESTRADA
DOLLY GISELLE TENJO CAMACHO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el titulo de
Microbiólogo Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
Enero 2007
Articulo 23 de la Resolución N°13 de julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justicia”.
OBTENCIÓN DE UN SUSTRATO FERMENTABLE DE ORIGEN VEGETAL Y SU
EVALUACIÓN CON CÉLULAS LIBRES DE Saccharomyces cerevisiae.
JOHANNA CAROLINA BUITRAGO ESTRADA
DOLLY GISELLE TENJO CAMACHO
APROBADO
Balkys Quevedo Hidalgo
Ingeniera Quimica M.Sc.
Director
Ivonne Gutiérrez
Bacterióloga M.Sc
Jurado
Adriana Matiz
Bacterióloga M.Sc
Codirector
Andrea Aguirre
Bacterióloga M.Sc
Jurado
OBTENCIÓN DE UN SUSTRATO FERMENTABLE DE ORIGEN VEGETAL Y SU
EVALUACIÓN CON CÉLULAS LIBRES DE Saccharomyces cerevisiae.
JOHANNA CAROLINA BUITRAGO ESTRADA
DOLLY GISELLE TENJO CAMACHO
APROBADO
___________________________
Angela Umaña Ph.D
Decana Académica
___________________________
David Gómez Méndez
Director de carrera
V
Agradecemos a nuestros padres y hermanos: Alba, Freddy, Jonathan, Blanca,
Gabriel, Angela y Delvin por su apoyo incondicional y por transmitirnos la fuerza
para seguir adelante. A los amigos y compañeros del laboratorio de
Biotecnología Aplicada por la colaboración y ánimo que nos brindaron. A la
Ingeníera Balkys Quevedo por su compromiso, dedicación, conocimiento,
paciencia y amistad. A la Doctora Adriana Matiz por su paciencia, comprensión y
conocimiento transmitido. Y a todas aquellas personas que no mencionamos
gracias por ayudarnos a lograr esta meta.
VI
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
ABSTRACT
INTRODUCCIÓN
2. MARCO TEÓRICO ___________________________________________________ 2
2.1 Uso de residuos vegetales ___________________________________________ 2
2.2 Cultivo de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) ________________________ 2
2.3 Celulosa _________________________________________________________ 3
2.4 Pretratamientos de residuos vegetales__________________________________ 5
2.5 Obtención de etanol ________________________________________________ 6
2.6 Microorganismos fermentativos _______________________________________ 7
2.7 Saccharomyces cerevisiae ___________________________________________ 7 2.7.1 Requerimientos nutricionales _______________________________________ 8 2.7.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae __________________________ 11 2.7.2. Tolerancia al etanol______________________________________________ 12
2.8. Determinación de azúcares reductores_________________________________ 13
3. JUSTIFICACIÓN____________________________________________________ 14
4. OBJETIVOS _______________________________________________________ 16
4.1. Objetivo general___________________________________________________ 16
4.2. Objetivos específicos _______________________________________________ 16
5. MATERIALES Y MÉTODOS___________________________________________ 17
5.1. Ubicación _______________________________________________________ 17
5.2. Obtención del sustrato fermentable ___________________________________ 17 5.2.1. Microorganismos________________________________________________ 17 5.2.2. Residuo Vegetal ________________________________________________ 17 5.2.3. Pretratamiento del residuo vegetal __________________________________ 18 5.2.3.2. Pretratamiento químico con peróxido de hidrógeno (delignificación oxidativa) 18 5.2.4. Pretratamiento biológico __________________________________________ 19 5.2.4.1. Fermentación discontinua del residuo vegetal por parte del consorcio celulolítico
19 5.2.4.1.1. Preparación del inóculo___________________________________________ 19 5.2.4.1.2. Fermentación discontinua_________________________________________ 19 5.2.5. Determinación de actividad celulolítica cuantitativa _____________________ 20 5.2.5.1. Actividad celulolítica a pH 7 _______________________________________ 20 5.2.5.2. Actividad celulolítica a pH 5 _______________________________________ 21
5.3. Evaluación del Sustrato con Saccharomyces cerevisiae ___________________ 21 5.3.1. Fermentación discontinua control ___________________________________ 21 5.3.1.1. Preparación del inóculo___________________________________________ 22 5.3.1.2. Fermentación discontinua_________________________________________ 22
VII
5.3.2. Fermentación discontinua con sustrato vegetal (SF) ____________________ 22 5.3.2.1. Preparación del inóculo___________________________________________ 22 5.3.2.2. Fermentación discontinua_________________________________________ 23 5.3.3. Determinación de azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5dinitrosalicílico
(DNS) ________________________________________________________ 23 5.3.4. Determinación de biomasa por peso seco en función del tiempo___________ 24 5.3.5. Determinación de etanol __________________________________________ 24 5.3.6. Determinación de rendimientos ____________________________________ 25 5.3.7. Análisis estadístico ______________________________________________ 25
6. RESULTADOS Y DISCUSION _________________________________________ 27
6.1 Pretratamiento del residuo vegetal ____________________________________ 27
6.2 Fermentación discontinua del residuo vegetal con el consorcio celulolítico _____ 30 6.2.1 Residuo vegetal al 10% (p/v) ______________________________________ 30 6.2.2 Residuo vegetal al 12% (p/v) ______________________________________ 35 6.2.3 Residuo vegetal al 5% (p/v) _______________________________________ 36
6.3 Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae__________ 38 6.3.1 Fermentación discontinua control ___________________________________ 38 6.3.1.1 Fermentación control con 20 g/L de glucosa __________________________ 39 6.3.1.2 Fermentación control con 2 g/L de glucosa ___________________________ 41 6.3.2 Fermentación discontinua del sustrato fermentable con Saccharomyces
cerevisiae _____________________________________________________ 43
CONCLUSIONES _________________________________________________________ 49
RECOMENDACIONES_____________________________________________________ 51
BIBLIOGRAFÍA___________________________________________________________ 52
ANEXOS________________________________________________________________ 59
VIII
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Azúcares reductores liberados en función del Tiempo. Residuo tratado con
SDS y sin SDS. ____________________________________________________27
Figura 2. Fermentación del residuo vegetal con el consorcio celulolítico.________30
Figura 3. Fermentación del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10%,
tratado con SDS y suplementado. Azúcares reductores liberados y actividad
enzimatica pH 7 a 37°C Y pH 5 a 50°C en función del Tiempo. _______________31
Figura 4. Azúcares reductores liberados y pH en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento,
con y sin suplemento.________________________________________________32
Figura 5. Actividad enzimática pH 7 a 37°C en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento. ___________________________________________________34
Figura 6. Actividad enzimática pH 5 a 50°C en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento. ___________________________________________________34
Figura 7. Azúcares reductores liberados y pH en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento. ___________________________________________________35
Figura 8. Actividad enzimática pH 7 a 37°C en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento. ___________________________________________________36
Figura 9. Actividad enzimática pH 5 a 50°C vs. Tiempo. Fermentación del
consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con y
sin suplemento. ____________________________________________________36
Figura 10. Fermentación del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 5%
(p/v), tratado con SDS y suplementado. Azúcares reductores liberados y actividad
enzimática pH 7 a 37°C en función del Tiempo. ___________________________37
IX
Figura 11. Concentración de biomasa, azúcares reductores y pH en función del
tiempo. Fermentación control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L
de glucosa. ________________________________________________________40
Figura 12. Concentración de biomasa, azúcares reductores y pH en función del
tiempo. Fermentación control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 2 g/L de
glucosa. __________________________________________________________43
Figura 13. Fermentación del sustrato fermentable con células libres de
Saccharomyces cerevisiae____________________________________________44
Figura 14. Concentración de biomasa y azúcares reductores en función del tiempo.
Fermentación con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF. __________________46
X
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal al 10% sin
suplemento tratado con SDS y peróxido de hidrógeno. (Temperatura 50°C por 12
horas). ___________________________________________________________28
Tabla 2. Determinación de etanol por HPLC fermentaciones control ___________41
Tabla 3. Determinación de etanol fermentación en SF ______________________47
XI
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO A Soluciones de trabajo
A.1 Buffer fosfato
A.2 Buffer ácido cítrico
ANEXO B Curva patrón de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS
Tabla 1. Curva patrón de glucosa.
Figura 1. Curva patrón de glucosa y ecuación lineal.
Tabla 2. Curva patrón de glucosa.
Figura 2. Curva patrón de glucosa y ecuación lineal.
ANEXO C Pretratamiento del residuo vegetal
Tabla 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en
residuo vegetal 10% con y sin tratamiento en SDS
ANEXO D Caracterización físico-química del Residuo Vegetal de
Crisantemo Fermentación discontinua del residuo vegetal
con el consorcio celulolítico
ANEXO E TABLA 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en
residuo vegetal 10% suplementado y tratado con SDS
TABLA 2. Fermentación con el consorcio celulolítico en
residuo vegetal 10% suplementado y sin tratamiento
TABLA 3. Fermentación con el consorcio celulolítico en
residuo vegetal 10% sin suplemento y sin tratamiento
TABLA 4. Fermentación con el consorcio celulolítico en
residuo vegetal 12% suplementado y sin tratamiento
TABLA 5. Fermentación con el consorcio celulolítico en
residuo vegetal 12% sin suplemento y sin tratamiento
TABLA 6. Fermentación con el consorcio celulolítico en
residuo vegetal 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v)
suplementado y sin tratamiento
ANEXO F Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae
Figura 1. Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae.
Absorbancia en función de la concentración de biomasa
XII
ANEXO G. Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces
cerevisiae. Fermentación discontinua control
TABLA 1. Fermentación control con Saccharomyces
cerevisiae en caldo YGC 20 g/L de glucosa
TABLA 2. Fermentación control con Saccharomyces
cerevisiae en caldo YGC 2 g/L de glucosa
ANEXO H. Fermentación discontinua del sustrato fermentable con
Saccharomyces cerevisiae
TABLA 1. Fermentación con Saccharomyces cerevisiae en
caldo SF
ANEXO I. Caracterización de composición nutricional del sustrato
fermentable (SF)
ANEXO J. Cromatografía líquida HPLC
J1. Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC
con 20 g/L de glucosa
J2. Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC
con 2 g/L de glucosa
J3. Fermentación con S. cerevisiae en SF
RESUMEN
La acumulación de residuos sólidos principalmente generados por el desarrollo de la
floricultura, ofrece una amenaza al ambiente y una oportunidad biotecnológica al
aprovechar los tres componentes que conforman los residuos vegetales: celulosa,
hemicelulosa y lignina, como fuente de carbono para los microorganismos que
poseen el complejo enzimático para metabolizar estos polímeros y liberar azúcares
simples que puden quedar a disposición de otros microorganismos fermentativos.
En este trabajo se plantea una alternativa de manejo de residuos vegetales de
Crisantemo (Dendranthema grandiflora), al realizar la conversión de este material
celulósico a azúcares fermentables por pretratamiento biológico con un consorcio
celulolítico en cultivo discontinuo, y de esta manera obtener un sustrato fermentable
(SF) rico en nutrientes y azúcares reductores que permitan el crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae y la producción de etanol.
Se evaluaron varias variables para obtener el mejor sustrato fermentable con el
consorcio celulolítico: la concentración del residuo vegetal al 5% (p/v), 10% (p/v) y
12% (p/v), pretratamientos químicos y suplemento con extracto de levadura y
peptona. Se determinó que la actividad enzimática fue mejor en la fermentación con
el residuo al 10% sin tratamiento y sin suplemento al obtenerse un SF con 2.5 g/L
de azúcares reductores.
El sustrato fermentable obtenido demostró ser un medio nutritivo y económico que
favorece la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, presentando el
mismo rendimiento (Yx/s) al compararlo con la fermentación control de 2g/L de
glucosa en caldo YGC, pero se determinó que no favorece la producción de etanol
por la mínima concentración de azúcares presentes.
ABSTRACT
The accumulation of solid waste, mainly generated through the development of the
flower-growing, brings a treat to the environment and a biotechnological opportunity
taking advantage of the three components that constitute the vegetable waste:
cellulose, hemicellulose and lignin as a source of carbon to the microorganisms that
own the enzymatic complex in order to metabolize these polymers and release the
simple sugars that might be left available to the other fermentative microorganisms.
This work proposes a management alternative of the vegetable waste of
Chrysanthemum (Dendranthema grandiflora) that consists in the conversion of this
cellulosic substrate to fermentable sugars through the biological pretreatment with a
microbial consortium and thus obtains a fermentable substrate (SF) rich in nutrients
and reductor sugars that allow the growing of Saccharomyces cerevisiae and the
production of ethanol.
Many variables were examined to obtain the best fermentable substrate with the
microbial consortium: the concentration of the vegetable waste to 5% (w/v), 10%
(w/v) and 12% (w/v), chemical pretreatment and supplement with extract of yeast
and peptone. It was found a better enzimatic activity with the vegetable waste 10%
(w/v) without treatment and without supplement obtaining a fermentable substrate
with 2.5 g/L of reductor sugars.
The fermentable substrate proved to be a nutritious and economic environment that
favors the production of biomass of Saccharomyces cerevisiae showing the same
yield (Yx/s) that was obtained with the fermentation control of 2 g/L of glucose in
media YGC, but one determined that it does not favor the ethanol production by the
minimum concentration of sugar.
INTRODUCCIÓN
En los últimos años, se ha venido acentuando progresivamente el aumento de la
conciencia y preocupación social por el ambiente y el desarrollo sostenible. Cerca
del 90% de residuos sólidos convencionales generados por la floricultura
corresponde a desechos vegetales, esto hace que la acumulación de residuos
orgánicos genere un desequilibrio en el ecosistema.
La actual administración colombiana ha iniciado algunas acciones tendientes a
identificar y promover alternativas de producción de biocombustibles como el etanol,
a partir de distintas fuentes, pues la actividad del sector agropecuario nacional es
generadora, actual o potencial de: jugo de caña de azúcar, paja de cereales, maíz,
papa, remolacha, melaza, yuca, residuos de la industria forestal y residuos
vegetales como los generados en los cultivos de flores, producto del manejo y ciclo
vital de las plantas que actualmente son aprovechados en compostaje y
reincorporados al proceso productivo como fuente de nutrientes y acondicionador de
suelos, además pueden servir como fuente de carbono de los microorganismos en
el proceso de fermentación de los azúcares que los componen. Esto promete doble
beneficio para el ambiente: primero una alternativa de manejo de residuos vegetales
y agroindustriales y el aprovechamiento biotecnológico de sus tres componentes:
celulosa, hemicelulosa y lignina, en la obtención de biomasa y etanol u otros
combustibles.
Por tal razón, la obtención de un sustrato fermentable a partir de la conversión del
residuo vegetal de Crisantemo (material celulósico), por pretratamiento biológico con
microorganismos celulolíticos representa una alternativa para la producción de
etanol, al lograr obtener un sustrato rico en azúcares fermentables u otros
nutrientes que permitan el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en cultivo
discontinuo, contribuyendo con el desarrollo biotecnológico a nivel industrial.
2
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Uso de residuos vegetales
El aumento de la producción de etanol en el mundo ha estado ligado con el
desarrollo de nuevas tecnologías que permiten obtenerlo a partir de residuos de
madera, de desechos sólidos y de todos los materiales que contengan celulosa y
hemicelulosa lo que permite revalorizar los desechos de varias industrias
convirtiéndolos en materia prima para la obtención de etanol.
El interés por el uso de materiales lignocelulósicos como materia prima en procesos
de transformación por microorganismos, es importante desde hace ya varias
décadas. Entre las razones fundamentales para tal interés se encuentran: la materia
lignocelulósica es el subproducto agrícola de mayor abundancia y constituye la parte
estructural en el reino vegetal, por ello es una fuente de materia prima renovable.
Sus tres mayores constituyentes, celulosa, hemicelulosa y lignina, tienen
aplicaciones practicas apreciables, por ejemplo, la celulosa es el polímero en mayor
proporción en los residuos vegetales provenientes de floricultura se utiliza para la
obtención de etanol y biomasa, la hemicelulosa como fuente de etanol y/o biomasa
y la lignina como combustible y como fuente de adhesivos y de inmunoadyuvantes
(Romano, et al., 2005).
2.2 Cultivo de Crisantemo (Dendranthema grandiflora)
Colombia se ha convertido en el segundo exportador mundial (después de Holanda)
de flores cortadas, con una participación del 10% sobre el total de las exportaciones
mundiales. Más de 50 tipos diferentes de flores, entre las cuales se destacan el
clavel, el pompon, la rosa y el crisantemo se cultivan principalmente en la sabana de
Bogotá, el oriente antioqueño y el Valle del Cauca, siendo sus principales mercados
Estados Unidos (80%) y la Unión Europea (14%)
(http://www.unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm).
3
El Crisantemo (Dendranthema grandiflora) es un hibrido complejo perteneciente a la
familia Asteraceae y engloba flores de las más antiguas cultivadas en Colombia.
Las hojas pueden ser lobuladas o dentadas, ligulosas o rugosas, de color variables
entre el verde claro y oscuro, recubiertas de un polvillo blanquecino que le da un
aspecto grisáceo (Stace, 2003; Santana, 2002).
En cuanto a sus requerimientos nutricionales el Crisantemo es un cultivo exigente
en lo referido a las cantidades de nitrógeno, fósforo y potasio necesarias para la
obtención de flores y plantas de óptima calidad. Cuando existen deficiencias,
aplicaciones moderadas no logran evitar los trastornos ocasionados, por lo cual,
luego de la siembra de los esquejes se recomienda utilizar fertilizantes con alto
contenido de nitrógeno, potasio y otros microelementos, manteniendo un pH entre
5.5 y 6,5 (Santana 2002).
2.3 Celulosa
La celulosa es un carbohidrato que constituye el 50% o más del total de átomos de
carbono en las plantas. Casi la mitad de la madera es celulosa, y el algodón tiene al
menos 90% de celulosa. Las células vegetales están rodeadas por paredes
celulares resistentes, formadas en su mayor parte de celulosa. Este carbohidrato es
el polímero más abundante del mundo, constituye alrededor de 40% a 60% de las
paredes celulares vegetales en peso seco. Es un polímero de unidades de glucosa
unidas entre sí por enlaces �- 1,4. Cada molécula de celulosa consta de miles de
subunidades de glucosa unidas para formar una cadena plana parecida a un listón.
De 40 a 70 de estas cadenas yacen paralelas entre sí y están conectadas por
enlaces de hidrógeno para formar una microfibrilla de celulosa con regiones
cristalinas y amorfas (no cristalinas), éstas últimas contienen torceduras y espacios
lo cual permite la formación de microporos y capilares lo suficientemente espaciosos
para permitir la penetración de moléculas relativamente grandes incluyendo, en
algunos casos enzimas celulasas (Solomon, et al., 2001; Howard, et al., 2003; Lynd,
et al., 2002).
4
2.3.1. Celulasas
Las enzimas implicadas en la degradación de la celulosa son conocidas como
celulasas dentro de las cuales se encuentran: la endo �-1,4 glucanasa (�- 1,4
glucanohidrolasa), la exo �- 1,4 celobiohidrolasa y la �- 1,4 glucosidasa.
La endo �-1,4 glucanasa actúa sobre la región amorfa de la celulosa cortando al
azar la región interna de las cadenas del polisacárido generando así oligosacaridos
de varias longitudes. La exo �- 1,4 celobiohidrolasa actúa sobre los extremos no
reductores del sustrato generando unidades de celobiosa; y la �- 1,4 glucosidasa
completa el proceso hidrolítico convirtiendo los fragmentos de la celobiosa a glucosa
o removiendo glucosa desde los extremos no reductores de pequeños celo-
oligosacaridos (Howard, et al., 2003).
2.3.2. Microorganismos celulolíticos
Muchos microorganismos no tienen la maquinaría enzimática para hidrolizar los
enlaces beta de la celulosa (Solomon, et al., 2001), por esto, los residuos vegetales
son de difícil manejo y presentan un impacto ambiental; ya que pueden generar
alteraciones en las propiedades de los suelos, atraer plagas de insectos y roedores,
producir olores, pérdida del espacio físico y un impacto paisajístico; además al ser
incinerados como una alternativa para su manejo se produce un impacto a la
atmósfera al generar gases tóxicos (Corbitt, 2003). Por lo tanto, se ha centrado el
interés en los microorganismos celulolíticos que participan en la descomposición de
este polímero a glucosa, permitiendo que los microorganismos fermentativos utilicen
este azúcar para la producción de etanol; además a nivel industrial se realiza un
pretratamiento al material celulolítico utilizando procedimientos como la hidrólisis
ácida, la sacarificación y la licuefacción; debido a que los materiales lignocelulosicos
son, en general, de muy baja susceptibilidad a los ataques enzimáticos y
microbianos, lo que se debe a factores derivados de su composición y de su
estructura físico-química: estrecha relación existente entre celulosa, hemicelulosa y
lignina, las que forman una estructura que no es accesible a las enzimas y a otros
agentes químicos y la cristalinidad de la celulosa (Yu y Zhang, 2004; Romano, et
5
al., 2005).
Diversos grupos de microorganismos son capaces de degradar total o parcialmente
la celulosa, entre las bacterias que se destacan están algunas especies de los
genéros Clostridium, Streptomyces, Thermomonospora, Bacillus sp, Bacillus subtilis,
en el caso de los clostridios, Clostridium cellulovorans hidroliza la celulosa en
condiciones de anaerobiosis, en tanto que especies celulolíticas de Streptomyces la
degradan en ambiente aeróbico (Ramírez y Coha 2003; Murashima, et al., 2002).
2.4 Pretratamientos de residuos vegetales
El propósito de los pretratamientos es aumentar la susceptibilidad del material, para
lo que es necesario remover la lignina y la hemicelulosa, reducir la cristalinidad de la
celulosa, e incrementar la porosidad de los materiales. La tecnología ideal del
pretratamiento debe cumplir los siguientes requerimientos:
• Aumentar la concentración de azúcares
• Minimizar la degradación o pérdida de carbohidratos
• Impedir la formación de coproductos colaterales inhibitorios para los procesos de
hidrólisis y fermentación subsecuentes.
• Escasa o nula la formación de residuos
• Ser económico
Con la aplicación de los pretratamientos se consigue además:
• Remover total o parcialmente la lignina y la hemicelulosa
• Disminuir la cristalinidad de la celulosa
• Reducir el tamaño de las partículas del material.
Los métodos de pretratamiento se clasifican en:
• Físicos: Reducción de tamaño de partícula, radiación de alta energía, pirolisis,
etc.
• Físico – químicos: explosión a vapor o con amonio, oxidación húmeda, etc.
6
• Químicos: Ozonólisis, hidrólisis ácida o alcalina, delignificación oxidativa, etc.
• Biológicos: Hidrólisis enzimática por bacterias y hongos de pudrición blanca,
marrón y blanda (Romano, et al., 2005).
2.5 Obtención de etanol
El etanol es el producto metabólico que puede ser obtenido por la hidrólisis de
diferentes sustratos ricos en carbohidratos como: caña de azúcar, maíz, arroz y
remolacha (Zaldivar, et al., 2005; Karimi, et al., 2006).
Teóricamente se puede obtener a partir de 1 gramo de glucosa 0,511 g de etanol.
Cuando se fermentan sustratos puros el rendimiento es del 95% y se reduce al 91%
cuando se utilizan materias primas grado industrial. 100 gramos de glucosa pura
producirán 48,4 gramos de etanol, 46,6 gramos de CO2, 3,3 gramos de glicerol y
1,2 gramos de biomasa (células de levadura). Las levaduras usualmente
demuestran un rendimiento de etanol de 0.42g/g bajo condiciones ideales a partir de
Xilosa (Karimi, et al, 2006).
La producción de etanol se puede realizar por diferentes tipos de fermentaciones
como: batch o discontinua, continua y lote alimentado. La fermentación batch opera
en un sistema cerrado, toda la materia (sustrato, cultivo de la levadura) se añade al
fermentador al principio del proceso; el sistema se cierra y los productos se recogen
únicamente cuando el proceso ha finalizado. Esta fermentación es la más utilizada
en la producción industrial, debido a las ventajas como: menor costo de producción,
y requiere menor control en comparación con los otros procesos (Doran, 1995;
Caylak y Vardar, 1998)
En la fermentación continua, el crecimiento del microorganismo es mantenido a una
tasa estable de crecimiento mediante el bombeo continuo de medio fresco y la
eliminación del medio utilizado; de tal forma que, el volumen del sustrato se
mantiene constante durante el tiempo de fermentación. Por esto, si las velocidades
de entrada y de salida de materia son iguales, el proceso puede operar
indefinidamente (Doran, 1995; Caylak y Vardar, 1998).
7
La fermentación lote alimentado consiste en un proceso de alimentación intermitente
ya que permite la entrada de materia (sustrato e inóculo) al sistema, pero no la
salida (Doran, 1995).
Estos diferentes procesos deben ser monitoreados de acuerdo con el conocimiento
que se tenga sobre las variables físicas, químicas y biológicas que afectan al
proceso; de acuerdo a esto es posible determinar parámetros como la concentración
de biomasa, de producto y de sustrato. Para calcular el rendimiento de la reacción,
es decir la cantidad de producto formado o acumulado por cantidad de reactante
suministrado o consumido durante la fermentación.
El rendimiento (Yx/s) expresa la cantidad de biomasa producida a partir del sustrato
consumido. Este rendimiento se ve afectado por factores como la composición del
medio, la naturaleza de las fuentes de carbono y nitrógeno, el pH, la temperatura, y
la concentración de oxígeno. Además, el rendimiento del producto a partir del
sustrato (Yp/s), es el factor más importante en la producción de etanol; ya que afecta
a la economía del proceso (Doran, 1995).
2.6 Microorganismos fermentativos
El principal microorganismo utilizado en la fermentación es Saccharomyces
cerevisiae, que aunque es efectivo en la producción de etanol está limitado en
cuanto a los sustratos que puede utilizar, al igual que otros microorganismos como:
Mucor indicus, Candida shehatae, Pichia stipitis, Zymomonas mobilis, Trichoderma
sp, algunos microorganismos como Escherichia coli y Klebsiella oxytoca han sido
modificados por ingeniería genética para la producción eficiente de etanol a partir de
hexosas y pentosas presentes en los polímeros de hemicelulosa (Zaldivar, et al.,
2005; Becker y Boles, 2003).
2.7 Saccharomyces cerevisiae
Reino: Fungi – Mycetae
8
División: Amastigomycota – Eumycota
Subdivisión: Ascomycotina
Clase: Asmomycetes – Hemiascomycete
Subclase: Hemiascomycetidae
Orden: Endomycetales - Saccharomycetales
Familia: Saccharomycetaceae - Endomycetaceae
Subfamilia: Saccharomycetoidea
Género: Saccharomyces
Especie: cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae es la especie de levaduras utilizada por excelencia para
la obtención de etanol a nivel industrial debido a que es un microorganismo de fácil
manipulación y recuperación, no es exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto
costo, tolera altas concentraciones de etanol, en la fermentación produce bajos
niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones
de azúcares, presenta alta viabilidad celular para el reciclado y características de
floculación y sedimentación para el procesamiento posterior (Carballo, 2000).
El etanol es el producto del metabolismo anaeróbico de esta levadura y es parte de
su metabolismo energético (Carballo, 2000). En los procesos de fermentación los
valores de pH deben ser controlados entre 4 y 5 para reducir el riesgo de
contaminación bacteriana, además para la producción de etanol la temperatura
puede estar en el rango de 30°C – 39°C, sin embargo, cerca de 39°C se presenta
perdida de viabilidad de las células; ya que la temperatura óptima de crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae es entre 28°C y 35°C. Teóricamente la temperatura
óptima para la producción de etanol debe ser de 5°C a 10°C más elevada que la
temperatura de crecimiento, esto para incrementar el rendimiento del proceso de
fermentación (Tuite y Oliver, 1991).
2.7.1 Requerimientos nutricionales
• Carbono:
Los compuestos carbonados son utilizados a la vez como fuente de energía y como
9
fuente de carbono por Saccharomyces cerevisiae ya que necesita D-azúcares como
hexosas, glucosa, fructosa, manosa, etc., porque los L-azúcares pueden ser
considerados no fermentables por esta levadura (Tuite y Oliver, 1991).
• Nitrógeno:
Este elemento es un constituyente importante en los medios de cultivo para
promover el crecimiento; ya que representa alrededor del 10% de peso seco de las
levaduras, S. cerevisiae es capaz de utilizar el nitrógeno en forma de ión amonio.
Los iones amonio pueden ser aportados en el medio por el cloruro de amonio, el
nitrato de amonio, fosfato de amonio y sobretodo el sulfato de amonio que provee
además una fuente de azufre asimilable ((NH4)2SO4). Otra fuente de nitrógeno son
los aminoácidos, los dipéptidos, tripéptidos, y la urea en asociación con biotina y las
bases púricas y pirimídicas (Carballo, 2000).
• Fósforo:
Es esencial para el crecimiento, regula la síntesis de los lípidos y los carbohidratos,
y mantiene la integridad de la pared celular. El fósforo es asimilado por la célula en
forma de iones ortofosfato (H2PO-4). Las fuentes de fósforo en el medio de cultivo
están constituidas por el dihidrogenofosfato (KH2PO4) o por el hidrogenofosfato
disódico (Na2HPO4) en una concentración 0.6 mM/g de células para una
fermentación óptima (Carballo, 2000).
• Azufre:
Constituye el 0.4% del peso seco de las levaduras. La fuente de azufre más
utilizada por Saccharomyces es el sulfato de amonio, el sulfito y el tiosulfato; la
metionina puede ser utilizada como fuente única de azufre y permite un crecimiento
más rápido que los iones sulfatos (Carballo, 2000).
• Elementos traza:
Macronutrientes. K, Mg, Ca, Zn, Fe, Mn, Cl. Se requiere en concentraciones de 0.1
– 1 mM.
10
• Potasio:
A pH ácidos estimula la fermentación y la respiración, actúa como efector de
numerosas enzimas: piruvato quinasas, aldolasa, aldehído deshidrogenasa y
permeasa e interviene en la estructura de los ARN. Las fuentes de potasio son el
cloruro potásico y los fosfatos mono y dipotásico (Carballo, 2000).
• Magnesio:
Es utilizado como activador de las enzimas glicolíticas, estimula la síntesis de ácidos
grasos, regulas las ATPasas de las membranas y participa con el potasio en la
penetración del fosfato. El magnesio es aportado en los medio de cultivo en forma
de sulfato o de cloruro de magnesio (Carballo, 2000).
• Microelementos: Co, B, Cd, Cr, Cu, I, Mo; Ni, Va. Se requieren concentraciones
0.1 - 100µM.
Los inhibidores, los cuales pueden afectar el crecimiento de la levadura cuando se
encuentran en concentraciones superiores a 100µM: Hg, Ag, Ar, Ba, Li, Ni, Os, Pb,
Se, Te (Tuite y Oliver, 1991).
• Otros compuestos:
El inositol juega un papel importante en la síntesis de los lípidos de las membranas.
El pantotenato es un factor de crecimiento para Saccharomyces y debe presentarse
en el medio en forma de pantotenato de calcio a una concentración de alrededor de
6.25mg/l.
La vitamina B6 o piridoxina es transformada en fosfato de piridoxal y en
piridoxamina, coenzimas implicadas en la desaminación y descarboxilación de los
aminoácidos.
La tiamina (vitamina B1) tiene un papel en el metabolismo respiratorio, el
metabolismo de los lípidos, la glucólisis y la fermentación alcohólica. Las
necesidades para S. cerevisiae son alrededor de 5 mg/l en tiamina-HCl.
11
La biotina es un factor de crecimiento para las levaduras. Está implicada en
numerosas reacciones anabólicas: carboxilación del piruvato, síntesis de las bases
púricas y pirimídicas, de los nucleótidos y de los ácidos nucleicos, síntesis de las
proteínas, de los polisacáridos y de los ácidos grasos.
Las necesidades de biotina son del orden de 1mg/l para S. cerevisiae. Las otras
vitaminas, ácido fólico, ácido p-amino benzoico y riboflavina son normalmente
sintetizadas por las levaduras (Carballo, 2000).
2.7.2 Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae
Es un microorganismo que puede llevar a cabo un metabolismo respiratorio o
fermentativo de acuerdo con concentración de oxígeno (Noor, et al., 2003). En
condiciones aerobias aumenta la biomasa y produce poco alcohol, pero en
anaerobiosis el crecimiento celular es lento y la producción de etanol es alta. Por
esta razón, la oxidación completa de la fuente de carbono a CO2 y H2O presenta
una producción celular óptima, donde el oxígeno es el aceptor final de electrones en
la fosforilación oxidativa durante la respiración. Es así, que en concentraciones altas
de oxígeno disuelto la fermentación de azúcar a etanol es inhibida. Esta situación
fue observada por Pasteur en 1967, y se denomina el efecto Pasteur (Fiechter, et
al., 1981).
Saccharomyces cerevisiae convierte la glucosa a etanol a través de la ruta de la
glicólisis. Esta es una vía ubicua para el catabolismo de los monosacáridos. Por
cada molécula de hexosa que se convierte a piruvato, hay una producción neta de
dos moléculas de ATP a partir de ADP + Pi y dos moléculas de NAD + se reducen a
NADH. La glicólisis se puede dividir en dos etapas: una de hexosas, en la cual el
ATP es consumido, y una etapa de triosas, en la cual se obtiene una ganancia neta
de ATP (Nelson y Cox. 2000).
En la fermentación alcohólica la producción de etanol se presenta en dos pasos: el
piruvato es descarboxilado por la piruvato descarboxilasa hasta acetaldehído; este
último es reducido a etanol por la alcohol deshidrogenada, con liberación de NAD+
12
proveniente de la etapa de la glicólisis, que había oxidado el 3-fosfogliceraldehido a
ácido 3- fosfoglicerico. El etanol y CO2 son productos finales de la fermentación
alcohólica y su ecuación general es la siguiente:
Glucosa + 2 ADP + 2 Pi 2 Etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O
La conversión de glucosa en etanol y CO2 produce 2 moles de ATP por mol de
glucosa transformada (Nelson y Cox. 2000).
2.7.2. Tolerancia al etanol
No todas las levaduras presentan la misma sensibilidad al etanol. Las más
resistentes son las especies de Saccharomyces sp. que se presentan en los
procesos de fermentación alcohólica para la elaboración de bebidas o la producción
industrial de etanol. Según las cepas y el estado fisiológico del cultivo, el etanol es
tóxico en concentraciones del 8% (p/v) al 18% (p/v). La tolerancia al etanol depende
de la composición en ácidos grasos de las membranas citoplasmáticas. Las células
cultivadas en presencia de ácido linoleico (C18:2) toleran mejor el etanol añadido al
medio que las células en presencia de ácido oleico (18:1). La viabilidad es mejor en
presencia de ergosterol que de camposterol (Carballo, 2000).
El etanol intracelular es más tóxico para las células que el etanol extracelular. La
viabilidad de los cultivos puede incrementar por la eficiencia de la excreción del
etanol, debido a esto, hay una influencia de la presión osmótica: cuando la presión
osmótica aumenta en el medio, la secreción del etanol se disminuye
considerablemente. En un medio que contiene 30% (p/v) de sorbitol y 10% (p/v) de
sacarosa, no hay prácticamente ninguna secreción del etanol durante 24 horas
mientras que en un medio con presión osmótica baja, el etanol difunde rápidamente.
Las medidas de etanol intracelular permiten situar el lumbral de toxicidad hacia 0.25
mg de etanol intracelular para 106 células viables. Es así que, la presión osmótica
elevada de los medios representa un problema importante en la fermentación
alcohólica, que debe ser tenido en cuenta en el procedimiento (Carballo, 2000).
13
Por otra parte, para hacer frente a estas situaciones desfavorables, S. cerevisiae
responde rápidamente sintetizando moléculas que le permiten actuar o reparar el
daño causado por el estrés. Entre las moléculas mejor caracterizadas en la
respuesta están las llamadas “proteínas de estrés”. Su estudio ha evidenciado que
la respuesta a nivel transcripcional es importante para la supervivencia celular y ha
llevado a la descripción de varias vías de transducción de señales y factores de
transcripción involucrados en esta respuesta (Folch, et al, 2004). Según estudios el
etanol inhibe el crecimiento de los microorganismos y causa daños en el ADN
mitocondrial de las células de las levaduras y la inactivación de algunas enzimas
como la hexoquinasa y la dehidrogenasa. Además, se ha encontrado que cuando S.
cerevisiae crece en presencia de etanol se incrementa la cantidad de ácidos grasos
insaturados en la membrana como una alternativa ante el estrés generado por la
toxicidad del etanol (Martini, et al., 2005; Man, et al., 2003).
2.8. Determinación de azúcares reductores
Una de las técnicas usadas para la detección de azúcares reductores es la
denominada DNS o ácido 3,5 dinitrosalicílico; esta es una técnica de oxido-
reducción en la que el ácido 3,5 dinitrosalicílico es reducido mientras que el grupo
aldehído del monosacárido es oxidado. La reducción del reactivo genera una
coloración amarilla la cual es proporcional a la concentración de azúcares
reductores presentes, esto se evidencia por medio de la lectura de absorbancias en
el espectrofotómetro lo que implica la aplicación de la ley de Beer Lambert (Miller,
1959).
14
3. JUSTIFICACIÓN
Actualmente la acumulación de residuos sólidos principalmente de origen vegetal
han generado impactos ambientales por el creciente desarrollo especialmente en el
sector agroindustrial como la floricultura; ya que producen alteraciones en el paisaje,
olores, plagas de insectos y roedores, generan gases tóxicos al ser incinerados
como una alternativa de manejo, producen eutrofización de aguas si estos o sus
lixiviados son dispuestos en cuerpos de agua y potencializan riesgos de
magnificación de plaguicidas en la cadena trófica si estos se dan como alimento a
animales de granja (Corbitt, 2003). Aproximadamente, el 90% de los residuos
sólidos generados en floricultura corresponden a residuos vegetales, los cuales
ofrecen tanto una amenaza al ambiente como una alternativa de uso biotecnológico
según el manejo y disposición que se les dé. Actualmente, la oportunidad consiste
en aprovecharlos en compostaje y reincorporarlos al proceso productivo como
fuente de nutrientes (Asocolflores, 2000).
Además, junto al manejo de los residuos vegetales se está presentando el impacto
ambiental por la emisión de gases de efecto invernadero en la utilización de
combustibles fósiles, pues actualmente es uno de los problemas que esta afectando
a todo el mundo, por la incidencia en el cambio climático y la contaminación
atmosférica; por esta razón, muchos países como Brasil y Estados Unidos, están
adoptando como alternativa a esta problemática, el uso del alcohol combustible
“Bioetanol”, para reducir las emisiones nocivas ambientales (Zaldivar, et al., 2001).
Por tal motivo el aprovechamiento biotecnológico de estos residuos vegetales como
sustratos de origen natural en la producción de biomasa y bioetanol, proporcionan
ventajas en la reducción tanto en el costo de la materia prima, como en el volumen
de residuos generados y en las emisiones de gases de efecto invernadero mitigando
esta serie de impactos ambientales.
La utilización de microorganismos representa una opción viable para la producción
de etanol, además, del manejo de residuos vegetales que pueden servir como
fuente de carbono para la producción del mismo, favoreciendo al medio ambiente.
Por esto, en el presente trabajo se plantea una alternativa biotecnológica para la
15
obtención de un sustrato fermentable a partir de la conversión del material vegetal
por pretratamiento biológico con microorganismos celulolíticos y su evaluación con
células libres de Saccharomyces cerevisiae en producción de biomasa y de etanol,
usando un sustrato económico y de origen natural, que puede llegar a proporcionar
los nutrientes necesarios para el desarrollo del microorganismo.
16
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Obtener un sustrato fermentable a partir de residuos vegetales de Crisantemo
(Dendranthema grandiflora) y evaluarlo con células libres de Saccharomyces
cerevisiae.
4.2. Objetivos específicos
Obtener un extracto crudo que pueda ser utilizado como sustrato fermentable.
Evaluar el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en el sustrato de origen
vegetal
Comparar rendimientos Yx/s y Yp/s obtenidos a partir del sustrato
fermentable de origen vegetal con los obtenidos a partir de medio de cultivo
YGC.
Cuantificar el etanol como producto final de la fermentación del sustrato de
origen vegetal.
17
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Todos los procesos experimentales planteados en este proyecto fueron realizados
por triplicado.
Durante todos los procedimientos se llevó a cabo la prueba de pureza para asegurar
cultivos axénicos.
5.1. Ubicación
Este proyecto de investigación, se desarrolló en las instalaciones del laboratorio de
Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana.
5.2. Obtención del sustrato fermentable
5.2.1. Microorganismos
Se utilizó un consorcio microbiano celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp) de
origen vegetal y suelo, para el pretratamiento del residuo vegetal (Gaitán y Pérez
2006)
5.2.2. Residuo Vegetal
Se utilizaron residuos de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) provenientes de
un cultivo localizado al norte del municipio de Tocancipá. Estos fueron sometidos a
una caracterización físico-química en un laboratorio certificado por el FCA. A los
residuos vegetales se les realizó pretratamiento tanto químico, como biológico para
obtener el extracto crudo o sustrato fermentable (SF), éste fue la fuente de carbono
(azúcar fermentable: glucosa) para ser utilizado como sustrato fermentable en la
producción de etanol con células libres de Saccharomyces cerevisiae.
18
5.2.3. Pretratamiento del residuo vegetal
El objetivo de estos procedimientos fue aumentar la susceptibilidad del residuo
vegetal, al reducir la cristalinidad de la celulosa, e incrementar la porosidad y de
esta manera obtener un extracto crudo con mayor concentración de glucosa; por lo
tanto, se seleccionó el mejor pretratamiento por análisis de medias (Daniel, 2002;
Romano, et al., 2005).
5.2.3.1. Lavado con SDS ( Sodio Dodecil Sulfato)
Los residuos vegetales de Crisantemo se lavaron con SDS (Sodio Dodecil Sulfato)
al 1% (p/v) y se redujo de tamaño realizando molienda, para posteriormente ser
sometidos a ebullición por un periodo de una hora con SDS al 1% (p/v). Luego se
realizó un secado a 55°C y por último, se sometió a un proceso de esterilización
(Guevara y Zambrano, 2006).
5.2.3.2. Pretratamiento químico con peróxido de hidrógeno (delignificación
oxidativa)
En una solución alcalina de peróxido de hidrógeno al 2% se suspendió el residuo
vegetal molido y pretratado con SDS en una relación 10:1 respectivamente, esta
mezcla fue llevada a un baño termostatado durante 12 horas a 50°C. Luego se filtró
y lavó con agua destilada. Por último se sometió a un proceso de secado en horno
de convección a 90°C por 12 horas (Sun, et al., 2000).
El residuo vegetal fue sometido a diferentes pretratamientos todos con reducción de
tamaño:
• Lavado con SDS.
• Lavado con SDS y tratado con peróxido de hidrógeno.
• Sin lavado con SDS y sin tratamiento con peróxido de hidrógeno (Control).
• Sin lavado con SDS y con tratamiento con peróxido de hidrógeno.
Todos los anteriores se sometieron a temperatura de 50°C por 12 horas,
condiciones del pretratamiento con peróxido de hidrógeno.
19
5.2.4. Pretratamiento biológico
5.2.4.1. Fermentación discontinua del residuo vegetal por parte del
consorcio celulolítico
Se llevaron a cabo tres fermentaciones con concentraciones de 5% (p/v), 10% (p/v)
y 12% (p/v) de residuo vegetal por triplicado; para evaluar en cual se obtenía la
mayor concentración de azúcares reductores.
5.2.4.1.1. Preparación del inóculo
Las cepas de los microorganismos celulolíticos fueron cultivadas en agar celulosa al
1% (p/v), cuya composición en g/L es: carboximetilcelulosa 10, extracto de levadura
2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato
monobásico de potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1, agar 15, pH final 7.0 +/-
0.2, bajo condiciones controladas de 35°C por 48 horas. Posteriormente, se realizó
un raspado de las colonias para preparar una suspensión en solución salina
0.85%(p/v), a una concentración de 108 células/ml, la cual fue obtenida para el
inóculo de bacterias igualando al tubo 5 de McFarland. En el caso del inóculo del
actinomiceto se realizó el recuento en cámara de Neubauer para obtener la misma
concentración en el consorcio.
En un erlenmeyer de 500mL con 90mL de caldo celulosa, fueron adicionados los
10ml de preinóculo y se cultivaron a 130 rpm, 35ºC por 24 horas.
5.2.4.1.2. Fermentación discontinua
Se adicionaron 900mL de caldo residuo vegetal estéril a la concentración
correspondiente (5%(p/v), 10%(p/v) ó 12%(p/v)) cuya composición en g/L es:
residuo vegetal a las diferentes concentracines, extracto de levadura 2.5, peptona
universal 2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de
potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1, (Caldo SVS) a un erlenmeyer de 2 litros;
posteriormente se agregó el 10% de inóculo (100mL), y se controlaron las
20
condiciones de operación: temperatura 35°C por 24 horas y agitación de 130 rpm.
Adicionalmente, como control se realizó una fermentación con la concentración de
residuo vegetal 10% (p/v) y 12% (p/v) sin la adición de los demás componentes
(sales, peptona y extracto de levadura) (Caldo SV), esto para verificar si el residuo
proporcionaba todas las fuentes nutricionales para el desarrollo de los
microorganismos celulolíticos.
Se realizaron muestreos cada 2 horas hasta completar 24 horas. Para cada
muestreo, se tomaron 6 mL distribuidos así: 1mL para evaluar la producción de
azúcares reductores mediante la técnica de DNS (Miller, 1959), 2mL para
determinación de pH, 3mL para determinación de actividad enzimática.
Al finalizar el proceso de fermentación se obtuvo el extracto crudo o sustrato
fermentable (SF), mediante un proceso de centrifugación y filtración, con el fin de
eliminar la población celular.
Se seleccionó la concentración de residuo vegetal que arrojó mayor cantidad de
azúcares; éste sustrato fermentable obtenido, fue sometido a la técnica de
cromatografía líquida HPLC para evaluar la concentración de glucosa, sacarosa y
celulosa disponible.
5.2.5. Determinación de actividad celulolítica cuantitativa
Esta se realizó evaluando dos condiciones de pH (5 y 7) y temperatura diferentes
(37 y 50°C) reportadas por literatura. Para la interpretación de los resultados, una
unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una
micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo (Guevara y
Zambrano, 2006).
5.2.5.1. Actividad celulolítica a pH 7
Se tomó un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de
muestreo y se adicionó 1mL de solución de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta
21
en buffer fosfato 0.1M pH 7 +/- 0.2 (Anexo A1). La mezcla final se incubó en baño
termostatado a 37°C durante 1 hora, finalizado este tiempo se frenó la reacción
refrigerando a 4°C durante 5 minutos. Posteriormente se centrifugó la muestra por
10 minutos a 5000 rpm, a partir del sobrenadante se determinó la concentración de
azúcares reductores por la técnica de DNS (Miller, 1959; Guevara y Zambrano,
2006).
5.2.5.2. Actividad celulolítica a pH 5
Se tomó un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de
muestreo y se adicionó 1mL de solución de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta
en buffer ácido cítrico 0.1M pH 5 +/- 0.2 (Anexo A2). La mezcla final se incubó en
baño termostatado a 50°C durante 1 hora, finalizado este tiempo se frenó la
reacción refrigerando a 4°C durante 5 minutos. Posteriormente se centrifugó la
muestra por 10 minutos a 5000 rpm, a partir del sobrenadante se determinó la
concentración de azúcares reductores por la técnica de DNS (Miller, 1959; Sun y
Cheng, 2002; Palmarola, et al., 2005).
5.3. Evaluación del Sustrato con Saccharomyces cerevisiae
Como microorganismo control para la producción de etanol se utilizó la levadura
Saccharomyces cerevisiae (Muñoz y Poutou, 1999). La cepa fue tomada del banco
de cepas del Laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Universidad Javeriana.
A partir de la concentraciones de residuo vegetal evaluadas se seleccionó el
sustrato fermentable que aportó mayor concentración de azúcares reductores para
la fermentación con Saccharomyces cerevisiae.
5.3.1. Fermentación discontinua control
Se realizó esta fermentación con el objetivo de verificar la actividad metabólica de la
cepa Saccharomyces cerevisiae en la producción de etanol.
22
5.3.1.1. Preparación del inóculo
La cepa de Saccharomyces cerevisiae fue cultivada en agar YGC cuya composición
es en g/L: extracto de levadura 5, D-glucosa 20, cloramfenicol 0.1 y agar-agar 14.9,
pH final 6.6 (Merck, 2000), bajo condiciones controladas de 30ºC por 12 horas.
Posteriormente se realizó un raspado de las colonias de la levadura para preparar
una suspensión en solución salina 0.85%(p/v), con una absorbancia de 0.8 a
620nm.
En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml
de preinóculo y se cultivaron a 120rpm, 30ºC por 12 horas.
5.3.1.2. Fermentación discontinua
Se adicionaron 1350mL de caldo YGC estéril a un erlenmeyer de 2 litros;
posteriormente se agregó el 10% de inóculo (150ml), y se controlaron las
condiciones de operación: temperatura 30°C por 14 horas y agitación de 70rpm
(Noor, et al., 2003).
Se tomaron 3 ml de medio estéril para determinar la concentración inicial de sustrato
y el pH. Luego de ser inoculado el erlenmeyer se retiraron 7 ml de muestra, que
correspondió a la hora cero (0) y, posteriormente se realizaron cada dos horas hasta
completar 14 horas; a estas muestras se les determinó la concentración de biomasa
por el método de peso seco y de azúcares reductores mediante la técnica de DNS.
Adicionalmente, se evaluó la producción de etanol por cromatografía líquida HPLC.
5.3.2. Fermentación discontinua con sustrato vegetal (SF)
5.3.2.1. Preparación del inóculo
La cepa de Saccharomyces cerevisiae fue cultivada en agar YGC, bajo condiciones
23
controladas de 30ºC por 12 horas. Posteriormente, se realizó un raspado de las
colonias de la levadura para preparar una suspensión en solución salina 0.85%(p/v),
con una absorbancia de 0.8 a 620nm.
En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml
de preinóculo y se cultivaron a 120rpm, 30ºC por 12 horas.
5.3.2.2. Fermentación discontinua
Se adicionaron 1350mL de caldo SF a un erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se
agregó el 10% de inóculo (150ml), y se controlaron las condiciones de operación:
temperatura 30°C por 24 horas y agitación de 70 rpm (Noor, et al., 2003).
Se tomaron 3 ml de medio estéril para determinar la concentración inicial de sustrato
y el pH. Luego de ser inoculado el erlenmeyer se retiraron 7 ml de muestra, que
correspondió a la hora cero (0) y, posteriormente se realizaron cada dos horas hasta
completar 32 horas; a estas muestras se les determinó la concentración de biomasa
por el método de peso seco, de azúcares reductores mediante la técnica de DNS
(Miller, 1959) y de etanol por cromatografía líquida HPLC.
5.3.3. Determinación de azúcares reductores por la técnica del ácido 3,5
dinitrosalicílico (DNS)
Se tomó un volumen de 0.25 ml a partir del extracto crudo obtenido en cada
muestreo durante la fermentación, al cual se le adicionó 0.25 ml de DNS, esta
mezcla fue sometida primero a ebullición por 5 minutos, y luego a un recipiente con
hielo por 5 minutos para frenar la reacción, y por último se adicionaron 2.5 ml de
agua destilada, a la mezcla. Para determinar la absorbancia, esta solución fue leída
en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm y sensibilidad media. El
dato de absorbancia fue reemplazado en la ecuación de la línea recta determinada
por la curva patrón utilizando glucosa previamente realizada y se obtuvo la
concentración de glucosa residual en g/L para cada muestreo (Miller, 1959).
24
5.3.4. Determinación de biomasa por peso seco en función del tiempo
Este procedimiento permitió obtener la concentración celular de Saccharomyces
cerevisiae al transformar los valores de absorbancia correspondientes a cada
tiempo de fermentación en unidades de gramos de masa celular seca por litro (g/L).
Para realizar la curva patrón de peso seco, se preparó una suspensión concentrada
de la levadura, fue lavada dos veces con solución salina 0.85% (p/v) por
centrifugación a 2250 g por 20 minutos. El pellet se resuspendió al volumen inicial.
Posteriormente, fueron adicionados en 10 tubos previamente pesados 10 mL de la
solución de células a cada uno, igualmente 10 mL de solución salina en 10 tubos
que sirvieron como blanco. Estos fueron llevados al horno a 105°C por 24 horas,
terminado el tiempo de evaporación del líquido se pasaron al desecador para ser
pesados nuevamente y determinar el promedio del peso de los 10 tubos que
contenían las células y el de los 10 tubos con solución salina, a partir de esto se
calculó la diferencia de peso entre los dos promedios para expresar la concentración
en gramos de biomasa seca por litro de solución (g/L). A partir de la solución
concentrada de células se realizaron diluciones por triplicado para ajustar la
absorbancia entre 0.2 – 0.9 y calcular las concentraciones finales para cada
dilución. Esto permitió hallar la ecuación bcmAbs += * al graficar la absorbancia
promedio en función de la concentración celular (g/L).
Se tomaron 5 ml de cada muestra de fermentación, se realizaron dos lavados con
solución salina 0.85 % (p/v) por centrifugación a 2250 g por 20 minutos. El pellet se
resuspendió al volumen inicial. Se agitó en vortex y se leyó la absorbancia a 620nm
para hallar la concentración de biomasa a partir de la ecuación de peso seco
(Godoy, 2002).
5.3.5. Determinación de etanol
El contenido de etanol se analizó por cromatografía líquida de alto desempeño
HPLC, en un cromatógrafo WATERS, con detector de indice de refracción (Waters
25
Corporation, Milford, MA). La fase móvil fue agua con un flujo de 0.5mL/min, y se
empleo una columna Sugar Pak I con precolumna KC-G (Waters Corporation,
Milford, MA). La temperatura de la columna fue 84°C. Para el análisis de los
resultados se uso el programa Millenium V 2.15.01.
Para la determinación de los factores de respuesta se utilizaron glucosa grado
cromatográfico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y etanol anhidro grado analítico
Merck (Darmastadt, Alemania).
5.3.6. Determinación de rendimientos
A partir de los datos de biomasa obtenidos por peso seco, de sustrato por la técnica
del DNS, y de producto por cromatografía líquida HPLC. Se determinaron los
rendimientos por las siguientes fórmulas (Doran, 1995):
sustratodeconsumoformadoproducto
sp
Y..
)etanol.(.=
sustratodeConsumoformadaBiomasa
sx
Y..
.=
5.3.7. Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de los datos obtenidos se realizaron curvas de biomasa,
consumo de sustrato y actividad enzimática en función del tiempo, además se utilizó
el programa SPSS versión 14 en el cual se determinaron las medias (nivel de
confianza 95%), la desviación estándar, el coeficiente de variación y la estadística
de prueba de la distribución t student para comparar la concentración de azúcares
liberados con el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12%(p/v). Y comparar la
26
concentración celular de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa y en el
SF (Daniel, 2002).
Hipótesis general:
La concentración de azúcares reductores liberados en la fermentación con SV al
10%(p/v) no difiere de la concentración de azúcares reductores liberados en la
fermentación con SV al 12%(p/v).
H0: µ1 - µ2 = 0
Hi: µ1 - µ2 � 0
Hipótesis general:
La concentración celular de Saccharomyces cerevisiae en el caldo sustrato
fermentable no difiere de la concentración celular en el caldo YGC con 2 g/L de
glucosa (control).
H0: µ1 - µ2 = 0
Hi: µ1 - µ2 � 0
27
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Pretratamiento del residuo vegetal
El propósito de realizar pretratamiento a los residuos vegetales es aumentar la
susceptibilidad del material al remover la lignina y hemicelulosa, reducir la
cristalinidad de la celulosa, e incrementar la porosidad del residuo. Por tal razón, se
evaluaron diferentes pretratamientos para determinar cual permitía obtener mayor
concentración de azúcares reductores, al facilitar la hidrólisis enzimática de la
celulosa por parte del consorcio celulolítico. Para estos análisis se seleccionó la
concentración de residuo vegetal al 10% (p/v) por ser la concentración intermedia a
las propuestas.
Con el residuo vegetal molido tratado con y sin SDS; se realizó una fermentación de
22 horas realizando muestreos en las horas 0 y 22, obteniendo como resultado que
la mayor cantidad de azúcares reductores liberados por los microorganismos
celulolíticos se presentó en el residuo vegetal sin tratamiento con SDS teniendo una
concentración de 2.46 g/L comparado con 1.44g/L del tratado con SDS (Figura 1,
anexo C).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 22
TIEMPO (h)
CALDO SV 10% SIN SDS CALDO SV 10% CON SDS
Figura 1. Azúcares reductores liberados en función del Tiempo. Residuo tratado con
SDS y sin SDS.
28
Al realizar los pretratamientos del residuo al 10% (p/v) con SDS, con peróxido de
hidrógeno 2% y un control en agua a las mismas condiciones 50°C por 12 horas,
se evaluó la liberación de azúcares reductores por parte del consorcio celulolítico en
una fermentación de 22 horas para cada tratamiento. El control se realizó con el
objetivo de evaluar el efecto de la temperatura. La concentración de azúcares
reductores con el residuo tratado con SDS y H2O2 fue de 0.870 g/L, estos
resultados mostraron que no actuó el complejo enzimático por parte del consorcio
celulolítico; porque de la hora 0 a la 22 no hubo una diferencia en la concentración
de azúcares reductores; mientras que en el control se presentó la mayor
concentración de azúcares reductores 1.84g/L a las 12 horas teniendo relación con
la mayor actividad enzimática 52.1 UC/L, como se observa en la tabla 1.
Tabla 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal al 10% sin
suplemento tratado con SDS y peróxido de hidrógeno. (Temperatura 50°C por 12
horas).
ND = No se determinó a Una unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una
micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo.
Se observó que el tratamiento a 50°C por 12 horas no tiene efecto en la liberación
de azúcares (Tabla 1); ya que los resultados obtenidos con el residuo vegetal sin
ningún tratamiento (sin SDS, sin H2O2 y sin temperatura a 50°C) son similares en la
hora 0 de fermentación (1.35 g/L y 1.329 g/L) (Figura 1), además en la hora 22 la
concentración de azúcares reductores fue mayor (2.461 g/L), que en el control de la
CALDO SV 10% (p/v) CON
SDS
CALDO SV 10% (p/v) CON
H 2O2 Y SIN SDS
CALDO SV 10% (p/v)SIN
H 2O2 Y SIN SDS (control)
CALDO SV 10% (p/v) CON
H 2O2 Y CON SDS
AZÚCARES
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37ºC
AZÚCARES
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37ºC
AZÚCARES
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37ºC
AZÚCARES
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37ºC HO
RA
g/L aUC/L g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L
0 0,595 0,0 0,471 0,0 1,350 0,0 0,835 0
12 0,926 23,1 0,484 15,0 1,840 52,1 ND ND
22 0,749 23,9 0,555 17,4 1,502 40,0 0,871 4,07
29
fermentación del residuo con tratamiento de temperatura (1.502 g/L); posiblemente,
en los pretratamientos al realizar los lavados para retirar tanto el SDS como el
peróxido de hidrógeno se pierden varios nutrientes necesarios para el crecimiento y
actividad enzimática de los microorganismos celulolíticos.
Estos resultados reflejaron que el tratamiento con SDS y H2O2 causa una inhibición
enzimática en el consorcio celulolítico, esto se debe a que el SDS es un tensoactivo
iónico y desnaturalizante de proteínas, y al quedar trazas de éste en el residuo
impide la degradación de la celulosa por parte del complejo enzimático (Castagnino,
2000), al igual que el peróxido de hidrógeno, agente oxidante usado para remover
la lignina y la hemicelulosa presentes en materiales lignocelulósicos. Según la
caracterización físico – química del residuo vegetal de Crisantemo, el porcentaje de
lignina es 0.51%, de hemicelulosa 2.03% y celulosa 65.3% (Anexo D), por lo tanto,
el pretratamiento con peróxido no sería necesario por la baja proporción de lignina y
hemicelulosa. Por el contrario su presencia inhibió la hidrólisis enzimática al
proporcionar un pH alcalino de 9.8 el cual esta por encima de las condiciones
óptimas de actividad del complejo enzimático reportadas por varios autores pH 5 a
50°C (Palmarola, et al., 2005; Sun y Cheng 2002; Duff y Murria, 1996).
Al comparar los pretratamientos realizados al residuo vegetal, se determinó que era
suficiente la reducción de tamaño del material para obtener mayor concentración de
azúcares reductores y de actividad enzimática, pues algunos factores que afectan la
hidrólisis de la celulosa son el contenido de lignina y hemicelulosa, la porosidad de
la materia prima (área superficial accesible) y cristalinidad de la celulosa, la cual se
reduce con la molienda; por lo tanto, no es necesario realizar tratamientos químicos
al residuo de crisantemo debido a la mínima proporción de lignina y hemicelulosa,
polímeros que reducen la eficiencia de la hidrólisis (Prasad, et al., 2006); debido
esto, el residuo vegetal se redujo de tamaño en un molino de martillo hasta que
pasara por un tamiz con un diámetro de poro menor a 850µm.
30
6.2 Fermentación discontinua del residuo vegetal con el consorcio celulolítico
El objetivo de utilizar el consorcio celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en
fermentación discontinua con el residuo vegetal, fue obtener azúcares reductores
presentes en la celulosa, gracias a la hidrólisis enzimática catalizada por el complejo
de celulasas. Por tal razón se evaluaron diferentes variables: concentración 5%
(p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) de residuo vegetal fresco y suplemento con: sales,
extracto de levadura y peptona (SVS), que podrían tener algún efecto sobre la
degradación de este polímero y por ende, en la concentración de azúcares
reductores liberados en el extracto crudo al finalizar la fermentación (Figura 2). De
acuerdo con estos resultados, se determinaron las variables que permitieran obtener
la mayor concentración de azúcares reductores en el extracto crudo que fue
evaluado como sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae.
Figura 2. Fermentación del residuo vegetal con el consorcio celulolítico.
6.2.1 Residuo vegetal al 10% (p/v)
Para confirmar el efecto del tratamiento con SDS en la hidrólisis enzimática, se
decidió realizar una fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal
fresco al 10% (p/v), suplementado (SVS) y tratado con SDS, se realizaron
muestreos desde la hora 12 hasta la 24 (Figura 3, tabla 1 del anexo E). Además se
31
realizó una fermentación con SVS sin tratamiento con SDS (Figura 4, tabla 2 -
anexo E), para establecer diferencias, con el fin de determinar si el consorcio
necesita otros requerimientos nutricionales para su crecimiento y actividad
enzimática.
Al comparar los resultados de la fermentación con suplemento (SVS) 10% (p/v) con
y sin tratamiento se observó que la actividad enzimática del consorcio es mejor al
utilizar el residuo sin tratamiento, al obtenerse una concentración de azúcares
reductores de 1.63g/L a la hora 12, mientras que en el residuo tratado fue 1.317 g/L
en la hora 20 (Figura 3 y 4). Este resultado corroboró que el SDS afecta la hidrólisis
enzimática y reduce su velocidad de reacción; probablemente al quedar trazas de
este tensoactivo en el residuo vegetal; razón por la cual se decidió no realizar
ningún pretratamiento, lo que significa una gran ventaja para llevar a cabo el
proceso al disminuir costos y tiempo de fermentación.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0 5 10 15 20 25 30
TIEMPO (h)
AZ
ÚC
AR
ES
RE
DU
CT
OR
ES
(g
/L)
0
10
20
30
40
50
60
UC
/L
Azúcares reductores (g/L) UC/L pH 7 37°C UC/L pH 5 50°C
Figura 3. Fermentación del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10%,
tratado con SDS y suplementado. Azúcares reductores liberados y actividad
enzimatica pH 7 a 37°C Y pH 5 a 50°C en función del Tiempo.
Al analizar los resultados de la fermentación con residuo fresco al 10% (p/v) sin
tratamiento, con y sin suplemento, se observó que la mayor concentración de
32
azúcares reductores liberados se presentó al utilizar el residuo sin suplemento de
sales y fuente de nitrógeno (caldo SV). A la hora 12 y 22 se obtuvo una
concentración de azúcares de 2.08 g/L y 2.47 g/L, respectivamente (Figura 4, tabla
3 - anexo E), mientras que en la fermentación con el residuo suplementado (caldo
SVS) la mayor concentración de azúcares fue 1.63 g/L a la hora 12.
Este resultado se presentó gracias a la composición del residuo vegetal, el cual
posee 5.01% de proteínas como fuente de nitrógeno, además de minerales que
proporcionan un medio nutritivo para el crecimiento del consorcio celulolítico (Anexo
E). Los requerimientos nutricionales de los microorganismos celulolíticos son
nitrógeno, fósforo, azufre, macroelementos y microelementos, los cuales
encuentran en su ambiente natural (residuo de Crisantemo); por esta razón no se
requieren de fuentes adicionales de nutrientes como peptona, extracto de levadura y
sales (Lynd, et al., 2002).
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 5 10 15 20 25
TIEMPO (h)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH
Azúcares (con suplemento) Azúcares (sin suplemento)
pH (con suplmento) pH (sin suplemento)
Figura 4. Azúcares reductores liberados y pH en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento.
33
Para determinar las mejores condiciones de la actividad celulolítica se evaluó la
técnica cuantitativa en un buffer fosfato pH 7 a 37ºC y un buffer de ácido cítrico pH 5
a 50ºC. Según varios autores el pH ácido en un rango de 4 a 5 y la temperatura
entre 45ºC – 50ºC, favorecen la hidrólisis enzimática de la celulosa (Palmarola, et
al., 2005; Sun y Cheng, 2002; Duff y Murria, 1996). Los resultados obtenidos
mostraron en general, que la actividad enzimática es mayor en condiciones de pH 7
y 37ºC (Figura 5 y 6), evidenciando que la expresión de las enzimas es mejor a pH
neutro y a una temperatura que no exceda los 40ºC, por ser microorganismos
mesófilos; y el pH ácido reduce la producción enzimática de los dos
microorganismos en consorcio (Lynd, et al., 2002).
No obstante, la actividad celulolítica es muy baja con el consorcio celulolítico; ya que
la mayor actividad fue de 98.4UC/L (0.098 UC/mL), a la hora 22 de la fermentación
con caldo SV 10% (p/v) (Figuras 5 y 6), en la cual el pH se mantuvo en un rango de
6 – 7 durante todo el proceso (Figura 4). Esta actividad es menor a la reportada por
Guevara y Zambrano 2006, al utilizar consorcios con cepas de B. subtilis y
Streptomyces sp. en residuos de caña de azúcar, obteniendo valores máximos de
0.694 UC/mL y 0.680 UC/mL. A pesar que la actividad celulolítica se determinó con
carboximetilcelulosa (CMC), sustrato que no representa la misma estructura
heterogénea de los sustratos celulósicos naturales; siendo más fácil de degradar por
los microorganismos al producir enzimas endoglucanasas, mientras que la hidrólisis
de la celulosa cristalina requiere todo el complejo enzimático (Guevara y Zambrano
2006). Esto indica que los microorganismos utilizados para degradar el residuo
vegetal de Crisantemo no tienen una buena actividad celulolítica, también se ve
reflejado en la baja concentración de azúcares reductores liberados, al tener en
cuenta que la proporción de celulosa en el residuo vegetal es de 65.3% (Anexo D),
aunque varios autores reportan que Streptomyces sp. produce las enzimas del
complejo, endoglucanasas, exoglucanasa y �- glucosidasa (Ramírez y Coha 2003).
34
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
UC
/L
UC/L 10% sin suplemento UC/L 10% con suplemento
Figura 5. Actividad enzimática pH 7 a 37°C en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
UC
/L
UC/L 10% sin suplemento UC/L 10% con suplemento
Figura 6. Actividad enzimática pH 5 a 50°C en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 10% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento.
35
6.2.2 Residuo vegetal al 12% (p/v)
Al evaluar esta concentración de residuo vegetal en caldo SV y SVS se observó que
el consorcio tiene el mismo comportamiento de la fermentación al 10% (p/v), ya que
la mayor concentración de azúcares reductores se obtuvo a la hora 14 con 2.25 g/L
en el caldo SV, mientras en el caldo SVS fue 2.15 g/L (Figura 7, tabla 4 y 5 - anexo
E). Igualmente la actividad enzimática fue baja y mostró mejor expresión a 37ºC
(Figura 8 y 9) y pH neutro, durante las 22 horas de fermentación el pH se mantuvo
entre 6 y 7 (Figura 7).
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
AZ
ÚC
AR
ES
RE
DU
CT
OR
ES
(g
/L)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pHAzúcares (con suplemento) Azúcares (sin suplemento)
pH (con suplemento) pH (sin suplemnto)
Figura 7. Azúcares reductores liberados y pH en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento.
36
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
UC
/L
UC/L 12% sin suplemento UC/L 12% con suplemento
Figura 8. Actividad enzimática pH 7 a 37°C en función del Tiempo. Fermentación
del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con
y sin suplemento.
0102030405060708090
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
UC
/L
UC/L 12% sin suplemento UC/L 12% con suplemento
Figura 9. Actividad enzimática pH 5 a 50°C vs. Tiempo. Fermentación del
consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 12% (p/v) sin tratamiento, con y
sin suplemento.
6.2.3 Residuo vegetal al 5% (p/v)
En esta fermentación, se observó que la mayor actividad enzimática y concentración
de azúcares reductores fue de 35.70 UC/L (pH 7 a 37°C) y 0.849g/L en la hora 18,
37
respectivamente (Figura 10). Al comparar las tres concentraciones evaluadas de
sustrato vegetal con suplemento (SVS) 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) se
observaron valores muy bajos, por tal razón, no se realizaron más experimentos con
la concentración al 5% (p/v), como se muestran en la tabla 6 - anexo E.
0
0.10.2
0.3
0.40.5
0.60.70.80.9
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
TIEMPO (h)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
UC
/L
Azúcares reductores (g/L) UC/L pH 7 37ºC
Figura 10. Fermentación del consorcio celulolítico en residuo vegetal fresco al 5%
(p/v), tratado con SDS y suplementado. Azúcares reductores liberados y actividad
enzimática pH 7 a 37°C en función del Tiempo.
La concentración de sustrato es uno de los principales factores que afectan la
producción y la velocidad inicial de la hidrólisis enzimática de la celulosa. Un
incremento de la concentración de sustrato normalmente resulta en un aumento de
la producción y de la velocidad de reacción de la hidrólisis. Sin embargo, altas
concentraciones de sustrato pueden causar inhibición enzimática, lo cual disminuye
sustancialmente la velocidad de la hidrólisis, y la dimensión de la inhibición por
sustrato depende de la relación del sustrato total a enzima total (Romano, et al.,
2005; Sun y Cheng, 2002). Al evaluar las tres concentraciones de residuo vegetal
(SVS) se observó una diferencia en la actividad celulolítica entre el 5% (p/v) y el
10% (p/v), pues la mayor actividad en el caldo SVS, fue 35.70 UC/L y 64.2 UC/L
respectivamente, de igual forma en el caldo SVS 12% (p/v) fue 80 UC/L a 37ºC y pH
7. En el SV 10% (p/v) y 12% (p/v) a la hora 22 se presentó la actividad más alta
98.4 UC/L y 105.2 UC/L respectivamente (Tabla 3 y 5 - anexo E).
38
De acuerdo al análisis de medias y la desviación estándar los datos de las
repeticiones de cada fermentación no presentaron una amplia dispersión, por lo
tanto, se determinó que la mayor concentración de azúcares reductores liberados
estaba entre el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12% (p/v) sin tratamiento y sin
suplemento, se decidió obtener el sustrato fermentable con el residuo de crisantemo
al 10% (p/v); ya que se llevo a cabo la estadística de prueba con la distribución t
student, concluyendo que no existe suficiente evidencia estadística para rechazar la
hipótesis nula (Ho). Por lo tanto, se afirma que no existe evidencia estadísticamente
significativa en la concentración de azúcares reductores liberados tanto en el SV
10%(p/v) como en el SV 12%(p/v). Además, la manipulación del residuo a esta
concentración (10%) era más fácil y se obtenía un volumen más alto del extracto
crudo (Anexo E). Así mismo, se decidió utilizar el caldo SV porque presentó mayor
concentración de azúcares reductores liberados, lo cual es una ventaja en cuanto
costos del proceso, ya que no es necesario adicionar fuentes nutricionales para que
el consorcio se desarrolle, pues el residuo vegetal de Crisantemo proporciona la
fuente de carbono, nitrógeno y sales. También se determinó que el tiempo de la
fermentación para la obtención del sustrato fermentable (extracto crudo) fuera de 12
horas al encontrar que la diferencia con la hora 22 no era relevante para prolongar
10 horas más el proceso.
6.3 Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae
6.3.1 Fermentación discontinua control
Se evaluó el comportamiento de Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 20
g/L y 2 g/L de glucosa, para determinar biomasa por peso seco (Anexo F), consumo
de sustrato y producción de etanol. Estas curvas se utilizaron como control para
evaluar el comportamiento de la cepa, teniendo en cuenta que esta levadura crece
con 20g/L de glucosa, pero debido a que la concentración de azúcares reductores
en el sustrato fermentable obtenido a partir del residuo vegetal de Crisantemo fue de
2g/L, se realizó el control con esta concentración.
39
De acuerdo a pruebas preliminares realizadas para determinar las condiciones
óptimas de las fermentaciones control se decidió llevarlas a cabo durante 16 horas a
30°C, 70 rpm, pH 6,5 – 6,7 y sin suministro de oxígeno.
Se utilizó un inóculo de 12 horas de incubación con una concentración celular de
2.76 g/L, un recuento de 50 x 106 UFC/mL, y una concentración de azúcares de 0.37
g/L
6.3.1.1 Fermentación control con 20 g/L de glucosa
En esta fermentación no se presentó una fase de adaptación, se observó una fase
exponencial desde la hora 0 hasta la hora 12 con una concentración de biomasa de
6.326 g/L, en esta hora del proceso la concentración de glucosa disminuyó hasta
0.311 g/L, y luego empezó la fase estacionaria, esto mostró un crecimiento rápido
de la levadura relacionado con el consumo de sustrato (Figura 11, tabla 1 - anexo
G).
Saccharomyces cerevisiae en condiciones aerobias aumenta la biomasa y produce
poco alcohol, pero en anaerobiosis el crecimiento celular es lento y la producción de
etanol es alta al realizar la conversión de hexosas, principalmente glucosa, fructosa,
manosa y galactosa. Alrededor del 70% de la energía es liberada como calor; el
resto es preservado en dos ATP, con enlaces fosfato terminales de alta energía,
para usarlo en las reacciones de transferencia, tales como la activación de la
glucosa (fosforilación) y de aminoácidos antes de la polimerización (Romano, et al.,
2005; Zaldivar, et al., 2005). Por tal razón, Saccharomyces cerevisiae es el
microorganismo más utilizado para producción de etanol al llevar a cabo un
metabolismo respiratorio o fermentativo de acuerdo con la concentración de oxígeno
(Noor, et al., 2003).
En la fermentación control la concentración de oxígeno fue baja, por la mínima
agitación (70 rpm) y el volumen utilizado, aunque no se proporcionó totalmente las
40
condiciones de anaerobiosis para producción de etanol. Sin embargo por el
metabolismo de la levadura en medios ricos en azúcar en presencia de aire se pasa
espontáneamente al proceso anaeróbico porque el consumo de oxígeno es muy
alto, por lo que se agota rápidamente. Además, la abundante producción de CO2
suele desplazar el aire de la atmósfera, dificultando la disolución del oxígeno
(Carballo 2000; Otterstedt, et al., 2004).
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
TIEMPO (h)
BIO
MA
SA
(g
/L)
- p
H
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
Biomasa (g/L) pH Azúcares reductores (g/L)
Figura 11. Concentración de biomasa, azúcares reductores y pH en función del
tiempo. Fermentación control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L
de glucosa.
Al principio de la fermentación el valor de pH fue de 6.38, al transcurrir el proceso el
pH disminuyó hasta llegar a 5 en la hora 10, lo que tuvo relación con la caída de la
concentración de la fuente de carbono; esto indica que el consumo de la glucosa
acidificó el medio al producirse ácidos como el succínico, acético, fórmico,
propiónico y pirúvico. Desde la hora 12 el pH presentó un leve aumento debido al
consumo del extracto de levadura; ya que se da la liberación de aminoácidos y otros
productos nitrogenados (Figura 11).
Para cuantificar el etanol por cromatografía líquida HPLC se seleccionaron las
muestras de las diferentes horas de fermentación que por destilación simple
indicaron la producción de este alcohol (datos no mostrados).
41
Al determinar el etanol por HPLC, a la hora 10 de fermentación se obtuvo una
concentración de 9.333 g/L y un rendimiento (Y p/s) de 0.45 g/g (Tabla 2). Este
resultado evidenció que la cepa de S. cerevisiae utilizada si produjo etanol bajo las
condiciones de fermentación planteadas. Según un estudio realizado por Yu y
Zhang, 2004, esta levadura con una concentración de 31.6 g/L de glucosa produce
13.7g/L de etanol con un rendimiento (Y p/s) de 0.43 g/g, luego de 18 horas de
fermentación en caldo YGC; por lo tanto, en la fermentación control con 20g/L de
glucosa, el consumo de la fuente de carbono fue consistente con el periodo de
tiempo de producción de etanol (Anexo J1).
Tabla 2. Determinación de etanol por HPLC fermentaciones control
Control con 20g/L Control con 2g/L Hora Rendimiento Y(p/s) (g/g)
Etanol g/L
%v/v Rendimiento Y(p/s) (g/g)
Etanol g/L
%v/v
6 (Fase
exponencial) ND ND ND 0.11 0.229 0.029
10 (Fase
estacionaria) 0.45 9.333 1.20 1.14 2.8 0.36
ND= No se determinó
6.3.1.2 Fermentación control con 2 g/L de glucosa
En esta fermentación Saccharomyces cerevisiae no presentó fase de adaptación, la
fase exponencial fue hasta la hora 6 con una concentración celular de 2.7g/L y de
glucosa 0.35g/L, a partir de la hora 8 empezó la fase estacionaria y la concentración
de la fuente de carbono se mantuvo estable (Figura 12, tabla 2 – anexo G).
El pH disminuyó de 6.3 a 5.75 a la hora 4, mostrando la relación del consumo de
glucosa y la producción de ácidos, mientras en la fase estacionaria el pH tuvo un
aumento leve por la liberación de aminoácidos al consumirse el extracto de levadura
(Figura 12).
42
Al comparar esta fermentación con la de 20g/L de glucosa (Yx/s= 0.37 g/g), se
evidenció un mayor rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Yx/s) de 1.44 g/g
para la fermentación de 2g/L de glucosa. Esto indica que la levadura transforma con
mayor eficiencia la glucosa en mínimas concentraciones; ya que cuando la fuente
de carbono es el factor limitante del crecimiento se obtiene más biomasa y un
equilibrio entre el número de células, el peso seco, el nitrógeno celular, el RNA y el
DNA al producirse a la misma velocidad (Parés y Juárez 1997). Con 20 g/L de
glucosa Saccharomyces cerevisiae presentó en la hora 6 una concentración celular
de 3.07 g/L al consumir 7.53 g/L de glucosa, esto confirmó que en la fermentación
control de 2 g/L existió mayor producción de biomasa con menor consumo de
sustrato al obtenerse la mayor concentración de células a la hora 6 de fermentación
2.729g/L al consumir 1.775g/L de glucosa.
Al analizar la cinética de S. cerevisiae en las fermentaciones control no fue posible
comparar la velocidad de crecimiento (µx); ya que el control de 20g/L no cumple con
la cinética de orden 1, por esto solo se determinó el tiempo de duplicación el cual
fue de 18 min para el control de 20g/L y 57 min en el control de 2g/L, esto evidenció
que la levadura al tener mayor concentración de glucosa tiene un crecimiento más
rápido.
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
TIEMPO (h)
BIO
MA
SA
(g
/L)
-
p
H
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
BIOMASA (g/L) pH AZÚCARES REDUCTORES (g/L)
43
Figura 12. Concentración de biomasa, azúcares reductores y pH en función del
tiempo. Fermentación control Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC con 2 g/L de
glucosa.
Al cuantificar el etanol por cromatografía líquida se obtuvo una concentración de
etanol de 2.805 g/L (Anexo J2) con un rendimiento (Yp/s) de 1.14 g/g en la hora 10
de fermentación (Tabla 2). Este resultado evidenció que con 2g/L de glucosa
Saccharomyces cerevisiae puede producir etanol, esta concentración de azúcar es
mínima para la obtención de alcohol; pues en varios estudios la menor
concentración de glucosa para este fin es de 20g/L, aunque en la investigación
realizada por Zaldivar, et al., 2005, con una concentración de 13.5g/L y 120 g/L de
glucosa se obtuvo un rendimiento de producto a partir de sustrato (Yp/s) de 0.46 g/g
y 0.47 g/g con una concentración de etanol de 6.2 g/L y 5.6 g/L, respectivamente.
El rendimiento (Yp/s) obtenido en esta fermentación control fue mayor al teórico 0.51
g/g, posiblemente, por la presencia de sacarosa en el medio de cultivo, azúcar que
fue detectado en el análisis cromatográfico y no por la técnica de DNS por ser un
azúcar no reductor. S. cerevisiae posee la enzima invertasa para hidrolizar la
sacarosa y producir glucosa y fructosa, azúcares fermentables que no fueron
cuantificados desde la hora 0 de fermentación, esto ocasionó la determinación de
valores no reales de la concentración de azúcares reductores, por esta razón el
rendimiento fue muy alto.
6.3.2 Fermentación discontinua del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae
El sustrato fermentable con una concentración de 2.547 g/L de azúcares reductores
se obtuvo al realizar la fermentación de 12 horas con el consorcio celulítico en el
residuo vegetal de Crisantemo al 10% sin pretratamiento ni suplemento (Figura 13).
44
La evaluación del SF se llevó a cabo en una fermentación con Saccharomyces
cerevisiae por 32 horas, se determinó concentración de biomasa por peso seco, de
azúcares reductores por la técnica de DNS y producción de etanol por cromatografía
líquida HPLC.
Figura 13. Fermentación del sustrato fermentable con células libres de
Saccharomyces cerevisiae
El SF fue sometido a esterilización por 30 minutos a 20 lb de presión, además se le
adicionó ampicilina en una concentración de 300mg/L; esto debido a la presencia
del bacilo esporulado del consorcio celulolitico que podría ser un contaminante en
esta parte del proceso. Lo anterior se determinó al realizar pruebas preliminares que
demostraron la resistencia de este microorganismo a la esterilización en condiciones
normales (15min, 15 lb de presión a 121°C), además, no se evidenció algún efecto
por parte de la ampicilina sobre Saccharomyces cerevisiae, por ser un antibiótico
bactericida que inhibe la síntesis del peptidoglicano.
El inóculo se realizó bajo las mismas condiciones que en la fermentación control, se
propagó en caldo YGC para asegurar una alta concentración de biomasa al iniciar la
fermentación. El inóculo presentó una concentración celular de 2.8 g/L, un recuento
de 40 x 106 UFC/mL, y una concentración de azúcares de 0.38 g/L.
45
Las condiciones durante las 32 horas de fermentación fueron iguales a las del
control, es decir que la concentración de oxígeno fue reducida por el volumen
efectivo de trabajo utilizado y la mínima agitación (70 rpm).
La levadura en el SF tuvo una fase exponencial hasta la hora 12 con una
concentración de biomasa de 2.594 g/L, de azúcares reductores 1.09g/L y un
rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Yx/s) de 1.45 g/g; desde de la hora 14
se observó la fase estacionaria hasta la hora 28 en la cual, la biomasa disminuyó
entrando a la fase de muerte y la concentración del sustrato se mantuvo estable. El
consumo de azúcares reductores fue rápido hasta la hora 14, terminando la
fermentación con una concentración de 0.667 g/L (Figura 14), estos posiblemente
pueden ser azúcares reductores no asimilables por Saccharomyces cerevisiae como
la celobiosa, que es producto de la hidrólisis de la celulosa del residuo vegetal de
Crisantemo.
Al comparar la cinética de Saccharomyces cerevisiae en el SF con el control de 2g/L
de glucosa, se encontró una diferencia en fase exponencial, en el control fue hasta
la hora 6 y en el sustrato fermentable hasta la hora 14, se determinó que la levadura
presenta una fase de adaptación hasta la hora 4, posiblemente porque el inóculo se
propagó en caldo YGC; razón por la cual, la fase logarítmica se prolongó unas horas
más. Por otra parte, no fue posible comparar con el control de 2g/L de glucosa, la
velocidad de crecimiento (µx); ya que la fermentación en el SF no cumple con la
cinética de orden 1, por esto solo se determinó el tiempo de duplicación el cual fue
de 57 min y 46.5 min, respectivamente, esto evidenció que la levadura tiene un
crecimiento más rápido en el sustrato fermentable.
El comportamiento de la biomasa en la fermentación evidenció que el SF puede ser
considerado como un medio que permite el crecimiento de Saccharomyces
cerevisiae al suplir ciertos requerimientos nutricionales como la fuente de carbono,
de nitrógeno, fósforo, azufre y elementos traza. Según la caracterización de
composición nutricional el SF contiene 0.87g/L de nitrógeno total, 0.41 g/L de
fósforo, 34 ppm de azufre y elementos como calcio, zinc, hierro, magnesio y
manganeso en bajas concentraciones (Anexo I); estas fuentes nutricionales
46
promueven el crecimiento de la levadura sin necesidad de adicionar otros
componentes al sustrato fermentable, ya que se obtuvo un tiempo de duplicación
menor, una concentración de biomasa similar y el mismo rendimiento (Y x/s) que en
caldo YGC (medio sintético) de la fermentación control 2 g/L de glucosa. Este SF es
una alternativa como medio de cultivo que proporciona ventajas en cuanto a costos
y composición nutricional al tener además elementos traza que no se encuentran en
el medio convencional (YGC), lo que favorece la producción de biomasa.
El pH fue aumentando en función del tiempo de 6.38 a 6.8 (Figura 14), esto
evidenció que el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae puede darse en un
rango amplio de pH debido a la capacidad de mantener estable el pH intracelular
entre 5.8 y 6.3 (Tuite, 1991). Varios autores reportan que el pH ácido (4.5 – 5) es
una de las condiciones óptimas para la levadura al incrementar la producción de
biomasa y de etanol (Yu y Zhang, 2004; Martín, et al, 2005; Palmarola, et al, 2005).
En este estudio se realizó una prueba preeliminar para determinar si el pH 4.5
favorecía la producción de etanol por parte de la cepa utilizada; se concluyó que el
pH entre 6 y 7 mostró mejores resultados, ya que a pH ácido no hubo producción de
etanol (datos no mostrados).
0.0
1.0
2.0
3.0
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6.0
7.0
8.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
TIEMPO (h)
BIO
MA
SA
(g
/L)
-
pH
0.0
0.5
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1.5
2.0
2.5
3.0
BIOMASA (g/L) pH AZÚCARES REDUCTORES (g/L)
Figura 14. Concentración de biomasa y azúcares reductores en función del tiempo.
Fermentación con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF.
47
Al analizar los datos de cromatografía líquida se obtuvo una concentración promedio
de etanol de 3.5 g/L (Anexo J3) y un rendimiento (Yp/s) de 1.73 g/g, en la hora 10 de
fermentación. En la fase estacionaria la concentración de etanol estuvo estable
hasta la hora 28, en la cual disminuyo posiblemente, porque la levadura lo empezó a
consumir como fuente de carbono (Tabla 3). Esto indica que la producción de etanol
si esta directamente asociada con el metabolismo energético, es decir, que la
velocidad de producción esta relacionada con la demanda de energía de las células;
por esto, el etanol se sintetiza en las rutas de formación de ATP (Doran, 1995).
A la hora 24 del proceso el rendimiento (Yp/s) mostró un resultado de 0.46 g/g, pero
los demás rendimientos fueron mayores al teórico 0.51 g/g, posiblemente, por la
presencia de sacarosa en el sustrato fermentable, azúcar que fue detectado en el
análisis cromatográfico y no por la técnica de DNS por ser un azúcar no reductor.
Pues S. cerevisiae seguramente hidrolizó la sacarosa en glucosa y fructosa durante
el tiempo de fermentación, esto ocasionó la determinación de valores no reales de
la concentración de azúcares reductores, por esta razón el rendimiento fue muy alto.
Tabla 3. Determinación de etanol fermentación en SF
Hora Rendimiento Y(p/s)
(g/g) Etanol g/L %v/v etanol
10 (Fase exponencial)
1.73 3.5 0.45
18 (Fase estacionaria)
0.85 3.536 0.45
22 (Fase estacionaria)
0.613 3.750 0.48
24 (Fase estacionaria)
0.46 3.627 0.47
28 (Fase estacionaria)
0.21 2.212 0.28
Al comparar estos resultados con el control de 2g/L de glucosa se corroboró que
Saccharomyces cerevisiae si puede producir etanol con esta mínima concentración
de glucosa. Aunque en el SF la concentración de etanol fue mayor que el control,
esto confirmó que el SF si es un medio nutritivo, natural y económico que
48
proporciona los requerimientos para el crecimiento de la levadura y la producción de
etanol con mejores resultados que el medio de cultivo sintético YGC; ya que,
además de glucosa tiene otros azúcares como fructosa y sacarosa que S. cerevisiae
puede fermentar (Anexo J4).
De acuerdo al análisis de medias se determinó que la mayor concentración de
biomasa se obtuvo en la fermentación control con 20g/L de glucosa, además, los
datos de las repeticiones de cada fermentación no presentaron una amplia
dispersión (Anexo H). Para comparar el crecimiento de S. cerevisiae en el control
con 2 g/L de glucosa y la fermentación del sustrato fermentable se llevo a cabo la
estadística de prueba con la distribución t student, concluyendo que no existe
suficiente evidencia estadística para rechazar la hipótesis nula (Ho). Por lo tanto, se
afirma que no existe evidencia estadísticamente significativa en la concentración
celular promedio de S. cerevisiae tanto en el control como en el sustrato
fermentable evaluado (p > 0.05) (Anexo K).
49
CONCLUSIONES
• Los tratamientos con SDS y Peróxido de hidrógeno mostraron inhibición de la
actividad enzimática del consorcio celulolítico.
• El residuo vegetal de Crisantemo (Dendranthema grandiflora) no requiere
pretratamiento químico por la proporción mínima de lignina 0.51% y
hemicelulosa 2.03%, solo es necesario la reducción de tamaño para obtener
mayor concentración de azúcares reductores liberados por parte del consorcio
celulolítico.
• El residuo vegetal de Crisantemo no requiere de suplemento para liberar mayor
concentración de azúcares reductores por parte del consorcio celulolítico.
• Se seleccionó el residuo vegetal al 10% (p/v), el cual mostró una mínima
diferencia con el 12% (p/v) al comparar la concentración de azúcares reductores
liberados en las fermentaciones de las tres concentraciones evaluadas.
• El proceso para la obtención del sustrato fermentable consta de las siguientes
etapas: reducción de tamaño, fermentación discontinua con el consorcio
celulolítico (35ºC por 12 horas, 130 rpm), centrifugación y filtración.
• Se obtuvo un sustrato fermentable a partir de residuo vegetal 10% (p/v) con un
consorcio celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) con una concentración de
azúcares reductores de 2.547 g/L.
• Al comparar la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae entre las
fermentaciones control de 20g/L y 2g/L de glucosa y el sustrato fermentable el
rendimiento Yx/s fue igual en las dos últimas 1.44 g/g, mejor que el obtenido con
20g/L.
50
• El tiempo de duplicación fue mayor en el sustrato fermentable, demostrando
mayor velocidad de crecimiento comparado con el control de 2 g/L de glucosa.
• La cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizada mostró baja producción de
etanol tanto en caldo YGC como en el SF.
• Los rendimientos Yp/s de la fermentación control 2 g/L y del SF fueron mayores
que el teórico, seguramente por la presencia de sacarosa, azúcar que no se
cuantifico durante el proceso.
• No existió evidencia estadísticamente significativa en la concentración celular
promedio de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa como en el
sustrato fermentable evaluado.
• El sustrato fermentable permitió la obtención de etanol con una concentración de
3.75 g/L usando S. cerevisiae, mayor que la obtenida en el control de 2 g/L de
glucosa 2.8 g/L.
• El sustrato fermentable obtenido demostró ser un medio nutritivo y económico
que favorece la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, al tener
fuente de carbono, nitrógeno, sales y elementos traza.
51
RECOMENDACIONES
• Evaluar otras cepas de microorganismos celulolíticos en el residuo vegetal
de Crisantemo, que puedan presentar mayor actividad enzimática, para
obtener un sustrato fermentable con alta concentración de azúcares
reductores.
• Utilizar técnicas de inmovilización de microorganismos en la obtención del
sustrato fermentable y en la producción de etanol.
• Estudiar la producción de etanol a partir del sustrato fermentable utilizando
otra cepa capaz de fermentar los azúcares reductores presentes.
• Utilizar el sustrato fermentable para producción de biomasa o suplemento
nutricional para suelos o procesos de compostaje.
• Evaluar el crecimiento de otros microorganismos en el sustrato fermentable,
al ser una alternativa como medio de cultivo.
52
BIBLIOGRAFÍA
Asocolflores. 2000. Guía ambiental para la floricultura. Colombia.
Becker, J. y Boles, E. 2003. A modified Saccharomyces cerevisiae strain
that consumes L-arabinose and produces ethanol. Applied and
Environmental Microbiology. Vol 69 Number 7: 4144 – 4150.
Bianco, H y Medina, A. 2001. Reseña histórica del vino en Venezuela, su
control de calidad. Revista de la Facultad de Farmacia. 42: 32-36.
Castagnino, J. 2000. Electroforesis capilar. Revista asociación de química y
farmacia del Uruguay. Revista número 28
Carballo, F. 2000. Microbiología industrial: microorganismos de interés
industrial. Editorial Acribia. España. Pg 20-31
Caylak, B y Vardar, F. 1998. Comparison of Different Production Processes
for Bioethanol. Turk J Chemistry. 22:351 – 359.
Corbitt, R. 2003. Manual de referencia de la ingeniería ambiental. Editorial
Mc Graw Hill. España. Pg 8.2, 8.3, 10.12, 10.13
Daniel, W. 2002. Bioestadística base para el análisis de las ciencias de la
salud. Editorial Limusa wiley. México. Pg 161.
Doran, P. 1995. Principios de ingeniería de los bioprocesos. Editorial Acribia
S.A. Zaragoza, España. Pg 80, 81, 287, 298 – 302.
Duff, S y Murray W. 1996. Bioconversion of forest products industry waste
cellulosics to fuel ethanol. Bioresour Technol. 55: 1 – 33.
Fahrasmane, L. 1997. Determinación de microcomponentes orgánicos por
53
cromatografía gaseosa. Memorias. TIPAL 97. Matanzas. Cuba.
Fernández, E., Arias, J., Vega, L y Moreno, O. 2001. Calidad de varios
rones cubanos. Rev Cubana Aliment Nutr. 15 (2): 96-100.
Fiechter, A., Fuhrmann, G. y Kappeli, C. 1981. Regulation of glucose
metabolism in growing yeast cell. Adv. Microbial Phisiology. 22: 123 – 183.
Folch, J., Garay, A., lledías, F y Cavarrubias, A. 2004. La respesta a
estrés en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Revista latinoamericana de
Microbiología. 46: 24-46.
Gaitan, D y Pérez, L. 2006. Aislamiento y evaluación de microorganismos
celulolíticos a partir de residuos vegetales generados en un cultivo de
Crisantemo (Dendranthema grandiflora). Tesis de pregrado Microbiología
Industrial. Facultad Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana.
Glazer, A y Nikaido, H. 1998. Microbial Biotechnology: Fundamentals of
applied microbiology. W. H. Freeman and company. USA. Pp. 334-347.
Godoy, R. 2002. Práctica fermentación. Facultad de Ingeniería.
Departamento de Ingeniería Química. Universidad Nacional de Colombia.
Bogotá.
Guevara, C y Zambrano, M. 2006. Sugarcane cellulose utilization by defined
microbial consortium. FEMS Microbiol. 255: 52 – 58.
Granger, G. 1955. Operaciones básicas de la ingeniería química. Manuel
Martín & Cia, editores. Pg 410.
Howard, R., Abootsi, E., Cansen van Rensburg, E y Howard, S. 2003.
Lignocellulose biotechnology: issues of biocoversion and enzyme production.
African Journal of Biotechnology. 2(12):602–619.
54
Karimi, K., Emtiazi, G y Taherzadeh, M. 2006. Production of etanol and
mycelial biomasa from rice straw hemicellulose hydrolyzate by Mucor indicus.
Process Biochemistry. 41: 653-658.
Lynd, L., Weimer, P., Zyl, H y Pretorius, I. 2002. Microbial cellulose
utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiology and molecular
biology reviews. 66: 506 – 577.
Man, K., Rosenfield, C y Knipple, D. 2003. Ethanol tolerance in the yeast
Saccharomyces cerevisiae is dependent on cellular oleic acid content.
Applied and environmental microbiology. 69: 1499-1503.
Martini, S., Ricci, M., Bonechi, C., Braconi, D., Millucci, L., Santucci, A. y
Rossi, C. 2005. Metabolic response to exogenous ethanol in yeast: An in
vivo NMR and mathematical modellig approach. Biophysical chemistry. 120:
135-142.
Merck. 2000. Manual de medios de cultivo.
Miller, G. 1959. Use of Dinitrosalisyc Acid Reagent for determination of
reducing sugar. Analytical Chemistry. 31: 426 – 428.
Muñoz, P y Poutou, R. 1999. Cultivo discontinuo con células inmovilizadas
de Saccharomyces cerevisiae autóctonas para producción de etanol. Tesis
de Maestria Microbiología. Facultad de Ciencias. Departamento de
Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana.
Murashima, K., Kosugi, A y Doi, R. 2002. Synergistic effects on crystalline
cellulose from Clostridium cellulovorans. J. Bacteriol. 184: 5088 – 5095.
Nelson, D y Cox, M. 2000. Lehninger Principles of Biochemistry. Third
Edition. Worth Publishers.
55
Noor, A., Hameed, A., Bhatti, K. y Tunio, S. 2003. Bio-ethanol
Fermentation by the Bioconversion of Sugar from Dates by Saccharomyces
cerevisiae Strains ASN-3 and HA-4. Biotechnology. Vol 2 number 1: 8-17.
Otterstedt, K., Larsson, C., Bill, R., Ståhlberg, A., Boles, E., Hohmann, S
y Gustafsson, L. 2004. Switching the mode of metabolism in the yeast
Saccharomyces cerevisiae. European Molecular Biology Organization. Vol 5
number 5: 532 – 537.
Palmarola, B., Chot�borská, P., Galbe, M y Zacchi, G. 2005. Etanol
production from non-starch carbohydrates of wheat bran. Bioresource
Technology. 96: 843-850.
Parés, R y Juárez, A. 1997. Bioquímica de los microorganismos. Editorial
Reverte S.A. Pg 43 – 44.
Perry, R. 1992, Manual del ingeniero químico. Tercera edición. McGraw Hill.
México.
Prasad, S., Anoop Singh. y H.C. Joshi. 2006. Ethanol as an alternative fuel
from agricultural, industrial and urban residues. Conservation and Recycling
Ramirez, P y Coha, J. 2003. Degradación enzimática de celulosa por
actinomicetos termófilos: aislamiento, caracterización y determinación de la
actividad celulolítica. Rev. Perú. Biol. 10(1): 67-77
Romano, D., González, E y Laborde M. 2005. Combustibles alternativos.
Ediciones Cooperativas. Buenos Aires.
Santana, M. 2002. Evaluación de cepas de Azotobacter sp y de bacterias
solubilizadoras de fosfato (BFS), como fertilizante mixto en un cultivo de
Crisantemo (Crisantemum morifolium var. Regal suerte) Tesis de pregrado.
Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogotá.
56
Solomon, E., Berg, L y Martin, D. 2001. Biología. Quinta edición. McGraw
Hill Interamericana. Mexico. Pg 51, 678.
Stase, C. 2003. Plant taxonomic and biosistematics. Quinta edición.
Cambrige University Press. Pg 163.
Sun, R., Tomkinson, J., Wang, S y Zhu, W. 2000. Characterization of
lignins from wheat straw by alkaline peroxide treatment. Polymer Degradation
and Stability. 67: 101 – 109.+
Sun, Y y cheng, J., 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for etanol
production: a review. Biosource technology. 83: 1-11
Tang, Y., Minzhe, A., Liu, K., Nagai, S., Shigematsu, T., Morimura, S y
Kida, K. 2006. Ethanol production from acid hydrolysate of wood biomass
using the flocculating yeast Saccharomyces cerevisiae strain KF-7. Process
biochemistry. Pg 1-6
Treybal, R. 1988. Operaciones de Transferencia de Masa. Mc.Graw-Hill, 2a.
Edición. México. Pg 406-407
Tuite, M. y Oliver, S. 1991. Saccharomyces. Plenum Press New York. Pg
250 -255.
Whitten, K; Davis, R y Peck, M. 1998. Química general. Mc Graw-Hill, 5a
edición. España. Pg 453-454.
Yu, Z., y Zhang H. 2004. Ethanol fermentation of acid-hydrolyced cellulosic
pyrolysate with Saccharomyces cerevisiae. Bioresource technology. 93: 199-
204.
Zaldivar, J., Nielsen, J. y Olsson, L. 2001. Fuel ethanol production from
lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integration.
57
Applied Microbiology Biotechnology. 56: 17 – 34.
Zaldivar, J., Roca, C., Foll, C., Hahn-Hagerdal, B y Olsson, L. 2005.
Ethanolic fermentation of acid pre-treated starch industry effluents by
recombinant Saccharomyces cerevisiae strains. Bioresource technology. 96:
1670-1676.
58
BIBLIOGRAFIA COMO RECURSOS ELECTRONICOS
Universidad Nacional de Colombia Comunicaciones y divulgación cultural
http://unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm [Consulta 28 de Enero de 2006].
59
ANEXO A
SOLUCIONES DE TRABAJO
A.1 Buffer fosfato
• Pesar 3.5g de Na2HPO4 y disolver en 100ml de agua destilada
• Pesar 3.45g de NaH2PO4 y disolver en 100ml de agua destilada.
• Mezclar las dos soluciones
• Ajustar a pH 7±0.2
A.2 Buffer ácido cítrico
• Pesar 1.03g de ácido citrico y disolver en 49 mL de agua destilada.
• Pesar 2.74g de Na2HPO4 y disolver en 51 mL de agua destilada.
• Mezclar las dos soluciones.
• Ajustar a pH 5 ± 0.2
60
ANEXO B
Curva patrón de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS
Tabla 1. Curva patrón de glucosa.
Curva utilizada para conocer la concentración de azúcares reductores obtenidos en
el residuo tratado con el consorcio celulolítico
Concentración de glucosa g/L Absorbancia a 540nm
0.5 0.26
0.7 0.37
1 0.5
1.5 0.73
1.7 0.89
2 1.09
Promedio tres repeticiones
y = 0.5346x - 0.0186R2 = 0.9885
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Concentración (g/L)
AB
S 5
40nm
Figura 1. Curva patrón de glucosa y ecuación lineal.
61
Tabla 2. Curva patrón de glucosa.
Curva utilizada para conocer la concentración de glucosa consumida por
Saccharomyces cerevisiae
CONCENTRACIÓN
g/l
ABS
540nm
0,5 0,271
0,7 0,352
1 0,485
1,5 0,775
1,7 0,827
2 0,995
Promedio tres repeticiones
y = 0.4883x + 0.0153R2 = 0.9962
0.00.20.40.60.81.01.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Concentración (g/L)
AB
S 5
40nm
Figura 2. Curva patrón de glucosa y ecuación lineal.
62
ANEXO C
Pretratamiento del residuo vegetal
TABLA 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% con y
sin tratamiento en SDS
SIN SDS CON SDS
AZÚCARES REDUCTORES Hora
g/L
0 1,329 0,586
22 2,461 1,440
Promedio de tres repeticiones
63
ANEXO E.
Fermentación discontinua del residuo vegetal con el consorcio celulolítico
TABLA 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% suplementado y tratado con SDS
Azúcares reductores Act enzimática 37° pH 7 Act enzimática 50° pH 5 pH Hora
g/L Desv. estándar Coef. variación *UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación
12 1,104 0,03 3,1 35,0 0,01 0,03 43,7 0,05 0,11 6,65 0,03 0,43
14 1,062 0,02 2,2 33,7 0,20 0,59 35,7 0,06 0,16 6,63 0,01 0,09
16 0,961 0,08 8,8 32,8 0,05 0,15 30,1 0,09 0,30 6,64 0,04 0,53
18 1,286 0,00 0,0 52,1 0,11 0,22 37,8 0,80 2,12 6,61 0,01 0,11
20 1,317 0,02 1,5 53,7 0,03 0,06 41,0 0,44 1,08 6,55 0,01 0,15
22 1,059 0,06 5,3 35,2 0,01 0,03 28,2 1,14 4,06 6,45 0,04 0,54
24 1,118 0,04 3,7 39,8 0,05 0,13 41,4 0,57 1,37 6,39 0,01 0,16
Promedio de tres repeticiones
* Una unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol de glucosa por minuto, bajo las condiciones del
ensayo.
64
TABLA 2. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% suplementado y sin tratamiento
Azúcares reductores Act enzimática 37° pH 7 Act enzimática 50° pH 5 pH Hora
g/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desviación estándar Coeficiente de variación Promedio Desv. estándar Coef. variación
0 1,08 0,021 1,9 ND ND ND ND ND ND 5.83 0.01 0.17
6 1,42 0,026 1,9 54,4 1,20 2,21 38,5 1,13 2,93 5,91 0,01 0,17
12 1,63 0,018 1,1 55,7 1,23 2,21 39,9 0,93 2,32 6,02 0,08 1,33
14 1,59 0,000 0,0 56,2 2,36 4,20 46,2 0,00 0,00 6,31 0,30 4,76
16 1,19 0,084 7,0 52,5 2,08 3,96 37,6 0,14 0,37 6,22 0,02 0,28
18 1,03 0,075 7,2 32,7 0,12 0,37 33,2 1,90 5,72 6,26 0,09 1,42
20 1,05 0,035 3,4 35,1 1,34 3,81 35,3 1,20 3,40 6,46 0,29 4,43
22 1,14 0,042 3,7 37.9 0 0 43,2 0,00 0,00 7,12 0,49 6,85
Promedio tres repeticiones
* ND= No se determinó
65
TABLA 3. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% sin suplemento y sin tratamiento
Azúcares reductores Act enzimática 37° pH 7 Act enzimática 50° pH 5 pH Hora
g/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación
0 1,533 0,08 5,0 ND ND ND ND ND ND 6.00 0.01 0.17
6 1,607 0,03 1,6 59,7 1,56 2,62 46,5 0,36 0,77 6,30 0,02 0,32
12 2,084 0,04 2,0 80,8 2,47 3,06 55,7 0,00 0,00 6,54 0,05 0,76
14 2,082 0,06 2,9 97,6 4,36 4,47 72,5 0,21 0,29 6,72 0,03 0,39
16 2,015 0,06 3,0 83,9 3,28 3,91 54,0 0,38 0,70 6,96 0,06 0,90
18 1,932 0,09 4,7 80,2 4,68 5,83 60,2 0,28 0,46 7,27 0,13 1,77
20 1,742 0,05 2,9 65,1 4,26 6,54 48,3 2,36 4,89 7,47 0,03 0,39
22 2,474 0,09 3,6 98,4 4,65 4,73 78,1 0,99 1,27 7,60 0,03 0,33
Promedio tres repeticiones
* ND= No se determinó
66
TABLA 4. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 12% suplementado y sin tratamiento
Azúcares reductores Act enzimática 37° pH 7 Act enzimática 50° pH 5 pH Hora
g/L Desv. estándar Coef. variación *UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación
0 1,47 0,07 4,8 ND ND ND ND ND ND 5.53 0.02 0.36
6 1,53 0,00 0,1 51,56 1,045 2,03 31,92 0,84 2,64 5,70 0,03 0,53
12 2,15 0,10 4,7 79,73 1,732 2,17 36,67 0,00 0,00 5,83 0,04 0,69
14 1,91 0,00 0,0 82,79 0,000 0,00 74,81 0,02 0,03 5,89 0,05 0,85
16 1,89 0,02 1,1 76,24 2,861 3,75 29,13 0,02 0,07 6,50 0,06 0,92
18 1,60 0,04 2,2 58,54 1,423 2,43 32,23 0,32 0,98 6,26 0,09 1,44
20 1,78 0,02 1,3 54,22 2,754 5,08 29,83 1,14 3,80 6,26 0,08 1,28
22 1,60 0,02 1,2 56,04 2,052 3,66 33,52 1,30 3,89 6,29 0,03 0,48
Promedio tres repeticiones
* ND No se determinó
67
TABLA 5. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 12% sin suplemento y sin tratamiento
Azúcares reductores Act enzimática 37° pH 7 Act enzimática 50° pH 5 pH
Hora g/L Desv. estándar Coef. variación *UC/L Desv. estándar Coef. variación UC/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación
0 1,773 0,05 2,8 ND ND ND ND ND ND 6.29 0.01 0.16
6 1,842 0,06 3,0 77 0,44 0,57 50,914 10,00 19,64 6,31 0,05 0,81
12 1,952 0,09 4,6 85,1 0,18 0,21 55,388 15,42 27,85 6,6 0,01 0,15
14 2,249 0,03 1,3 104,9 0,82 0,78 68,093 6,89 10,12 6,82 0,11 1,57
16 2,227 0,06 2,6 92 0,95 1,03 61,256 11,28 18,42 6,96 0,03 0,38
18 2,089 0,06 2,7 94,9 0,43 0,45 68,481 23,90 34,90 7,15 0,15 2,14
20 1,931 0,08 4,0 73,4 0,18 0,25 48,332 23,37 48,35 7,4 0,05 0,62
22 2,317 0,03 1,3 105,2 0,29 0,28 82,884 8,39 10,12 7,49 0,08 1,11
* ND No se determinó
68
TABLA 6. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 5%
(p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) suplementado y sin tratamiento
Promedio tres repeticiones
• ND No se determinó
Residuo vegetal 5% Residuo vegetal 10% Residuo vegetal 12%
Azúcares
reductores
Act
enzimática
37° pH 7
Azúcares
reductores
Act
enzimática
37° pH 7
Azúcares
reductores
Act
enzimática
37° pH 7
HORA
g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L
0 0,378 0 1,08 ND 1,47 ND
6 0,435 11,85 1,42 54,4 1,53 51,56
12 0,352 30,27 1,63 55,7 2,15 79,73
14 ND ND 1,59 56,2 1,91 82,79
16 0,589 17,80 1,19 52,5 1,89 76,24
18 0,849 35,70 1,03 32,7 1,60 58,54
20 0,423 35,00 1,05 35,1 1,78 54,22
22 0,419 25,50 1,14 37,9 1,60 56,04
69
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Estadística de prueba distribución t student
Hipótesis general:
La concentración de azúcares reductores liberados en la fermentación con SV al
10%(p/v) no difiere de la concentración de azúcares reductores liberados en la
fermentación con SV al 12%(p/v).
H0: µ1 - µ2 = 0
Hi: µ1 - µ2 � 0
Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales SV 10%(p/v) SV 12%(p/v) Media 1.934 2.048 Varianza 0.092 0.041 Observaciones 8 8 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 12 Estadístico t -0.881 P(T<=t) dos colas 0.395 Valor crítico de t (dos colas) 2.179
70
ANEXO D
Caracterización físico-química del Residuo Vegetal de Crisantemo
RESULTADOS ANALÍTICOS
Humedad 7,92 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
Fracción Mineral 2,84 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
Pérdidas por Volatilización 89,2 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2 %)
Proteína 5,01 % MICRO-KJELDHAL (MET. INTERNO)
Celulosa 65,3 % SUMATORIA
Hemicelulosa 2,03 % SUMATORIA
Carbohidratos no
estructurales 16,6 % COLORIMÉTRICO (MET. INTERNO)
Lignina 0,51 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
Humedad 7,92 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
Fracción Mineral 2,84 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
Pérdidas por Volatilización 89,2 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2%)
Grasa 0,31 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
Fibra Cruda 46,4 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
Proteína 5,01 % MICRO-KJELDHAL (MET. INTERNO)
Extracto no Nitrogenado 37,5 % SUMATORIA
Fibra detergente neutra 68,3 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
71
Fibra detergente ácida 66,3 % GRAVIMÉTRICO (MET. INTERNO)
NUTRIENTES
Fósforo (P2O5) 0,27 % COLORIMÉTRICO (NTC 234)
Calcio (CaO) 0,69 % ABS. ATÓMICA (MET. INTERNO)
Sílice (SiO2) 0,55 % ABS. ATÓMICA (MET. INTERNO)
72
ANEXO F
Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae
Concentración biomasa g/L ABS 620 nm
3.18 0.858
2.39 0.745
1.59 0.501
1.19 0.416
0.95 0.339
0.8 0.294
0.68 0.257
0.6 0.192
0.53 0.170
Promedio tres repeticiones
y = 0,2625x + 0,0718R2 = 0,9803
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
1
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Biomasa g/L
AB
S 6
20 n
m
Figura 3. Curva peso seco de Saccharomyces cerevisiae. Absorbancia en función
de la concentración de biomasa
73
ANEXO G.
Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae
Fermentación discontinua control
TABLA 1. Fermentación control con Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC 20 g/L de glucosa
AZÚCARES REDUCTORES BIOMASA pH
HORA g/L Desv. estándar Coef. variación g/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación
0 18,850 0,09 0,48 0,201 0,01 7,32 6,38 0,19 2,95
2 17,559 0,09 0,51 0,460 0,06 11,95 6,03 0,14 2,36
4 15,727 0,06 0,38 1,868 0,04 1,94 5,565 0,10 1,88
6 11,323 0,61 5,39 3,068 0,23 7,40 5,24 0,07 1,28
8 2,411 0,04 1,66 5,541 0,05 0,97 5,12 0,04 0,71
10 2,487 0,05 2,01 6,205 0,08 1,20 4,99 0,01 0,25
12 0,311 0,03 10,51 6,326 0,26 4,15 5,045 0,07 1,47
14 0,269 0,04 15,92 6,207 0,13 2,00 5,095 0,09 1,81
16 0,258 0,02 8,22 6,277 0,01 0,09 5,125 0,02 0,41
Promedio tres repeticiones
74
TABLA 2. Fermentación control con Saccharomyces cerevisiae en caldo YGC 2 g/L de glucosa
AZÚCARES REDUCTORES BIOMASA pH
HORA g/L Desv. estándar Coef. variación g/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación
0 2,124 0,18 8,56 0,174 0,01 7,28 6,26 0,17 2,71
2 1,667 0,33 19,57 0,409 0,09 23,06 6,12 0,10 1,70
4 1,141 0,42 36,76 1,405 0,24 17,15 5,75 0,03 0,59
6 0,349 0,11 30,31 2,729 0,32 11,54 5,75 0,23 4,00
8 0,184 0,01 7,55 2,445 0,07 2,73 5,89 0,19 3,17
10 0,172 0,02 13,37 2,412 0,10 4,19 5,98 0,18 3,09
12 0,15 0,03 17,29 2,434 0,12 5,08 6,02 0,26 4,24
14 0,148 0,03 17,63 2,443 0,25 10,13 6,13 0,20 3,26
16 0,124 0,00 0,00 2,404 0,01 0,56 6,08 0,22 3,61
Promedio tres repeticiones
75
ANEXO H.
Fermentación discontinua del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae
TABLA 1. Fermentación con Saccharomyces cerevisiae en caldo SF
AZÚCARES REDUCTORES BIOMASA pH
HORA g/L Desv. estándar Coef. variación g/L Desv. estándar Coef. variación Promedio Desv. estándar Coef. variación
0 2,738 0,06 2,25 0,194 0,010 4,91 6,38 0,04 0,65
2 2,650 0,01 0,38 0,185 0,012 6,49 6,38 0,01 0,16
4 2,590 0,02 0,77 0,210 0,016 7,62 6,37 0,02 0,31
6 1,605 0,03 1,87 1,340 0,014 1,01 6,36 0,04 0,64
10 1,224 0,02 1,63 1,986 0,020 1,02 6,29 0,03 0,51
12 1,091 0,04 3,72 2,594 0,014 0,52 6,37 0,04 0,57
14 0,888 0,02 2,21 2,545 0,006 0,24 6,43 0,03 0,39
18 0,871 0,03 2,99 2,531 0,004 0,14 6,53 0,07 1,13
20 0,861 0,08 8,87 2,526 0,008 0,31 6,57 0,06 0,95
22 0,816 0,02 3,03 2,529 0,002 0,09 6,59 0,06 0,92
24 0,797 0,001 0,13 2,487 0,006 0,25 6,60 0,09 1,39
26 0,725 0,01 1,70 2,449 0,004 0,16 6,69 0,11 1,70
28 0,686 0,001 0,17 2,400 0,008 0,33 6,73 0,10 1,43
30 0,674 0,01 1,69 2,367 0,015 0,63 6,76 0,09 1,29
32 0,667 0,01 1,80 2,228 0,006 0,27 6,80 0,12 1,71
Promedio de tres repeticiones
76
ANEXO I.
Caracterización de composición nutricional del sustrato fermentable (SF)
PARÁMETRO RESULTADO UNIDADES MÉTODO ANALÍTICO
Carbono Orgánico Oxidable 4,00 g/L WALKLEY-BLACK (NTC 5167)
Nitrógeno total (NT) 0,87 g/L MICRO-KJELDHAL (NTC 5167)
Fósforo total (P2O5) 0,41 g/L COLORIMÉTRICO (NTC 5167)
Potasio total (K2O) 1,93 g/L ABS. ATÓMICA (NTC 5167)
Calcio total (CaO) 0,07 g/L ABS. ATÓMICA (NTC 5167)
Magnesio total (MgO) 0,05 g/L ABS. ATÓMICA (NTC 5167)
Azufre total 34 p.p.m. TURBIDIMÉTRICO (NTC 5167)
Hierro total 2,6 p.p.m. ABS. ATÓMICA (NTC 5167)
Manganeso total 1,4 p.p.m. ABS. ATÓMICA (NTC 5167)
Cobre total 0,21 p.p.m. ABS. ATÓMICA (NTC 5167)
Zinc total 1,6 p.p.m. ABS. ATÓMICA (NTC 5167)
Boro total 7,0 p.p.m. COLORIMÉTRICO (NTC 5167)
Sodio total 225 p.p.m. EMISIÓN LLAMA (NTC 5167)
77
ANEXO J
Cromatografía líquida HPLC
J1. Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L de
glucosa hora 10 (Repetición 1)
78
Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC con 20 g/L de glucosa
hora 10 (Repetición 2)
79
J2. Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC con 2 g/L de
glucosa hora 6
80
Fermentación control con S. cerevisiae en caldo YGC con 2g/L de glucosa
hora 10
81
J3. Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 10 (Repetición 1)
82
Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 10 (Repetición 2)
83
Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 10 (Repetición 3)
84
Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 18
85
Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 22
86
Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 24 (repetición 1)
87
Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 24 (repetición 2)
88
Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 24 (repetición 3)
89
Fermentación con S. cerevisiae en SF hora 28
90
J4. Sustrato fermentable
91
ANEXO K
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Tabla 1. Estadística de prueba distribución t student
SF CONTROL 2 g/L Prueba t para dos muestras suponiendo
varianzas desiguales Biomasa g/L Biomasa g/L
Media 2.167394383 1.872671958
Varianza 0.467267849 0.940370635
Observaciones 13 9
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 13
Estadístico t 0.786473886
P(T<=t) dos colas 0.445690435
Valor crítico de t (dos colas) 2.160368652
Hipótesis general:
La concentración celular de Saccharomyces cerevisiae en el caldo sustrato
fermentable no difiere de la concentración celular en el caldo YGC con 2 g/L de
glucosa (control).
H0: µ1 - µ2 = 0
Hi: µ1 - µ2 � 0
EVALUACIÓN DE UN SUSTRATO VEGETAL OBTENIDO A PARTIR DE RESIDUOS
VEGETALES DE CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora) CON UN CONSORCIO
CELULOLÍTICO
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz.
Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiología
Pontificia Universidad Javeriana, Cra. 7 No. 40 – 62, Bogotá, Colombia
bquevedo@javeriana.edu.co
RESUMEN En este trabajo se planteó una alternativa de manejo de residuos vegetales de crisantemo (Dendranthema grandiflora), mediante la transformación de este material celulósico en azúcares fermentables, por pretratamiento biológico con un consorcio celulolítico en cultivo discontinuo, y de esta manera obtener un sustrato fermentable (SF) rico en nutrientes y azúcares reductores que permitan el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae y la producción de etanol. Se evaluaron diferentes variables para obtener el mejor sustrato fermentable con el consorcio celulolítico: la concentración del residuo vegetal al 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v), pretratamientos químicos y suplemento con sales, extracto de levadura y peptona. Se determinó que la actividad enzimática fue mejor en la fermentación con el residuo al 10% (p/v) sin tratamiento y sin suplemento al obtenerse un SF con 2.5 g/L de azúcares reductores. El SF obtenido demostró ser un medio nutritivo y económico que favorece la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, pero no favorece la producción de etanol por la mínima concentración de azúcares liberados. Palabras claves: Consorcio celulolítico, crisantemo, etanol, residuos vegetales, Saccharomyces cerevisiae ABSTRACT
This work proposes a management alternative of the vegetable waste of chrysanthemum (Dendranthema grandiflora) that consists in the conversion of this cellulosic substrate to fermentable sugars through the biological pretreatment with a microbial consortium and thus obtains a fermentable substrate (SF) rich in nutrients and reductor sugars that allow the growing of Saccharomyces cerevisiae and the production of ethanol. Different variables were examined to obtain the best fermentable substrate with the microbial consortium: the concentration of the vegetable waste to 5% (w/v), 10% (w/v) and 12% (w/v), chemical pretreatment and supplement with salts, extract of yeast and peptone. It was found a better enzimatic activity with the vegetable waste 10% (w/v) without treatment and without supplement obtaining a fermentable substrate with 2.5 g/L of reductor sugars. The fermentable substrate proved to be a nutritious and economic that favors the production of biomass of Saccharomyces cerevisiae, but one determined that it does not favor the ethanol production by the minimum concentration of sugar presents.
Keywords: celulolytic consortium, chrysanthemum, ethanol, Saccharomyces cerevisiae, vegetable
waste.
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz
INTRODUCCIÓN
Aproximadamente, el 90% de los residuos sólidos generados en floricultura corresponden a
residuos vegetales, los cuales ofrecen tanto una amenaza al ambiente, como una alternativa de uso
biotecnológico según la disposición final de los mismos. Actualmente, la oportunidad consiste en
aprovecharlos en compostaje y reincorporarlos al proceso productivo como fuente de nutrientes
(Asocolflores, 2000).
La actual administración colombiana ha iniciado algunas acciones tendientes a identificar y
promover alternativas de producción de biocombustibles (como el etanol), de forrajes y alimento
para animales a partir de distintas fuentes, pues la actividad del sector agropecuario nacional es
generadora, actual o potencial de: jugo de caña de azúcar, paja de cereales, maíz, papa,
remolacha, melaza, yuca, y residuos vegetales como los que provienen de los cultivos de flores,
producto del manejo y ciclo vital de las plantas que actualmente son aprovechados en compostaje
y reincorporados al proceso productivo como fuente de nutrientes y acondicionador de suelos,
además pueden servir como fuente de carbono de los microorganismos en el proceso de
fermentación de los azúcares que los componen. Esto promete doble beneficio para el ambiente:
primero una alternativa de manejo de residuos vegetales y subproductos agroindustriales que
actualmente son utilizados en compostaje o incinerados (generando gases tóxicos), y sus tres
componentes: celulosa, hemicelulosa y lignina. Segundo, la posible utilización en la obtención de
etanol u otros combustibles.
Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este trabajo fue la obtención de un sustrato
fermentable a partir de la conversión del residuo vegetal de Crisantemo (Dendranthema
grandiflora), por pretratamiento biológico con microorganismos celulolíticos y su evaluación con
células libres de Saccharomyces cerevisiae, como una alternativa para la producción de etanol,
para lograr obtener un sustrato rico en azúcares fermentables u otros nutrientes que permitan el
crecimiento en cultivo discontinuo, contribuyendo con el desarrollo biotecnológico a nivel
industrial.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos
Se utilizó un consorcio microbiano celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp) de origen vegetal
y suelo, para el pretratamiento del residuo vegetal (Gaitán, et al., 2006). Como microorganismo
control para la evaluación del sustrato fermentable se utilizó la levadura Saccharomyces
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cerevisiae (Muñoz y Poutou, 1999), microorganismos tomados del banco de cepas del
Laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Universidad Javeriana.
Obtención del sustrato fermentable
Residuo Vegetal
Se utilizaron residuos de crisantemo (Dendranthema grandiflora) provenientes de un cultivo
localizado al norte del municipio de Tocancipá. Estos fueron sometidos a una caracterización
físico-química en un laboratorio certificado por el ICA (Instituto colombiano Agropecuario).
Pretratamiento del residuo vegetal
Lavado con SDS ( Sodio Dodecil Sulfato)
Se redujo de tamaño el residuo vegetal realizando molienda, se lavaron con SDS (Sodio Dodecil
Sulfato) al 1% (p/v) para posteriormente ser sometidos a ebullición por un periodo de una hora en
SDS al 1% (p/v) y se realizaron lavados con agua destilada. Luego fueron secados a 55°C y por
último, se sometió a un proceso de esterilización (Guevara y Zambrano, 2006).
Pretratamiento químico con peróxido de hidrógeno (delignificación oxidativa)
En una solución alcalina de peróxido de hidrógeno al 2% se suspendió el residuo vegetal molido
y pretratado con SDS en una relación 10:1 respectivamente, esta mezcla fue llevada a un baño
termostatado durante 12 horas a 50°C. Luego se filtró y lavó con agua destilada. Por último se
sometió a un proceso de secado en horno de convección a 90°C por 12 horas (Sun, et al., 2000).
Adicionalmente, como control, se estudió el residuo molido y sin ningún tratamiento.
Pretratamiento biológico
Fermentación discontinua del residuo vegetal por parte del consorcio celulolítico
Se llevaron a cabo tres fermentaciones con concentraciones de 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v)
de residuo vegetal por triplicado; para evaluar en cual se obtenía la mayor concentración de
azúcares reductores.
Preparación del inóculo
Las cepas de los microorganismos celulolíticos fueron cultivadas en agar celulosa al 1% (p/v),
cuya composición en g/L es: carboximetilcelulosa 10, extracto de levadura 2.5, peptona universal
2.5, sulfato de amonio 0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de potasio 0.1, fosfato
dibásico de potasio 0.1, agar 15, pH final 7.0 +/- 0.2, bajo condiciones controladas de 35°C por
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48 horas. Posteriormente, se realizó un raspado de las colonias para preparar una suspensión en
solución salina 0.85%(p/v), a una concentración de 108 células/ml.
En un erlenmeyer de 500mL con 90mL de caldo celulosa, fueron adicionados los 10ml de
preinóculo y se cultivaron a 130 rpm, 35ºC por 24 horas.
Fermentación discontinua
Se adicionaron 900mL de caldo residuo vegetal suplementado (SVS) estéril a la concentración
correspondiente (5%(p/v), 10%(p/v) ó 12%(p/v)) cuya composición en g/L fue: residuo vegetal a
las diferentes concentraciones, extracto de levadura 2.5, peptona universal 2.5, sulfato de amonio
0.5, cloruro de calcio 0.5, fosfato monobásico de potasio 0.1, fosfato dibásico de potasio 0.1,
(Caldo SVS) a un erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se agregó el 10% de inóculo (100mL), y
se controlaron las condiciones de operación: temperatura 35°C por 24 horas y agitación de 130
rpm. Adicionalmente, se realizaron cultivos con la concentración de residuo vegetal 10% (p/v) y
12% (p/v) sin la adición de los demás componentes (sales, peptona y extracto de levadura) (Caldo
SV). Se realizaron muestreos cada 2 horas hasta completar 24 horas, evaluando la producción de
azúcares reductores mediante la técnica de DNS (Miller, 1959), pH y actividad enzimática
(Guevara y Zambrano, 2006; Sun y Cheng, 2002).
Al finalizar el proceso de fermentación se obtuvo el extracto crudo o sustrato fermentable (SF),
mediante un proceso de centrifugación y filtración, con el fin de eliminar la población celular.
Determinación de actividad celulolítica cuantitativa
Esta técnica se realizó evaluando dos condiciones de pH (5 y 7) y temperatura diferentes (37 y
50°C) reportadas por literatura. Para la interpretación de los resultados, una unidad celulolítica
(UC) equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol de glucosa por
minuto, bajo las condiciones de ensayo.
Se tomó un volumen de 1mL de sobrenadante correspondiente a cada hora de muestreo y se
adicionó 1mL de solución de carboximetilcelulosa 1% (p/v) disuelta en buffer fosfato 0.1M pH 7
+/- 0.2 y en buffer ácido cítrico 0.1M pH 5. La mezcla final se incubó en baño termostatado a
37°C y 50ºC, respectivamente, durante 1 hora. Finalizado el tiempo de incubación de cada
muestra se frenó la reacción refrigerando a 4°C durante 5 minutos (Guevara y Zambrano, 2006;
Sun y Cheng, 2002; Palmarola, et al., 2005). Posteriormente se centrifugó cada muestra por 10
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minutos a 5000 rpm. A partir del sobrenadante se determinó la concentración de azúcares
reductores por la técnica de DNS (Miller, 1959).
Evaluación del Sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae
A partir de las concentraciones de residuo vegetal evaluadas se seleccionó el sustrato fermentable
que aportó mayor concentración de azúcares reductores para la fermentación con S. cerevisiae.
Como control de la cepa se realizaron fermentaciones en caldo YGC cuya composición es en g/L:
extracto de levadura 5, D-glucosa 20 y cloramfenicol 0.1, pH final 6.6 (Merck, 2000), y se llevó a
cabo la modificación de este medio de cultivo al utilizar 2g/L de glucosa para comparar con el
sustrato fermentable.
Preparación del inóculo
La cepa de S. cerevisiae fue cultivada en agar YGC cuya composición es en g/L: extracto de
levadura 5, D-glucosa 20, cloramfenicol 0.1 y agar-agar 14.9, pH final 6.6 (Merck, 2000), bajo
condiciones controladas de 30ºC por 12 horas. Posteriormente, se realizó un raspado de las
colonias de la levadura para preparar una suspensión en solución salina 0.85%(p/v), con una
absorbancia de 0.8 a 620nm.
En un erlenmeyer de 500mL con 135mL de caldo YGC, fueron adicionados los 15ml de
preinóculo y se cultivaron a 120rpm, 30ºC por 12 horas.
Fermentación discontinua
Se adicionaron 1350mL del respectivo caldo (YGC, YGC modificado y SF) estéril a un
erlenmeyer de 2 litros; posteriormente se agregó el 10% de inóculo, y se controlaron las
condiciones de operación: temperatura 30°C por 16 horas para cultivo con YGC y 32 horas para
el SF con agitación de 70rpm, tomando muestras cada dos horas. A estas muestras se les
determinó la concentración de biomasa por el método de peso seco (Godoy, 2002), de azúcares
reductores mediante la técnica de DNS (Miller, 1959) y de etanol por cromatografía líquida
(HPLC).
Determinación de etanol
El contenido de etanol se analizó por cromatografía líquida de alto desempeño HPLC, en un
cromatógrafo WATERS, con detector de indice de refracción (Waters Corporation, Milford,
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz
MA). La fase móvil fue agua con un flujo de 0.5mL/min, y se empleo una columna Sugar Pak I
con precolumna KC-G (Waters Corporation, Milford, MA). La temperatura de la columna fue
84°C. Para el análisis de los resultados se usó el programa Millenium V 2.15.01. Para la
determinación de los factores de respuesta se utilizaró glucosa grado cromatográfico (Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO), y etanol anhidro grado analítico Merck (Darmastadt, Alemania).
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de los datos obtenidos se utilizó el programa SPSS versión 14 en el
cual se determinaron las medias (nivel de confianza 95%), la desviación estándar, el coeficiente
de variación y la estadística de prueba de la distribución t student para comparar la concentración
de azúcares liberados con el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12%(p/v). Y comparar la
concentración celular de S. cerevisiae tanto en el control de 2 g/L de glucosa y en el SF (Daniel,
2002).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Obtención del sustrato fermentable
Pretratamiento del residuo vegetal
Se evaluaron diferentes pretratamientos para determinar cual permitía obtener mayor
concentración de azúcares reductores, al facilitar la hidrólisis enzimática de la celulosa por parte
del consorcio celulolítico.
Con el residuo vegetal molido tratado con y sin SDS; se realizó una fermentación de 22 horas,
obteniendo como resultado que la mayor cantidad de azúcares reductores liberados se presentó en
el residuo vegetal sin tratamiento con SDS teniendo una concentración de 2.46 g/L comparado
con 1.44g/L del tratado con SDS a la hora 22.
Al realizar los pretratamientos del residuo al 10% (p/v) con y sin peróxido de hidrógeno 2%,
luego de una fermentación de 22 horas se presentaron valores de concentración de azúcares
reductores de 0.555 g/L y 1.502 g/L, respectivamente (Tabla 1).
Estos resultados reflejaron que el tratamiento con SDS y H2O2 causa una inhibición enzimática
en el consorcio celulolítico, esto se debe a que el SDS es un tensoactivo iónico y desnaturalizante
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de proteínas, y al quedar trazas de éste en el residuo impide la degradación de la celulosa por
parte del complejo enzimático (Castagnino, 2000), al igual que el peróxido de hidrógeno, agente
oxidante usado para remover la lignina y la hemicelulosa presentes en materiales
lignocelulósicos. Según la caracterización físico – química del residuo vegetal de Crisantemo, el
porcentaje de lignina es 0.51%, de hemicelulosa 2.03% y celulosa 65.3%, por lo tanto, el
pretratamiento con peróxido no sería necesario por la baja proporción de lignina y hemicelulosa
Se determinó que era suficiente la reducción de tamaño del material para obtener mayor
concentración de azúcares reductores y de actividad enzimática, pues algunos factores que
afectan la hidrólisis de la celulosa son el contenido de lignina y hemicelulosa, la porosidad de la
materia prima (área superficial accesible) y cristalinidad de la celulosa, la cual se reduce con la
molienda.
Tabla 1. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal al 10% sin suplemento
tratado con SDS y peróxido de hidrógeno. (Temperatura 50°C por 12 horas).
ND = No se determino Fuente: Autores a Una unidad celulolítica equivale a la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar una micromol
de glucosa por minuto, bajo las condiciones de ensayo.
Fermentación discontinua del residuo vegetal con el consorcio celulolítico
Se evaluaron diferentes variables: concentración 5% (p/v), 10% (p/v) y 12% (p/v) de residuo
vegetal fresco y suplemento con: sales, extracto de levadura y peptona (SVS), que podrían tener
algún efecto sobre la degradación de este polímero y por ende, en la concentración de azúcares
reductores liberados en el extracto crudo al finalizar la fermentación con el consorcio celulolítico
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.), los resultados se muestran en la tabla 2.
CALDO SV 10% (p/v)
CON SDS
CALDO SV 10% (p/v)
CON H2O2 Y SIN SDS
CALDO SV 10% (p/v)SIN
H 2O2 Y SIN SDS
(control)
CALDO SV 10% (p/v)
CON H 2O2 Y CON SDS
AZÚCAR
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37ºC
AZÚCAR
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37ºC
AZÚCAR
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37ºC
AZÚCAR
REDUC.
ACT. ENZ
pH 7 37ºC
HO
RA
g/L aUC/L g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L
0 0,595 0,0 0,471 0,0 1,350 0,0 0,835 0
12 0,926 23,1 0,484 15,0 1,840 52,1 ND ND
22 0,749 23,9 0,555 17,4 1,502 40,0 0,871 4,07
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TABLA 2. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 5% (p/v), 10% (p/v) y
12% (p/v) suplementado y sin tratamiento
ND= No se determinó Fuente: Autores Las concentraciones del 10% y 12% (p/v) mostraron los valores más altos de azúcares reductores
en la hora 12 de fermentación, evidenciando mejor expresión de la actividad enzimática. Al
evaluar la concentración de residuo al 5% (p/v) se presentaron valores muy bajos, por tal razón,
no se realizaron más experimentos con esta concentración.
Es importante analizar la concentración de sustrato; ya que es uno de los principales factores que
afectan la producción y la velocidad inicial de la hidrólisis enzimática de la celulosa. Un
incremento de la concentración de sustrato normalmente resulta en un aumento de la producción
y de la velocidad de reacción de la hidrólisis. Sin embargo, altas concentraciones de sustrato
pueden causar inhibición enzimática, lo cual disminuye sustancialmente la velocidad de la
hidrólisis (Romano, et al., 2005; Sun y Cheng, 2002).
Se evaluó la concentración de residuo vegetal fresco al 10% (p/v) y 12%(p/v) sin suplemento,
para determinar si la composición del residuo (tabla 3) puede ser favorable para el crecimiento
del consorcio celulolítico. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Este resultado se presentó gracias a la composición del residuo vegetal, el cual posee 5.01% de
proteínas como fuente de nitrógeno, además de minerales, fósforo, azufre, macroelementos y
microelementos que proporcionan un medio nutritivo para el crecimiento del consorcio
celulolítico.
Residuo vegetal 5% Residuo vegetal 10% Residuo vegetal 12%
Azúcares
reductores
Act enzimática
37° pH 7
Azúcares
reductores
Act enzimática
37° pH 7
Azúcares
reductores
Act enzimática
37° pH 7
HORA
g/L UC/L g/L UC/L g/L UC/L
0 0,378 0 1,08 ND 1,47 ND
6 0,435 11,85 1,42 54,4 1,53 51,56
12 0,352 30,27 1,63 55,7 2,15 79,73
14 ND ND 1,59 56,2 1,91 82,79
16 0,589 17,80 1,19 52,5 1,89 76,24
18 0,849 35,70 1,03 32,7 1,60 58,54
20 0,423 35,00 1,05 35,1 1,78 54,22
22 0,419 25,50 1,14 37,9 1,60 56,04
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De acuerdo al análisis de medias y la desviación estándar, los datos no presentaron una amplia
dispersión, por lo tanto, se determinó que la mayor concentración de azúcares reductores
liberados estaba entre el residuo vegetal al 10% (p/v) y 12% (p/v) sin tratamiento y sin
suplemento (Tabla 4), se decidió obtener el sustrato fermentable con el residuo de crisantemo al
10% (p/v); ya que no se encontró gran diferencia con el 12%(p/v), mostrando 2.1g/L y 2.2g/L de
azúcares reductores, respectivamente. Por lo tanto, se llevo a cabo la estadística de prueba con la
distribución t student, concluyendo que no existe suficiente evidencia estadística para rechazar la
hipótesis nula (Ho). Por consiguiente, se afirma que no existe evidencia estadísticamente
significativa en la concentración de azúcares reductores liberados tanto en el SV 10%(p/v) como
en el SV 12%(p/v). También se determinó que el tiempo de la fermentación para la obtención del
sustrato fermentable fuera de 12 horas al encontrar que la diferencia con la hora 22 no era
relevante para prolongar 10 horas más el proceso.
Los resultados obtenidos mostraron en general, que la actividad enzimática es mayor en
condiciones de pH 7 y 37ºC, evidenciando que la expresión de las enzimas es mejor a pH neutro y
a una temperatura que no exceda los 40ºC, por ser microorganismos mesófilos (Tabla 4) (Lynd, et
al., 2002).
TABLA 3. Caracterización físico-química del Residuo Vegetal de Crisantemo
CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2 %)
Proteína 5,01 %
Celulosa 65,3 %
Hemicelulosa 2,03 %
Carbohidratos no estructurales 16,6 %
Lignina 0,51 %
FRACCIÓN ORGÁNICA (89.2%)
Grasa 0,31 %
Fibra Cruda 46,4 %
Proteína 5,01 %
NUTRIENTES
Fósforo (P2O5) 0,27 %
Calcio (CaO) 0,69 %
Sílice (SiO2) 0,55 %
FUENTE: LABORATORIO AGRILAB
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TABLA 4. Fermentación con el consorcio celulolítico en residuo vegetal 10% (p/v) y 12% (p/v) suplemento y sin tratamiento
ND= No se determinó Fuente: Autores
Evaluación del sustrato fermentable con Saccharomyces cerevisiae
Fermentación discontinua control caldo YGC 20 g/L de glucosa.
En esta fermentación no se presentó una fase de adaptación, se observó una fase exponencial
desde la hora 0 hasta la hora 12 con una concentración de biomasa de 6.326 g/L, en esta hora del
proceso la concentración de glucosa disminuyó hasta 0.311 g/L, y luego empezó la fase
estacionaria, esto mostró un crecimiento rápido de la levadura relacionado con el consumo de
sustrato (Figura 1).
Al principio de la fermentación el valor de pH fue de 6.38, al transcurrir el proceso el pH
disminuyó hasta llegar a 5 en la hora 10, lo que tuvo relación con la caída de la concentración de
la fuente de carbono; esto indica que el consumo de la glucosa acidificó el medio (Navarro y
Sossa, 2003).
Al determinar el etanol por HPLC, a la hora 10 de fermentación se obtuvo una concentración de
9.333 g/L. Este resultado evidenció que la cepa de S.cerevisiae utilizada si produjo etanol bajo las
condiciones de fermentación planteadas. Ya que, la concentración de oxígeno fue baja, por la
mínima agitación (70 rpm) y el volumen utilizado, aunque no se proporcionaron totalmente las
condiciones de anaerobiosis para producción de etanol. Sin embargo por el metabolismo de la
levadura en medios ricos en azúcar en presencia de aire se pasa espontáneamente al proceso
anaeróbico porque el consumo de oxígeno es muy alto, por lo que se agota rápidamente (Carballo
2000; Otterstedt, et al., 2004).
RESIDUO VEGETAL 10% (p/v) RESIDUO VEGETAL 12% (p/v)
Azúcares reductores
Act enzimática
37° pH 7
Act enzimática
50° pH 5
Azúcares reductores
Act enzimática
37° pH 7
Act enzimática
50° pH 5
Hora
g/L UC/L UC/L g/L UC/L UC/L
0 1,53 ND ND 1,77 ND ND 6 1,61 59,7 46,5 1,84 77 50,91 12 2,1 80,8 55,7 1,95 85,1 55,39 14 2,08 97,6 72,5 2,25 104,9 68,09 16 2,01 83,9 54,0 2,23 92 61,26 18 1,93 80,2 60,2 2,09 94,9 68,48 20 1,74 65,1 48,3 1,93 73,4 48,33 22 2,47 98,4 78,1 2,32 105,2 82,88
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz
Fermentación discontinua control caldo YGC 2 g/L de glucosa.
En esta fermentación Saccharomyces cerevisiae no presentó fase de adaptación, la fase
exponencial fue hasta la hora 6 con una concentración celular de 2.7g/L y de glucosa 0.35g/L, a
partir de la hora 8 empezó la fase estacionaria y la concentración de la fuente de carbono se
mantuvo estable (Figura 2).
El pH disminuyó de 6.3 a 5.75 a la hora 4, mientras en la fase estacionaria el pH tuvo un
aumento leve por la liberación de aminoácidos al consumirse el extracto de levadura.
Al cuantificar el etanol por cromatografía líquida (HPLC) se obtuvo una concentración de etanol
de 2.805 g/L en la hora 10 de fermentación. Este resultado evidenció que con 2g/L de glucosa S.
cerevisiae puede producir etanol.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
TIEMPO (h)
BIO
MA
SA
(g/L
) - p
H
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
AZÚ
CA
RE
S R
ED
UC
TOR
ES
(g
/L)
BIOMASA g/L pH AZÚCARES REDUCTORES g/L
Figura 1. Fermentación control en caldo
YGC 20g/L de glucosa.
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0 5 10 15 20
TIEMPO (h)
BIO
MA
SA
(g/L
) - p
H
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
AZÚ
CA
RE
S
RE
DU
CTO
RE
S (g
/L)
BIOMASA g/L pH AZÚCARES REDUCTORES g/L
Figura 2. Fermentación control en caldo
YGC con 2 g/L de glucosa.
Fermentación discontinua del sustrato fermentable (SF) con Saccharomyces cerevisiae
El sustrato fermentable con una concentración de 2.547 g/L de azúcares reductores se obtuvo al
realizar la fermentación de 12 horas con el consorcio celulítico en el residuo vegetal de crisantemo
al 10% (p/v) sin pretratamiento ni suplemento.
La fermentación en el SF se realizó de 32 horas. La levadura presentó una fase de adaptación de 4
horas y la exponencial hasta la hora 12 con una concentración de biomasa de 2.5g/L, 1.1g/L de
azúcares reductores; desde de la hora 14 se observó la fase estacionaria hasta la hora 28 en la cual,
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz
la biomasa disminuyó entrando a la fase de muerte. El consumo de azúcares reductores fue rápido
hasta la hora 14, terminando la fermentación con una concentración de 0.667 g/L (Figura 3), estos
posiblemente pueden ser azúcares reductores no asimilables por S. cerevisiae como la celobiosa,
que es producto de la hidrólisis de la celulosa del residuo vegetal de crisantemo.
Al analizar los datos de cromatografía líquida (HPLC) se obtuvo una concentración de etanol de
3.5 g/L en la hora 10 de fermentación y 3.8 g/L en la hora 22 (Figura 3 y 4).
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
TIEMPO (h)
BIO
MA
SA
g/L
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
AZÚ
CA
RE
S R
ED
UTO
RE
S
ETA
NO
L (g
/L)
BIOMASA g/L ETANOL g/L AZÚCARES REDUCTORES g/L
Figura 3. Fermentación en SF con S. cerevisiae
Por otra parte, se determinó el tiempo de duplicación el cual fue de 57 min para el control de 2 g/L
y 46.5 min para el SF, esto evidenció que la levadura tiene un crecimiento más rápido en el sustrato
fermentable. Según la caracterización de composición nutricional el SF contiene 0.87g/L de
nitrógeno total, 0.41 g/L de fósforo, 34 ppm de azufre y elementos como calcio, zinc, hierro,
magnesio y manganeso en bajas concentraciones, además el análisis cromatográfico mostró la
presencia de sacarosa, glucosa y fructosa (Figura 5); estas fuentes nutricionales promueven el
crecimiento de la levadura sin necesidad de adicionar otros componentes al sustrato fermentable, ya
que se obtuvo un tiempo de duplicación menor, una concentración de biomasa similar que en caldo
YGC (medio sintético) de la fermentación control 2 g/L de glucosa.
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz
Figura 4. Fermentación en SF con S.
cerevisiae hora 10.
Figura 5. Cromatografía liquida SF.
El pH fue aumentando en función del tiempo de 6.38 a 6.8, esto evidenció que el crecimiento de S.
cerevisiae puede darse en un rango amplio de pH debido a la capacidad de mantener estable el pH
intracelular entre 5.8 y 6.3 (Tuite y Oliver, 1991). En este estudio se realizó una prueba preeliminar
para determinar si el pH 4.5 favorecía la producción de etanol por parte de la cepa utilizada; se
concluyó que el pH entre 6 y 7 mostró mejores resultados, ya que a pH ácido no hubo producción
de etanol (datos no mostrados).
Para comparar el crecimiento de S. cerevisiae en el control con 2 g/L de glucosa y la fermentación
del sustrato fermentable se llevo a cabo la estadística de prueba con la distribución t student,
concluyendo que no no existe evidencia estadísticamente significativa en la concentración celular
promedio de S. cerevisiae tanto en el control de 2g/L de glucosa como en el sustrato fermentable
evaluado.
CONCLUSIONES
El residuo vegetal de crisantemo (Dendranthema grandiflora) no requiere pretratamiento químico
ni suplemento para obtener mayor concentración de azúcares reductores liberados por parte del
consorcio celulolítico.
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz
Se obtuvo un sustrato fermentable a partir de residuo vegetal 10% (p/v) con un consorcio
celulolítico (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) con una concentración de azúcares reductores de
2.5g/L.
El sustrato fermentable obtenido demostró ser un medio nutritivo y económico que favorece la
producción de biomasa de S. cerevisiae, al tener fuente de carbono, nitrógeno, sales y elementos
traza; pero esta cepa mostró baja producción de etanol tanto en caldo YGC como en el SF.
Al comparar la producción de biomasa de S. cerevisiae entre las fermentaciones control de 20g/L y
2g/L de glucosa y el sustrato fermentable el rendimiento Yx/s fue igual en las dos últimas 1.44 g/g,
mejor que el obtenido con 20g/L.
El sustrato fermentable permitió la obtención de etanol con una concentración de 3.8 g/L usando S.
cerevisiae, mayor que la obtenida en el control de 2 g/L de glucosa 2.8 g/L.
El Sustrato fermentable permitió la obtención de etanol 3.5 g/L, luego de la fermentación con
Saccharomyces cerevisiae.
BIBLIOGRAFÍA
Asocolflores. 2000. Guía ambiental para la floricultura. Colombia. Castagnino, J. 2000. Electroforesis capilar. Revista asociación de química y farmacia del Uruguay. Revista número 28 Carballo, F. 2000. Microbiología industrial: microorganismos de interés industrial. Editorial Acribia. España. Pg 20-31 Daniel, W. 2002. Bioestadística base para el análisis de las ciencias de la salud. Editorial Limusa wiley. México. Pg 161. Gaitan, D., Pérez, L., Matiz, A y Quevedo, B. 2006. Aislamiento y evaluación de microorganismos celulolíticos a partir de residuos vegetales generados en un cultivo de Crisantemo (Dendranthema grandiflora). Tesis de pregrado Microbiología Industrial. Facultad Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Godoy, R. 2002. Práctica fermentación. Facultad de Ingeniería. Departamento de Ingeniería Química. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá.
J. Buitrago, D. Tenjo, B. Quevedo, A. Matiz
Guevara, C y Zambrano, M. 2006. Sugarcane cellulose utilization by defined microbial consortium. FEMS Microbiol. 255: 52 – 58. Lynd, L., Weimer, P., Zyl, H y Pretorius, I. 2002. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiology and molecular biology reviews. 66: 506 – 577. Merck. 2000. Manual de medios de cultivo. Miller, G. 1959. Use of Dinitrosalisyc Acid Reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31: 426 – 428. Muñoz, P y Poutou, R. 1999. Cultivo discontinuo con células inmovilizadas de Saccharomyces
cerevisiae autóctonas para producción de etanol. Tesis de Maestria Microbiología. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Navarro, M y Sossa, D. 2003. Obtención de etanol a partir de almidón de papa proveniente del sector agrícola. Trabajo de grado. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Noor, A., Hameed, A., Bhatti, K. y Tunio, S. 2003. Bio-ethanol Fermentation by the Bioconversion of Sugar from Dates by Saccharomyces cerevisiae Strains ASN-3 and HA-4. Biotechnology. Vol 2 number 1: 8-17. Otterstedt, K., Larsson, C., Bill, R., Ståhlberg, A., Boles, E., Hohmann, S y Gustafsson, L. 2004. Switching the mode of metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. European Molecular Biology Organization. Vol 5 number 5: 532 – 537. Palmarola, B., Chot�borská, P., Galbe, M y Zacchi, G. 2005. Etanol production from non-starch carbohydrates of wheat bran. Bioresource Technology. 96: 843-850. Sun, R., Tomkinson, J., Wang, S y Zhu, W. 2000. Characterization of lignins from wheat straw by alkaline peroxide treatment. Polymer Degradation and Stability. 67: 101– 109. Sun, Y y cheng, J., 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for etanol production: a review. Biosource technology. 83: 1-11 Tuite, M. y Oliver, S. 1991. Saccharomyces. Plenum Press New York. Pg 250 -255.