Post on 09-Oct-2019
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Institut für Pathologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Morphologische Charakterisierung und molekulare
Pathogenese Perillaketon-induzierter
Lungenveränderungen beim Pferd als Modell für die
interstitielle Pneumonie
These
Zur Erlangung des Grades eines
Philosophical Doctor
- Ph.D. –
im Fachgebiet Pathologie
an der Tierärztlichen Hochschule Hannover
von Stefan Schmidbauer
aus Cham
Hannover 2003
2
Supervisor: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer
Betreuungsgruppe: 1. Univ.-Prof. Dr. R. Pabst
2. Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Erstgutachter: 1. Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer, Institut für
Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
2. Univ.-Prof. Dr. R. Pabst, Institut für Anatomie der
Medizinischen Hochschule Hannover
3. Univ.-Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie,
Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover
Zweitgutachter: Priv.-Doz. Dr. S. Rittinghausen, Abteilung für Toxikologie und
Umwelthygiene, Fraunhoferinstitut für Toxikologie und
Aerosolforschung Hannover
Tag der mündlichen Prüfung:20.11.03
3
Meinen Eltern
als Dank und zur Freude
4
Teile dieser Arbeit wurden bei folgendem wissenschaftlichem Kongress
vorgetragen:
SCHMIDBAUER, S.-M., A. D. GRUBER, M. VENNER und W. DROMMER (2003):
Kompensierte Überexpression der Kollagensynthese nach experimenteller Induktion eines
akuten Alveolarschadens durch Perillaketon (1-(3-furyl) 4-Methylpentaton) beim Pferd.
46. Tagung der Fachgruppe Pathologie in der Deutschen Veterinärmedizinischen
Gesellschaft, Bamberg, 10. Juni 2003
Folgende Teile dieser Arbeit wurden zur Publikation eingereicht:
SCHMIDBAUER, S.-M., M. VENNER, G. VON SAMSON-HIMMELSTJERNA, W.
DROMMER and A.D. GRUBER (2003):
Compensated overexpression of procollagens a1(I) and a1(III) after experimental perilla mint
ketone-induced acute pulmonary damage in horses.
J. Comp. Pathol. (submitted)
5
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG UND ZIELE DER ARBEIT S. 11
2. LITERATURÜBERSICHT S. 13
2.1 Die Normalstruktur der Lunge S. 13
2.1.1 Histologie, UItrastruktur und Funktion S. 13
2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD) S. 25
2.3 Zelltod: Nekrose und Apoptose S. 28
2.3.1 Morphologische und biochemische Kriterien von
Apoptose und Nekrose S. 28
2.3.2 Die Rolle von Apoptose bei diffusem Alveolarschaden S. 29
2.4 Ki-67 als Proliferationsmarker S. 31
2.5 Struktur, Verteilung und Stoffwechsel von Kollagen in der Lunge S. 32
2.5.1 Kollagen Typ I und Typ III S. 33
2.5.2 Regulation des Kollagenstoffwechsels S. 34
2.5.3 Die Bedeutung von Kollagen Typ I und Typ III
bei diffusem Alveolarschaden S. 37
2.6 Transforming Growth Factor-β (TGF-β ) S. 39
2.6.1 Struktur, Regulation und Signalbildung S. 39
2.6.2 Allgemeine Funktion S. 40
2.6.3 Einfluss von TGF-β auf den Kollagenstoffwechsel S. 42
2.6.4 Die Rolle von TGF-β im Entzündungsgeschehen S. 44
2.6.5 Rolle von TGF-β bei akutem Alveolarschaden S. 46
2.6.6 Bedeutung von TGF-β bei Regeneration und Reparation
nach akutem Alveolarschaden S. 48
2.7 Interleukin-1ß (IL-1ß) S. 50
2.7.1 Allgemein S. 50
2.7.2 Regulation der Genexpression und Proteinsynthese
von IL-1ß S. 51
2.7.3 Interleukin-1 bei Wundheilung und entzündlichen
Lungenveränderungen S. 52
2.8 Perillaketon (PK) als lungentoxisches Agens S. 55
6
3 MATERIAL UND METHODEN S. 59
3.1 Untersuchungsmaterial S. 59
3.2 Allgemeine Versuchsplanung S. 61
3.3 Methoden S. 63
3.3.1 Fixierung und Archivierung der Lungenbiopsieproben S. 63
3.3.2 Paraffineinbettung und Schnittherstellung für
licht-mikroskopische und immunhistochemische
Untersuchungen sowie terminal dUTP nick-end labeling
(TUNEL) S. 63
3.3.3 Immunhistochemische Untersuchungen S. 64
3.3.3.1 Bestimmung der Zellproliferationsrate S. 64
3.3.3.2 Bestimmung des Anteils der Makrophagen-
und Granulozytenpopulation an der
Gesamtzellzahl der Lunge S. 64
3.3.4 Bestimmung der Zelluntergangsrate im
terminal dUTP nick-end labeling (TUNEL) -Assay S. 67
3.3.5 Bestimmung des Anteils kollagener und retikulärer Fasern
an den alveolären Septen S. 69
3.3.6 Licht- und transmissionselektronenmikroskopische
Untersuchung S. 70
3.3.7 Molekularbiologische Präparationen S. 71
3.3.7.1 Allgemeine Maßnahmen S. 71
3.3.7.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus tiefgefrorenem
Lungengewebe S. 72
3.3.7.3 Reverse Transkription S. 73
3.3.7.4 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) S. 74
3.3.8 Klinischer Score S. 79
3.4 Statistische Auswertung S. 80
4 ERGEBNISSE S. 81
4.1 Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen S. 81
4.1.1 Biopsieproben vor der Applikation von Perillaketon S. 81
4.1.2. Biopsieproben nach der Applikation von Perillaketon S. 82
4.2 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen S. 99
7
4.2.1 Zellproliferationsrate S. 99
4.2.2 Zelluntergangsrate S. 102
4.2.3 Veränderungen des Anteils von Makrophagen und
Granulozyten an der Gesamtzellzahl S. 105
4.2.4 Gehalt der alveolären Septen an kollagenen und
retikulären Fasern S. 107
4.3 Untersuchungen zur Genexpression S. 109
4.3.1 Kontrolle der mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese S. 110
4.3.2 Ergebnisse der qPCR S. 110
4.3.3 Expressionsrate von Interleukin-1β S. 111
4.3.4 Expressionsrate von TGF-β S. 113
4.3.5 Expressionsrate von Prokollagen a1(I) S. 115
4.3.6 Expressionsrate von Prokollagen a1(III) S. 117
4.4 Vergleich mit den klinischen Befunden S. 119
5 DISKUSSION S. 121
6 ZUSAMMENFASSUNG S. 139
7 SUMMARY S. 141
8 LITERATURVERZEICHNIS S. 143
9 ANHÄNGE S. 205
9.1 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen (Rohdaten) S. 205
9.2 Ergebnisse der Reverse-Transkriptase quantitativen
Polymerase-Kettenreaktion (Rohdaten) S. 213
9.3 Reaktionslösungen und Färbungen S. 228
8
Abkürzungsverzeichnis
A Adenosin
A-aDO2 Alveoloarterielle Sauerstoffdifferenz
AI-Zellen Alveolarepithelzellen vom Typ I
AII-Zellen Alveolarepithelzellen vom Typ II
ADC Active Cell Death
AIP Atypische Interstitielle Pneumonie
ALI Acute Lung Injury
AP-1 Activator Protein-1
ARDS Acute Respiratory Distress Syndrom
ATP Adenosin-5´-triphosphat
BALF Bronchioalveoläre Lavageflüssigkeit
BALT Bronchus-associated Lymphatic Tissue
bFGF basic Fibroblast Growth Factor
BMP Bone Morphogenetic Protein
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
ca. cirka
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
CD Cluster of Differentiation
cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid
COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease
CYP450 Cytrochrom P450
DAB Diaminobenzidin-tetra-Hydrochlorid
DAD Diffuse Alveolar Damage
DC Dendritic Cells
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic Acid
DNase Desoxyribonuclease
dNTP 2´-Desoxyribonucleosid-5´-triphosphate
dUTP 2´-Uracil-5´-triphosphat
EF-1a Elongationfactor-1a
9
EGF Epidermal Growth Factor
ER endoplasmatisches Retikulum
etc. et cetera
GSSG Glutathiondisulfid
HE Hämalaun-Eosin
ICAM Intercellular Adhesion Molecule
ICE Interleukin Converting Enzyme
IFN Interferon
IGF Insulin- like Growth Factor
IL Interleukin
ILD Interstitial Lung Disease
IPF Idiopathic Pulmonary Fibrosis
i.v. intra venam
K Kontrolle
KG Körpergewicht
LPS Lipopolysaccharide
LTGF Latent Transforming Growth Factor
MHC Major Histocombatibility Complex
MIS Mullerian Inhibitory Substance
MOV Multisystemisches Organversagen
mRNA Messenger-Ribonucleic Acid
NADPH Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide-Phosphate
N-PCP III N-terminal Procollagenpeptide Type III
NSIP Idiopathic Nonspecific Interstitial Pneumonia
NTC No Template Control
PAI-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1
PBS Phosphate Buffered Saline
PICP C-terminal Procollagenpeptide Type I
PIIICP C-terminal Procollagenpeptide Type III
PDGF Platelet Derived Growth Factor
PGE Prostaglandin E
PK Perillaketon
Proa1(III) Prokollagen a1(III)
Proa1(I) Prokollagen a1(I)
10
qPCR quantitative Polymerase Chain Reaction
RNA Ribonucleic Acid
RNase Ribonuclease
ROI Reactive Oxygen Intermediates
RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction
s Standardabweichung
SARA Smad Anchor for Receptor Activation
Smad Mother against decapentaplegic Homolog
TdT Terminal desoxynucleotidyl Transferase
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
TGF Transforming Growth Factor
TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinases
TNF Tumor Necrosis Factor
tRNA Transfer-Ribonucleic Acid
TUNEL terminal dUTP nick end labeling
U Uracil
V Variationskoeffizient
x arithmetischer Mittelwert
xg x Erdbeschleunigung
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1 Einleitung und Ziele der Arbeit
Leistungsverluste bei Sportpferden stellen ein in zunehmendem Maße auftretendes Problem
dar, wobei hierfür als eine wesentliche Ursache interstitielle Lungenerkrankungen anzusehen
sind (BUERGELT et al., 1986, 1995; WINDER et al., 1988; DIEKMANN et al., 1990).
Zentral im Krankheitsgeschehen steht als Folge zahlreicher, sehr heterogener Insulte ein
initialer, akuter Alveolarschaden. Im anschließenden subakuten und chronischen Stadium
laufen regenerative und reparative Prozesse ab, wobei unter günstigen Voraussetzungen eine
vollständige Ausheilung möglich ist. Vielfach werden jedoch mehr oder weniger stark
ausgeprägte, irreversible Veränderungen in Form einer Lungenfibrose beobachtet, die mit
Ablagerung vor allem der Kollagentypen I und III im Bereich der alveolären Septen
einhergeht (DIEKMANN et al., 1990; JUBB, 1991; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995;
BRUCE, 1995). Der Grad der dabei auftretenden restriktiven Lungenerkrankungen kann sehr
stark variieren, und insbesondere Sportpferde im Hochleistungsbereich zeigen schon bei
relativ geringer Beeinträchtigung der respiratorischen Funktionen erkennbare
Leistungseinbußen (DIEKMANN et al., 1990).
Über die Pathogenese des akuten Alveolarschadens und der interstitiellen Pneumonie
existieren bereits bei verschiedenen Spezies zahlreiche Untersuchungen. Im Besonderen
fehlen jedoch beim Pferd kontinuierliche Untersuchungen über längere Zeiträume, die alle
Phasen des Krankheitsverlaufs mit einschließen. Ein Modell der interstitiellen Pneumonie
beim Pferd könnte daher einen großen Beitrag zu einem besseren Verständnis der
Pathogenese und zu einer Verbesserung der klinischen Diagnostik leisten. Es sollte daher an
transkutan entnommenen Lungenbiopsieproben geklärt werden, ob eine einmalige intravenöse
Applikation von Perillaketon (1-(3-furyl) 4-Methylpentaton) beim Pferd zur Induktion eines
akuten Alveolarschadens und einer interstitielle Pneumonie geeignet ist. Diese
Veränderungen können potenziellen Modellcharakter für Untersuchungen der Lungenfibrose
besitzen.
Die Ziele der Arbeit waren:
1. Beschreibung der Perillaketon-induzierten Lungenveränderungen über einen Zeitraum
von vier Wochen nach Applikation im Hinblick auf morphologische und strukturelle
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Alterationen sowie auf die Expression Pathogenese-relevanter Gene (IL-1ß, TGF-ß,
Prokollagen a1(I) (COL1A1) und Prokollagen a1(III) (COL3A1)).
2. Ermittlung des Grades einer interstitiellen Fibrose als möglicher Spätschaden.
3. Beurteilung der prognostischen Relevanz der Genexpression von IL-1ß, TGF-ß,
COL1A1 und COL3A1.
4. Bewertung des Verfahrens als Modell für interstitielle Lungenerkrankungen beim
Pferd.
Die Entzündungsmediatoren IL-1ß und TGF-ß sowie die extrazellulären Matrixprotein-
vorläufer Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) besitzen große Bedeutung in der
Pathogenese akuter und chronischer Lungenerkrankungen. Weiterhin sollen in diesem
Zusammenhang Parameter für die Kollagensynthese aussichtsreiche Kandidaten für
prognostische Faktoren quoad restitutionem und quoad vitam darstellen (WAYDHAS et al.,
1993; MEDURI et al., 1998; BAUER et al., 2000; MARSHALL et al., 2000, MIKUNIYA et
al., 2000). Die Bestimmung der Genexpression von Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III)
durch Reverse Transkriptase – quantitative Polymerasekettenreaktion könnte raschere und
exaktere Ergebnisse liefern als die bisher überwiegend auf Proteinebene durchgeführten
Untersuchungen. Zur Bearbeitung dieser Fragestellungen musste ein neues Verfahren etabliert
werden, das die Quantifizierung dieser Parameter einschließlich der Genexpressionsraten
intra vitam erlaubte. Für die Untersuchung der aus den Lungenbiopsieproben gewonnenen
mRNA-Spezies stand mit der quantitativen Polymerasekettenreaktion eine moderne,
hochspezifische und –sensitive Methode zur Verfügung, die auch für die Analyse von
Minimalbiopsieproben geeignet war.
In der vorliegenden Arbeit erfolgten somit erstma lig zusammenhängende und umfassende
Untersuchungen zur Pathogenese der interstitiellen Pneumonie des Pferdes in den
verschiedenen Stadien der Erkrankung. Die innovative Kombination der verschiedenen
Methoden und die Etablierung der Untersuchungsverfahren zur Genexpression von IL-1ß,
TGF-ß, Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) beim Pferd kann über die eigene Arbeit
hinaus bei zukünftigen Fragestellungen eine große Hilfe sein. Parallel zu dieser Arbeit wurden
umfassende Untersuchungen mittels erweiteter klinischer und sekretzytologischer Methoden
sowie bildgebender Verfahren von Frau Dr. Venner durchgeführt, um den Krankheitsverlauf
klinisch systematisch zu erfassen.
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2 Literaturübersicht
2.1 Die Normalstruktur der Lunge
Die Gliederung der Lunge in einzelne Lappen ist tierartlich unterschiedlich und unter den
Haussäugetieren beim Pferd am wenigsten ausgeprägt. Unterschieden werden an jeder Lunge
des Pferdes ein Lobus cranialis und ein Lobus caudalis, wobei dem Lobus caudalis pulmonis
dexter der Lobus accessorius medial angefügt ist. Typisch für das Pferd ist auch die
Aufzweigung des Bronchialbaumes. Der Bronchus cranialis teilt sich in beiden Lungen in
einen cranialen und caudalen Bronchus segmentalis. Der craniale Segmentbronchus entlässt
wiederum vier bis fünf dorsale und ventrale Äste, während sich vom caudalen vier kräftige
ventrale sowie fünf bis sieben kurze dorsale Bronchi segmentales abspalten (NICKEL u.
WILKENS, 1987).
2.1.1 Histologie, Ultrastruktur und Funktion
Allgemein
Im Anschluss an die terminalen Bronchioli, die den letzten Abschnitt des ausschließlich
luftleitenden Systems der Lunge bilden, finden sich die Bronchioli respiratorii und Ductus
alveolares. Die Wände der Alveolargänge bestehen aus dünnen spiralartig angeordneten
Bändern aus kollagenen und elastischen Fasern, zwischen denen die ebenfalls spiralig
angeordneten Mündungen der Alveoli liegen (WHIMSTER, 1970). Diese Anordnung
entspricht den Windungen einer Feder und besitzt daher die Fähigkeit sich in Abhängigkeit
von Inspiration und Exspiration zu dehnen und zusammenzuziehen. Die Alveolarwände
setzen sich aus penta- oder hexagonalen Abschnitten zusammen und bilden ein Polyeder
(ODERR, 1964). Das System der Alveolargänge und der polyedrischen Alveolen ist durch
seine Anordnung in der Lage, sich optimal an die bei der Atmung erfolgenden
Volumenänderungen anzupassen. Die Form der Alveolen, die Oberflächenspannung des
alveolären Flüssigkeitsfilms und in geringerem Maße bindegewebige Komponenten wie
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kollagene und elastische Fasern sind hauptverantwortlich für die Compliance der Lunge
(HABER et al., 1983). Die Dehnungsfähigkeit der Lunge wird durch oberflächenaktive
Substanzen, die das so genannte Surfactant bilden, erhöht. Insgesamt setzt sich die Lunge aus
über 42 verschiedenen Zelltypen zusammen, über die bereits in den siebziger Jahren
umfangreiche Übersichtsartikel verfasst wurden (JEFFEREY u. REID, 1975; BREEZE u.
WEEHLDON, 1977). Allein im Bereich der luftleitenden Wege finden sich zwölf
unterschiedliche Typen von Epithelzellen.
Die interalveolären Septen
Die interalveolären Septen, Septa interalveolaria, bilden den Hauptteil des lufttauschenden
Gewebes der Säugetierlunge. Diese Septen trennen benachbarte Lumina von Alveolen und
sind aus dem Alveolarepithel, einem umfangreichen Kapillarsystem und aus interstitiellem
Bindegewebe aufgebaut, wobei Epithel und Endothel jeweils einen Anteil von ca. 30 % an der
Ausbildung der Blut-Luft-Schranke haben und das interstitielle Bindegewebe etwa 40 %
(WEIBEL u. KNIGHT, 1964). Auf der einen Seite der Alveolarwand sind die Kapillaren eng
mit dem Alveolarepithel verbunden. Hier fusionieren die endo- und epitheliale
Basalmembran. An der gegenüberliegenden Seite sind Epithel und Endothel durch schmale
Bahnen interstitiellen Bindegewebes getrennt (CORRIN, 2000). Neben Endo- und
Epithelzellen finden sich als weiterer wichtiger Zelltyp die Alveolarmakrophagen (RIESNER,
1978). Sehr früh konnte festgestellt werden, dass die Septen keine kontinuierlichen,
lückenlosen Platten darstellen, sondern von Öffnungen unterbrochen sind (MACKLIN, 1936).
Diese so genannten Kohn´schen Poren stellen eine Verbindung zwischen benachbarten
Alveolen her (KOHN, 1893) und sollen dem kolateralen Druckausgleich dienen (PARRA et
al., 1978). Diese Öffnungen können außer beim Pferd (KAUP et al., 1990a) noch bei
zahlreichen anderen Spezies wie Mensch, Ratte (GIL u. WEIBEL, 1969), Maus (RANGA u.
KLEINERMAN, 1980) und Hund (PARRA et al., 1978) beobachtet werden und sind von
intaktem Alveolarepithel gesäumt. Es finden sich bis zu sieben Poren in einer Alveole, deren
Durchmesser zwischen 2 und 13 µm liegt. Zum Zeitpunkt der Geburt sind diese Öffnungen
noch nicht ausgebildet und entwickeln sich erst in den frühen Lebensabschnitten.
15
Das Alveolarepithel
Die Alveolaroberfläche besteht bei Mensch und Tier hauptsächlich aus zwei Zelltypen, den
flachen, im Bereich der Alveolarsepten gelegenen Alveolarepithelzellen vom Typ I (AI-
Zellen) bzw. Pneumozyten Typ I und den größeren, vor allem in den alveolären Nischen
gelegenen granulierten Alveolarepithelzellen vom Typ II (AII-Zellen) bzw. Pneumozyten Typ
II (BASKERVILLE, 1970; WEIBEL, 1973; WAGNER et al., 1973; WEIBEL et al., 1976).
Die Zellen an der Alveolaroberfläche sind über tight junctions miteinander verbunden und
bilden so ein kontinuierliches Epithel (WEIBEL, 1973; SCHNEEBERGER et al., 1976),
wobei die Typ I-Zellen mit ihren Zytoplasmaausläufern krakenartig benachbarte Typ II-
Zellen überlappen. Der ultrastrukturelle Aufbau dieser Zellen ist bei allen bisher untersuchten
Tierarten sehr ähnlich (z.B. Mensch (BARTELS, 1979), Hase (MOORE u. SCHOENBERG,
1964), Rind (RYBICKA et al., 1974), Hamster (KUHN, 1978), Ratte (WEIBEL et al., 1976;
KAUP, 1982), Pferd (KAUP et al., 1990a)).
Alveolarepithelzellen vom Typ I (AI-Zellen)
Alveolarepithelzellen vom Typ I besitzen nur wenige Organellen und sind durch ihr flaches
Zytoplasma gekennzeichnet, das sich ausgehend von der nukleären Zone über eine
verhältnismäßig große Fläche ausdehnt. Sie bedecken beim Menschen im Schnitt eine Fläche
von bis zu 5098 µm2, weisen jedoch nur eine Dicke von etwa 0,2 µm auf. Insgesamt beträgt
ihr Anteil an der Gesamtzellpopulation der Lunge 8 %, sie bedecken jedoch ca. 95 % der
inneren Oberfläche (CRAPO et al., 1982). AI-Zellen sollen auch in der Lage sein
Alveolarwände zu penetrieren, so dass ein und dieselbe Zelle beide Seiten des
Alveolarseptums bedecken kann (WEIBEL, 1973). Ihre Aufgabe besteht in der Ausbildung
einer kontinuierlichen, aber sehr schmalen Auskleidung des weitaus größten Teils der
Alveolaroberfläche und sie sind somit einerseits an der Bildung der Blut-Luft-Schranke
beteiligt, andererseits dienen sie zusammen mit anderen Faktoren der Aufrechterhaltung der
mechanisch-statischen Stabilität der Alveole (RADFORD, 1964). Von großer Bedeutung ist
auch ihre Barrierefunktion zur Vermeidung eines übermäßigen Flüssigkeitsverlustes über die
Lungenoberfläche. Typ I-Zellen sind untereinander und mit Typ II-Zellen über tight-junctions
verbunden (KAUP et al., 1990a). Im Zytoplasma weisen sie zahlreiche Pinozytosevesikel auf,
die der Resorption von Makromolekülen dienen (SCHNEEBERGER, 1976; LAUWERYNS
16
u. BAERT, 1977). Die dünnen Ausläufer der Typ I-Zellen sind sehr empfindlich gegenüber
zahlreichen exogenen schädigenden Einflüssen. Zusammen mit dem Kapillarendothel stellen
sie die vulnerabelste Komponente der Lunge dar (CORRIN, 2000).
Alveolarepithelzellen vom Typ II (AII-Zellen)
Zu den wichtigsten Funktionen der AII-Zellen gehören Synthese, Sekretion und Speicherung
oberflächenaktiver Substanzen, die das so genannte Surfactant bilden, das der Herabsetzung
der Oberflächenspannung an der Grenzfläche zwischen Luft und Alveolarwand dient. AII-
Zellen stellen weiterhin die Stammzellpopulation für Alveolarepithelzellen vom Typ I dar.
Auf einen Alveolarschaden mit Verlust von AI-Zellen folgt eine Regeneration mit
Proliferation von AII-Zellen und anschließender Differenzierung zu Typ I-Zellen
(ADAMSON u. BOWDEN, 1974; MASON et al., 1977ab; SUTINEN et al., 1980). Der
natürliche Turnover von AII-Zellen dauert etwa 25 Tage, während für die Differenzierung in
AI-Zellen nur ca. 48 h nötig sind. Histologisch treten dabei Übergangsformen auf (EVANS et
al., 1975). Weitere wesentliche Funktionen der AII-Zellen sind die Metabolisierung und
Detoxifikation von Xenobiotika (DOMIN et al., 1986) und ihre Beteiligung an der
Modulation der Hypophase des oberflächenaktiven Films (MASON et al., 1977ab) bzw. an
der Resorption von Flüssigkeit und Elektrolyten aus der Hypophase und deren
Weitertransport in das Interstitium. Sie halten in der wässrigen alveolären Hypophase ein
konstantes Elektrolytverhältnis und einen pH von 6,8 aufrecht (VAN GOLDE et al., 1988).
AII-Zellen sezernieren auch Bestandteile der extrazellulären Matrix (z. B. Fibronektin,
Prokollagen Typ IV, Thrombospondin, Laminin, Kollagen Typ V) (MASON et al., 1982;
SAGE et al., 1983; LWEBUNGA-MUKASA et al., 1984; CROUCH et al., 1987; SINGH et
al., 1988), Proteine des klassischen und alternativen Komplementsystems (STRUNK et al.,
1988) und bei der Ratte konnte auch die Produktion von Lysozym nachgewiesen werden
(ADAMSON u. KING, 1985). Die Alveolarepithelzellen vom Typ II besitzen kubische
Gestalt und werden hauptsächlich in den Nischen der Alveolen angetroffen. Sie machen nur
12-15 % der Gesamtzellpopulation der Lunge aus, stellen jedoch ca. 65 % des
Gesamtzellgehaltes der Alveole und bedecken etwa 3 % der Alveolaroberfläche (WEIBEL et
al., 1976; MORGENROTH u. KISSLER, 1980; HAIES et al., 1981). Untersuchungen an
Ratten haben gezeigt, dass die AII-Zellen kurz nach der Geburt diffus über die Alveole
verteilt sind, sich mit zunehmendem Alter der Tiere jedoch immer mehr in Bereich der
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alveolären Nischen konzentrieren: Einen Tag nach der Geburt befinden sich etwa 30 % aller
AII-Zellen in den alveolären Nischen, am dritten Tag 50 %, am 5. Tag 78 % und beim adulten
Tier 81 % (SHAPIRO et al., 1989). Ultrastrukturell weist die Oberfläche der AII-Zellen
zahlreiche 0,1 µm dicke Mikrovilli mit axialen Filamenten und Exkretionsöffnungen auf
(KUHN, 1978; KAUP et al., 1990a). Das organellenreiche Zytoplasma enthält neben einem
gut entwickelten Golgiapparat, rauem endoplasmatischen Retikulum sowie zahlreichen
Multivesikulärkörperchen und Mitochondrien die für diese Zellen typischen rundlichen bis
ovalen osmiophilen Granula. Diese von einer Membran umgebenen, ca. 0,5 bis 1 µm großen
Organellen bestehen aus konzentrisch angeordneten Lamellen, die eine Periodizität von 4,2
bis 9,4 nm aufweisen (KAUP, 1982; DOUGLAS et al., 1975; STRATTON et al., 1980; POST
et al., 1982) und in denen elektronendichte Bereiche mit einer Dicke von 2,6 nm mit
elektronendurchlässigen mit einer Breite von 1,6 nm alternieren. Aufgrund dieser
Innenstruktur werden sie als Lamellärkörperchen oder Lamellar Bodies bezeichnet (WEIBEL
et al., 1976; KAUP, 1982). Es handelt sich bei diesen Einschlüssen um intrazelluläre
Speicher- und Sekretionsorganellen oberflächenaktiver Substanzen (Surfactant) (ASKIN u.
KUHN, 1971; GIL u. REISS, 1973). Der Volumenanteil der Lamellärkörperchen am
Zytoplasma beträgt ca. 18 bis 24 % (MASSARO u. MASSARO, 1975). Die durchschnittliche
Anzahl dieser Einschlüsse pro AII-Zelle ist tierartlich unterschiedlich: Beim Pferd finden sich
bis zu acht (GILLESPIE u. TYLER, 1967ab) und bei der Ratte bis zu 150 Lamellar Bodies
pro Zelle (YOUNG et al., 1981). Auch die Größe der Lamellärkörperchen weist Unterschiede
auf. Die des Menschen besitzen im Vergleich zur Ratte einen geringeren Durchmesser und
zeigen häufig eine multizentrische Anordnung der Lamellen (MORGENROTH u. KISSLER,
1980; DOBBS, 1990).
Alveoläres Interstitium
Das Bindegewebsgerüst der Lunge wird von deren Interstitium gebildet. Es ist am stärksten
ausgeprägt in der Umgebung von Luftwegen und Arteriolen im Zentrum der Läppchen sowie
um die Venen in deren Peripherie. Auf Ebene der Alveolen sind diese beiden wesentlichen
Lokalisationen des pulmonalen Bindegewebes durch feine Verzweigungen verbunden, die
letztlich das alveoläre Interstitium bilden. Dieses ist zusammengesetzt aus kollagenen und
elastischen Fasern, zwischen denen sich Fibroblasten, Myofibroblasten und Histiozyten
befinden. In diesem Bereich zeigen sich auch spärlich Nerven und Nervenendigungen. Die
18
Myofibroblasten liegen in enger räumlicher Beziehung zu den Kapillaren und regulieren die
alveoläre Perfusion (ADLER et al., 1989). Zu den weiteren im Interstitium gelegenen Zellen
gehören eine Form von Histiozyten, die einen Intermediärtyp zwischen Blutmonozyten und
Alveolarmakrophagen darstellt (CROWELL et al., 1992; SEBRING u. LEHNERT, 1992;
JOHANNSON et al., 1997), Mastzellen und lymphoide Elemente. Die Alveolarwände weisen
keine Lymphgefäße auf. Die interstitielle Flüssigkeit wird über die größeren
Bindegewebsansammlungen im Bereich der Luftwege, Arteriolen und Venen drainiert. Die
eigentliche Bindegewebsmatrix der Septen besteht zu 60 % aus kollagenen Fasern, die etwa
20 % des Trockengewichts ausmachen, zu 35 - 40 % aus elastischen Fasern und zu 1 - 2 %
aus Proteoglykanen (HANCE u. CHRYSTAL, 1975). Bei den Kollagenfasern des
Bindegewebes handelt es sich überwiegend um die Typen I und III, der Fasertyp II tritt in den
Knorpelgewebsstrukturen des Tracheobronchialbaumes auf und Typ IV ist ein integraler
Bestandteil der Basalmembran (CLARK et al., 1983; AMENTA et al., 1988). Die elastischen
Fasern finden sich nach SOBIN et al. (1974) vor allem in der Wand der Ductus alveolares und
zwischen den sie umgebenden Blutgefäßen. Gelegentlich bilden sie fächerförmig
aufgesplitterte Ausläufer, die bis in die Alveolarsepten reichen.
Alveoläre Kapillaren
Die kontinuierlichen, alveolären Kapillaren bilden ein stark verflochtenes Netzwerk aus sich
überkreuzenden Gefäßen (GUNTHEROTH et al., 1982). Pro Alveole existieren etwa 1000
solcher Kapillarsegmente (WEIBEL, 1984), wobei jede Blutzelle, die die Lunge durchfließt,
etwa 60 von ihnen passiert. Begleitet werden die Kapillaren von lang ausgezogenen,
kontraktilen Perizyten, die zahlreiche zytoplasmatische Filamente enthalten und in der
endothelialen Basalmembran liegen (WEIBEL, 1974). Die auskleidenden Endothelzellen
besitzen einen abgeflachten Kern und ein schmales, weit ausgezogenes Zytoplasma, das in
seiner Dicke etwa der der AI-Zellen entspricht und eine Lebensdauer von etwa 100 bis 180
Tagen. Die einzelnen Zellen sind durch tight junctions und gap junctions miteinander
verknüpft, überlappen sich häufig unter Ausbildung marginaler Falten und formen einen
geschlossenen Verband. Es finden sich zahlreiche Pinozytosevesikel mit einem Durchmesser
von 60 – 70 nm, die sich sowohl luminal als auch basal als Caveolae öffnen können und als
solche teilweise noch mit einem Diaphragma, bestehend aus einer einfachen Membran,
verschlossen sind. Leukozyten besitzen im Vergleich zu Erythrozyten aufgrund ihrer weniger
19
ausgeprägten Verformbarkeit eine geringere Passagegeschwindigkeit durch die dünnen
Alveolarkapillaren (MACNEE u. SELBY, 1990), wobei diese Verzögerung bei entzündlichen
Prozessen noch verstärkt wird. Im Gegensatz zum großen Kreislauf, in dem die Migration
neutrophiler Granulozyten auf Ebene der Venulen stattfindet, erfolgt sie in der Lunge in den
Alveolarkapillaren (DOWNEY et al., 1993).
Lungenmakrophagen
Da die Lunge permanent einer großen Bandbreite an Umweltpathogenen ausgesetzt ist, stellt
sie eine wichtige Eintrittspforte für Infektionskrankheiten dar. Alveolarmakrophagen spielen
daher im Atmungstrakt eine wesentliche Rolle im Rahmen der körpereigenen Abwehr und
sind in der Lage zahlreiche zytotoxische und immunregulatorische Substanzen, wie ROI
(Reactive Oxygen Intermediates), TNFα oder Interleukine, zu bilden (LOHMANN-
MATTHES et al., 1994). In Abhängigkeit von ihrer Lokalisation lassen sich die
Lungenmakrophagen in verschiedene Untergruppen einteilen: Alveolarmakrophagen,
interstitielle und intravasale Makrophagen (LOHMANN-MATTHES et al., 1994).
Alveolarmakrophagen besitzen aufgrund ihrer Lokalisation in der Interphase des alveolären
Surfactantfilms eine einzigartige Stellung (JOHNSSON et al., 1986). Es handelt sich um die
einzigen Makrophagen im Organismus, die physiologischerweise Kontakt zu atmosphärischer
Luft besitzen. Sie bilden somit die erste Linie der körpereigenen Abwehr gegen inhalierte
Pathogene und spielen eine große Rolle bei der Clearence aufgenommener Staubpartikel.
Hinsichtlich der Fc-Rezeptor-vermittelten Phagozytose zeigen alveoläre und interstitielle
Makrophagen dieselbe Effektivität (CROWELL et al., 1992; LAVNIKOVA et al., 1993). In
Bezug auf andere Funktionen weisen diese beiden Subpopulationen erhebliche Unterschiede
auf. So besitzen Alveolarmakrophagen eine höhere Aktivität bei der Fc-Rezeptor-
unabhängigen Phagozytose, der Bildung von Sauerstoffradikalen und diversen Cytokinen wie
TNFα und IFN-α / β , weisen jedoch eine vergleichsweise geringere Expression von MHCII-
Molekülen, von IL-1 und IL-6 auf (STEINMÜLLER et al., 2000). Alveolarmakrophagen
besitzen unregelmäßige Umrisse und zahlreiche Pseudopodien als prominente,
zytoplasmatische Ausstülpungen. Das Zytoplasma ist reich an dichten Vesikeln mit
lysosomalen Enzymen, ebenso an Phagosomen und multilokulären Phagolysosomen
(CORRIN et al., 1969). Alveolarmakrophagen sind normalerweise in dem die Alveolen
auskleidenden Flüssigkeitsfilm lokalisiert, können jedoch im Zuge einer Immersionsfixierung
20
abgeschwemmt werden. Das die innere Oberfläche der Lunge auskleidende Material ist
chemotaktisch für Alveolarmakrophagen (SCHWARTZ u. CHRISTMAN, 1979), deren
Phagozytoseaktivität zudem durch Surfactant gesteigert wird (LAFORCE et al., 1973).
Gleichzeitig dienen sie unter anderem auch dem Abbau von sezernierten
Surfactantbestandteilen (RAO et al., 1981). Die Herkunft der Alveolarmakrophagen ist
Gegenstand zahlreicher Diskussionen. Es existieren höchstwahrscheinlich zwei wesentliche
Mechanismen für die Aufrechterhaltung dieser Makrophagenpopulation. Hierzu gehört zum
einen die chemotaktische Rekrutierung von Blutmonozyten, die wiederum dem Knochenmark
entstammen und unter steady-state-Bedingungen sowie bei akuten entzündlichen
Veränderungen in die Alveolen emigrieren (BLUSSE VAN OUD ALBAS u. VAN FURTH,
1979; ADAMSON u. BOWDEN, 1980; BOWDEN u. ADAMSON, 1980; BLUSSE VAN
OUD ALBAS et al., 1983; TAKAHASHI et al., 1996). Zum anderen spielt, da sich auch
teilende Makrophagen in den Alveolarlumina nachweisen lassen, die Proliferation
ortsständiger Zellen eine Rolle (GOLDE et al., 1974; CHEN et al., 1988; LOHMANN-
MATTHES et al., 1994). Es existieren Hinweise darauf, dass die Proliferation vor Ort den
größten Anteil an der Aufrechterhaltung der Population der Alveolarmakrophagen besitzt
(SHELLITO et al., 1987). Die Verweildauer der Alveolarmakrophagen in der Lunge beträgt
beim Menschen etwa sieben Tage (BOWDEN u. ADAMSON, 1982). Danach wird der größte
Teil der Zellen über die Luftwege abtransportiert und schließlich abgeschluckt oder
ausgehustet, wobei die Atembewegungen diese Wanderung unterstützen. Auch eine Rückkehr
der Alveolarmakrophagen in das Interstitium ist möglich. Da sie dazu neigen sich in den
Lungenbläschen anzusammeln, die die relativ unbeweglichen bronchiovaskulären Strukuren
im Zentrum der Lungenacini begrenzen, erfolgt der Übertritt vor allem in diesem Bereich
(HARMSEN et al., 1985). Es wird in diesem Zusammenhang angenommen, dass die
interstitielle Translokation von Makrophagen eine Rolle bei der Antigenpräsentation und der
Einleitung immunologischer Reaktionen spielt (HARMSEN et al., 1985). Bei
Lungenerkrankungen zeigt sich sowohl eine erhebliche Zunahme an Alveolarmakrophagen
als auch an weniger differenzierten, im Interstitium befindlichen Makrophagen. Letztere
können gelegentlich bei der Emigration in das Alveolarlumen beobachtet werden
(VIJEYARATNAM u. CORRIN, 1972). Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass bei
entzündlichen Reaktionen eine biphasische Antwort erfolgt, mit einem Influx von Monozyten
in den ersten 24 Stunden und einer späteren Proliferation von Makrophagen im Interstitium
(ADAMSON u. BOWDEN, 1980). Kinetikstudien haben ergeben, dass die meisten
Monozyten, die sich in Alveolarmakrophagen umwandeln, sehr rasch in die Alveolen
21
auswandern und nur ein geringer Prozentsatz sich zuerst im Interstitium differenziert
(ADAMSON u. BOWDEN, 1980, 1982). Die Reifung von Monozyten geht einher mit einer
Zunahme an Zytoplasma, einer Abnahme der Myeloperoxidaseaktivität und der Entwicklung
charakteristischer Lysosomen. Bei erhöhtem Bedarf können in den Alveolen aber auch
unreife Makrophagen mit nur spärlichen Lysosomen beobachtet werden. Bei den
verschiedenen Subpopulationen an Alveolarmakrophagen, die aufgrund unterschiedlicher
Dichte getrennt werden können, handelt es sich vermutlich um einzelne Reifungsstadien
(NAKSTAD et al., 1989).
Tabelle 1: Anteil von Makrophagen an der Gesamtzellzahl der Lunge bei verschiedenen
Spezies
Mensch
(CRAPO et
al., 1982)
Pavian
(CRAPO et
al., 1994)
Ratte
(CRAPO et
al., 1980)
Gesamtzellzahl / Lunge (x109) 230 ± 25 48 ± 5 0,89 ± 0,04
Anteil von Makrophagen an der
Gesamtzellpopulation (%)
9,4 ± 2,2 2,3 ± 0,7 3,0 ± 0,3
Lymphozyten
B- und T-Lymphozyten, wobei letztere in zwei Subpopulationen (Th1- und Th2-Zellen)
unterteilt werden können, sind wesentlich an humoraler und zellulärer Immunabwehr sowie
an Überempfindlichkeitsreaktionen beteiligt (Corrin, 2000). Sie spielen jedoch nur bei einem
Teil der entscheidenden zellulären Interaktionen in Rahmen der primären und sekundären
Immunreaktionen eine Rolle und müssen in enger Nachbarschaft zu antigenpräsentierenden
Zellen lokalisiert sein. Es wird angenommen, dass auch im Körper zirkulierende und in die
Lunge eingewanderte Lymphozyten aus dem Gastrointestinaltrakt nach oraler Immunisierung
eine Rolle bei der pulmonalen Immunabwehr spielen. Lymphozyten finden sich sowohl im
Bereich von Epithel und Lamina propria der luftführenden Wege, im Bronchus-assoziierten
lymphatischen Gewebe (BALT), im Lungenparenchym und den bronchioalveolären Räumen.
Zudem existiert ein pulmonaler intravaskulärer Pool, der sich in seiner Zusammensetzung aus
den verschiedenen lymphozytären Subpopulationen vom peripheren Blut unterscheidet
(Übersicht in PABST u. TSCHERNIG, 1995). Beim Pferd existieren vergleichsweise wenige
22
Untersuchungen über Verteilung und Anteile der einzelnen Subpopulationen in der Lunge.
Beim Menschen überwiegen im trachealen und bronchialen Epithel zytotoxische T-Zellen
(CD8+) gegenüber T-Helferzellen (CD4+) (FOURNIER et al., 1989), B-Lymphozyten
werden hier kaum angetroffen, während in der bronchialen Lamina propria CD4+-Zellen
vorherrschen (HUNNINGHAKE et al., 1981). Stichprobenartige Untersuchungen von
Lungenbiopsieproben (WATSON et al., 1997) weisen auf ähnliche Verhältnisse beim Pferd
hin. Bei Patienten mit Idiopathic Nonspecific Interstitial Pneumonia (NSIP) und
Lungenfibrose finden sich nach YAMADORI et al. (2000) B-Lymphozyten hauptsächlich im
Bereich von Lymphfollikeln, CD4+-Lymphozyten sind in deren Peripherie und in den
verbreiterten Wänden fibrotischer Alveolen lokalisiert, während CD8+-Zellen eher diffus
verteilt sind. Bei diesen klinischen Entitäten zeigt sich auch eine Zunahme von Lymphozyten
in der BALF. Die Rolle von Lymphozyten bei der Entstehung fibrotischer Veränderungen in
Zusammenhang mit verschiedenen Lungenerkrankungen ist unterschiedlich. Aufgrund von
Tierversuchsergebnissen vermuten MAJESKI et al. (2003), dass T-Lymphozyten von
wesentlicher Bedeutung bei der Entwicklung einer intraluminalen Fibrose bei Bronchiolitis
Obliterans Organizing Pneumonia sind, nicht jedoch bei ARDS. Nach DAVIS et al. (2001)
existieren starke Hinweise darauf, dass Lymphozyten eine Rolle bei der Entstehung der
silikoseinduzierten Lungenfibrose spielen, während IRIFUNE et al. (2003) bei chronischer
Hypersensitivity Pneumonitis lediglich eine Beteiligung von TH1-Zellen an der Ausbildung
einer reversiblen Alveolitis beschreibt, eine fibrogene Wirkung jedoch verneint. Beim Pferd
lässt sich in Zusammenhang mit Chronischer Obstruktiver Bronchopneumonie (COB) eine
erhebliche Zunahme an CD4+-Zellen und des CD4/CD8-Verhältnisses im peripheren Blut
nachweisen (WATSON et al., 1997).
Dendritische Zellen (DC)
Beim Pferd existieren nahezu keine Untersuchungen über pulmonale, dendritische Zellen,
während die Verhältnisse bei anderen Tierarten (z. B. Ratte (HOLT et al., 1990), Maus und
Meerschwein (SCHOON-HEGRAD et al., 1991)) und beim Menschen (HOLT et al., 1989)
ausführlich beschrieben sind. Sie besitzen eine nur kurze Lebensdauer, und die biologische
Erneuerung, die innerhalb eines Zeitraums von 7 - 10 Tagen stattfindet, erfolgt, verglichen
mit mehr als 21 Tagen bei epidermalen Langerhans-Zellen, sehr rasch. Sie reagieren auf
bakterielle oder virale Infektionen mit einer raschen Proliferation (HOLT u. STUMBLES,
23
2000). Dendritische Zellen sind primär für Antigenprocessing, Antigenpräsentation und T-
Zell-Aktivierung verantwortlich. Sie bestimmen maßgeblich das Ausmaß, die Kinetik und die
Art einer adaptiven Immunreaktion (Übersicht in PEEBLES u. GRAHAM, 2001), sie sind
jedoch auch über die Ausschüttung von IL-10 an der Ausbildung einer Toleranz gegenüber
inhalierten Antigenen beteiligt (ABCARI et al., 2001). Ganz allgemein werden dendritische
Zellen aufgrund ihres Reifegrades und ihrer Lokalisation eingeteilt (Übersicht in LIPSCOMB
u. MASTEN, 2002):
- DC-Vorläufer in Knochenmark und Blut,
- unreife DC außerhalb lymphatischer Organe, z. B. im Trachealepithel,
- reifende DC nach Aufnahme von Antigenen, wie sie z. B. in afferenten Lymphgefäßen
anzutreffen sind,
- reife, antigenpräsentierende DC in Lymphknoten.
In der humanen Lunge sind zwei verschiedene Arten von dendritischen Zellen beschrieben:
Follicular Dendritic Cells als Bestandteil des Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebes
und S100-positive Interdigitating Dendritic Cells (HANCE, 1993; VANHAARST et al.,
1994). Beide leiten sich von Stammzellen aus dem Knochenmark ab und erreichen die Lunge
auf hämatogenem Wege. Interdigitating Dendritic Cells finden sich in Lymphknoten und sind
weit verbreitet im Bindegewebe der Lunge, im Bereich der Wände von Bronchien, Bronchioli
und Alveolen, interlobulären Septen und der Pleura anzutreffen. Sie besitzen lange
zytoplasmatische Ausläufer, bilden an der Epithelbasis in den luftführenden Wegen ein
Netzwerk und nehmen somit für die Erkennung inhalierter Antigene eine ideale Position ein.
Beide Typen von dendritischen Zellen dienen der Antigenpräsentation gegenüber T-
Lymphozyten. Die Antigenpräsentation erfolgt über deren Oberfläche in Assoziation mit dem
HLA-DR-Histokompatibilitätskomplex. Auch größere antigentragende Partikel, wie Konidien
oder Hyphen von Pilzen, werden phagozytiert. Langerhans-Zellen, die sich zwar überwiegend
in der Epidermis, jedoch auch in geringer Anzahl in der Lunge finden, stellen eine
Subpopulation dendritischer Zellen dar. Ebenso wie dendritische Zellen sind sie in der
unveränderten Lunge in der Regel nicht im Alveolarlumen anzutreffen. Sie zeichnen sich
durch die so genannten Birbeck-Granula aus (BIRBECK et al., 1961), die im Zuge der
Ingestion oberflächengebundener Antigene im Zytoplasma entstehen. Bemerkenswert ist, dass
sich pulmonale Langerhans-Zellen bei Patienten mit fibrotischen Lungenveränderungen nicht
nur im Bronchialepithel, sondern auch im Epithel von Alveolen mit proliferierenden AII-
24
Zellen nachweisen lassen (KAWANAMI et al., 1981). Die Anzahl dendritischer Zellen steigt
aufgrund ihrer Aufgabe an, Antigene im Rahmen von Immunreaktionen gegenüber
Lymphozyten zu präsentieren (MCWILLIAM et al., 1994). DC können in diesem
Zusammenhang aus dem Bereich des Epithels in die regionären Lymphknoten auswandern
(HOLT et al., 1994). Dort sind in dendritischen Zellen MHC II / Antigen–Komplexe noch
über längere Zeit nachweisbar (VU et al., 2002). Die Lebensdauer der dendritischen Zellen
ist, wie bereits erwähnt, begrenzt und ihr Verbleib in den Lymphknoten daher terminiert.
25
2.2 Interstitielle Pneumonie und Diffuse Alveolar Damage (DAD)
Der Begriff Diffuse Alveolar Damage (DAD) ist in der Humanmedizin die Bezeichnung für
ein Syndrom, das durch einen diffusen Schaden des Alveolarepithels und des
Kapillarendothels im distalen Lungenparenchym hervorgerufen wird und gleicht in Ätiologie,
Pathogenese und Verlauf dem Wesen der interstitiellen Pneumonie, wie sie in der
Veterinärmedizin aufgefasst wird. Die klinischen Symptome als Folge dieser Veränderungen
werden unter dem Begriff Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) zusammengefasst
und sind charakterisiert durch respiratorische Insuffizienz, Zyanose und arterielle Hypoxämie,
die letztlich zu einem extrapulmonalen Multisystemischen Organversagen (MOV) und zum
Tod führen können. Klassischerweise wird der Ablauf der interstitiellen Pneumonie in drei
Phasen eingeteilt: initiale Entzündung / exsudative Phase, fibroproliferative Phase und
schließlich Regeneration oder interstitielle und interalveoläre Fibrose (ZAPOL et al., 1979;
KERINS et al., 1995; MEDURI, 1996). Die Ergebnisse jüngerer Untersuchungen weisen
jedoch darauf hin, dass entzündliche und fibrotische Prozesse nicht wie ursprünglich
angenommen nacheinander ablaufen, sondern parallel (ASHA et al., 1997; CHESNUTT et al.,
1997b; MARSHALL et al., 2000). Wie weit interstitielle Pneumonien bei Pferden verbreitet
sind, ist nicht genau geklärt. Zwar wiesen nach Untersuchungen von WINDER und VON
FELLENBERG (1987) an 115 Schlachtpferden bereits 15,6 % der Tiere das
histopathologische Erscheinungsbild einer interstitiellen Pneumonie auf, es wird jedoch noch
zusätzlich mit einer erheblichen Dunkelziffer gerechnet. Nach der Auswertung von 4255
Sektionsfällen in Kentucky zwischen den Jahren 1993 und 1996 waren interstitielle
Pneumonien mit 12,5 % aller Fälle die zweithäufigste Erkrankung der unteren Atemwege
beim Pferd (WILLIAMS, 1997).
Das wesentliche pathohistologische Kriterium einer interstitiellen Pneumonie ist eine diffuse
oder unregelmäßig verteilte Schädigung der alveolären Septen, die vorrangig zu einer initialen
exsudativen Reaktion führt, gefolgt von proliferativen und / oder fibrotischen Prozessen
(KERINS et al., 1995; MEDURI, 1996). Dieser Zustand kann durch verschiedene Insulte
herbeigeführt werden, zu denen neben infektiösen Ursachen (z. B. Influenza equi, Equines
Arteriitis Virus, Pneumocystis carinii), anorganischen Stäuben (z. B. Silikose) Toxinen
(Pyrrolizidinalkaloide, Crofton Weed, Perillaketon), Hypersensitivitätsreaktionen und akuter
Pankreatitis auch Schock und Septikämie gehören, wobei die Ursache beim Pferd nur selten
festgestellt werden kann (MOORE et al., 1981; TURK et al., 1981; BUERGELT et al., 1986;
26
DIEKMANN et al., 1990; BRUCE, 1995; BUERGELT, 1995; PERRON-LEPAGE et al.,
1999; DEL PIERO, 2000). Auch die toxische Wirkung durch die therapeutische Applikation
hochkonzentrierten Sauerstoffs ist eine mögliche Ursache (JUBB, 1991). Das Fehlen einer
bevorzugten Orientierung der Schäden im Bereich kleiner luftführender Wege unterscheidet
die interstitielle Pneumonie von der Bronchopneumonie. Im Allgemeinen treten die
Veränderungen disseminiert auf, oft jedoch akzentuiert in den dorsokaudalen
Lungenabschnitten. In den meisten Fällen sind die auslösenden Insulte für die
Alveolarschäden hämatogenen Ursprungs, was zu einem ausgedehnten oder unregelmäßigen
Verteilungsmuster der Schäden in den Azini führt, wohingegen sie bei aerogener Irritation
zentroazinär lokalisiert sind. Es gibt jedoch auch Ausnahmen von dieser für den Ursprung der
Noxen typischen Verteilung. Ebenso wie in anderen Organen sind die morphologisch
fassbaren Reaktionen auf viele unterschiedliche Agentien sehr ähnlich und nicht spezifisch für
die jeweilige Ätiologie. Unabhängig davon, ob die Ursachen toxischer, metabolischer oder
infektiöser Natur sind, verursachen sie Schäden an Alveolarepithelzellen vom Typ I und am
alveolären Kapillarendothel. Art, Eintrittspforte und Intensität einer Noxe bestimmen jedoch
die zeitliche Reihenfolge, ob als Erstes Epithel- oder Endothelschäden auftreten. Aufgrund
ihrer fehlenden Regenerationsfähigkeit sind Alveolarepithelzellen vom Typ I in der Regel am
stärksten betroffen (JUBB, 1991). In einem frühen Stadium zeigen AI-Zellen Vesikelbildung
im Zytoplasma, gefolgt von Zelluntergang, Ablösung und Freilegung der Basalmembran.
Auch an kapillären Endothelzellen findet sich eine Vesikelbildung, aufgrund ihres besseren
Regenerationsvermögens lassen sich jedoch bloßgelegte endotheliale Basalmembranen nur
sehr selten beobachten (CORRIN u. VIJEYARATNAM, 1975; BACHOFEN u. WEIBEL,
1977). Während dieser akuten Phase können serofibrinöses Exsudat, Stauung und Ödeme der
Alveolarwände beobachtet werden. Fibrin, andere Serumproteine und Zelldebris kondensieren
dabei häufig zu hyalinen Membranen (HILL et al., 1976; KATZENSTEIN et al., 1976).
Zudem finden sich im alveolären Exsudat für gewöhnlich Leukozyten und Erythrozyten sowie
eine gemischtzellige, interstitielle Infiltration. Der Ersatz degenerierter AI-Zellen erfolgt
durch Proliferation und Differenzierung von AII-Zellen, wobei die intakte Basalmembran als
Leitschiene dient. Alveolen, gesäumt von kubischen AII-Zellen, sind ein typisches Zeichen
für subakute bis chronische interstitielle Pneumonien (ADAMSON u. BOWDEN, 1974).
Nach Regression der Entzündung und bei fehlender Fibrose der Alveolarwände ist eine
vollständige Heilung möglich. Die Proliferation der AII-Zellen markiert den Übergang von
der exsudativen in die proliferative Phase. Beginnende fibrotische Veränderungen zu diesem
Zeitpunkt sind mögliche und sehr kritische Prozesse. Bereits 72 h nach einem DAD kann die
27
Proliferation von Fibroblasten eintreten und unreife Fibroblasten können innerhalb von drei
Tagen nach hochgradiger Exsudation in den Alveolarlumina beobachtet werden. Fibrotische
Prozesse können also sowohl interalveolär als auch intraalveolär ablaufen, wobei deren
Umfang vom Ausmaß der Entzündungsreaktion abhängt (MEDURI u. CHINN, 1994). Bei
überlebenden Tieren heilen akute interstitielle Pneumonien mit mehr oder weniger stark
ausgeprägter Narbenbildung ab. Ähnlich der kutanen Wundheilung sind auch in der Lunge
Myofibroblasten mit in reparative Vorgänge einbezogen (PACHE et al., 1998). Chronische,
progressive Entzündungen sind nur selten zu beobachten und stehen in Zusammenhang mit
einer dauerhaften oder wiederholten Exposition gegenüber dem auslösenden Agens. Die
chronische interstitielle Pneumonie ist durch die intraalveoläre Akkumulation mononukleärer
Zellen - in erster Linie Makrophagen - durch Proliferation und Persistenz von AII-Zellen,
interstitielle lymphozytäre Infiltrate und Zubildung von Bindegewebe charakterisiert (JUBB,
1991).
28
2.3 Zelltod: Nekrose und Apoptose
2.3.1 Morphologische und biochemische Kriterien von Apoptose und Nekrose
Beim Zelluntergang ist grundsätzlich zwischen einem passiven und einem aktiv durch die
Zelle selbst herbeigeführten Zelltod zu unterscheiden. Die Nekrose ist ein pathologisch
bedingtes Absterben von Zellen infolge einer Noxe, wie z. B. Anoxie, chemischen oder
physikalischen Einflüssen etc., die zu einer irreparablen Schädigung führen. Der Zelltod
durch Apoptose wird durch zelleigene Proteine und energieabhängige Syntheseprozesse von
der sterbenden Zelle aktiv vollzogen (GREEN et al., 1994), weshalb viele Autoren die
Bezeichnung Active Cell Death (ADC) vorziehen (GREEN et al., 1994; SCHULTE-
HERMANN et al., 1994).
Tabelle 2: Morphologische Kriterien zur Differenzierung von Apoptose und Nekrose
(THOMPSON et al., 1992)
Apoptose Nekrose
Absterben einzelner Zellen Absterben von Zellgruppen Vesikelbildung an der Zellmembran ohne Integritätsverlust
Verlust der Membranintegrität
intakte Lysosomen Auflösung der Lysosomen homogene Kondensation des Chromatins inhomogene Clusterbildung des
Chromatins cell shrinkage und Zerfall in apoptotische Körperchen
Zellschwellung und Lyse
Phagozytose durch Nachbarzellen und Makrophagen
Phagozytose durch Makrophagen
fehlende entzündliche Reaktion entzündliche Reaktion
Tabelle 3: Biochemische Kriterien zur Differenzierung von Apoptose und Nekrose
(THOMPSON et al., 1992)
Apoptose Nekrose
feinregulierter Prozess mit Synthese- und Aktivierungsschritten
Verlust der Regulation der Ionenhomöostase
de novo Transkription von Genen fehlende de novo Transkription von Genen energieabhängiger Prozess energieunabhängiger Prozess abhängig von der Synthese essentieller Makromoleküle
unabhängig von Protein- oder Nukleinsäuresynthese
geordnete Fragmentierung der DNA in Oligonukleosomen (180 – 200 bp)
ungeordnete Verdauung der DNA
29
2.3.2 Die Rolle von Apoptose bei akutem Alveolarschaden
DAD-Patienten weisen erhebliche Schäden des Alveolarepithels auf, die eine wesentliche
Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen (WARE u. MATTHAY, 2000). Diese stellen
eine Reaktion auf eine Vielzahl möglicher Noxen dar, die in diesem Zusammenhang nicht
direkt zur Nekrose führen, sondern den Active Cell Death einleiten (HENGARTNER, 2000).
Aufgrund der Signalwege die hier eine Rolle spielen, kann grob zwischen einer
rezeptorvermittelten, Fas-abhängigen und einer mitochondrienabhängigen Apoptose
unterschieden werden (BUDINGER u. CHANDEL, 2001). Der erste Weg, der vor allem im
Bereich entzündlicher Veränderungen anzutreffen ist, geht mit der verstärkten Sekretion des
proapoptotischen Moleküls FasL einher, das über die Bindung an spezifische Rezeptoren die
Caspasekaskade aktiviert (WALCZAK u. KRAMMER, 2000). Die zweite Möglichkeit führt
über die Zerstörung der Mitochondrienmembran zur Freisetzung von Cytochrom C in das
Cytosol und in der Folge ebenfalls zum Ablauf der Caspasekaskade (VAN DER HEIDEN,
1999; KROEMER u. REED, 2000). Die mitochondrienabhängige Apoptose ist im Gegensatz
zur Fas-abhängigen eine Reaktion auf viele verschiedene Stimuli, zu denen neben oxidativem
Stress, Chemotherapeutika und Strahlung (BUDINGER u. CHANDEL, 2001) möglicherweise
auch mechanische Überbeanspruchung gehört (EDWARDS et al., 1999). In der BAL-
Flüssigkeit von ARDS-Patienten finden sich deutlich erhöhte FasL-Konzentrationen, deren
apoptosefördernde Wirkung auf Zellkulturen durch neutralisierende Antikörper gehemmt
werden kann (MATUTE-BELLO et al., 1999). Auch zeigt sich in vitro nach periodischer
mechanischer Überdehnung von AII-Zellmonolayern ein Anstieg von Apoptosemarkern
(EDWARDS et al., 1999). Eine IL-6 induzierte verstärkte Bcl-2-Expression kann über die
Stabilisierung der Mitochondrienmembran Lungenzellen vor Apoptose als Folge
hyperoxischer Einwirkung schützen (WARD et al., 2000). Eine Bcl-2 Überexpression übt
jedoch keinen Einfluss auf die FasL- oder TNF- mediierte Apoptose aus (WALCZAK u.
KRAMMER, 2000). Zusammengefasst kann man aufgrund einer mittlerweile großen Anzahl
von Studien vermuten, dass bei ARDS sowohl der Fas- als auch der mitochondrienabhängige
Active Cell Death große Bedeutung besitzen (BUDINGER u. CHANDEL, 2001). Historisch
ging man davon aus, dass die Mechanismen des Zelltodes sich bei Zellen mit den
morphologischen Erscheinungen von Apoptose bzw. Nekrose unterscheiden. Nach neueren
Untersuchungen wird jedoch eine etwas andere Betrachtungsweise vorgeschlagen. Die
verschiedenen morphologischen Veränderungen sind möglicherweise nur in einem
unterschiedlichen ATP-Gehalt der betroffenen Zellen zum Zeitpunkt einer
30
Caspaseaktivierung begründet. Da die Caspasekaskade ATP-abhängig ist, kann bei einer
vorliegenden ATP-Depletion oder einer Caspasehemmung ein weniger geordneter
„nekrotischer“ Zelltod ablaufen (EGUCHI et al., 1997; HIRSCH et al., 1997). Bei der eher
geordneten „apoptotischen“ Form des Zelltodes könnte pharmakologisch die Überlebensrate
von Zellen und somit die Prognose bei ARDS verbessert werden, während bei den
minderregulierten Formen derartige Therapieversuche wohl erfolglos bleiben würden
(BUDINGER u. CHANDEL, 2001).
31
2.4 Ki-67 als Proliferationsmarker
Ki-67 ist ein kernständiges Nicht-Histon Protein, das sehr eng mit der Proliferation von
somatischen Zellen verknüpft (ENDL u. GERDES, 2000) und in allen aktiven Phasen des
Zellzyklus nachweisbar ist (GERDES et al., 1984). Die Expression beginnt bei vorher
ruhenden Zellen in der späten G1-Phase, steigt in der S-Phase an und erreicht das Maximum
in der G2- und M-Phase (SASAKI et al., 1987). Nach der Mitose fällt sie sofort ab. Sich
kontinuierlich teilende Zellen zeigen während der gesamten G1-Phase eine positive Reaktion
für Ki-67. Die G0-Phase ist regelmäßig Ki-67-negativ (GERDES et al., 1984). Während des
größten Teils der Interphase in vitro proliferierender Zellen wird Ki-67 hauptsächlich in den
Nukleoli und dort insbesondere in deren Peripherie vorgefunden (TAKAGI et al., 1999). In
der Mitose findet sich Ki-67 bei Mensch und Maus als Netzwerk an der Oberfläche
kondensierter Chromosomen (VERHEIJEN et al., 1989; TAKAGI et al., 1999). Sehr bald
nach dem Austritt aus der Mitose, in der frühen G1-Phase, ist Ki-67 über viele kleine nukleäre
Foci verteilt, die später in der G1-Phase in und um den neu gebildeten Nukleolus und die
Heterochromatinbezirke des Kerns kondensieren (KREITZ et al., 2000). Nach Sequenzierung
der cDNA des Ki-67 Proteins durch SCHLÜTER et al. (1993) ist eine breite Palette an
monoklonalen Antikörpern (z. B. MIB 1-3, MIB 5, IND.64, JG-67-2a) gegen rekombinante
Teile des Ki-67-Antigens erhältlich (KUBBUTAT et al., 1994). Das Gen besitzt eine Länge
von etwa 30.000 bp und enthält 15 Exons. Die Transkription und anschließende Prozessierung
führen zur Entstehung verschiedener Splicingvarianten des Proteins, zu denen auch die beiden
prominenten Formen gehören, die auf Proteinebene nachgewiesen werden. Die Tatsache, dass
Ki-67 ausschließlich während der Mitose exprimiert wird, macht die Markierung dieses
Proteins durch spezifische Antikörper zu einem wichtigen und mittlerweile sehr verbreiteten
Instrument zur Beurteilung der Zellproliferation (SCHOLZEN u. GERDES, 2000). Auch
beim Pferd wurde die Markierung von Ki-67 bereits von verschiedenen Autoren in
Zusammenhang mit zahlreichen Fragestellungen verwendet und die Kreuzreaktivität,
insbesondere von MIB-1, mit equinem Material gesichert (MARTENS et al., 2000; ROELS et
al., 2000; WATSON u. AL-ZI`ABI, 2002). Trotz der zahlreichen Untersuchungen über Ki-67
ist dessen genaue Funktion des Proteins jedoch bislang noch unbekannt.
32
2.5 Struktur, Verteilung und Stoffwechsel von Kollagen in der Lunge
Allgemein
Zur Familie der Kollagene gehören bislang 20 bekannte eng verwandte Mitglieder, die grob in
sieben verschiedene Gruppen eingeteilt werden (HULMES, 1992). Eine achte Gruppe besteht
aus Proteinen, die teilweise typische tripelhelikale Domänen besitzen, jedoch nicht zu den
Kollagenen gezählt werden. Die fibrillären Formen, zu denen auch Kollagen Typ I und III
gehören, stellen die in der Lunge am häufigsten auftretende Gruppe dar (KIRK et al., 1984).
Prinzipiell besitzen alle Kollagene die gleiche Grundstruktur (KÜHN, 1986). Sie setzen sich
aus jeweils drei Polypeptid-α-Ketten zusammen, die entweder identische oder verschiedene
AS-Sequenzen besitzen können (VAN DER REST u. GARRONE, 1991; BIENKOWSKI u.
GOTKIN, 1995). Diese bilden höhermolekulare Vorstufen, die so genannten Prokollagene,
die zusätzlich globuläre N- und C-terminale Extensionspeptide besitzen und aus denen
letztlich reife Kollagenproteine entstehen. In Verbindung mit den 20 Isotypen wurden bislang
33 verschiedene α-Ketten entdeckt. Die Extensionspeptide sollen unter anderem eine
intrazelluläre Fibrillogenese verhindern, da die tripelhelikalen Kollagenmonomere eine starke
Tendenz zum self-assembly besitzen (CROUCH, 1990). Im Rahmen der Fibrillogenese lagern
sich drei proα-Ketten an ihren C-terminalen Bereichen aneinander, um in N-terminaler
Richtung fortschreitend eine rechtsgewundene Tripelhelix mit einem Durchmesser von etwa
1,5 nm zu bilden (KÜHN, 1986). Zur Stabilisierung der helikalen Struktur erfolgt die
posttranslationale Hydroxilierung etwa der Hälfte aller Prolinreste. Nach Sekretion des
Proteins werden die Extensionspeptide der proα-Ketten durch teilweise membranständige
Proteasen abgespalten und durch das endständige und laterale Aneinanderlagern von
Kollagenmonomeren entstehen Fibrillen. Man ging lange Zeit davon aus, dass einmal
gebildetes Kollagen inert sei und keinem weiteren Stoffwechsel unterliege. Tatsächlich hat
sich jedoch gezeigt, dass sich Kollagene ebenso wie andere Proteine durch ständige Auf- und
Abbauvorgänge in einem dynamischen Gleichgewicht befinden. Man vermutet, dass bei
jungen erwachsenen Ratten pro Tag etwa 10 % des gesamten Kollagengehaltes der Lunge
umgesetzt werden (MCANULTY u. LAURENT, 1987). Diese Umbauraten sind bei
wachsenden Tieren größer und nehmen mit fortschreitendem Alter ab. Der permanente
Turnover von Kollagen bleibt jedoch zeitlebens auf einem gewissen Level erhalten (MAYS et
al., 1989; MAYS et al., 1991).
33
2.5.1 Kollagen Typ I und Typ III
Das in der menschlichen Lunge befindliche Kollagen besteht zu 90 % aus den interstitiellen
Fasertypen I und III, die beim Erwachsenen in der unveränderten Lunge in einem Verhältnis
von etwa 2:1 vorliegen (KIRK et al., 1984b) und sich außer im Interstitium noch in großen
Bronchien und Blutgefäßen finden. Fibroblasten, die etwa 40 % aller Lungenzellen
ausmachen, stellen die Hauptproduzenten der Kollagentypen I und III dar (HANCE et al.,
1976), wobei jedoch auch Endothelzellen (MACARAK, 1984), Epithelzellen (BIENKOWSKI
u. GOTKIN, 1995), Mesothelzellen (RENNARD et al., 1984) und glatte Muskelzellen zu
deren Synthese in der Lage sind (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995). Kollagen Typ I ist aus
drei so genannten α(I)-Ketten aufgebaut, die sich vor allem durch ihren hohen Prolingehalt
von bis zu 20 % auszeichnen, der die helikale Struktur der Ketten bedingt, und durch ihre
Primärstruktur mit Glycin in jeder dritten Position. Bei einem Kollagen Typ I-Molekül
handelt es sich in der Regel um ein Heterotrimer aus zwei α1(I)- und einer α2(I)-Kette. Bei
Mangel an α2(I)-Ketten können auch α1(I)-Homotrimere gebildet werden (BIENKOWSKI u.
GOTKIN, 1995). Die Gene für die proα1(I)- und proα2(I)-Ketten - COL1A1 und COL1A2 -
befinden sich beim Menschen auf den Chromosomen 17 bzw. 7 (SANDEL u. BOYD, 1990).
Obwohl die mRNA-Konzentrationen normalerweise ein recht stabiles Verhältnis von 2:1
aufweisen, kann die Transkription der Gene unabhängig voneinander erfolgen (FINE et al.,
1989; FINE et al., 1990). Kollagen Typ III ist in Struktur und Zusammensetzung dem
Kollagen Typ I sehr ähnlich, wobei es jedoch im Unterschied dazu ein Homotrimer aus
α1(III)-Ketten darstellt. Beide Formen finden sich vorrangig im Interstitium (BIENKOWSKI
u. GOTKIN, 1995), wobei diese interstitiellen Kollagenfibrillen Kopolymere dieser beiden
Kollagentypen darstellen (FLEISCHMAJER et al., 1990; XU et al., 1993). Kollagen Typ I
und III können aber auch in Verbindung mit dem von glatten Muskelzellen und Fibroblasten
sezernierten Kollagen Typ IV im Interstitium feine Fasern bilden (AMENTA et al., 1988).
34
2.5.2 Regulation des Kollagenstoffwechsels
Es existieren zahlreiche Mechanismen zur Regulation des Kollagenstoffwechsels. Diese
schließen die Migration von Fibroblasten zu einem aktiven Fokus ein,
Fibroblastenproliferation und klonale Selektion von Fibroblastensubtypen sowie Modulation
der zellulären Kollagensynthese und -degradierung (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995).
Zahlreiche endokrine, parakrine und autokrine Mediatoren sind in der Lage, die Funktion von
Fibroblasten zu beeinflussen (CROUCH, 1990). So sind Fibrinogen und Endothelin 1 aus
endo- und epithelialen Zellen Stimuli für Fibroblastenmigration und -proliferation
(BITTERMAN et al., 1983; AKIYAMA et al., 1989). Die vermutlich größte Rolle spielen
jedoch Cytokine – Interleukine, Interferon und Polypeptid-Wachstumsfaktoren – als
hochpotente Modulatoren des Zellstoffwechsels. Sie werden von Bindegewebs- und
Entzündungszellen gebildet und sind zudem in der Lage ihre eigene Synthese zu stimulieren
(ZHANG et al., 1993). Da sie mit Oberflächenrezeptoren unterschiedlicher Spezifität
reagieren (PARTANEN et al., 1993) und verschiedene Signaltransduktionswege in
unterschiedlichen Zellen aktivieren (z. B. cAMP (ZHANG et al., 1993), Tyrosinkinasen
(DARNELL et al., 1994)), können sie gegensätzliche Effekte hervorrufen (YAN et al., 1994).
Daher sind viele dieser Substanzen in der Lage, mehrere Funktionen gleichzeitig zu
übernehmen. So regen Mediatoren wie IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) und IL-1
(Interleukin-1) Kollagensynthese und Fibroblastenproliferation an, wobei monozytäres IL-1
gleichzeitig auch einen extrazellulären Kollagenabbau durch verstärkte Kollagenase-
ausschüttung induziert (BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995).
Die Regulation der Kollagensynthese erfolgt gleichzeitig an mehreren Stellen des
Stoffwechselweges auf transkriptionaler, translationaler und posttranslationaler Ebene. Die
Transkription der codierenden Gene wird durch zahlreiche Agentien beeinflusst, zu denen
neben Prostaglandinen vom E-Typ insbesondere Cytokine - vor allem IL-1α, -1β und TGF-ß
(Transforming Growth Factor-β) - gehören. Posttranskriptional wird die Kollagensynthese
über die Stabilität der gebildeten mRNA und die Effektivität der Translation beeinflusst
(MAKELA u. VUORIO, 1986). Nach GEESIN et al. (1988) spielt hier unter anderem
Ascorbinsäure eine Rolle. Darüber hinaus existieren Feedbackmechanismen, wobei vor allem
die N- und C-terminalen Telopeptide der Prokollagene in der Lage sind, die
Kollagenneusynthese zu beeinflussen (WIESTNER et al., 1979). Das N-terminale Propeptid
führt in diesem Zusammenhang zu einer unspezifischen Hemmung der Translation
35
(GOLDENBERG u. FINE, 1985), Fragmente des C-terminalen Propeptides können sowohl
inhibitorisch als auch stimulierend wirken (KATAYAMA et al., 1991).
Die posttranslationale Regulation erfolgt vor allem durch den Abbau von Kollagen auf zwei
verschiedenen Ebenen:
1. Ein erheblicher Anteil des im Bindegewebe gebildeten Kollagens wird bereits vor seiner
Sekretion degradiert (BIENKOWSKI, 1985). Der basale Level dieses intrazellulären
Kollagenabbaus in Lungenfibroblasten liegt bei etwa 15 % (BARILE et al., 1990) des
neugebildeten Prokollagens (KEHRER, 1985; PICKRELL et al., 1987), steigt jedoch bei
vermehrter Bildung strukturell abnormalen Kollagens oder unter Einfluss von PGE1 an
(BIENKOWSKI et al., 1978; BARILE et al., 1988). Über die Lokalisation des Abbaus
existieren unterschiedliche Ansichten. BERG et al. (1980) beschreiben eine lysosomale
Proteolyse, während RIPLEY et al. (1993) von einer Degradierung in einem distalen
Kompartiment des Sekretionsweges ausgehen. Ob derartige Vorgänge, wie bei anderen
Proteinen bekannt, bereits auf der Ebene des endoplasmatischen Retikulums ablaufen, ist
unklar (FRA u. SITIA, 1993).
2. Das bereits sezernierte Kollagen unterliegt einer extrazellulären Proteolyse, die durch
spezifische Enzyme und deren Inhibitoren reguliert wird (MATRISIAN, 1990; MURPHY
u. DOCHERTY, 1992). Sowohl die Enzyme als auch ihre Inhibitoren unterliegen
wiederum der Regulation durch zahlreiche Mediatoren.
Eine Steigerung der Kollagenbildung ist auch indirekt durch verstärkte Fibroblasten-
proliferation oder Chemotaxis möglich. Zahlreiche Mediatoren verschiedener Zelltypen, wie
Makrophagen, Monozyten, Lymphozyten, Fibroblasten, epi- und endotheliale Zellen, spielen
hierbei eine Rolle. Daneben existieren noch frei zirkulierende Faktoren. Weiterhin setzt sich
die Fibroblastenfraktion in den einzelnen Organen aus mehreren Subpopulationen mit
unterschiedlichen Eigenschaften zusammen (HURUM et al., 1982; KONDO et al., 1985) und
es existieren Hinweise darauf, dass in von Patienten mit Lungenfibrose gewonnenen
Fibroblastenlinien Zellklone mit einer überdurchschnittlich hohen Teilungsrate vorliegen
(JORDANA et al., 1988).
36
-OH
AAA
Mannose- und Scavengerrezeptoren
Kollagenfibrillen
Kernmembran
Hydroxilierung
Bildung der Tripelhelix
Transcrip tion Factor Antagonists
Sekretion Zellmembran
Abspaltung der Propeptide
C-Propeptidase
N-Propeptidase
Lysyloxidaseinhibitoren
-O-Gal-Glc
Gal-O- Gal-O-
-OH
-OH
HO-
-OH
Translation
-OH
Matrixmetalloproteinasen
Tissue Inhibitors of Metalloproteinase MMP-Aktivatoren
Zellkern
Transkription
Quervernetzung
Intrazelluläre Degradierung N- und C-
terminale Propeptide
Abb. 1: Schematische Darstellung der Kollagenbiosynthese (CROUCH, 1990; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995; SCHUPPAN et al., 1999)
37
2.5.3 Die Bedeutung von Kollagen Typ I und Typ III bei diffusem Alveolarschaden und
interstitieller Pneumonie
Nach allgemeiner Auffassung besteht die erste akute Phase von DAD und interstitieller
Pneumonie in einer massiven Steigerung der alveolären Permeabilität, die zu einer
Akkumulation proteinreicher Ödemflüssigkeit in Interstitium und Alveolarlumina führt.
Diesem Frühstadium folgt im Rahmen einer konsekutiven interstitiellen Pneumonie (JUBB,
1991) eine fibroproliferative Phase, die entweder die Regeneration der Alveoli einleitet oder
aber auch zu einer progressiven Obliteration der interstitiellen und alveolären
Lungenkompartimente führen kann (BITTERMAN, 1992). Die dabei ablaufenden Vorgänge
umfassen Proliferation von Endothelzellen, Proliferation und Migration von Fibroblasten,
Angiogenese sowie die Neubildung von extrazellulären Matrixproteinen (MEDURI et al.,
1998). Unter anderem beschreiben ZAPOL et al. (1979) eine Verdreifachung neu gebildeten
Kollagens als Folge von ARDS gegenüber unveränderten Lungen. Das ansonsten sehr stabile
Verhältnis von Kollagen Typ I zu Typ III in der Lunge von 2:1 kann auf bis zu 4:1 ansteigen
(LAST et al., 1983). Ähnlich wie bei der kutanen Wundheilung sind auch bei der Lunge
Myofibroblasten mit in die Regeneration / Reparation einbezogen (MARINELLI et al., 1990).
Die fibroproliferative Reaktion stellt einen limitierenden Faktor bei der Wiederherstellung der
normalen Lungenfunktion dar und beeinflusst wesentlich die Prognose sowohl quoad
valitudinem als auch quoad vitam. Verschiedene Autoren verwenden in diesem
Zusammenhang biologische Marker für die Kollagensynthese als mögliche diagnostische und
prognostische Parameter (KIRK et al., 1984a; HORSLEV-PETERSEN, 1990). Mehrere
Arbeitsgruppen (WAYDHAS et al., 1993; CLARK et al., 1995; ASHA et al., 1997; MEDURI
et al., 1998) nutzten hierfür den Gehalt des N-terminalen Prokollagen-Typ III-Peptids (N-
PCP-III) in bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) oder Trachealaspiraten und konnten
bemerkenswerterweise bereits in den ersten 24 h nach der klinischen Diagnose eine verstärkte
Kollagensynthese feststellen sowie einen Zusammenhang zwischen der Peptidmenge und der
Mortalität der untersuchten ARDS-Patienten: Der Anstieg der N-PCP-III-Konzentration über
1,75 U / ml im Trachealaspirat ging mit einer Verdoppelung des Todesrisikos einher. Bei
kardiogen oder hydrostatisch bedingten Lungenödemen hingegen lagen keine erhöhten Werte
vor. Histologisch oder immunhistochemisch fanden sich nachweisbare Kollagenablagerungen
erst nach mehreren Tagen. Andere Studien zeigen zudem, dass innerhalb von 24 h in BALF
und Plasma von ARDS-Patienten ebenfalls deutlich erhöhte Konzentrationen von Cytokinen
und Wachstumsfaktoren vorliegen, die Kollagensynthese und Fibroblastenproliferation
38
stimulieren (PUGIN et al., 1996; CHESNUTT et al., 1997b). Verlaufsuntersuchungen des N-
PCP-III-Gehaltes über mehrere Tage weisen bei ARDS-Patienten mit erhöhtem Todesrisiko
auf eine prolongierte fibroproliferative Phase hin (MARSHALL et al., 2000). Da sich die
Nettokollagenablagerung in der Lunge aus dem dynamischen Gleichgewicht von
Prokollagensynthese und Kollagenabbau ergibt, kann man durchaus davon ausgehen, dass bei
Patienten mit besserer Prognose degradierende Prozesse im Vergleich zu profibrotischen
überwiegen (MCANULTY et al., 1997; COKER u. LAURENT, 1998). Untersuchungen zum
Stoffwechsel von Kollagen Typ I liefern vergleichbare Ergebnisse zu Kollagen Typ III. So
zeigt sich eine Verdoppelung des Prokollagen Typ I mRNA-Levels bei Patienten mit DAD
nach cardiovaskulärem Bypass bereits nach 108 min (DEHEINZELIN et al., 1997). Auch
immunhistochemisch konnte im Alveolarbereich nicht nur erst in der fibroproliferativen
Phase eine Zunahme Kollagen Typ I-bildender Zellen nachgewiesen werden, in 50 % aller
Fälle der Studie gelang dies auch im frühen, exsudativen Stadium (LIEBLER et al., 1998).
ARMSTRONG et al. (1999) verwenden bei ARDS / ALI-Patienten das C-terminale Propeptid
(PICP) von Kollagen Typ I als Maß für die Kollagenneosynthese und COL2-3 / 4short-
Neoepitope, die Abbauprodukte von Kollagen Typ I und II, als Maß für die Kollagenolyse.
Bereits am ersten Tag zeigt sich auch hier, gemessen an der PICP-Konzentration in der
BALF, eine Steigerung der Kollagensynthese, während gleichzeitig, gemessen an der
Konzentration der COL2-3 / 4short-Neoepitope, ein verminderter Kollagenabbau vorliegt, so
dass eindeutig die Nettoablagerung von Kollagen Typ I begünstigt wird. Der Vorteil der
Messung von PICP besteht darin, dass seine Freisetzung in direktem Zusammenhang mit der
Kollagensynthese steht, während das C-terminale Propeptid von Kollagen Typ III (PIIICP)
bei Entzündungs- und Abbauvorgängen ebenfalls vermehrt auftritt (RISTELLI u. RISTELLI,
1995). Jedoch werden auch anhand der Bestimmung von PIIICP vergleichbare
Schlussfolgerungen gezogen (CHESNUTT et al., 1997a).
39
2.6 Transforming Growth Factor (TGF) -β
2.6.1 Struktur, Regulation und Signalbildung
Der 1981 erstmals beschriebene Transforming Growth Factor-β (MOSES et al., 1981;
ROBERTS et al., 1981) stellt den hochkonservierten Prototyp einer Gruppe von über 28
Peptiden dar, die als TGF-β-Superfamilie bezeichnet wird (VENTER et al., 2001). Zu dieser
Superfamilie gehören neben der TGF-β-Familie die Bone Morphogenetic Proteins Family
(BMP), die Mullerian Inhibitory Substance Family (MIS), die Aktivin / Inhibin Familie und
zahlreiche weitere, strukturell verwandte Faktoren bei Vertebraten, Insekten und Nematoden
(MASSAGUE, 1998). TGF-β dient unter anderem der Regulation des Zellwachstums in der
embryonalen, fetalen und neonatalen Entwicklung und beim Erwachsenen, der
Differenzierung, Migration und Adhäsion von Zellen, der Modulation der Zusammensetzung
der extrazellulären Matrix, spielt eine Rolle bei der Apoptosesteuerung und besitzt
immunsuppressive Effekte (MASSAGUE et al., 1994, LAWRENCE, 1996; COX u.
MAURER, 1997).
Es existieren fünf bekannte TGF-β-Isoformen. TGF-β1-3 finden sich bei Säugetieren, während
TGF-β4 beim Huhn und TGF-β5 beim Krallenfrosch nachgewiesen werden konnten
(LAWRENCE, 1996). Thrombozyten stellen eine wesentliche Quelle für TGF-β1 dar (VAN
DEN EUNDEN–VAN RAAIJ et al., 1988), darüber hinaus sind fast alle Zelltypen des
Organismus in der Lage, TGF-β-Isoformen zu exprimieren, insbesondere aktivierte T- und B-
Lymphozyten, Makrophagen, neutrophile Granulozyten und Fibroblasten (ROBERTS u.
SPORN, 1990). Die einzelnen Isoformen werden in verschiedenen Organen in
unterschiedlichen Verhältnissen und Mengen gebildet (BONEWALD, 1999). TGF-β1-3
besitzen beim Menschen jeweils eigene Genloci auf verschiedenen Chromosomen, wobei
TGF-β1 eine hohe Sequenzhomologie von 74 % zu TGF-β2 und von 78 % zu TGF-β3 aufweist
(LAWRENCE, 1996). Trotz dieser großen Ähnlichkeit erfolgt eine voneinander unabhängige
Regulation der Expression von TGF-β1 und TGF-β2 (DANIELPOUR et al., 1989). TGF-β1
wird als inaktives, 55 kDa großes, latentes Vorläuferprotein (LTGF-β) aus 390 Aminosäuren
gebildet, das vor der Entfaltung seiner biologischen Wirkung aktiviert werden muss. Bei der
aktiven Form von TGF-β1, die das C-terminale Ende des Precursors darstellt, handelt es sich
um ein Homodimer mit einem Molekulargewicht von 25 kDa. Die beiden Untereinheiten
40
bestehen aus je 112 Aminosäuren und sind über drei Disulfidbrücken miteinander verbunden,
die auch der Stabilisierung der β-Faltblattstruktur dienen (VERRECCHIA u. MAUVIEL,
2002). Eine Autoinduk tion der Transkription von TGF-β1 ist möglich, die durch AP-1-
Bindungsstellen (Activator Protein-1) in den Promoterregionen vermittelt wird (KIM et al.,
1990). Große Bedeutung besitzt auch die Aktivierung durch Integrin αvβ6 (MUNGER et al.,
1999), wobei TGF-β seinerseits in der Lage ist die Expression dieses Integrins zu fördern, und
somit eine positive Rückkopplungsschleife entstehen kann (SHEPPARD et al., 1992).
Aufgrund der großen Anzahl verschiedener Aktivierungsmöglichkeiten wird davon
ausgegangen, dass über diese Mechanismen ebenfalls eine Regulation der TGF-β-Aktivität
erfolgt (PIRCHER et al., 1986). Humanes rekombinantes, latentes TGF-β1 besitzt in vivo eine
Halbwertszeit von 90 min, wohingegen aktiviertes TGF-β1 bei Mensch und Ratte innerhalb
eines Zeitraumes von 3 min vor allem durch die Leber eliminiert wird (COFFREY et al.,
1990; WAKEFIELD et al., 1995). Die biologische Wirkung der Mitglieder der TGF-β-
Familie wird durch die Bindung an spezifische Membranrezeptoren vermittelt. Es existieren
in diesem Zusammenhang drei wesentliche Rezeptortypen, die als TβRI, -II und -III
bezeichnet werden und unterschiedliche Affinität zu den einzelnen Isoformen aufweisen. So
zeigen Typ II-Rezeptoren eine 100-fach höhere Affinität zu TGF-β1 und TGF-β3 als zu TGF-
β2 (LIN et al., 1992). Eine Bindung an die zur Familie der Serin / Threonin-Rezeptoren
gehörigen Typen I und II führt eine Signalbildung nach sich, während nach einer Anlagerung
an den Typ III-Rezeptor (Betaglykan) eine Signaltransduktion nicht zwingend erfo lgt
(DERYNCK u. FENG, 1997; PADGET et al., 1998). Seine Anwesenheit führt jedoch zu einer
Erhöhung der Affinität des Liganden an die Typ II-Rezeptoren (DERYNCK u. FENG, 1997)
und dient möglicherweise der Stabilisierung des TβRI-TβRII-Komplexes (MITTL et al.,
1996). Die weitere Transduktion des Signals erfolgt hauptsächlich durch Phosphorylierung
zytoplasmatischer, zur Smad-Familie gehörender Mediatoren (PIEK et al., 1999;
MASSAGUE u. CHEN, 2000; MASSAGUE u. WOTTON, 2000).
2.6.2 Allgemeine Funktion
Die Isoformen des Transforming Growth Factor-β bilden eine Gruppe multifunktioneller
Proteine, deren drei wichtigste biologische Aufgaben in der Proliferationshemmung, der
Stimulation der Synthese extrazellulärer Matrix und der Immunsupression liegen
41
(BONEWALD, 1999). Paradoxerweise kann TGF-β darüber hinaus aber auch starke
proinflammatorische Wirkungen entfalten (WAHL, 1992a). Das zur TGF-β-Gruppe gehörige
Cytokin TGF-β1 stellt einen wichtigen Wachstumsfaktor dar, der die Zellproliferation sowohl
stimulieren als auch hemmen kann, spielt eine wesentliche Rolle bei der Organogenese und
Wundheilung (ROBERTS u. SPORN, 1990) und ist vielseitig an der Regulation des
Immunsystems beteiligt (TIZARD, 2000). Während die Proliferation von epithelialen,
endothelialen und hämatopoetischen Zellen unterdrückt wird, zeigt TGF-β1 gegenüber
mesenchymalen Zellen wachstumsfördernde Eigenschaften (LAWRENCE, 1996;
ALEVIZOPOULOS u. MERMOD, 1997). Der genaue Mechanismus, der dieser
unterschiedlichen Wirkungsweise zugrunde liegt, ist noch nicht bekannt. Die mitogenen
Effekte scheinen jedoch nur indirekt von TGF-β1 hervorgerufen zu werden und von einer
Vermittlung durch autokrine Mediatoren, wie PDGF (Platelet-derived Growth Factor) und
EGF (Epidermal Growth Factor), oder von Bestandteilen der extrazellulären Matrix abhängig
zu sein (MASSAGUE, 1990; MASSAGUE u. POLYAK, 1995; ALEVIZOPOLOUS u.
MERMOD, 1997). Die sehr stark ausgeprägten wachstumshemmenden Eigenschaften
(MOSES et al., 1985) beruhen auf einem reversiblen Arrest der G1-Phase des Zellzyklus
(DERYNCK u. FENG, 1997). TGF-β1 ist darüber hinaus in der Lage die Differenzierung
verschiedener Zelltypen zu beeinflussen oder auch Apoptose zu induzieren
(ALEVIZOPOULOS u. MERMOD, 1997). So ist das Cytokin direkt oder indirekt durch
Vermittlung anderer Cytokine an der Regulation von Entwicklung, Differenzierung und
Funktion von B- und T-Lymphozyten beteiligt (ABBAS et al., 1996; TIZARD, 2000). TGF-
β1 beeinflusst auch Funktion und Aktivität von Makrophagen und zeigt hier in Abhängigkeit
von der Anwesenheit anderer Cytokine hemmende oder stimulierende Wirkung. Neben einer
Abnahme der Aktivität von Gewebemakrophagen wird auch die Bildung von
Stickstoffmonoxid und Wasserstoffperoxid unterdrückt (ROBERTS u. SPORN, 1990;
DUBOIS et al., 1995; LAWRENCE, 1996; TIZARD 2000). Es vermindert die Aktivität von
Natürlichen Killerzellen (ROBERTS u. SPORN, 1990) und unterdrückt die endotheliale
Adhäsion von Granulozyten (PFISTER et al., 1992). Außer diesen supressiven Effekten zeigt
TGF-β1 auch stimulierende. Es verstärkt die Chemotaxis für Makrophagen, neutrophile
Granulozyten und Fibroblasten (OSSEGE et al., 1994; TIZARD, 2000) und wirkt mitogen
insbesondere auf Fibroblasten. Monozyten exprimieren unter Einfluss von TGF-β1 verstärkt
Integrine, Interleukin-1 (IL-1) und Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α). Von sehr großer
Bedeutung in der Regulation entzündlicher Prozesse sind die antiinflammatorischen
Eigenschaften. In diesem Zusammenhang ist TGF-β1 ein Antagonist zu
42
Entzündungsmediatoren wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-12, TNF-α, TNF-β , IFN-α und IFN-γ
(ROBERTS u. SPORN, 1990; DUBOIS et al., 1995; TIZARD, 2000) und daher auch als
„Anti-Cytokin“ bezeichnet (ABBAS et al., 1996).
2.6.3 Einfluss von TGF-β auf den Kollagenstoffwechsel
Der Transforming Growth Factor-β ist der stärkste bekannte Stimulus der Kollagenbildung
(ROBERTS et al., 1986; IGNOTZ u. MASSAGUE, 1986; VARGA et al., 1986). Er
unterscheidet sich von anderen kollagenstimulierenden Cytokinen dadurch, dass er die
Produktion von Kollagen auf allen Ebenen des Stoffwechselweges gleichzeitig fördern kann
(RHAGOW, 1991), und wird daher auch als „Master Switch“ in Zusammenhang mit
fibrotischen Veränderungen bezeichnet (GIRI et al., 1993; BIENKOWSKI u. GOTKIN,
1995). TGF-β wird vor allem von Fibroblasten und Makrophagen synthetisiert und ist in der
Lage seine eigene Produktion autokrin und parakrin zu stimulieren (KELLEY et al., 1993).
Nach Untersuchungen mehrerer Arbeitsgruppen steigert TGF-β die Genexpression von
COL1A1 (FINE et al., 1990; DIAZ et al., 1989) und in Maus-NIH / 3T3-Zellen konnte
darüber hinaus eine Hochregulierung von COL1A2 nachgewiesen werden (ROSSI et al.,
1988; FINE et al., 1990). Der Effekt von TGF-β auf die Transkription von Kollagenen wird
dabei vermutlich durch die Bindung des Nuclear Factor-1 oder eines ähnlichen Proteins an
regulatorische Sequenzen nahe der Promoterregion von COL1A1 und COL1A2 vermittelt
(ROSSI et al., 1988; RITZENTHALER et al., 1993). Bemerkenswerterweise war in vitro ein
positiver Effekt auf die Expression von COL1A2 bei embryonalen humanen
Lungenfibroblasten nicht nachvollziehbar (FINE et al., 1990). TGF-β erhöht nicht nur die
Transkription und Stabilität spezifischer mRNA für Prokollagene, sondern reduziert auch den
intrazellulären Abbau von Prokollagenen, hemmt die Produktion von extrazellulären
Kollagenasen und stimuliert die Bildung von Metalloproteinaseinhibitoren, wie Tissue
Inhibitors of Metalloproteinase (TIMP´s), Plasminogen-Activator-Inhibitor und α2-
Makroglobulin (EDWARDS et al., 1987; VARGA u. JIMINEZ, 1987; PENTTINEN et al.,
1988; OVERALL et al., 1989; SHI et al., 1990; MCANULTY et al., 1991). Nach
Untersuchungen von KAWAGUCHI et al. (1992) und SCHULTZ et al. (1992) steigert TGF-β
die Prolylhydroxylaseaktivität in Hautfibroblasten bei Sklerodermie und die der Lysyloxidase,
die für die Ausbildung kovalenter Crosslinks zwischen α-Ketten verantwortlich ist. Auch die
43
Synthese von Fibronektin wird erhöht, das sich an extrazelluläre Kollagenfibrillen bindet und
das Wachstum von Fibroblasten fördert (AKIYAMA et al., 1989), ebenso die Ausschüttung
von Interleukin-6, das seinerseits wiederum die Bildung von TIMP´s in Fibroblasten und
Monozyten fördert (ELIAS et al., 1991). In vivo stimuliert TGF-β in fibrotischem Gewebe
direkt die Replikation von Zellen (RHAGOW et al., 1989), ebenso von Lungenfibroblasten in
vitro (SCHREIER et al., 1993). Inwieweit TGF-β auf Lungenfibroblasten chemotaktisch
wirkt, ist unklar. Mehrere Arbeitsgruppen gehen davon aus, dass es sich um einen sehr
wirkungsvollen chemotaktischen Faktor für Fibroblasten in verschiedenen Weichgeweben
handelt (PIERCE et al., 1989a; ADELMANN-GRILL et al., 1990), nach Untersuchungen von
OSORNIO-VARGAS et al. (1993) besitzt TGF-β jedoch keinen Einfluss auf das
Migrationsverhalten von rodenten Lungenfibroblasten oder Swiss 3T3-Fibroblasten. In
Tiermodellen für Lungenfibrose konnte sowohl ein Anstieg von TGF-β-mRNA als auch des
Proteins selbst festgestellt werden, dessen höchste Konzentration zum Zeitpunkt der
maximalen Kollagensynthese beobachtet werden konnte (KELLEY et al., 1985; HOYT u.
LAZO, 1988). Im Initialstadium bleomycininduzierter Lungenfibrose gelang immun-
histochemisch der Nachweis von TGF-β in der subepithelialen Matrix, später in Makrophagen
und im fortgeschrittenen Stadium in den Rändern der fibrotisch veränderten, hyperzellulären
Areale (KHALIL et al., 1989). Durch in situ-Hybridisierung konnte bei
Lungenfibrosepatienten die Anwesenheit von TGF-β-mRNA in Bereichen entzündlicher
Reaktionen in der Frühphase festgestellt werden, in denen Makrophagen in enger
Nachbarschaft zu Prokollagen Typ I-mRNA-bildenden Fibroblasten liegen (BROEKEL-
MANN et al., 1991). Immunhistochemische Studien zeigen auch, dass TGF-β nicht nur
intrazellulär in Alveolarmakrophagen und hyperplastischen Pneumozyten Typ II auftritt,
sondern sich darüber hinaus auch extrazellulär in Nachbarschaft zu Pneumozyten vom Typ II
in fibrotischem, interstitiellem Bindegewebe findet (BROEKELMANN et al., 1991; KHALIL
u. GREENBERG, 1991; CORRIN et al., 1994).
44
2.6.4 Die Rolle von TGF-β im Entzündungsgeschehen
Obwohl bei verschiedenen Lungenerkrankungen bereits zahlreiche Untersuchungen über die
Rolle von chemotaktischen Cytokinen, wie z. B. IL-8, vorliegen, gibt es vergleichsweise nur
wenige Erkenntnisse über den Einfluss von Angehörigen der TGF-β-Familie (BÜHLING et
al., 1999). Unter den zahlreichen Polypeptidwachstumsfaktoren nimmt TGF-β aufgrund
seiner umfassenden Wirkungen auf Zellproliferation und -differenzierung eine einzigartige
Stellung ein (ROBERTS u. SPORN, 1990). Zusätzlich zu seinen komplexen und essentiellen
regulatorischen Effekten auf das Wachstum aller Zelltypen besitzt TGF-β große Bedeutung
als Immunmodulator (WAHL et al., 1989; WAHL, 1992a). Da es sich bei TGF-β sowohl um
ein immunsupressives als auch um ein sehr potentes proinflammatorisches Protein handelt,
spielt es eine wichtige Rolle bei der Initiierung, Progression und Regression entzündlicher
Reaktionen (WAHL, 1992a). Diese gegensätzlichen Wirkungen von TGF-β unterliegen einer
Kontrolle durch Latenz und selektiver Expression des Cytokins, durch Rezeptormodulation
und Suszeptibilität der Zielzellen in Abhängigkeit verschiedener Stadien von Entwicklung,
Reifung und Aktivierung (WAHL, 1992a). Unmittelbar nach Schädigungen oder dem
Einsetzen einer Immunreaktion erfolgt im betroffenen Bereich die Freisetzung von TGF-β aus
Thrombozyten (ASSOIAN et al., 1983), das eine stark chemotaktische Substanz für
Monozyten (WAHL et al., 1987), neutrophile Granulozyten (BRANDES et al., 1991a; FAVA
et al., 1991; REIBMANN et al., 1991) und T-Lymphozyten (ADAMS et al., 1991) darstellt.
Das hohe Potential zur Rekrutierung von Entzündungszellen konnte in situ durch die
intradermale (ROBERTS et al., 1986) und intraartikuläre (ALLEN et al., 1990; FAVA et al.,
1991) Applikation des nativen oder rekombinanten Proteins nachgewiesen werden. Während
bei gesunden Individuen durch die lokale Verabreichung von TGF-β eine leukozytäre
Infiltration induziert werden kann (LYNCH et al., 1989), unterbleibt bei monozytopenischen
Tieren eine solche Reaktion (PIERCE et al., 1989b). Die entzündungsfördernden
Eigenschaften durch die Rekrutierung weißer Blutzellen beruhen auf vier in gegenseitiger
Wechselbeziehung stehenden Wegen molekularer Signalgebung: Modulation der Expression
von Integrinen, gesteigerte Adhäsion von Monozyten, Förderung der Sekretion
matrixspezifischer Kollagenasen und Chemotaxis (WAHL et al., 1987; WAHL et al., 1992b).
Die Translokation von Entzündungszellen durch die extrazelluläre Matrix erfordert die
Freisetzung matrixdegradierender Enzyme, wobei TGF-β die Produktion einer 92 kDa- und
97 kDa-Gelatinase sowie von Kollagenase Typ IV in Monozyten fördert (WAHL et al.,
45
1992a). Da TGF-β jedoch in vitro die Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen hemmt
(GAMBLE u. VADAS, 1988), ist unklar, welcher Mechanismus für die lokale Akkumulation
von Leukozyten in vivo nach Injektion von TGF-β verantwortlich ist. Eine erhöhte
Integrinexpression kann hier jedoch durchaus eine Rolle bei verstärkten Wechselwirkungen
zwischen Zellen sowie Zellen und Matrix spielen (WAHL et al., 1992a). Monozyten reagieren
bereits auf pikomolare TGF-β-Konzentrationen und zeigen eine verstärkte mRNA-Expression
sowohl von TGF-β1 als auch von TGF-β2 (MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1990). Auch
aktivierte T-Lymphozyten sezernieren vermehrt diese beiden Isoformen (KEHRL et al.,
1986). Entsprechend können die höchsten Konzentrationen von TGF-β-mRNA im Verlauf
von Entzündungsreaktionen und in Zusammenhang mit zellvermittelten Immunreaktionen
beobachtet werden (YAMAMURA et al., 1991). Über die Fähigkeit zur Rekrutierung von
Entzündungszellen hinaus stellt TGF-β einen potenten Regulator anderer wesentlicher
Zellfunktionen dar. Bereits in pikomolaren Konzentrationen ist TGF-β in der Lage in
ruhenden Monozyten die mRNA-Level verschiedener Entzündungsmediatoren, wie IL-1,
TNF, PDGF, bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) und IL-6, zu erhöhen (WAHL et al.,
1987; ALLEN et al., 1990; WAHL et al., 1990; MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1990;
KEHRL et al., 1986; YAMAMURA et al., 1991; TURNER et al., 1990). Die Sekretion von
IL-1, TNF und IL-6 kann wiederum eine Cytokinkaskade auslösen, in der jedes dieser
Moleküle eine eigene Rolle spielt (MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1990; WISEMAN et al.,
1988; TURNER et al., 1990). Zum Beispiel führt IL-1 posttranskriptional zu einer verstärkten
Bildung von aktivem TGF-β , das durch positives Feedback wiederum die Synthese von IL-1
fördert (MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1990). Zusätzlich zur Induktion von verschiedenen
Cytokinen stimuliert TGF-β die Präsentation von CD16 (FcγRIII) auf der Oberfläche
rekrutierter Monozyten (WELCH et al., 1990; PHILLIPS et al., 1991), das zusammen mit
dem Anstieg von Adhäsionsmolekülen die Phagozytoseaktivität und die Freisetzung toxischer
Sauerstoffradikale sowohl in vitro (WELCH et al., 1990) als auch in vivo (WAHL et al.,
1992b; ALLEN et al., 1991) steigert. Eine der wesentlichen Aufgaben in der Wirkung von
TGF-β auf Monozyten scheint also in der, wenn auch zeitlich begrenzten, Kontrolle einer
ganzen Reihe von biologisch aktiven Molekülen zu liegen, die zahlreiche Ereignisse im
Ablauf einer Entzündungsreaktion beeinflussen (BRANDES et al., 1991b). In mehreren
Studien konnte gezeigt werden, dass die Isoformen von TGF-β wichtige Regulatoren in der
Pathogenese von Lungenerkrankungen, wie Fibrose (MORELAND et al., 1992; KHALIL et
al., 1996), akuten und chronischen Entzündungen (XING et al., 1992; KOTECHA et al.,
1996), Hypersensitivity Pneumonitis (DENIS u. GHADIRIAN, 1992) und Transplantat-
46
abstoßung, spielen (MAGNAN et al., 1996). BÜHLING et al. (1999) gehen aufgrund von
Untersuchungen der Konzentrationen von TGF-β1 und TGF-β2 in der BALF von Patienten
mit unterschiedlichen Lungenerkrankungen wie Pneumonie, Interstitial Lung Disease (ILD)
und Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) davon aus, dass diese Cytokine den
Ablauf entzündlicher Reaktionen bei Pneumoniepatienten beeinflussen. Jedoch lagen erhöhte
Level von TGF-β1 und TGF-ß2 nur bei solchen Patienten vor, bei denen auch das Wachstum
pathogener Keime nachweisbar war. TGF-β1 kann daher einen potentiellen Marker für den
Schweregrad vorliegender infektiöser Prozesse darstellen.
2.6.5 Rolle von TGF-β bei akutem Alveolarschaden
TGF-β spielt eine wichtige Rolle bei entzündlichen Reaktionen und der Regeneration von
Gewebeschäden in zahlreichen Organen einschließlich der Lunge (SHULL et al., 1992). Das
Verhalten von TGF-β wurde in diesem Zusammenhang intensiv in der späten Phase der
Reparation nach ALI / DAD (Acute Lung Injury / Diffuse Alveolar Damage) untersucht, wo es
wesentlich an der Entstehung von Lungenfibrose beteiligt ist (BROEKELMANN et al., 1991;
GIRI et al., 1993). Jedoch stellen sich auch schon sehr früh, innerhalb von 48 h nach
bleomycininduzierten Lungenschäden TGF-β-bedingte Wirkungen ein, zum Beispiel in Form
einer deutlichen Zunahme der Expression von TGF-β-induzierbaren Genen (KAMINSKI et
al., 2000). In vitro konnten bereits nach 60 - 120 min direkte Effekte auf Endothelzellen
beobachtet werden, die nach acht bis neun Stunden ihr Maximum erreichten. Es zeigte sich
eine deutliche Permeabilitätssteigerung als Folge der Ausbildung von Interzellularspalten
durch Endothelzellkontraktion, ausgelöst durch Aktivierung der Myosin Light Chain-Kinase
Signalkaskade (HURST et al., 1999). Diese Abläufe scheinen dabei von der jeweiligen
Zellzyklusphase und dem Konfluenzgrad eines Monolayers abzuhängen. Ruhende Zellen
zeigen keine Reaktion. Zudem gelang der Nachweis einer zeit- und dosisabhängigen
Zunahme der Transepithelial Electric Resistance (TER) bei Primärkulturen rodenter
Pneumozyten Typ II nach der Applikation von rhTGF-β1, so dass davon ausgegangen werden
kann, dass TGF-β eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von Lungenödemen in vivo
spielt. Auch am Tiermodell für ALI konnte ein Zusammenhang zwischen der ausgeprägten
Exsudation und TGF-β hergestellt werden. Die lokale Aktivierung des Cytokins durch
Integrin αvβ6 besitzt dabei essentielle Bedeutung (PITTET et al. 2001). Für die TGF-β
47
abhängige Steigerung der epithelialen Permeabilität scheint ein anderer Mechanismus als für
die der endothelialen verantwortlich zu sein, die durch eine Myosin Light Chain-Kinase
vermittelte Kontraktion hervorgerufen wird. Man geht davon aus, dass hier eine Depletion
von intrazellulärem Gluthation und die Zunahme seiner oxidierten Form Gluthationdisulfid
(GSSG) eine große Rolle spielt. Untersuchungen der Gluthationkonzentration im alveolären
Flüssigkeitsfilm sowohl in Modellen (MODELSKA, 1999) als auch von ALI-Patienten
(BUNNEL u. PACHT, 1993) weisen auf eine wesentliche Beteiligung einer Abnahme von
Gluthation an einer erhöhten epithelialen Durchlässigkeit für Proteine hin (GUIDOT et al.,
2000). Eine mögliche Erklärung ist die Tatsache, dass TGF-β die Gluthationsynthese von
Lungenepithelzellen auf transkriptioneller Ebene durch Beeinflussung der γ-
Glutamylcysteinsynthetase hemmt (ARSALANE et al., 1997). Weiterhin agiert TGF-β als
prooxidative Substanz über eine Erhöhung der zellulären H2O2-Bildung, das sekundär die
endotheliale Permeabilität steigert (DAS u. FANBURG, 1991), und ein TGF-β-abhängiger
GSSG-Anstieg führt zu einer Steigerung der paraze llulären Durchlässigkeit in
Endothelzellmonolayern (RAO et al., 2000). TGF-β fördert auch zusammen mit TNF-α durch
die erhöhte Freisetzung von PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1) aus humanen
Lungenfibroblasten und der damit verbundenen prokoagulatorischen Wirkung die interstitielle
und intraalveoläre Ablagerung von Fibrin, wie sie bei ARDS oder Pneumonien anzutreffen ist
(IDELL et al., 1992). In vitro stimuliert TGF-β in humanen Hautfibroblasten aber auch die
Sekretion von Urokinase- und Tissue Plasminogen Activator-Inhibitoren (LAIHO et al.,
1986a) und hemmt in fetalen humanen Lungenfibroblasten die Ausschüttung von Urokinase
und Tissue Plasminogen Activator (LAIHO et al., 1986b), so dass eine Hemmung der
Fibrinolyse auf mehreren Ebenen erfolgt.
48
2.6.6 Bedeutung von TGF-β bei Regeneration und Reparation nach akutem
Alveolarschaden
Für einen ungestörten Gasaustausch ist die komplexe dreidimensionale und fragile Struktur
der Lunge von größter Bedeutung. Erstaunlicherweise kann sich diese Struktur bei
Erwachsenen auch nach erheblichen Schädigungen, z. B. durch bakterielle Infektionen oder
toxische Einflüsse, wieder regenerieren. Allerdings besteht auch die Möglichkeit, dass durch
fehlerhafte Wechselwirkungen zwischen extrazellulärer Matrix, mesenchymalen Zellen,
Epithel-, Endothel- und Entzündungszellen Störungen im Heilungsablauf entstehen
(WARBURTON et al., 2000). Für die Erhaltung der Struktur und damit der Funktionalität der
Lunge ist daher eine exakte zeitliche und räumliche Abstimmung der Regulation der
zellulären Abläufe essentiell (SHEPPARD, 2001). Im Anschluss an die akute Phase einer
Entzündungsreaktion spielt TGF-β eine wichtige Rolle bei der Entzündungshemmung,
Geweberegeneration und der Entstehung von Fibrose (WAHL, 1992a). Zum Teil sind die
durch TGF-β initiierten Abläufe unter anderem aufgrund dessen kurzer biologischer
Halbwertszeit (WAKEFIELD et al., 1991) und der Abnahme von TGF-β-Rezeptoren
(WELCH et al., 1990; WAHL, 1992a) selbstlimitierend und reversibel (ROBERTS et al.,
1986; ALLEN et al., 1990). TGF-β1 bildet zusammen mit IL-1β (SHEPPARD, 2001),
Bleomycin (JONES u. REEVE, 1978) und Fas death Receptor-Liganden (HAGIMOTO et al.,
1997) eine kleine Gruppe von Substanzen, die zu einer Umgehung des normalen
Heilungsprozesses führen und sich selbst unterhaltende Prozesse induzieren, und zu
Lungenfibrose führen (SHEPPARD, 2001; SIME et al., 1997). Da sich in der Lunge gesunder
Erwachsener bereits große Mengen an latentem TGF-β finden, kann Fibrose ohne gesteigerte
Proteinexpression von TGF-β allein infolge einer lokalen Aktivierung (MUNGER et al.,
1997), zum Beispiel durch Integrin αvβ6 (MUNGER et al., 1999), entstehen (SHEPPARD,
2001). Immunhistochemisch konnte bei pulmonaler Fibrose in humanem Lungengewebe ein
vermehrtes Auftreten von TGF-β in sich regenerierendem Epithel nachgewiesen werden
(KHALIL u. GREENBERG, 1991). Zusätzlich zu seiner Eigenschaft, eine generalisierte
fibrotische Reaktion einzuleiten und aufrechtzuerhalten, kann TGF-β , das zunächst von
infiltrierenden Makrophagen und anschließend von ortsständigen epithelialen und
mesenchymalen Zellen gebildet wird, die Regeneration von Alveolarepithel verzögern. TGF-
β ist in der Lage in niedriger Konzentration die Proliferation von Alveolarepithelzellen zu
stimulieren, jedoch deren Differenzierung zu hemmen (HOWE et al., 1990). Darüber hinaus
49
fördert TGF-β die Bildung basalmembrandegradierender Kollagenasen (OVERALL et al.,
1991; WAHL et al., 1993), wodurch der Übertritt interstitieller Zellen in die Alveolarlumina
und die dortige Ablagerung von Kollagen erleichtert wird (BIENKOWSKI u. GOTKIN,
1995).
50
2.7 Interleukin (IL) -1ß
2.7.1 Allgemein
Die Interleukin-1-Genfamilie besteht aus drei Mitgliedern, IL-1α, IL-1β und IL-1Ra, von
denen IL-1α und IL-1β agonistische Wirkungen besitzen und IL-1Ra einen spezifischen
Rezeptorantagonisten darstellt. Interleukin-1 (IL-1) ist der Prototyp eines multifunktionellen
Cytokins, wobei IL-1α und IL-1β in Wirkung und biologischer Aktivität vielfach nicht
unterschieden werden können und nur geringe Speziesspezifität aufweisen. Zunächst als
Kostimulus für T-Zellen beschrieben (GERY et al., 1972) wurde Interleukin-1 nach über
beinahe 30 Jahren intensiver Forschung als zentraler Mediator bei der Initiation und
Modulation von Entzündungs- und anderen Immunreaktionen etabliert. Im Gegensatz zu den
Lymphocyte und Colony Stimulating Factors ist IL-1 in der Lage - oft auch in Kombination
mit anderen Cytokinen - nahezu jeden Zelltyp zu beeinflussen. IL-1α und IL-1β werden zwar
von unterschiedlichen Genen kodiert und weisen in ihrer Aminosäuresequenz lediglich eine
Homologie von 26 % auf, jedoch enthalten die Gene sieben hochkonservierte Exons und
liegen bei der Maus eng benachbart auf Chromosom 2 (D´EUSTACHIO et al., 1987). Die
aktiven Formen von IL-1α und IL-1β mit einem Molekulargewicht von 17 kDa entstehen aus
inaktiven 31 kDa schweren Vorläufern, die nicht mit einem Signalpeptid ausgestattet sind
(AURON et al., 1984; MARCH et al., 1985). Im Gegensatz dazu wird IL-1Ra, das ein
Signalpeptid trägt, ohne erforderliche Aktivierung direkt von der Zelle sezerniert und in dieser
Form als secreted IL-1Ra (sIL-1Ra) bezeichnet (DINARELLO, 1998). Neben
Blutmonozyten, Lymphozyten, Keratinozyten und Astrozyten sind noch zahlreiche andere
Zellen in der Lage IL-1 zu bilden, wobei nach Stimulation mit Endotoxinen in Monozyten das
Verhältnis von IL-1β zu IL-1α - sowohl was die mRNA als auch das aktive Protein betrifft -
9:1 beträgt (MARCH et al., 1985). IL-1β stellt einen potenten proinflammatorischen Faktor
dar, dessen Ausschüttung und Aktivität sehr starken regulativen Mechanismen unterliegen.
Diese Kontrollmechanismen beeinflussen neben Genexpression, Proteinsynthese und
Sekretion auch Oberflächenrezeptoren, lösliche Rezeptoren und Rezeptorantagonisten. Es
existieren zwei Typen von Oberflächenproteinen, die die wichtigsten Rezeptoren für IL-1β
darstellen. Die Anlagerung des Liganden an einen IL-1-Typ I-Rezeptor (IL-1RI) führt dabei
zu einer Signaltransduktion, während bei einer Bindung an IL-1-Typ II-Rezeptoren (IL-1RII)
51
eine Signalbildung unterbleibt. IL-1RII dient daher einer Minderung der IL-1-Effekte und
wird auch als Decoy Receptor bezeichnet (COLOTTA et al., 1994).
2.7.2 Regulation der Genexpression und Proteinsynthese von IL-1ß
Es existieren zahlreiche Stimuli mikrobiellen und nichtmikrobiellen Ursprungs, die in der
Lage sind, Transkription und Synthese der drei Proteine der Interleukin-1-Familie zu
induzieren. In Abhängigkeit vom Stimulus kann der Level der IL-1β-mRNA sehr rasch
innerhalb von 15 min ansteigen, jedoch auch bereits nach 4 h wieder abfallen. Man geht
davon aus, dass diese Abnahme durch die Bildung eines transkriptionalen Repressors und /
oder durch die Senkung der biologischen Halbwertszeit der mRNA herbeigeführt wird
(JARROUS u. KAEMPFER, 1994). Bei Autoinduktion von IL-1β können jedoch erhöhte
mRNA-Level auch über einen Zeitraum von 24 h aufrechterhalten werden (SCHINDLER et
al., 1990c; SERKOLLA u. HURME, 1993). Zahlreiche weitere Faktoren sind zu einer
Steigerung der Genexpressionsrate von IL-1β in der Lage, während sie jedoch einen nur
unzureichenden oder schwachen Stimulus für die Proteinsynthese darstellen und der größte
Teil der mRNA wieder degradiert wird (SCHINDLER et al., 1993). So fördern C5a
(SCHINDLER et al., 1990b), hypoxische Zustände (GHEZZI et al., 1991), Adhärenz an
Oberflächen (SCHINDLER et al., 1990a) und Blutgerinnung (MILENO et al., 1995) die
Bildung großer Mengen an IL-1β-mRNA in Monozyten, ohne jedoch die Translation
nennenswert zu beeinflussen. Diese Diskrepanz zwischen Transkription und Translation ist
charakteristisch sowohl für IL-1β als auch für TNF-α (SCHINDLER et al., 1990a). Obwohl
sich die IL-1β-mRNA an Polyribosomen anlagert, unterbleibt eine signifikante Steigerung der
Elongation des Proteins (KASPAR u. GEHRKE, 1994). Bei gleichzeitiger Anwesenheit von
IL-1β selbst oder von Endotoxinen zeigen jedoch Zellen mit hohen Leveln an IL-1β-mRNA
eine deutliche Zunahme der Translationsrate (SCHINDLER et al., 1990ab). Dieser Zustand
kann unter anderem auf eine Stabilisierung der nichttranslierten AU-reichen Regionen
zurückgeführt werden, wie sie in LPS-stimulierten Zellen beobachtet werden kann (MILLER
et al., 1992). Ein weiterer Effekt in diesem Zusammenhang ist die Stabilisierung der IL-1β-
mRNA durch das IL-1β Protein selbst über eine Hemmung der Deadenylierung (STOECKLE
u. GUAN, 1993). Im Anschluss an die Synthese verbleibt ProIL-1β vor allem im Cytosol und
wird nach erfolgter Interleukin Converting Enzyme (ICE)-vermittelter Cleavage von der Zelle
52
ausgeschleust (BLACK et al., 1988). Im Gegensatz zu IL-1α existiert von IL-1β keine
bekannte membranständige Form (JOBLING et al., 1988). Neben ICE sind noch andere
Proteasen in der Lage ProIL-1β durch Spaltung an der Position 116-117 (Aspartat-Alanin) in
die aktive Form zu konvertieren (HAZUDA et al., 1990; HAZUDA et al., 1991). Hierzu
gehören neben Trypsin (KOBAYASHI et al., 1991), Elastase (DINARELLO et al., 1986),
Chymotrypsin (MIZUTANI et al., 1991a) und Mastzellchymase (MIZUTANI et al., 1991b),
die in entzündlichen Sekreten gefunden werden können. Ihre Rolle bei der in vivo-
Umwandlung des IL-1β-Precursors ist fraglich, da jedoch auch im lebenden Organismus
Entzündungszellen absterben und rupturieren können, sind eine Freisetzung des Precursors
und extrazelluläre Aktivierung grundsätzlich möglich (DINARELLO, 1998).
2.7.3 IL-1 bei Wundheilung und entzündlichen Lungenveränderungen
IL-1 besitzt große Bedeutung als Mediator bei entzündlichen Reaktionen und der
Blutgerinnung (OPPENHEIM et al., 1986). Verschiedene Lungenzellen sind in der Lage IL-1
zu synthetisieren, wobei die Bildungsrate von IL-1 in Makrophagen im Rahmen der
Umwandlung von Blutmonozyten zu Alveolarmakrophagen auf nur noch 5 % des
Ausgangswertes sinkt (WEWERS et al., 1984; RICH et al., 1987). Lokale Wirkungen von
IL-1 dienen der Rekrutierung und Aktivierung immunkompetenter Zellen, wie
polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten, Makrophagen und Lymphozyten, und ist in
der Lage in Fibroblasten und Chondrozyten die Synthese von Prostaglandinen und latenten
Kollagenasen zu fördern (MIZEL et al., 1981). Auch die Suszeptibilität der Lunge gegenüber
schädigenden Insulten wird durch IL-1 beeinflusst. So zeigen mit IL-1 und TNF
vorbehandelte Ratten nach Applikation von 100 %igem Sauerstoff deutlich weniger stark
ausgeprägte Lungenveränderungen und eine geringere Mortalität, wobei dieser Effekt
vermutlich durch eine IL-1-vermittelte Induktion von Superoxiddismutase und anderen
antioxidativen Enzymen hervorgerufen wird (WHITE et al., 1987). Die Verabreichung von
IL-1 kann jedoch auch zu Lungenschäden führen, die mit pulmonaler Leukostase und akuten,
pulmonalen, nichtletalen Endothelzelldefekten einhergehen (GOLDBLUM et al., 1988). Die
IL-1-Produktion in der Lunge, vor allem durch Monozyten und Makrophagen, kann durch
verschiedene Faktoren induziert werden. Hierzu gehören inhalierte anorganische Stäube und
Fasern, wie Quarzstaub und Asbest (SCHMIDT et al., 1984), auch Lipopolysaccharide
53
(BERNADINE et al., 1988). Nach Untersuchungen von PARSEY et al. (1998) sollen
interstitielle neutrophile Granulozyten bei Endotoxämie die Hauptproduzenten von IL-1β im
Parenchym sein. IL-1β spielt auch eine Rolle sowohl in frühen (PIEDBOEUF et al., 1998) als
auch in späten Phasen entzündlicher Reaktionen der Lunge, beim wundheilungsbedingten
Gewebeumbau (MAY et al., 1991) und bei fibrotischen Veränderungen (OPPENHEIM et al.,
1986). So kann bei der Maus nach hyperoxischen Lungenschäden ab dem zweiten Tag ein
Anstieg der IL-1β-Expression in interstitiellen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten
festgestellt werden, wobei die Transkripte - im Gegensatz jedoch zum Protein - ab dem
vierten Tag disseminiert auftraten (PIEDBOEUF et al., 1998). Im Tiermodell konnte darüber
hinaus auch nachgewiesen werden, dass akute entzünd liche Lungenschäden, die durch die
Ausschüttung von IL-1β initiiert werden, in progressive fibrotische Veränderungen übergehen
können (KOLB et al., 2001). Durch intratracheale Applikation von Interleukin-1 gelang es
eine Steigerung der Permeabilität im Alveolarbereich und eine Neutrophileninfiltration
hervorzurufen (HYBERTSON et al., 1997). Diese Steigerung der Gefäß- und
Gewebepermeabilität kann durch eine Stimulation der Freisetzung von Proteasen,
Kollagenasen und Hyaluronidasen erklärt werden. Die Adhäsion und Transmigration von
neutrophilen Granulozyten aus den Kapillarlumina in das Lungenparenchym wird durch eine
IL-1 mediierte Hochregulierung endothelialer Adhäsionsmoleküle gefördert, zu denen neben
E-Selektin auch ICAM-1 gehört (WARD, 1997). Auch bei Patienten mit Adult Respiratory
Distress Syndrome (ARDS) zeigen sich erhöhte Werte für IL-1β in bronchioalveolärer
Lavageflüssigkeit und in Alveolarmakrophagen (PUGIN et al., 1996; ZIEGENHAGEN et al.,
1998) sowie in fibroproliferativen Bereichen bei Idiopathischer Lungenfibrose (IPF) (PAN et
al., 1996). Sowohl IL-1α als auch -β fördern die Bildung von Prokollagen Typ I und III,
Glycosaminglykanen und Fibronektin in Fibroblasten sowie von Kollagen Typ IV in
Epithelzellen. Zusätzlich fördern sie indirekt über eine verstärkte Expression des Platelet-
derived Growth Factors (PDGF) und des PDGFα-Rezeptors die Proliferation von
Fibroblasten. IL-1α und -β dienen auch als frühe Mediatoren im Rahmen chronischer
Entzündungen und stimulieren die Fibrosierung durch Cytokininduktion, wie von IL-1 selbst,
IL-6 sowie von CXC- und CC-Chemokinen (KEANE u. STRIETER, 2002).
Bemerkenswerterweise existieren auch Hinweise darauf, dass IL-1β eine wesentliche Rolle
bei der Heilung von Schäden des Alveolarepithels bei Patienten mit Acute Lung Injury (ALI)
und ARDS spielt. So zeigt sich in vitro nach Hemmung der IL-1β-Aktivität durch den
natürlichen Antagonisten IL-1Ra bei A549-Zellen eine deutlich reduzierte
Regenerationsfähigkeit. Auch finden sich bei der Defektbehebung in Monolayern von
54
Primärkulturen rodenter Alveolarepithelzellen sehr hohe IL-1β-Konzentrationen. Dabei soll
IL-1β vor allem das Spreiten der am Defektrand gelegenen Zellen sowie deren Migration und
nicht die Zellproliferation fördern. Darüber hinaus steigert IL-1β die Sekretion von EGF und
TGF-α von Alveolarepithelzellen, die ihrerseits durch parakrine und autokrine Stimulation
die Epithelregeneration positiv beeinflussen. Auch eine erhöhte Expression des Epithelial
Growth Factor-Rezeptors, der die gemeinsame Andockstelle für EGF und TGF-α darstellt,
durch IL-1β ist nicht ausgeschlossen (GEISER et al., 2001). Aufgrund der gemessenen
systemischen und in der BALF angetroffenen Werte sowie aufgrund seiner gesicherten und
postulierten Effekte bei entzündlichen Lungenveränderungen soll IL-1β neben TNFα und das
Verhältnis IL-1Ra / IL-1β ein guter Parameter zur Beurteilung des Schweregrades von
Lungenschäden sein bzw. ein geeigneter prognostischer Faktor für Sarcoidosis beim
Menschen (BAUER et al., 2000; MIKUNIYA et al., 2000).
55
2.8 Perillaketon (PK) als lungentoxisches Agens
Herkunft
Perillaketon (1-(3-furyl)4-Methylpentaton) ist das wichtigste toxische Agens von Perilla
frutescens. Diese Pflanze ist unter einer Reihe von Namen wie Perillaminze oder
Beafsteakpflanze bekannt, kann bis zu 2 m groß werden und wird aufgrund der
purpurfarbenen Tönung der reifen Blätter auch als Purpurminze bezeichnet. Ursprünglich
stammt sie aus dem asiatischen Raum und gelangte von dort nach Nordamerika, wo sie vor
allem im Osten und Südosten in der Nähe von Flüssen, in Schluchten und an Straßenrändern
zu finden ist. Ihre Aufnahme führt bei Weidegängern, insbesondere bei Rind und Schaf, zu
Atypischer Interstitieller Pneumonie (AIP), damit zu respiratorischer Insuffizienz und häufig
auch zum Tod der Tiere (KERR et al., 1986). Neben Perilla frutescens existieren noch
verwandte Spezies, die vor allem in Japan kommerziell genutzt werden. Unter anderem
werden daraus Lebensmittelfarbstoffe, Tierfutter und Öl gewonnen. Die Blätter mancher
Arten eignen sich zum Würzen von Speisen oder als Zusatz zu Japanischem Tabak (WILSON
et al., 1977). Es finden sich in Perilla frutescens im Wesentlichen vier verschiedene toxische
Inhaltsstoffe: 1-Perillaaldehyd, Perillaketon (PK), Egomaketon und Isoegomaketon. Bei
Perillaketon, Egomaketon und Isoegomaketon handelt es sich um an Position 3 substituierte
Furanringe, die chemisch mit 4-Ipomeanol verwandt sind. Isoegomaketon stellt das in den
Blättern vorherrschende Furan im Frühsommer dar, während Perillaketon später in der
Wachstumsperiode überwiegt (GARST u. WILSON, 1984).
Perillaketon im Tiermodell
Perillaketon wird in Tiermodellen für die Induktion nichtkardiogener Lungenödeme und
ARDS (GUERRY-FORCE et al., 1987; BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998;
SNAPPER et al., 1999; HWANG et al., 2001) sowie für restriktive Lungenerkrankungen
beim Pferd (BREEZE et al., 1984) eingesetzt. Dieser Zustand ist die Folge einer erheblichen
mikrovaskulären Permeabilitätssteigerung in der Lunge, jedoch ohne Blutdruckveränderungen
oder eine Erhöhung des Gefäßwiderstandes. Somit besitzt diese Substanz in Tiermodellen
z. B. gegenüber E.-coli-LPS oder Ölsäure große Vorteile.
56
Pathohistologische Veränderungen
Bei Schafen konnten bereits 15 min nach Beginn der Applikation per infusionem Stauungen
der Lungenkapillaren und nach 180 min Extravasation von Erythrozyten in das Interstitium
und die Alveolarlumina beobachtet werden. Auch finden sich in den ersten 10 – 15 min eine
Ödematisierung der Alveolarwände, später des Interstitiums und der Austritt von
Ödemflüssigkeit in die Lumina. Nach 180 min können häufig auch perivaskuläre Ödeme mit
Ansammlungen von neutrophilen Granulozyten und mononukleären Zellen nachgewiesen
werden, wobei die Margination der Neutrophilen schon in den ersten Minuten einsetzt, die
Migration jedoch erst nach etwa 2 h stattfindet. Histologisch finden sich neben Ödemen und
entzündlichen Infiltraten Schädigungen des Gefäßendothels und der Alveolarepithelzellen
vom Typ I. Bei verendeten Weidetieren kann auch eine Proliferation von
Alveolarepithelzellen vom Typ II nachgewiesen werden, die im Zuge regenerativer Prozesse
die Alveolen säumen. Die makroskopischen Befunde bei PK-bedingten Veränderungen
bestehen in einem deutlich erhöhten Organgewicht und Flüssigkeitsgehalt der explantierten
Lunge mit erweiterten, ödematisierten interlobulären Septen und interstitiellem und bullösem
Emphysem. Es zeigen sich Ödemflüssigkeit in Trachea und Bronchien und mitunter auch
hämorrhagische Areale im Lungenparenchym (GUERRY-FORCE et al., 1988; KERR et al.,
1986). Bemerkenswert ist, dass im Tierversuch mit Mäusen die Veränderungen bei
Vergiftungen mit PK und 4-Ipomeanol nicht zu unterscheiden sind (BOYD et al., 1974).
Elektronenmikroskopische Veränderungen
Auch elektronenmikroskopisch kann im Tiermodell bereits innerhalb der ersten 15 min des
Versuches Ödemflüssigkeit in den interstitiellen Räumen und den Alveolen nachgewiesen
werden. In diesem Zeitraum fanden sich auch bereits erhebliche Schäden des Endothels mit
einem Anstieg der Elektronendichte, mit Vesikelbildung, Vakuolisierung, Fragmentierung des
Zytoplasmas, Verklumpung des Chromatins und manchmal Ablösung der Endothelzellen in
alveolären Kapillaren. In Zusammenhang mit der entblößten Basalmembran zeigten sich
häufig Plättchenaggregate. Auf Ebene der Kapillaren weisen die Perizyten ebenfalls eine
erhöhte Elektronendichte auf, was auf eine Schädigung der gesamten Gefäßwand hinweist.
Nach 120 min zeigen sich ausgedehnte Schäden und Unterbrechungen des Endothels,
vergesellschaftet mit intravaskulären Fibrinkonglomeraten. Im zum Endothel benachbarten
57
Interstitium können flockiger Debris, Erythrozyten und Fibrin beobachtet werden. Während
die Endothelschäden immer mit einem interstitiellen Ödem vergesellschaftet sind, können zu
sehr frühen Zeitpunkten auch Foci mit Ödemen ohne erkennbare Beeinträchtigung der Gefäße
angetroffen werden. Später im Versuchsablauf findet sich auch eine Ablösung von
Pneumozyten vom Typ I und die Alveolarräume in diesen Bereichen enthalten große Mengen
an proteinreicher Flüssigkeit und Fibrin. Nach 180 min weist bereits etwa die Hälfte der
gesamten Zellpopulation Schäden auf, während die Pneumozyten vom Typ II zu allen
Zeitpunkten der Untersuchung unverändert zu sein scheinen. Betroffen sind auch die
terminalen und respiratorischen Bronchioli. Nach 30 min können gelegentlich subepitheliale
Ödeme beobachtet werden und fokal nichtziliertes Brochialepithel mit verminderter
Elektronendichte und einer Dilatation des glatten und rauen endoplasmatischen Retikulums.
Funktionell äußern sich die Veränderungen letztlich in respiratorischer Insuffizienz,
verminderter dynamischer Compliance und Hypoxämie. Zudem zeigt sich eine Abnahme der
funktionellen Residualkapazität. Im Tierversuch lassen sich bei Kaninchen, Hunden und
Schweinen auch Leberzelldegenerationen und -nekrosen nachweisen, Hunde können
zusätzlich blutigen Durchfall zeigen und Schweine neurologische Symptome (GARST et al.,
1985).
Wirkungsmechanismus
Verschiedene Autoren gehen davon aus, dass 3-substituierte Furane durch pulmonale
Cytochrom P450-Enzyme (CYP450) aktiviert werden müssen, um ihre toxische Wirkung zu
entfalten (BOYD et al., 1978; DUTCHER u. BOYD, 1979; BOYD, 1980). GARST u.
WILSON (1984) beschreiben eine bemerkenswerte Beziehung zwischen dem Ausmaß der
Schädigungen verschiedener Organe, wie Lunge, Leber und Niere, durch PK und deren
Gehalt an Cytochrom P450. Auch soll ein Zusammenhang zwischen der Letalität und den
Aktivitäten von CYP 450-Enzymen und der NADPH-Cytochrom C-Reduktase bestehen
(KERR et al., 1986). Obwohl der genaue Wirkungsmechanismus noch nicht geklärt ist,
stützen diese Ergebnisse die Hypothese, dass Perillaketon, ebenso wie das chemisch sehr
ähnliche 4-Ipomeanol, durch das Cyp450-Enzymsystem erst metabolisch aktiviert werden
muss. RIVANDRANATH et al. (1984) vermuten, dass Furane in diesem Zusammenhang
nichtgesättigte Dialdehyde wie Acetylacrolein und Methylbutenedial bilden können, die
unmittelbar vor Ort der Entstehung reagieren. Ein weiterer Hinweis auf eine metabolische
58
Aktivierung ist die Tatsache, dass sich bei Hühnern und Japanischen Wachteln, die keine
CYP450-Aktivität in der Lunge besitzen, zwar Leberveränderungen finden, die Atemorgane
jedoch unbeeinträchtigt bleiben (BOYD, 1977). In vitro-Versuche mit bovinen aortalen
Endothelzellen führen zu anderen Ergebnissen (WATERS et al., 1993). Zwar hat eine
Behandlung der Zellen mit PK ebenfalls eine deutliche Permeabilitätssteigerung des
Monolayers zur Folge, ein Einsatz von Ketokonazol als CYP450-Inhibitor zeigt jedoch keine
Wirkung, was gegen eine Aktivierung der Substanz durch mikrosomale Monooxigenasen
spricht. Es zeigen sich jedoch unter Einfluss von PK eine Zunahme interzellulärer Spalten,
jedoch keine Zelluntergänge. Diese „Permeabilitätssteigerung“ ist nach Absetzten von PK
reversibel. Bei der Betrachtung des Zytoskeletts weisen die Endothelzellen Unterbrechungen
und Fragmentierung der Aktinfilamente auf und es finden sich Parakristalle. Als weitere
mögliche Mechanismen werden unter anderem rezeptorvemittelte Effekte oder
Unterbrechungen von Adhäsionsmolekülen zur Basalmembran diskutiert (WATERS et al.,
1993).
59
3 Material und Methoden
3.1 Untersuchungsmaterial
Die Planung des Tierversuchs, die Durchführung der klinischen Untersuchungen und der
Probenentnahmen erfolgte durch Frau Dr. Monika Venner (Klinik für Pferde, Tierärztliche
Hochschule Hannover), die in diesem Zusammenhang parallel zur vorliegenden Arbeit
ebenfalls ein Thema im Rahmen des Ph.D.-Studiums bearbeitete (VENNER, 2003). Im
Rahmen dieser Arbeit wurden nach umfassender klinischer Untersuchung und oraler
Entwurmung mit Ivermectin (IvomecP®, Merial, Halbermoos) an zehn lungengesunden,
adulten Pferden Versuche durchgeführt. Der Impfstatus war bei den meisten Pferden
unbekannt. Die Pferde wurden in der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule
Hannover zwei Wochen vor Versuchsbeginn und während des Versuchs auf Späneeinstreu
und mit Blickkontakt zu anderen Pferden aufgestallt. Die standardisierte Fütterung bestand
dreimal täglich aus nassem Heu sowie einer Mischung aus Hafer und Pellets mit Möhren.
Sofern ihr klinischer Zustand dies zuließ, wurden die Tiere täglich 30 - 45 min frei in der
Reithalle oder an der Longe bewegt. In einem Vorversuch zur Dosisfindung erfolgte bei zwei
Pferden die intravenöse (i.v.) Applikation von 5 mg / kg KG 1-(3-furyl)4-Methylpentaton
(Perillaketon) in insgesamt 13 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), wobei die Gesamtdosis zu
gleichen Teilen auf zwei Bolusinjektionen im Abstand von 30 min verteilt wurde. Im darauf
folgenden Hauptversuch, ebenfalls zu gleichen Teilen verteilt auf zwei Bolusinjektionen im
Abstand von 30 min, erhielten sechs weitere Pferde eine intravenöse Dosis von 6 mg / kg KG
zur Erzeugung eines akuten Alveolarschadens. Die Synthese von Perillaketon wurde nach der
Methode von GARST et al. (1984, 1985) vom Institut für Chemie der Tierärztlichen
Hochschule, Hannover, durchgeführt. Die Verabreichung der Perillaketon / DMSO-Lösung
erfolgte über einen Teflonkatheter (Vygonüle S, 12 Gauche, Fa. Vygon, Aachen, Best.-Nr.
103.827) in der Vena jugularis. Die Tiere der höheren Dosisgruppe des Hauptversuchs (6 mg /
kg KG) wurden bei Auftreten schwerwiegender klinischer Symptome als lebenserhaltende
Maßnahme über 48 h zweimal täglich mit 1 mg / kg KG Methylprednisolon (Urbason®,
Eurim Pharm, Pid ing) und mit Furosemid (Dimazon®, Intervet, Unterschleißheim) i.v.
behandelt. Zur Gewinnung von Lungengewebe als Untersuchungsmaterial erfolgte am
sedierten Pferd ab dem ersten Versuchstag zweimal wöchentlich in regelmäßigen Abständen
die transkutane Entnahme von je zwei Bioptaten vom linken und rechten Hauptlappen aus
60
dem Bereich zwischen 8. und 11. Interkostalraum bzw. bei kleineren Pferden zwischen dem 7.
und 10. Interkostalraum. Als Kontrollen dienten von jedem Pferd insgesamt acht an zwei
verschiedenen Tagen aus denselben Bereichen vor Versuchsbeginn entnommene Proben. Die
Gewinnung erfolgte mit Hilfe einer halbautomatischen Biopsiepistole (Pro-Mag 2.2,
USBiopsy engineered medical products, Franklin, USA) mit Einmalbiopsienadeln (14
Gauche, 10 cm Länge), die gegenüber der herkömmlichen True-Cut Nadel hinsichtlich
Probenqualität und Nebenwirkungen für das Pferd deutliche Vorteile besitzt (VENNER et al.,
in Druck). Die Proben besaßen eine Größe von bis zu 1,5 x 0,2 x 0,2 cm und waren nur in
wenigen Fällen erheblich kleiner. Zu einigen Zeitpunkten lieferten die Biopsien jedoch nicht
von allen vier Lokalisationen auswertbares Gewebe. Für die vorliegende Arbeit erfolgten im
Hauptversuch die Untersuchungen bis zur 4. Woche, wobei Pferd 3 und 5 bereits am 11. bzw.
9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert werden müssen. Dieser Beobachtungs-
zeitraum war gerechtfertigt, da in anderen Untersuchungen (ZAPOL et al., 1979; COLLINS et
al., 1984) bereits drei Wochen nach einem erfolgten diffusen Alveolarschaden eine Zunahme
der Kollagengehaltes der Lunge um das Dreifache beobachtet werden konnte. Zudem
erfolgten pathohistologische Untersuchungen an Biopsieproben anhand von HE – gefärbten
Paraffinschnitten und Semidünnschnitten noch über weitere vier Wochen. Nach Ablauf dieser
Zeit wurden die Tiere euthanasiert und die Lungen explantiert. Eine Lunge jedes Tieres wurde
im Rahmen der Ph.D.-Arbeit von Frau Dr. Venner an der Klinik für Pferde für
computertomographische Untersuchungen verwendet, die verbliebene Lunge umfassend
pathohistologisch ausgewertet.
Tabelle 4: Übersicht über die Versuchspferde
Versuchstier
Nr.
Alter Geschlecht Rasse Gewicht Dosierung
Perillaketon (i.v.)
1 3 Jahre Wallach Warmblut 510 kg 5 mg / kg KG
2 5 Jahre Wallach Warmblut 600 kg 5 mg / kg KG
3 3 Jahre Stute Warmblut 490 kg 6 mg / kg KG
4 2 Jahre Stute Traber 480 kg 6 mg / kg KG
5 2 Jahre Wallach Warmblut 480 kg 6 mg / kg KG
6 5 Jahre Stute Traber 420 kg 6 mg / kg KG
7 3 Jahre Wallach Warmblut 550 kg 6 mg / kg KG
8 3 Jahre Stute Warmblut 550 kg 6 mg / kg KG
61
3.2 Allgemeine Versuchsplanung
Um anhand der Lungenbiopsieproben der Versuchspferde die induzierten Schäden der
alveolären Septen, regenerative und eventuelle reparative Prozesse charakterisieren zu
können, sollten zunächst licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an Hämalaun-
Eosin (HE) -gefärbten Paraffinschnitten und Semidünnschnitten bzw. an Ultradünnschnitten
einer jeden Lokalisation durchgeführt werden. Zur Beurteilung des initialen, durch
Perillaketon hervorgerufenen diffusen Alveolarschadens, der die Grundlage für alle weiteren
auftretenden Veränderungen bildete, wurden nekrotische und apoptotische Zellen durch
terminal dUTP nick -end labeling (TUNEL) dargestellt, und durch die Gegenüberstellung von
TUNEL-positiven Zellen und Gesamtzellzahl die Apoptose- und Nekroserate bestimmt. Um
den Verlauf und das Ausmaß der mit regenerativen und möglicherweise reparativen
Vorgängen einhergehenden, fibroproliferativen Phase und einer eventuellen Fibrose zu
erfassen, erfolgte zum einen die immunhistochemische Markierung von Ki-67 zur Darstellung
von proliferierenden Zellen, wobei in Bezugsetzung zur Gesamtzellzahl die Proliferationsrate
ermitteltet wurde. Des Weiteren diente die morphometrische, phasenanalytische Auswertung
von in der Heidenhainschen Azanfärbung dargestellten kollagenen und retikulären Fasern
dazu, eine Zu- oder auch Abnahme des Anteils extrazellulärer Matrixbestandteile an den
alveolären Septen festzustellen und somit den Grad ablaufender fibrotischer oder auch
erosiver Prozesse zu bestimmen. Zur Untersuchung des Ausmaßes entzündlicher zellulärer
Infiltrate wurden Makrophagen und Granulozyten durch immunhistochemische Markierung
von Myeloid / Histiozyten-Antigen (MAC 387) dargestellt und in Bezug zur Gesamtzellzahl
gesetzt. Diese Untersuchungen sollten dazu dienen, eine Aussage über das Ausmaß der
entzündlichen Reaktion treffen zu können und das unterschiedliche Auftreten der
verschiedenen Typen von Entzündungszellen in den einzelnen Phasen der interstitiellen
Pneumonie darzustellen. Die Durchführung der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion
diente der Untersuchung der Veränderungen der Genexpression der Cytokine TGFß und IL-
1ß sowie der Strukturproteine Prokollagen a1(I) und a1(III). Diese neu zu etablierenden
Methoden mussten bei der Anwendung an diesen sehr geringen Gewebemengen hoch sensitiv
und präzise quantitativ sein. Es sollte dabei geklärt werden, wie sich die Genexpressionen
dieser Cytokine und extrazellulären Matrixproteine im Verlauf dieser experimentell erzeugten
interstitiellen Pneumonie verhalten. Ferner sollten sie zu den Ergebnissen der oben
aufgeführten morphologischen und morphometrischen Untersuchungen in Bezug gesetzt und
62
geprüft werden, in wie weit sie sich als möglicher prognostischer Parameter quoad
restitutionem und quoad vitam eignen. Durch die Kombination der Untersuchungsmethoden
und der transkutanen Entnahmetechnik, die die Gewinnung von Lungengewebe intra vitam
ermöglicht, sollten erstmals umfassende und zusammenhängende Untersuchungen über die
Pathogenese der interstitiellen Pneumonie in allen Phasen des Krankheitsverlaufs bis zur
Ausheilung oder einer möglichen Lungenfibrose erfolgen. Die etablierten Methoden können
Modellcharakter für Genexpressionsanalysen an Minimalbiopsieproben besitzen.
63
3.3 Methoden
3.3.1 Fixierung und Archivierung der Lungenbiopsieproben
Unmittelbar nach der Entnahme wurde das gewonnene Gewebe mit einer sterilen
Skalpellklinge dreigeteilt und die Einzelproben fixiert bzw. archiviert. Für die spätere
Isolierung von Gesamt-RNA wurde eine der Teilproben sofort in flüssigem Stickstoff
schockgefrostet und anschließend bei –80°C gelagert. Für die lichtmikroskopischen und
immunhistochemischen Untersuchungen erfolgte die Fixierung einer der Teilproben für
maximal 24 Stunden in 4 %iger, neutral gepufferter Paraformaldehydlösung (siehe Anhang)
und für die elektronenmikroskopische Auswertung für mindestens 24 Stunden in 5 %igem
Glutaraldehyd in Cacodylatpuffer (siehe Anhang).
3.3.2 Paraffineinbettung und Schnittherstellung für lichtmikroskopische und
immunhistochemische Untersuchungen sowie terminal dUTP nick-end
labeling (TUNEL)
Die formalinfixierten Proben wurden in einem Automatensystem (Hypercenter II, Fa.
Shandon, Frankfurt) nach dreistündiger Spülung in Leitungswasser in einer aufsteigenden
Alkoholreihe (70 %iges, 80 %iges und 96 %iges Ethanol jeweils 45 min, zweimal 100 %iger
Isopropylalkohol für 45 min) dehydriert und nach zweimaligem Spülen in Essigsäure-n-
Butylester (je 60 min) als Intermedium in Paraplast Plus (Fa. Shandon, Frankfurt) eingebettet.
Schließlich erfolgte die Herstellung 2-3 µm dicker Schnitte mit einem Schlittenmikrotom, die
in einem Wasserbad (42°C) gestreckt und auf Superfrost Plus Objektträger (Menzel-Gläser,
Braunschweig, Best.-Nr.: 041300) aufgezogen wurden. Abschließend wurden sie für 20
Minuten bei 60°C in einem Wärmeschrank getrocknet. Die Aufbewahrung erfolgte bei
Raumtemperatur.
64
3.3.3 Immunhistochemische Untersuchungen
3.3.3.1 Bestimmung der Zellproliferationsrate
Zur Ermittlung der Zellproliferationsrate in Abhängigkeit vom zeitlichen Verlauf der
Lungenveränderungen wurden diejenigen Zellen der Gewebepräparate, die sich in Zellteilung
befanden mit Antikörper gegen Ki-67 (MIB-1, Fa. DAKO, Hamburg, Best.-Nr. M 7240)
identifiziert. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des Bildanalyseprogramms analySIS 3.2
(Fa. Soft Imaging System GmbH, Münster), wobei pro Biopsieprobe, soweit aufgrund der
Schnittgröße möglich, unter dem Mikroskop wenigstens zwei Sichtfelder bei zehnfacher
Vergrößerung ausgezählt wurden. Die Gesamtzahl proliferierender Zellen zu den einzelnen
Zeitpunkten ergab sich aus der Summe der markierten Zellen aller Biopsieproben eines
Entnahmetages. Da die Biopsieproben entnahmebedingt unterschiedlich stark komprimiert
bzw. ent faltet waren, wurde als Bezugspunkt für die Zellproliferationsrate nicht die
Schnittfläche sondern die Gesamtzellzahl des untersuchten Bereichs gewählt. Die
Bestimmung der Gesamtzellzahl erfolgte an den entsprechenden Lokalisationen HE-gefärbter
Konsekutivschnitte durch computergestützte Zählung der sich blauviolett darstellenden
Zellkerne. Hierfür wurden auf Objektträger gezogene Paraffinschnitte mit Hämalaun-Eosin
(ROMEIS, 1989) in einem Färbeautomaten (Varistain 24-3, Fa. Shandon, Frankfurt) gefärbt.
Die Zellproliferationsrate ergab sich aus dem Anteil Ki-67-positiver Zellen an der
Gesamtzellzahl. Luftführende Wege, Bindegewebssepten, größere Gefäße und intraalveoläre
Bestandteile wurden nicht in die Bestimmung der Zellproliferationsrate miteinbezogen. Die
Durchführung der immunhistochemischen Markierung ist unter 3.1.3.3.2 beschrieben.
3.3.3.2 Bestimmung des Anteils der Makrophagen- und Granulozytenpopulation an
der Gesamtzellzahl der Lunge
Zur Untersuchung der Makrophagenpopulation wurde eine immunhistochemische Markierung
von Myeloid / Histiozyten-Antigen (Klon MAC 387, Fa. DAKO, Hamburg, Best.-Nr. M0747)
durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des Bildanalyseprogramms analySIS 3.2
(Fa. Soft Imaging System GmbH, Münster), wobei pro Biopsieprobe, soweit aufgrund der
Schnittgröße möglich, unter dem Mikroskop wenigstens zwei Sichtfelder bei zehnfacher
Vergrößerung ausgezählt wurden. Die Gesamtzahl der Makrophagen zu den jeweiligen
65
Zeitpunkten ergab sich aus der Summe der MAC 387-positiven Zellen aller Biopsieproben
eines Entnahmetages. Da die Biopsieproben entnahmebedingt unterschiedlich stark
komprimiert bzw. entfaltet waren, wurde als Bezugspunkt für den Umfang der
Makrophagenpopulation nicht die Schnittfläche sondern die Gesamtzellzahl des untersuchten
Bereichs gewählt. Die Gesamtzellzahl ergab sich aus der Summe der mit Hämalaun
blauviolett gefärbten Zellkerne. Luftführende Wege, Bindegewebssepten und größere Gefäße
wurden nicht in die Bestimmung von Makrophagenpopulation und Gesamtzellzahl
miteinbezogen.
Vorgehensweise
1. Entparaffinieren und Rehydrieren: Xylol: 3 x 5 min
Isopropanol: 5 min
Ethanol 96 %: 3 min
Ethanol 70 %: 3 min
Ethanol 50 %: 3 min
2. 30 min Hemmung der endogenen Peroxidase in 85 %igem Ethanol mit 0,5 % H2O2.
3. 3 x 5 min Spülen in PBS (siehe Anhang) unter ständigem Rühren
4. Antigendemaskierung: Ki-67: 6 x 5 min Demaskierung der Antigene in der
Mikrowelle (750 W) in kochendem Citratpuffer
(pH=6, 10mM), hergestellt aus Konzentrat
(ProTaqstura, Vertrieb über quartett GmbH,
Berlin) (siehe Anhang)
MAC 387: 20 min Demaskierung der Antigene in
Demaskierungslösung G (1:4 in Aqua dest.)
(Fa. Biologo, Wettenberg, Best.-Nr. DE007)
bei 95°C im Wasserbad
5. 3 x 5 min Spülen in PBS unter ständigem Rühren
6. Blockserum: Verbringen der Schnitte in Coverplates (Fa. Shandon, Frankfurt, Best.-Nr.
72110013) und Überschichten mit 1:5 in PBS verdünntem, inaktiviertem Ziegen-
Normalserum für 20 min bei Raumtemperatur zur Unterdrückung unspezifischer
Hintergundfärbungen
66
7. Erstantikörper: Ki-67: Zugabe von 150 µl Maus Ki-67 (MIB-1,
Fa. DAKO, Hamburg, Best.-Nr. M 7240)
monoklonalem Antikörper (1:100 in PBS mit
0,05 % Tween20 und 1 % BSA)
MAC 387: Zugabe von 150 µl Maus-anti- Myeloid /
Histiozyten-Antigen (Klon MAC 387, Fa.
DAKO, Hamburg, Best.-Nr. M0747) mono-
klonalem Antikörper(1:200 in PBS mit 0,05 %
Tween20 und 1 % BSA)
und Inkubation über Nacht bei 4°C
8. 3 x Spülen mit je 600 ml PBS bei Raumtemperatur
9. Zweitantikörper: Überschichten mit 150 µl des 1:200 in PBS verdünnten Sekundär-
antikörpers (biotinyliertes Ziege-anti-Maus Serum) für 30 min bei Raumtemperatur
10. 3 x Spülen mit je 600 ml PBS
11. Überschichten mit 1:250 in PBS verdünntem Avidin-Biotin-Komplex (Fa. Vector,
Burlingham, USA, Best.-Nr. PK6100) für 45 min
12. 3 x Spülen mit je 600 ml PBS
13. Enzymhistochemische Reaktion: Überführen der Schnitte in eine Küvette und fünf-
minütige Inkubation in 150 ml einer 0,05 %igen Diaminobenzidin-tetra-Hydrochlorid
(DAB) Lösung mit 0,03 % H2O2 unter ständigem Rühren. Mit Anti-Ki-67 markierte
Zellkerne färbten sich rotbraun
14. Spülen der Schnitte in PBS und verbringen in fließendes Leitungswasser für insgesamt
15 min
15. Nur MAC 387: Gegenfärbung in Hämalaun nach Meyer für 15 s und Bläuen für 5 min
unter fließendem Leitungswasser
16. Entwässerung: Ethanol 50 %: 3 min
Ethanol 70 %: 3 min
Ethanol 96 %: 3 min
Isopropanol: 5 min
Xylol: 3 x 5 min
17. Eindecken mit Corbitbalsam (Fa. Hecht, Kiel)
67
Kontrollen
Die Etablierung der Methoden zum Nachweis von Ki-67 und Myeloid / Histiozyten-Antigen
erfolgte an Paraffinschnitten von unverändertem, equinem Lungengewebe und equinen
Mandibularlymphknoten, die hinsichtlich Fixierungsmedium und –dauer dem zu
untersuchenden Gewebe entsprachen. Diese wurden auch als Positiv- und Negativkontrollen
bei jeder Reaktion mitgeführt, als Negativkontrollen dienten zusätzlich Originalproben aus
dem vorliegenden Tierversuch. Die Negativkontrollen wurden statt mit dem Primärantikörper
oder dem Sekundärantikörper mit balb / C-Mausaszites (Ki-67: 1:1000, MAC 387: 1:2000)
überschichtet. Zur Beurteilung eventueller unspezifischer Hintergrundreaktionen wurde das
Normalserum durch PBS ersetzt.
3.3.4 Bestimmung der Zelluntergangsrate im terminal dUTP nick-end labeling
(TUNEL) Assay
Zur Durchführung der TUNEL-Reaktion für die Bestimmung der Zelluntergangsrate wurde
das In Situ Apoptosis Detection Kit (ApopTag, Best.-Nr.: S7101) der Firma Appligene
Oncor (Heidelberg) verwendet. Das Prinzip der TUNEL-Reaktion basiert auf der
enzymatischen Markierung der freien 3 -́OH-Termini von Einzel- oder Doppelstrang-DNA-
Bruchstücken mit digoxigeninhaltigen Nukleotiden durch eine terminal deoxynucleotidyl
transferase (TdT). Diese Bruchstücke entstehen durch Fragmentierung der DNA in
apoptotischen Zellen und finden sich dort im Zellkern und in apoptotischen Körperchen. Die
so an die Bruchenden des DNA-Stranges ange lagerten Digoxigenin-dNTP-Oligomere dienten
als Bindungsstellen für einen peroxidasekonjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörper.
Fragmentierte DNA lässt sich außer in apoptotischen auch in nekrotischen Zellen nachweisen
(COLLINS et al., 1992). Die Antigen-Antikörper-Reaktion war somit durch Verwendung von
Diaminobenzidin-tetra-Hydrochlorid dargestellt werden. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe
des Bildanalyseprogramms analySIS 3.2 (Fa. Soft Imaging System GmbH, Münster), wobei
pro Biopsieprobe, soweit aufgrund der Schnittgröße möglich, unter dem Mikroskop
wenigstens zwei Sichtfelder bei zehnfacher Vergrößerung bearbeitet wurden. Da die
Biopsieproben entnahmebedingt unterschiedlich stark komprimiert bzw. entfaltet waren,
wurde als Bezugspunkt für die Zellproliferationsrate nicht die Schnittfläche sondern die
Gesamtzellzahl des untersuchten Bereichs gewählt. Die Anzahl nekrotischer und
68
apoptotischer Zellen zu den einzelnen Zeitpunkten ergab sich aus der Summe der
Einzelproben des jeweiligen Entnahmetages. Die Gesamtzellzahl ergab sich aus der Summe
der mit Hämalaun blauviolett gefärbten Zellkerne und der Anzahl TUNEL-positiver Zellen.
TUNEL-positive Zellen und mit Hämalaun gefärbte Kerne im Bereich von luftführenden
Wegen, Bindegewebssepten und größeren Gefäßen wurden von der Messung ausgeschlossen.
Vorgehensweise
1. Entparaffinieren und Rehydrieren: Xylol: 3 x 5 min
Isopropanol: 5 min
Ethanol 96 %: 3 min
Ethanol 70 %: 3 min
Ethanol 50 %: 3 min
2. Einmaliges Spülen der Schnitte in PBS (siehe Anhang) für 5 min unter ständigem Rühren.
3. Abtrocknen der Objektträger und Umranden der Schnitte mit einem Fettstift
4. Andauen des Gewebes mit Proteinase K-Gebrauchslösung (siehe Anhang) für 10 min bei
Raumtemperatur in einer feuchten Kammer
5. Umsetzen in eine Küvette und 4 x 2 min Spülen in PBS unter ständigem Rühren.
6. Hemmung der endogenen Peroxidasen mit 2 % H2O2 in PBS für 5 min unter ständigem
Rühren
7. 2 x 5 min Spülen der Schnitte in PBS unter ständigem Rühren
8. Auftragen von 75 µl Equilibrierungsspuffer pro Schnitt für 10 min
9. Equilibrierungspuffer abschütteln, Überführen der Präparate in eine vorgewärmte feuchte
Kammer und Auftragen von 54 µl Working Strength TdT Solution (siehe Anhang) pro
Schnitt und Abdecken mit CoverSlip-Folie. Inkubation für 60 min bei 37°C im
Brutschrank
10. Entfernen der CoverSlip-Folie und Überführen der Objektträger in vorgewärmten Stop-
Wash-Puffer (siehe Anhang). Inkubation für 30 min bei 37°C im Schüttelwasserbad.
11. 3 x 5 min Spülen in PBS unter ständigem Rühren
12. Auftragen von 55 µl Anti-Digoxigenin-Peroxidase pro Schnitt und Abdecken mit
CoverSlip-Folie; Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur
13. Umsetzen in eine Küvette und 4 x 2 min Spülen in PBS unter ständigem Rühren.
69
14. Enzymhistochemische Reaktion: Überführen der Schnitte in eine Küvette und
fünfminütige Inkubation in 150 ml einer 0,05 %igen Diaminobenzidin-tetra-Hydrochlorid
Lösung (DAB) mit 0,03 % H2O2 unter ständigem Rühren zur Darstellung der TUNEL-
Reaktion. TUNEL-positive Zellen färbten sich rotbraun
15. Kurzes Eintauchen der Schnitte in Aqua dest.
16. Gegenfärben in Hämalaun nach Meyer für 15 s und anschließendes Bläuen der Schnitte
für 5 min unter fließendem Leitungswasser
17. Entwässerung: Ethanol 50 %: 3 min
Ethanol 70 %: 3 min
Ethanol 96 %: 3 min
Isopropanol: 5 min
Xylol: 3 x 5 min
18. Eindecken mit Corbitbalsam (Fa. Hecht, Kiel)
Kontrollen
Zur Überprüfung der Spezifität der Reaktion wurden die vom Hersteller gelieferten
Positivkontrollen mitgeführt. Als Negativkontrollen dienten Originalproben aus dem
vorliegenden Tierversuch sowie Gewebeschnitte von unverändertem equinem Lungengewebe
und equiner Mandibularlymphknoten, die statt mit dem Digoxigenin-dNTP-haltigen
Reaktionspuffer oder Anti-Digoxigenin-Peroxidase mit PBS überschichtet wurden.
3.3.5 Bestimmung des Anteils kollagener und retikulärer Fasern an den
alveolären Septen
Zur Bestimmung des Anteils kollagener und retikulärer Fasern am Gesamtgewebe der
alveolären Septen wurden diese in der Heidenhainschen Azanfärbung dargestellt. Die Schnitte
wurden in einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert und rehydriert (3 min Ethanol
50 %, 3 min Ethanol 70 %, 3 min Ethanol 96 %, 5 min Isopropanol, 3 x 5 min Xylol) in Aqua
dest. gespült und anschließend in vorgewärmter Azokarminlösung (siehe Anhang) über 15
min im Brutschrank bei 60°C inkubiert. Nach dem Spülen in Aqua dest. gelangten die
Präparate bei Raumtemperatur für 3 min in alkalische Anilinlösung (siehe Anhang), für 1 min
in essigsauren Alkohol (siehe Anhang) und für 30 min in 5 %ige Phosphorwolframsäure.
70
Nach abermaligem Waschen in Aqua dest. erfolgte über 30 min die Inkubation in Anilinblau-
Orange-Essigsäure-Gebrauchslösung (siehe Anhang) und erneutes Spülen. Zur
Differenzierung wurden die Schnitte kurz in 96 %iges Ethanol getaucht und zum Entwässern
für 2 min in Propanol und danach in Essigsäure-n-Butylester gegeben. Abschließend erfolgte
das Eindecken mit Corbitbalsam. Kollagenes und retikuläres Bindegewebe stellten sich blau
dar, alle übrigen Strukturen färbten sich in Rot- und Orangetönen. Mit Hilfe des
Bildanalyseprogramms analySIS 3.2 (Fa. Soft Imaging Systems GmbH, Münster) erfolgte
durch Phasenanalyse die Bestimmung der Flächen der einzelnen Farbanteile. Pro
Biopsieprobe, soweit aufgrund der Schnittgröße möglich, wurden unter dem Mikroskop
wenigstens zwei Sichtfelder bei zehnfacher Vergrößerung untersucht. Da die Biopsieproben
entnahmebedingt unterschiedlich stark komprimiert bzw. entfaltet waren, wurde als
Bezugspunkt für den Kollagenanteil nicht die Gesamtschnittfläche, die auch die
Alveolarlumina beinhaltet, gewählt, sondern die Gesamtfläche ausschließlich der alveolären
Septen des untersuchten Bereichs. Die Gesamtfläche der alveolären Septen im Paraffinschnitt
ergab sich aus der Summe der rötlich und der blau gefärbten Strukturen. Der Anteil
kollagener und retikulärer Fasern ergab sich aus dem Anteil blau gefärbter Strukturen an der
Gesamtfläche der alveolären Septen. Luftführende Wege, Bindegewebssepten, größere
Gefäße und intraalveoläre Bestandteile wurden in die Phasenanalyse nicht mit einbezogen.
3.3.6 Licht- und transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen
Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte sowohl an mit HE gefärbten Paraffinschnitten
(siehe Anhang) des formalinfixierten Gewebes, als auch an mit Toluidinb lau gefärbten
Semidünnschnitten des in Glutaraldehyd fixierten Gewebes (siehe unten). Für die
elektronenmikroskopische Untersuchung wurden die mindestens für 24 Stunden in 5 %iger
Glutaraldehydlösung fixierten Teilproben der Lungenbiopsien in ca. 1 x 1 x 1 mm große
Stücke geschnitten, für 4 x 15 min in Cacodylatpuffer (siehe Anhang) gespült, in 1 %igem
Osmiumtetroxid nachfixiert, erneut mehrmals in Cacodylatpuffer gewaschen und
anschließend in einer aufsteigenden Alkoholreihe (30 %iges, 50 %iges, 70 %iges, 90 %iges
und absolutes unvergälltes Ethanol) dehydriert. Im nächsten Schritt gelangten die
Gewebeproben für 30 min in Propylenoxid als Intermedium und zur Infiltration für 30 min in
ein Gemisch aus Propylenoxid und Glycidether (Fa. Serva, Heidelberg, Best.-Nr. 21045) und
schließlich in reinen Glycidether. Danach erfolgte die Einbettung in Glycidether mit 1,5 %
71
DMP-30 (2, 4, 6-Dimethylaminomethylphenol) (Fa. Serva, Heidelberg, Best.-Nr. 36975) als
Akzelerator. Die vorbereiteten Proben wurden in flachen Silikonformen ausgegossen
(Flacheinbettung) und abschließend zur Polymerisation in einen programmierbaren
Wärmeschrank gegeben (24 h 35°C, 24 h 45°C, 4 Tage 60°C). Die Kunstharzblöcke wurden
mit Hilfe eines Pyramitoms (Fa. Reichert-Jung, Nußloch, Österreich) zugetrimmt und
zunächst zur Anfertigung von 0,5 µm dicken Semidünnschnitten an einem Ultramikrotom
Ultracut E (Fa. Reichert-Jung, Nussloch, Österreich) mit Glasmesser verwendet. Die
Semidünnschnitte dienten nach Färbung in 0,25 %igem Toluidinblau (1 min) sowohl der
lichtmikroskopischen Auswertung als auch der Vororientierung und Auswahl der Lokalisation
für die Elektronenmikroskopie. Von den ausgewählten Bereichen wurden mit Hilfe eines
Ultramikrotoms Ultracut E mit Diamantmesser (Fa. Diatome, Ag Biel, Schweiz) 70 nm dicke
Ultradünnschnitte hergestellt, diese auf Kupferobjektträgernetze (Science-Services, München)
verbracht und in einem Kontrastierautomaten Modell 2168 Ultrostainer Carlsberg System (Fa.
LKB, Bromma, Schweden) einer 2-Schritt-Kontrastierung unterzogen: im ersten Schritt
erfolgte für 30 min eine Inkubation in Ultrostain I (Uranylacetatlösung, Fa. Le ica, Benzheim,
Best.-Nr. 2168-200) mit anschließender Spülung in blasenfreiem Aqua bidest., im zweiten
Schritt wurden die Ultradünnschnitte für die Gegenkontrastierung für 80 s in Ultrostain II
(Bleicitratlösung, Fa. Leica, Benzheim, Best.-Nr. 2168-210) inkubiert und ebenfalls
abschließend in blasenfreiem Aqua bidest. gespült. Die elektronenmikroskopische
Untersuchung erfolgte an einem Transmissionselektronenmikroskop EM 10C der Firma Zeiss
(Oberkochen).
3.3.7 Molekularbiologische Präparationen
3.3.7.1 Allgemeine Maßnahmen
Um einen möglichst hohen Schutz vor DNA-Kontaminationen und dem Einfluss von RNasen
zu gewährleisten, wurden zur Durchführung der Präparationen die allgemein anerkannten
Maßnahmen molekularbiologischen Arbeitens im Labor beachtet:
- Tragen von Latex-Einmalhandschuhen (Fa. Jürgens, Hannover, Best.-Nr. 9405220),
die nach jedem Präparationsschritt gewechselt wurden
72
- Sämtliche verwendeten Gefäße, Materialien und Lösungen zur Extraktion von
Gesamt-RNA oder Durchführung von reverser Transkription und quantitativer
Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurden für 20 min bei 121°C und 2,5 bar
autoklaviert
- Zweifach destilliertes Wasser, sofern es sich nicht um vom Hersteller für die
entsprechenden Präparationen geliefertes Wasser handelte, für die Isolierung von
Gesamt-RNA, reverse Transkription und qPCR wurde mit Diethylpyrocarbonat
(DEPC) (Fa. Aldrich, Steinheim, Best.-Nr. 27238-8) nach der Methode von
EHRENBERG et al. (1974) behandelt (siehe Anhang)
- Um Produktkontaminationen vor und während der Durchführung der qPCR zu
vermeiden, wurden die RNA-Präparationen und das Ansetzen der Reagenzien für
reverse Transkription und qPCR in einem eigens dafür vorgesehenen, abgetrennten
Raum vorgenommen, in den keine DNA aus PCR-Produkten eingebracht wurde
- Bei der Präparation mit Mikroliterpipetten wurden sterile, RNase- und DNase-freie,
gestopfte Einmalpipettenspitzen (Fa. Biozym, Hameln, Best.-Nr. 691975 und 692151)
verwendet
- Bei allen PCR-Amplifikationen wurden in jeder Reaktionscharge zur Überprüfung auf
DNA-Kontaminationen entsprechende Negativkontrollen mitgeführt, bei denen das
Template durch das gleiche Volumen an DEPC-behandeltem Wasser ersetzt wurde
3.3.7.2. Isolierung von Gesamt-RNA aus tiefgefrorenem Lungengewebe
Die Isolierung von Gesamt-RNA aus den in flüssigem Stickstoff archivierten Teilproben
erfolgte mit Hilfe des RNeasy Mini Kits der Firma Qiagen (Hilden, Best.-Nr. 74104). Das
Prinzip der Isolierung beruht auf einer selektiven Ausfällung von RNA-Molekülen mit einer
Länge von mehr als ca. 200 Basen und der Bindung an eine Silikagelmembran bei definierten
Salzkonzentrationen. Kleinere Moleküle wie 5.8 S RNA, 5 S RNA und tRNA binden
aufgrund ihrer geringeren Größe von ca. 160, 120 bzw. 70-90 Nukleotiden nicht und werden
eluiert. Alle Arbeitsschritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Zu Beginn der
Extraktion mussten die Teilproben in 1,5 ml Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg, Best.-
Nr. 0030 125.150) nach Zugabe von 350 µl Lysispuffer RLT mit 1 % 2-Mercaptoethanol mit
einem Mikropistill (Fa. Eppendorf, Hamburg, Best.-Nr. 0030 120.973) zerkleinert werden.
Das im Puffer enthaltene Guanidin-Isothiocyanat und das zugesetzte 2-Mercaptoethanol
73
besitzen starke denaturierende Eigenschaften und dienen daher unter anderem der
Inaktivierung von RNasen. Im Anschluss wurde die Suspension in eine Qiashredder-Säule
(Fa. Qiagen, Hilden, Best.-Nr. 79654) überführt und in einer Zentrifuge bei 10.000 x g 5 min
lang durch die auftretenden Scherkräfte homogenisiert, das Homogenisat zur Verbesserung
der Bindungseigenschaften der RNA an die Säulenmembran mit 350 µl 70 %igem Ethanol
versetzt, auf eine RNeasy Mini-Säule verbracht, 15 s bei 10.000 x g zentrifugiert und diese
anschließend mit 350 µl Puffer RW1 (15 s, 10.000 x g) gewaschen. Grundsätzlich bindet
DNA bei anderen Salzkonzentrationen wie RNA an die Silikagelmembran, und wird mit dem
angewandten Verfahren bei Verwendung sehr kleiner Gewebeproben, wie sie hier vorlagen,
sehr effektiv entfernt. Dennoch erfolgte als weitere Maßnahme, um eine Amplifikation
genomischer DNA bei der quantitativen PCR zu vermeiden, auf der Säule für 15 min bei
Raumtemperatur ein DNase-Verdau (RNase-Free DNase-Set, Fa. Qiagen, Hilden, Best.-Nr.
79254). In den folgenden Schritten wurde, um Salze und Proteine von der Membran zu
entfernen, mit 350 µl Puffer RW1 (15 s, 10.000 x g) und zweimal mit 500 µl Puffer RPE (15
s, 10.000 x g, bzw. 2 min 10.000 x g) gewaschen. Die Pufferlösungen wurden vom Hersteller
mitgeliefert. Das jeweils anfallende Eluat wurde verworfen. Die nun noch an das Silikagel
gebundene RNA konnte durch Auftragen von 50 µl RNase-freiem Wasser gelöst und
abzentrifugiert (1 min, 10.000 x g) werden. Da in der nachfolgenden quantitativen PCR die
gemessene Kopienzahl der mRNA-Spezies gegen ein „Housekeeping-Gen“ normalisiert
wurde, war es möglich, adäquate Mengen aller Einzelproben eines Versuchstages zu einem
Pool zusammenzufassen. Die Lagerung der so gewonnen, in DEPC-behandeltem Wasser
gelösten RNA erfolgte bei -80°C.
3.3.7.3 Reverse Transkription
Zur Synthese der komplementären DNA (cDNA) wurde das Omniscript Reverse
Transcriptase-System der Firma Qiagen (Hilden, Best.-Nr. 205113) verwendet (Tabelle 5).
Bei dieser Reaktion wurden Random Hexamer-Primer (Fa. Promega, Madison, USA, Best.Nr.
C1181) verwendet, Hexanukleotide mit statistisch verteilter Basenzusammensetzung, die
entsprechend ihrer individuellen Sequenz an verschiedensten Stellen hybridisieren und damit
eine cDNA-Synthese über die gesamte Länge der mRNA ermöglichen. Die reverse
Transkription wurde durch das multifunktionale Enzym Omniscript Reverse Transcriptase
katalysiert, das Aktivitäten sowohl als RNA-abhängige DNA-Polymerase, Hybrid-abhängige
74
Exoribonuklease (RNase H) und DNA-abhängige DNA-Polymerase besitzt, von denen die
ersten beiden Wirkungen für die cDNA-Erststrangsynthese von Bedeutung sind. Während die
RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität zur Transkription der RNA-Vorlage in
komplementäre DNA dient, degradiert das Enzym durch seine Funktion als Exoribonuklease
RNA in RNA-DNA Hybriden, während freie RNA nicht beeinflußt wird, und verbessert
dadurch die Sensitivität der nachfolgenden quantitativen PCR. Reagenzien und Gesamt-RNA
wurden auf Eis aufgetaut, kurz auf einem Vortexer gemischt und zentrifugiert. Bei einem
Reaktionsvolumen von 20 µl für jede RNA-Sammelprobe wurden pro Ansatz folgende
Komponenten zu einem Mastermix zusammenpipetiert und gut gemischt:
Tabelle 5: Komponenten des Reaktionsansatzes für die reverse Transkription
Buffer RT (10x) * 2 µl
dNTP Mix (5 mM pro dNTP) * 2 µl
Random Hexamer-Primer (250 µg / ml) (Fa. Promega, Madison, USA,
Best.Nr. C1181)
1 µl
RNase-Out (10 U / µl) (Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Best.-Nr. 10777-019) 1 µl
Omniscript Reverse Transcriptase (4 U) * 1 µl
RNase-freies Wasser 6 µl
* vom Hersteller mitgeliefert
Pro Ansatz wurden 13 µl des Mastermix in ein 500 µl-Reaktionsgefäß gegeben und 7 µl in
DEPC-behandeltem Wasser gelöste Gesamt-RNA hinzugefügt. Die Reaktion erfolgte in
einem programmierbarem Thermocycler T3 (Fa. Biometra, Göttingen) bei 25°C für 10 min,
37°C für 60 min und zur Inaktivierung des Enzyms bei 93°C für 5 min. Das Produkt wurde
direkt in der qPCR eingesetzt oder bei -20°C gelagert.
3.3.7.4 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
Untersucht wurde die Genexpression der Cytokine TGFß und Interleukin-1ß sowie der
extrazellulären Matrixproteine Prokollagen a1(I) und a1(III). Als „Housekeeping-Gen“ diente
der Elongationsfaktor-1a (EF-1a), der sich durch eine extrem konstante Expressionsrate
auszeichnet (GRUBER u. LEVINE, 1997). Zu diesem Zweck wurde die bislang beim Pferd
noch nicht bekannte Sequenz von EF-1a ermittelt und GenBank (Genbank-Nr.: AY237113)
75
zur Verfügung gestellt. Die Quantifizierung der cDNA erfolgte in einem Fluoreszenzdetektor
mit integriertem Thermocycler und 96-Loch-Mikrotiterplatte Mx4000 Multiplex QPCR
System der Firma Stratagene (LaJolla, USA). In einer PCR-Reaktion wurden neben den
Sammelproben der Lungenbiopsien eines jeden Entnahmetages stets Negativkontrollen und
die Verdünnungsreihe eines entsprechenden DNA-Mengens tandards gemessen. Der
Mengenstandard wurde aus equiner mRNA mittel RT-PCR gewonnen, wobei die Primer für
deren Amplifikation in der PCR ein Fragment begrenzten, das das Fragment der Sonden-
Primer-Paare der quantitativen PCR sowohl in 5´-, als auch in 3 -́Richtung deutlich überragte.
Bei den Negativkontrollen handelte es sich um no template controls (NTCs), bei denen die
cDNA durch DEPC-behandeltes Wasser ersetzt wurde. Die Proben zur Bestimmung der
Expression der untersuchten Gene, des „Housekeeping-Gens“ und die Negativkontrollen
wurden in zwei identischen Messdurchgängen als Triplikate gemessen, die einzelnen
Standardverdünnungen als Duplikate. Diese Mehrfachmessungen dienten der Sicherung der
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Zur Etablierung der qPCR wurden verschiedene
Annealing-Temperaturen, MgCl2- und Sondenkonzentrationen an einer Standard-
verdünnungsreihe getestet, bis die für das verwendete Sonden-Primer-Paar besten
Bedingungen ermittelt waren. Die Auswahl der verwendeten Primer und Sonden erfolgte mit
Hilfe des Computerprogramms BeaconDesigner® 2.03 der Firma Premier Biosoft
International (Palo Alto, USA) (Tabelle 6). Die Primersynthese wurde von den Firmen
Invitrogen (Karlsruhe) und Applied Biosystems (Weiterstadt) durchgeführt, die Herstellung
der Oligonukleotidsonden (TaqMan-Sonden) von der Firma Applied Biosystems
(Weiterstadt). Bei allen Sonden wurde TAMRA als Quencherfarbstoff verwendet, als
Reporterfarbstoff dienten FAM bzw. VIC. Die Komponenten für einen Reaktionsansatz mit
einem Volumen von 25 µl stammten bis auf das DEPC-behandelte Wasser aus Brilliant Core
Reagent Kits der Firma Stratagene (LaJolla, USA, Best.-Nr. 600530) (Tabelle 7).
76
Tabelle 6: Nukleotidsequenzen und Schmelzpunkte verwendeter Primer und TaqMan-Sonden
untersuchte
mRNA-Spezies
(Genbanknummer)
Schmelzpunkt
(bei 100 mM
NaCl)
Sequenz (5´→3´) Reporter-
farbstoff
Produkt-
länge
Forward Primer
59,2°C TACTAGTGCTGACG
CCTGGC
Reverse Primer
59,1°C TTCCGCTTCACCAG
CTCCAT
Transforming
Growth Factor 1β
(AF175709)
TaqMan-Sonde
68,9°C CCGCCGGACTGTCC
ACCTGCAAGA
VIC-5´-…
79 bp
Forward Primer
59,3°C GGCTGCACTTCACT
GTTGTCTA
Reverse Primer
59,5°C CTGAGGATTGGCTC
TGGGAAAC
Interleukin 1ß
(U92481)
TaqMan-Sonde
68,2ºC CTGCTCCACCCGCC
TGCTGGG
FAM-5´-…
117 bp
Forward Primer
59,2°C CACAACAGGAAGTT
GCTGAAGGA
Reverse Primer
59,1°C CATATTATGTCATC
GCAGAGAACAGATC
Prokollagen a1(III)
(AF117954)
TaqMan-Sonde
68,4ºC TGCTCCCATCTTGGT
CAGTCCTATGCGG
FAM-5´-…
130 bp
Forward Primer
59,2°C GCTGGAATTCCGTG
CCTGG
Reverse Primer
58,4°C GCCTTGGAAACCTT
GGGGAC
Prokollagen a1(I)
(AF034691)
TaqMan-Sonde
68,9ºC TCCTTCTGGTCCTCG
TGGTCTCCCTGG
FAM-5´-…
144 bp
„Housekeeping Gen“
(Genbanknummer)
Schmelzpunkt
(bei 100 mM
NaCl)
Sequenz (5´→3´) Reporter-
farbstoff
Produkt-
länge
Forward Primer
60°C CAAAAACGACCCAC
CAATGG
Reverse Primer
62°C GGCCTGGATGGTTC
AGGATA
Elongationsfaktor-
1α
(AY237113)
TaqMan-Sonde
68,5°C AGCAGCTGGCTTCA
CTGCTCAGGTG
FAM-5´-…
98 bp
77
Tabelle 7: Konzentrationen und Volumina der einzelnen Komponenten eines Reaktions-
ansatzes
* vom Hersteller mitgeliefert
Die einzelnen Komponenten wurden entsprechend der Anzahl an Reaktionen auf Eis
zusammenpipettiert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt. Nach dem
Aliquotieren erfolgte die Zugabe von 1 µl gelöster cDNA, bzw. bei den Negativkontrollen
von 1 µl DEPC-behandeltem Wasser. Das Zeit-Temperatur-Profil der nachfolgenden
Zweistufen-PCR mit 40 Zyklen wurde entsprechend der zuvor durchgeführten
Etablierungsarbeiten der jeweiligen Sonde gewählt (Tabelle 8).
Komponenten Spezifität eingesetztes Volumen Endkonzentration
Core Reagent Buffer (10x)* 2,5 µl
dNTP (je 5mM)* 1 µl 200 µM
TGFß 2,78 µl 5 mM
IL-1ß 4,17 µl 7,5 mM
Proa1(III) 2,78 µl 5 mM
Pro1(I) 2,78 µl 5 mM
MgCl2 (50 mM)*
EF-1a 2,78 µl 5 mM
ForwardPrimer (7 pmol / µl) 1,25 µl 300 nM
Reverse Primer (7 pmol / µl) 1,25 µl 300 nM
TGFß 0,1 µl 200 nM
IL-1ß 0,05 µl 100 nM
Proa1(III) 0,1 µl 200 nM
Pro1(I) 0,1 µl 200 nM
TaqMan-Sonde
EF-1a 0,1 µl 200 nM
Referenzfarbstoff (ROX)* 0,38 µl 76 nM
Surestart TaqPolymerase
(5 U / µl)*
0,13 µl 0,0025 U / µl
DEPC-behandeltes Wasser ad 25 µl
78
Tabelle 8: Zeit-Temperatur-Profile der Zweistufen-PCR
TaqMan-Sonde Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing und
Extension
Transforming Growth
Factorβ
95°C / 10 min 95°C / 15 s 64°C / 1 min
Interleukin-1ß 95°C / 10 min 95°C / 15 s 61°C / 1 min
Prokollagen a1(III) 95°C / 10 min 95°C / 15 s 61°C / 1 min
Prokollagen a1(I) 95°C / 10 min 95°C / 15 s 61°C / 1 min
Elongationsfaktor-1α 95°C / 10 min 95°C / 15 s 64°C / 1 min
Aus dem Quotienten der Fluoreszenzsignale von Reporter- (FAM oder VIC) und passivem
Referenzfarbstoff (ROX) wurde automatisch ein normalisiertes Reportersignal (Rn-Wert)
berechnet. Die Rn(+)-Werte stellten das relative Reportersignal der zu messenden Proben und
die Rn(-)-Werte das der Leerkontrollen dar. Aus der Differenz des Rn(-)-Wertes
(Hintergrundfluoreszenz) und des Rn(+)-Wertes der ersten Zyklen ergab sich der ∆Rn-Wert
(dRn), der logarithmisch in einem Koordinatensystem an der Abszisse aufgetragen wurde, und
mit dessen Hilfe eine Amplifikationskurve erstellt wurde. Diese Amplifikationskurve
entspricht der graphischen Darstellung des zeitlichen Verlaufs der Zunahme an Produkt im
jeweiligen Reaktionsgefäß. Aus den Fluoreszenzdaten in einem schwankungsarmen Bereich
von mindestens 5 der ersten 12 Zyklen konnte eine Basislinie abgeleitet werden, die zur
Ermittlung eines Messgrenzwertes (sog. threshold) diente. Der threshold sollte dabei in einem
Bereich ≤ 0,015 dRn liegen. Der Thresholdcycle (CT), der die Grundlage für die Berechnung
der Ausgangskopienzahl bildete, stellte den Schnittpunkt des thresholds mit der
Amplifikationskurve dar. Zur Quantifizierung der zu messenden Proben wurde anhand der
mitgeführten definierten Verdünnungsreihe (DNA-Kopienstandard) automatisch eine
Standardkurve der logarithmierten CT-Werte erstellt. Durch Interpolation der CT-Werte der
Proben aus dem Tierversuch konnte so die der in der jeweiligen Probe vorhandene
ursprüngliche Kopienzahl ermittelt werden.
79
3.3.8 Klinischer Score
Als Grundlage für den Vergleich des Verlaufs der morphologisch und morphometrisch
erfassten Lungenveränderungen sowie der Genexpressionsdaten mit der klinischen
Symptomatik, wurde der von Frau Dr. Venner anhand der semiquantitativen Erfassung
klinischer Befunde erhobene Score herangezogen (Venner et al., 2003). Dieser klinische
Score wurde dabei nach dem ursprünglich zur Bewertung der Chronisch Obstruktiven
Bronchitis des Pferdes erstellten System von Ohnesorge et al. (1998) ermittelt, nach dem eine
Bewertung einzelner klinischer Parameter und Symptome mit Punkten erfolgt (Tabellen 9 +
10). Durch die Ermittlung der Gesamtpunktzahl wird eine vergleichende Beurteilung des
Krankheitsverlaufs verschiedener Pferde mit ähnlichen Lungenerkrankungen ermöglicht.
Tabelle 9: Übersicht über die Punkteverteilung bei der Untersuchung des Respirationstraktes
(Ohnesorge et al., 1998)
Merkmal Veränderung Punktzahl
Husten
(spontan / auslösbar)
Nein
Ja
0
1
Ruhedyspnoe
Nein
Verstärkte abdominale Atmung
Afteratmen / Dampfrinne
0
1
3
Auskultationsbefund Vesikulär / Vesikulär verstärkt
Rasseln / Giemen / Knistern
0
2
Perkussionsbefund
= 3 Finger erweitertes Lungenfeld
handbreit erweitertes Lungenfeld
> 2 handbreit erweitertes Lungenfeld
0
1
2
Tracheobronchoskopie
Septum scharfrandig
Septum deutlich verdickt
Sekretmenge / Viskosität =1
Sekretmenge / Viskosität = 1 - 2
Sekretmenge / Viskosität = 4
0
1
0
1
2
Zytologie des
Tracheobronchialsekrets
Makrophagen, neutrophile oder eosinophile
Granulozyten
= ++
= +++
0
1
Blutgasanalyse
(Alveolo-arterielle
Sauerstoffdifferenz (A-aDO2))
< 7 mm Hg
7 – 14 mm Hg
> 14 mm Hg
0
1
2
80
Tabelle 10: Scorepunktzahl in Abhängigkeit vom Grad der Erkrankung
3.4 Statistische Aus wertung
Die Angabe der Ergebnisse der morphometrischen Auswertung erfolgte in Form des
arithmetischen Mittels ( x ) der Werte der Biopsieproben eines Entnahmetages. Die
Ergebnisse der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion wurden als arithmetisches Mittel ( x )
der Kopienzahlen der gemessenen mRNA-Spezies pro Kopienzahl des Housekeeping-Gens
EF-1a aus sechs einzelnen Experimenten (je ein Triplikat in zwei identischen
Messdurchgängen) dargestellt. Dazu wurde die jeweilige einfache Standardabweichung
(s = ((n? x2-(? x)2 / n(n-1))½) bestimmt. Zwischen den einzelnen Messdurchgängen der
quantitativen PCR wurde der Variationskoeffizient berechnet (V = s / x (Ct)), der nach den
Empfehlungen von BUSTIN (2000) unter 5 % liegen sollte.
Score Grad der Erkrankung
0 - 1 gesund
2 - 3 geringgradig
4 - 5 mittelgradig
7 - 14 hochgradig
81
4 Ergebnisse
4.1 Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen
4.1.1 Befunde vor der Applikation von Perillaketon
Die Kontrollbiopsien der Lungen der acht untersuchten Pferde stellten sich licht- und elektro-
nenmikroskopisch gleichermaßen als ausgereiftes Lungengewebe und ohne erkennbare pa-
thologische Veränderungen dar (Abb. 2 + 14). Die Alveolarsepten waren luminal von dünnen
Alveolarepithe lzellen vom Typ I bedeckt, die einen geschlossenen Zellverband bildeten. In
den alveolären Nischen und sehr vereinzelt auch mittig an den Septen konnten Alveolarepi-
thelzellen vom Typ II angetroffen werden, zum Teil mit bereits lichtmikroskopisch gut er-
kennbaren, intrazytoplasmatischen Granula. Ganz vereinzelt fanden sich in den Lumina auch
Alveolarmakrophagen. Nicht nur im Bereich der größeren interlobulären Septen, sondern
auch auf Ebene der Alveolarwände waren kollagene Bindegewebsstrukturen zu erkennen, die
dem normalen Stützgerüst der Lunge zuzuordnen waren. Sie stellten sich dort als schmale,
meist nur auf einer Seite der Wand gelegene Stränge oder Platten dar mit einer teilweise sehr
typischen, lockenartig gewundenen Binnenstruktur. Soweit in den Schnitten Bronchioli vorla-
gen, wiesen diese einen Besatz aus ziliiertem Bronchialepithel und auch von Clarazellen auf.
Die überwiegenden Proben waren entnahmebedingt in unterschiedlichem Ausmaß kompri-
miert. Zudem fanden sich intraluminal in unterschiedlicher Anzahl freie Erythrozyten (Abb.
2) und ein abschnittsweise graduell variierendes, zumeist jedoch sehr gering ausgeprägtes
alveoläres Ödem als Folge des Entnahmetraumas. In einigen wenigen Lokalisationen konnten
vor allem in den Randbereichen der Bioptate Lipidtröpfchen und versprengtes quergestreiftes
Muskelgewebe nachgewiesen werden, die eine Kontamination der Probe mit Material aus
Unterhautfettgewebe und Interkostalmuskulatur als Folge der transkutanen Entnahmetechnik
zu interpretieren waren. Elektronenmikroskopisch stellte sich die Blut-Luft-Schranke als
schmale Barriere mit einer Dicke von etwa 0,15 – 0,5 µm dar, bestehend aus Alveolarepithe l-
zellen vom Typ I, den beiden zum Teil verschmolzenen epi- und endothelialen Basalmembra-
nen sowie dem Kapillarendothel (Abb. 15). In der Regel war sie nur an einer Seite des Al-
veolarseptums abschnittsweise durch eine dünne Platte aus reifen Kollagenfibrillen zwischen
Epi- und Endothel verstärkt (Abb. 16). Die kubischen, rundkernigen Alveolarepithelzellen
82
vom Typ II waren charakterisiert durch eine mäßige Zahl relativ großer Lamellarkörperchen,
die einen Großteil des Zytoplasmas einnahmen, und einen apikalen, lückenlosen Besatz mit
Mikrovilli. Alveolarepithelzellen vom Typ I hingegen zeigten neben einem abgeflachten Kern
ein sehr schmales und sehr organellenarmes Zytoplasma. Das Kapillarendothel besaß eben-
falls einen abgeflachten Kern und ein dünn ausgezogenes Zytoplasma. Benachbarte Zellen
bildeten einen lückenlosen Verbund. Auffälligstes Merkmal waren die zahlreichen, ubiquitär
vertretenen und überwiegend membrannah gelegenen Pinozytosevesikel. In einigen Bereichen
konnten eine Schwellung von Endothelzellen und eine ziehharmonikaartige Faltung der Sep-
ten beobachtet werden, die höchstwahrscheinlich auf das Entnahmetrauma zurückzuführen
waren.
4.1.2. Biopsieproben nach der Applikation von Perillaketon
Pferd 1 und Pferd 2 aus dem Vorversuch zeigten nach einer einmaligen, intravenösen Appli-
kation von 5 mg Perillaketon / kg KG nur gering ausgeprägte histomorphologische Verände-
rungen. Daher wurde die verabreichte Menge im Hauptversuch auf 6 mg / kg KG erhöht, wo-
durch eine stärkere Reaktion ausgelöst werden konnte. Somit lagen bei der Auswertung der
Proben eine niedrige und eine höhere Dosisgruppe vor. Bei den Versuchstieren 3, 4, 5, 6, 7
und 8 des Hauptversuchs waren durchweg gleichartige und sehr ausgeprägte Veränderungen
mit nahezu identischer Chronologie zu beobachten, die sich in drei verschiedene Phasen ein-
teilen ließen. Grundsätzlich konnten am selben Entnahmetag an den verschiedenen Biopsielo-
kalisationen der einzelnen Pferde gleiche Befunde erhoben werden. Die Zahl der untersuchten
Biopsien pro Tag und Pferd war damit ausreichend und eine gemeinsame Untersuchung der
Proben eines Entnahmetages mit den molekularbiologischen Methoden gerechtfertigt.
Phase 1 (Tag 1 - 4 post applicationem):
Die Tiere der niedrigeren Dosisgruppe wiesen während dieses Zeitraums im Vergleich zu den
Kontrollproben keine Veränderungen auf.
Am ersten Tag unmittelbar nach der Applikation von Perillaketon ließen sich bei den Pferden
der höheren Dosisgruppe nur geringfügige lichtmikroskopisch erkennbare Veränderungen
gegenüber den Kontrollproben nachweisen. Neben einer leichten Zunahme an Makrophagen
und bei den Pferden 3 und 5 auch an neutrophilen Granulozyten sowie proliferierenden AII-
Zellen fand sich in wenigen Lokalisationen geringgradig fibrinreiches Exsudat (Abb. 19 +
83
20). Elektronenmikroskopisch zeigten AI-Zellen bei allen Tieren - besonders ausgeprägt je-
doch bei Pferd 3 und Pferd 5 - über weite Strecken eine zum Teil erhebliche Vakuolisierung
des Zytoplasmas (Abb. 18). Vereinzelte Kerne befanden sich im Frühstadium der Pyknose mit
Wandhyperchromasie, tiefen Invaginationen der Kernmembran und zeigten mitunter einem
prominenten Nukleolus. Zahlreiche Endothelzellen wiesen eine deutliche Schwellung auf
(Abb. 17). Gleichzeitig fanden sich aber auch in geschwollenen Endothelzellen und auch von
solchen mit unveränderter Dicke zahlreiche sehr gut umschriebene Abschnitte, die von außer-
ordentlich abgeflachten Endothel-zellausläufern bedeckt waren. Erst bei starker Vergrößerung
(50.000x) konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass die endotheliale Basalmembran in
diesen Bereichen nicht entblößt war (Abb. 20 + 21). Zu allen Zeitpunkten des Versuchs waren
in den untersuchten Bereichen die Verbindungen zwischen benachbarten Endothelzellen in-
takt. Die lichtmikroskopisch festgestellten vermehrten Makrophagen und neutrophilen Gra-
nulozyten waren vor allem intrakapillär und interstitiell lokalisiert. Weiterhin konnten im In-
terstitium multifokal durch Ödemflüssigkeit auseinander gedrängte Kollagenfaserbündel be-
obachtet werden (Abb. 24) und es fanden sich vereinzelt Mastzellen (Abb. 23). Lichtmikro-
skopisch ließ sich vom 3. – 4. Tag bei den Tieren der höheren Dosisgruppe im Vergleich zu
den Kontrollproben ein abschnittsweise variierendes, geringgradig stärker ausgeprägtes al-
veoläres Ödem feststellen. Es fanden sich auch geringgradig vermehrt alveoläre-, interstitielle
und intrakapilläre Makrophagen und in mehreren Lokalisationen in den Alveolarlumina ge-
ringgradig fibrinreiches Exsudat. Als Reaktion auf den Verlust von AI-Zellen war multifokal
eine gering- bis mittelgradige Proliferation von Alveolarepithelzellen vom Typ II zu beob-
achten. Die alveolären Septen wiesen abschnittsweise eine geringfügige Ödematisierung auf
und die Kapillaren waren mäßig gestaut, wodurch es in einigen Bereichen zu einer geringen
Verbreiterung der Alveolarwände kam. Im Interstitium waren geringgradig vermehrt
Mastzellen zu beobachten. Elektronenmikroskopisch lagen weiterhin über große Strecken AI-
Zellen mit ausgeprägter Vakuolisierung des Zytoplasmas vor und darüber hinaus zahlreiche
Lokalisationen mit entblößter Basalmembran nach Desquamation von AI-Zellen (Abb. 22).
Als Folge dieser Defekte zeigte sich multifokal eine Proliferation von AII-Zellen. Diese wie-
sen teilweise ein sehr prominentes und mitunter dilatiertes, glattes endoplasmatisches Reti-
kulum auf, und es fanden sich im Rahmen ihrer Differenzierung in AI-Zellen verschiedene
Übergangsformen mit einer Abnahme bis hin zum völligen Verschwinden von Lamellarkör-
perchen und einer unterschiedlich starken Abflachung des Zytoplasmas. Der Mikrovillibesatz
der Zellmembran war auch bei sehr weit differenzierten Zellen noch vorhanden. Mitunter fan-
den sich von ihrer Form her noch kubische AII-Zellen, die jedoch mit langen, sehr schmalen
84
und mit Mikrovilli besetzten Ausläufern die angrenzende Basalmembran bedeckten. In eini-
gen Bereichen zeigten ihre Zellkerne einen sehr prominenten Nukleolus, der zusammen mit
dem ausgeprägten glatten ER auf eine verstärkte Stoffwechselleistung hinwies. An mehreren
Lokalisationen konnten teilweise an der Basalmembran gelegene und teilweise frei im Al-
veolarlumen befindliche große, kubische und organellenarme Zellen beobachtet werden, mit
geringen Mengen an überwiegend rauem ER, einzelnen Mitochondrien und einem gering aus-
geprägten Golgiapparat. Sie enthielten auch wenige, sehr kleine Lamellarkörperchen, wiesen
zum Teil einen geringen, lückenhaften Mikrovillibesatz auf und konnten somit als AII-Zellen
interpretiert werden (Abb. 25), sofern sie keinen Kontakt mehr zur Basalmembran besaßen,
im Zustand nach Desquamation. In den Alveolarlumina lagen auch Makrophagen und Zellde-
tritus vor. Vereinzelt fanden sich in intrakapillär gelegenen Makrophagen phagozytierte La-
mellarkörperchen, was die Vermutung nahe legte, dass es sich dabei um ursprüngliche Al-
veolarmakrophagen handelte, die nach der Ingestion untergegangener AII-Zellen oder von
intakt ausgeschleusten Lamellarkörperchen wieder über das Interstitium in die Kapillaren
ausgewandert waren. Im Interstitium konnten neben Makrophagen und neutrophilen Granulo-
zyten auch Mastzellen festgestellt werden sowie durch Ödemflüssigkeit auseinander ge-
drängte Kollagenfaserbündel. Das Endothel wies ebenso wie am ersten Tag sowohl Schwel-
lungen als auch Bereiche auf, die nur durch sehr schmale Zytopla smaausläufer bedeckt wur-
den. Darüber hinaus ließen sich einzelne Endothelzellen mit hoher Elektronendichte als Aus-
druck degenerativer Veränderungen beobachten. Nach den licht- und elektronenmikroskopi-
schen Befunden entsprach dieses erste Versuchstadium mit Nachweis eines akuten Alveolar-
schadens der exsudativen Phase der interstitiellen Pneumonie. Zwar waren keine hyalinen
Membranen wie in ausgeprägten klassischen Fällen von interstitiellen Pneumonien feststell-
bar, jedoch fanden sich multifokal geringgradige Exsudatmengen. Es konnte kein exakter
Zeitpunkt des Wechsels der exsudativen zur proliferativen Phase festgelegt werden, da sich
hier sowohl Exsudat als auch Schäden der Alveolarwand gleichzeitig zusammen mit einer
Proliferation von AII-Zellen beobachten ließen, die den Beginn der zweiten Phase der
interstitiellen Pneumonie darstellt. Es kann also ein fließender Übergang zwischen exsudati-
ver und proliferativer Phase angenommen werden.
Phase 2 (Tag 4 - 11 post applicationem):
Bei den Versuchstieren der niedrigeren Dosisgruppe (5 mg / kg KG) konnten in diesem Zeit-
raum lichtmikroskopisch und durch immunhistochemische Markierung von Ki-67 bzw. MAC
85
387 lediglich eine geringgradig verstärkte AII-Zellproliferation und bei Pferd 2 eine gering-
gradige Zunahme an Makrophagen festgestellt werden.
In dieser Phase ließen sich an den Tieren der höheren Dosisgruppe die stärksten Veränderun-
gen beobachten, die am 8. bis 11. Tag post applicationem ihr Maximum erreichten und bei
den Pferden 3 und 5 im Vergleich zu den Pferden 4, 6, 7, und 8 noch ausgeprägter waren.
Aufgrund der hochgradigen klinischen Erscheinungen mussten Pferd 5 am 9. und Pferd 3 am
11. Versuchstag euthanasiert werden. Es zeigte sich ein im Vergleich zu den Kontrollproben
mittelgradiges alveoläres Ödem und eine mittelgradige Zunahme von Makrophagen (Abb.
13), die - wie in der immunhistochemischen Darstellung mit MAC 387 erkennbar - sowohl in
den alveolären Septen lokalisiert waren und ebenso als Alveolarmakrophagen auftraten. Die
Anzahl an großen, rundkernigen und organellenarmen Zellen mit wenigen, kleinen Lamellar-
körperchen, die elektronenmikroskopisch als AII-Zellen zum Teil nach Desquamation inter-
pretiert wurden, stieg drastisch an. In einzelnen Lokalisationen füllten sie zusammen mit
Alveolarmakrophagen die alveolären Lumina vollständig aus, wobei dieser Eindruck jedoch
durch die entnahmebedingte Kompression des Gewebes verstärkt wurde. Als Reaktion auf
den Epitheldefekt zeigte sich eine disseminierte, abschnittsweise variierende mittel- bis hoch-
gradige Proliferation von AII-Zellen, die zusammen mit der Einlagerung von Ödemflüssigkeit
zu einer erheblichen Verbreiterung der Blut-Luft-Schranke führte (Abb. 3). In diesem Stadi-
um lag vor allem bei den euthanasierten Pferden 3 und 5 unmittelbar ante mortem ubiquitär
eine nahezu vollständige Auskleidung der Alveolen mit AII-Zellen vor, die dem Lungenge-
webe ein adenoides Erscheinungsbild verliehen. Am Höhepunkt der Veränderungen fanden
sich bei den Tieren der höheren Dosisgruppe, am stärksten ausgeprägt bei Pferd 3 und Pferd
5, multifokal-herdförmige intraalveoläre Ansammlungen von neutrophilen Granulozyten
(Abb. 4) und eine deutliche Leukozytostase. Ausschließlich in dieser Phase konnte neben gra-
nulohistiozytären Infiltraten lichtmikroskopisch auch eine geringgradige Zunahme von Lym-
phozyten beobachtet werden. Bei der immunhistochemischen Markierung von Ki-67 ließen
sich nicht nur an der luminalen Seite der Septen proliferierende Zellen feststellen, die mitun-
ter die gesamte Alveole auskleideten, sondern auch plumpkernige, im Interstitium gelegene
Zellen. Vereinzelt lagen auch im Alveolarlumen Ki-67-positive Zellen vor (Abb. 9). Elektro-
nenmikroskopisch fanden sich bei den Tieren der höheren Dosisgruppe in diesem Versuchs-
stadium die größte Anzahl an AII-Zellen und Übergangsformen. Bei den angetroffenen AI-
Zellen war die Vakuolisierung im Vergleich zu Phase 1 erkennbar geringer ausgeprägt. Es
zeigten sich eine Ödematisierung und eine Infiltration des Interstitiums mit Makrophagen und
neutrophilen Granulozyten, die auch in den Alveolarlumina anzutreffen waren. Ebenso ließen
86
sich interstitielle Mastzellen beobachten. Die Schwellung des Endothels war, wenn auch ge-
ringer ausgeprägt, noch vorhanden und es konnten einzelne, sehr elektronendichte
Endothelzellen festgestellt werden. Hochgradig abgeflachte Endothelzellausläufer fanden sich
in den untersuchten Bereichen jedoch nicht mehr. Mitunter waren im Interstitium Fibroblasten
mit hochgradig dilatiertem endoplasmatischem Retikulum anzutreffen. Nach den licht- und
elektronenmikroskopischen Befunden entsprach dieses zweite Versuchsstadium mit dem
Nachweis einer ausgeprägten Proliferation nicht nur epithelialer sondern auch interstitieller
Zellen und einer deutlichen Infiltration mit Entzündungszellen der proliferativen Phase der
interstitiellen Pneumonie.
Phase 3 (Tag 11 – 18 post applicationem)
In der letzten Phase zeigte sich eine Regression der Veränderungen. Bei der lichtmikroskopi-
schen Betrachtung erfolgte ein Rückgang der entzündlichen zellulären Infiltrate, des alveolä-
ren und interstitiellen Ödems sowie auch der Proliferation von AII-Zellen. Damit in Überein-
stimmung standen die Ergebnisse der immunhistochemischen Markierung granulohis tiozytä-
rer Zellen und proliferierender Zellen. Während jedoch eine Abnahme MAC 387-positiver
Zellen auf das Ausgangsniveau zu erkennen war, blieb die Anzahl Ki-67 positiver Zellen
noch bis zum Ende des Beobachtungszeitraums erhöht. In der Spezialfärbung für kollagene
und retikuläre Fasern nach Heidenhain konnte im Vergleich mit der Ausgangssituation kein
vermehrtes Bindegewebe beobachtet werden. Bei den Pferden 1, 2 und 4 waren ab dem 15.
Tag und bei den Pferden 6, 7 und 8 ab dem 18. Tag post applicationem gegenüber den Kon-
trollen keine abweichenden Befunde mehr zu erheben. Dieses letzte Versuchsstadium ent-
sprach aufgrund der morphologischen Befunde mit Ausnahme der euthanasierten Tiere 3 und
5 der Phase der Ausheilung der interstitiellen Pneumonie. Bei den Pferden 1, 2, 4, 6, 7 und 8
wurden weiterhin bis insgesamt acht Wochen nach Versuchsbeginn Biopsieproben entnom-
men und pathohistologisch untersucht. Es konnten keine Hinweise auf fibrotische Verände-
rungen angetroffen werden. Nach Ende dieser acht Wochen wurden die Tiere mit Ausnahme
der Pferde 3 und 5 euthanasiert und die Lungen explantiert. Während je eine Lunge eines
Versuchstieres an der Klinik für Pferde für computertomographische Untersuchungen ve r-
wendet wurde, erfolgte eine umfassende pathohistologische Untersuchung an der verbliebe-
nen Lunge. Hier konnten in acht definierten Lokalisationen (Kraniallappen, craniale, caudale,
mediale, laterale, dorsale, ventrale und zentrale Abschnitte des Hauptlappens) an mit HE-
gefärbten Paraffinschnitten keine Hinweise auf fibrotische Veränderungen gefunden werden.
87
Abb. 2 (Pferd 3, Kontrolle): Normal strukturierte Lunge: Alveolarlumen (AL), alveoläre Septen ( ), entnahmebedingte, extravasale Erythrozyten ( * ) und Kompression von Alveolen ( + )(HE, 350x)
AL
AL *
*
Abb. 3 (Pferd 3, Tag 8, proliferative Phase): Massive Verbreiterung der alveolären Septen durch hochgradige, disseminierte Proliferation von Alveo-larepithelzellen vom Typ II ( ) und ein interstitielles Ödem ( + ); gemischtzellige, alveoläre und interstitielle Infiltrate ( * ) (HE, 350x)
*
*
+
+
* +
* *
+
+
88
Abb. 4 (Pferd 5, Tag 8, proliferative Phase): Herdförmige, intraalveoläre Infiltration mit polymorphkernigen, neutrophilen Granulozyten und Alveo-larmakrophagen ( ), alveoläres Ödem ( * ) (Semidünnschnitt, Toludin-blau, 350x)
*
Abb. 5 (Pferd 8, Kontrolle): In der Heidenhainschen Azanfärbung blau dargestellte kollagene und retikuläre Fasern vor Versuchsbeginn als Teil des normalen Stützgerüstes der Lunge ( ) (Azan, 350x)
*
89
Abb. 6 (Pferd 8, Tag 29): In der Heidenhainschen Azanfärbung blau darge-stellte kollagene und retikuläre Fasern 11 Tage nach Ende der Ausheilungs-phase als Teil des normalen Stützgerüstes der Lunge ( ) (Azan, 350x)
Abb. 7 (Pferd 8, Kontrolle): Expression von Ki-67: Proliferierende Zellen im unveränderten Lungengewebe vor der Applikation von Perillaketon (MIB-1, Gegenfärbung mit Hämalaun, 175x)
90
Abb. 8 (Pferd 8, Tag 8, proliferative Phase): Expression von Ki-67: Hochgradige Zunahme proliferierender Zellen in der proliferativen Phase ( ) (MIB-1, Gegenfärbung mit Hämalaun, 175x)
Abb. 9 (Pferd 8, Tag 8, proliferative Phase): Expression von Ki-67: Ki-67-positive Zellen säumen nicht nur die Alveolen, sondern finden sich auch im Interstitium ( * ) und frei im Alveolarlumen ( ); massive Verbreiterung der alveolären Septen ( ) (MIB-1, Gegenfärbung mit Hämalaun, 570x)
*
91
Abb. 10 (Pferd 5, Kontrolle): Vereinzelte Zelluntergänge im Rahmen der physiologischen Zellmauser der Lunge ( ) (TUNEL, Gegenfärbung mit Hämalaun, 350x)
Abb. 11 (Pferd 5, Tag 4, exsudative Phase): Vermehrte Zelluntergänge bei Pferd 5 unmittelbar ante mortem ( ); die Kompression der Alveolarlumi-na ist entnahmebedingt (TUNEL, Gegenfärbung mit Hämalaun, 350x)
92
Abb. 12 (Pferd 7, Kontrolle): Expression des Myeloid / Histiozyten-Antigens: Überwiegend im Bereich der Septen lokalisierte DAB-positive Zellen mit der Morphologie von Makrophagen ( ) (MAC 387, Gegenfärbung mit Hämalaun, 175x)
Abb. 13 (Pferd 7, Tag 8, proliferative Phase): Expression des Myeloid / Histiozyten-Antigens: Zunahme von intraalveolären ( ) und interstitiellen ( ), granulohistiozytären Infiltraten (MAC 387, Gegenfärbung mit Hämalaun, A: 175x, B: 350x)
A B
93
Abb. 14 (Pferd 1, Kontrolle): Übersicht über die normale Ultrastruktur der Lunge: Alveolarlumen (AL), Alveolarepithelzellen vom Typ I ( ), Kapillar-endothel ( ), Kapillarlumen (KL), Erythrozyten (E) (TEM, 1.600x)
AL
KL
E
E
Abb. 15 (Pferd 1, Kontrolle): Normalstruktur der Blut-Luft-Schranke: intra-alveoläre Ödemflüssigkeit ( * )Alveolarlumen (AL), Alveolarepithelzelle vom Typ I (AI), Basalmembran (BM), Endothelzelle (EZ), Endothelzell-verbindung ( ), Kapillarlumen (KL), Erythrozyt (E) (TEM, 20.000x)
AL
AI
BM
EZ
E
KL
KL
AL
*
94
Abb. 16 (Pferd 1, Kontrolle): Normales Stützgerüst der Lunge im Bereich der alveolären Septen: Alveolarepithelzelle vom Typ I (AI); kollagene Fasern (KF), Endothelzelle (EZ), Erythrozyt (E) (TEM, 20.000x)
Abb. 17 (Pferd 2, Tag 1, exsudative Phase): Ausgeprägte Schwellung des Kapillarendothels: Alveolarepithelzelle vom Typ I ( ), Endothelzelle (EZ), geschlossene Endothelzellverbindungen ( ), Kapillarlumen (KL) (TEM, 5.000x)
EZ
E EZ
KF
AI
KL
95
Abb. 18 (Pferd 7, Tag 1, exsudative Phase): degenerierende Alveolar-epithelzelle vom Typ I (AI) mit hochgradig vakuolisiertem Zytoplasma ( ); Alveolarlumen (AL); kollagene Fasern (KF); Mastzelle (MZ) (TEM, 6.300x)
AI
AL
KF
Abb. 19 (Pferd 5, Tag 1, exsudative Phase): frei im Alveolarlumen gelegenes Fibrin ( ); Alveolarepithelzelle Typ I (AI); Endothelzelle (EZ) (TEM, 6.300x)
AI
EZ
MZ
96
Abb. 20 (Pferd 5, Tag 1, exsudative Phase): Abschnitte im Endothelzell-verband, die nur durch außerordentlich dünne Zytoplasmaausläufer über-brückt werden ( ); ödematisierte Endothelzelle (EZ); intraalveoläre Ödem-flüssigkeit mit Fibrin ( * ); Alveolarepithelzelle Typ I (AI) (TEM, 8.000x)
*
AI EZ
Abb. 21 (Pferd 5, Tag 1, exsudative Phase): Ausschnittsvergrößerung von Abb. 20: stark abgeflachter Endothelzellausläufer ( ); Kapillarlumen (KL); Basalmembran (BM); Alveolarepithelzelle vom Typ I (AI) (TEM, 50.000)
KL
BM
AI
*
97
Abb. 22 (Pferd 5, Tag 4, exsudative Phase): entblößte Basalmembran nach Desquamation von Alveolarepithelzellen Typ I ( ); Alveolarlumen (AL); Erythrozyt (E), Endothelzelle (EZ); Kapillarlumen (KL) (TEM, A: 6.300x, B: 25.000x)
A
AL AL EZ
EZ
KL
KL
B
E
Abb. 23 (Pferd 7, Tag 4, exsudative Phase): Entzündliche, zelluläre, interstitielle Infiltrate: Mastzelle (MZ), polymorphkerniger neutrophiler Granulozyt (PMN); durch Ödemflüssigkeit auseinander gedrängte kollagene Fasern (KF) (TEM, 6.300x)
MZ
PMN
KF
98
Abb. 24 (Pferd 4, Tag 4, exsudative Phase): proliferierende Alveolarepithel-zellen vom Typ II ( ) mit intrazytoplasmatischen Lamellarkörperchen (LK); durch interstitielle Ödemflüssigkeit auseinander gedrängte kollagene Fasern (KF); Alveolarlumen (AL); Fibroblast mit dilatiertem, endoplasmatischem Retikulum ( * ) (TEM, 6.300x)
KF LK AL
LK
Abb. 25 (Pferd 3, Tag 8): Proliferation von Alveolarepithelzellen vom Typ II (AII): im Rahmen der Differenzierung zu Alveolarepithelzellen vom Typ I lassen sich nur noch sehr kleine zytoplasmatische Lamellarkörperchen nachweisen ( ); Nukleolus (N) (TEM, 2.500x)
AII
AII
N
*
99
4.2 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen
Für die exakte Erfassung der in den licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen
erhobenen Befunde und um eine Grundlage für den Vergleich des Verlaufs der
Lungenveränderungen mit den durch qPCR ermittelten Genexpressionsdaten zu schaffen,
erfolgte eine morphometrische Quantifizierung von verschiedenen Parametern für
regenerative, degenerative, entzündliche und reparative Prozesse. Hierfür wurden die
Zellproliferationsrate durch immunhistochemische Markierung von Ki-67, die
Zelluntergangsrate im TUNEL-Assay und der Umfang infiltrierender Granulozyten und
Makrophagen als Maß für die ablaufende entzündliche Reaktion durch immunhistochemische
Markierung des Myeloid / Histiozyten-Antigens bestimmt. Die Infiltration mit Lymphozyten
wurde rein lichtmikroskopisch beurteilt. Zudem diente die phasenanalytische Bestimmung des
Gehalts an kollagenen und retikulären Fasern anhand der Heidenhainschen Azanfärbung auf
Ebene der alveolären Septen der Beurteilung möglicher fibrotischer oder auch erosiver
Prozesse.
4.2.1 Zellproliferationsrate
Um das Ausmaß ablaufender regenerativer und reparativer Vorgänge beurteilen zu können,
wurden proliferierende Zellen durch die immunhistochemische Markierung von Ki-67
dargestellt. Durch die Bestimmung ihres Anteils an der Gesamtzellzahl zu den jeweiligen
Zeitpunkten der Biopsieprobenentnahme konnte die Proliferationsrate ermittelt werden. Im
Vergleich der Immunhistochemie mit den licht- und elektronenmikroskopischen
Untersuchungen hatte sich gezeigt, dass es sich bei den Ki-67-positiven Zellen weitaus
überwiegend um Alveolar-epithelzellen vom Typ II handelte, jedoch fanden sich auch im
Interstitium gelegene, plumpkernige, proliferierende Zellen mit fibroblastenähnlicher
Morphologie.
Bei den Tieren der niedrigeren Dosisgruppe (Pferde 1 + 2) zeigte sich im Durchschnitt ab
Tag 1 ein Anstieg des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl von 1,1 % (± 0,4)
in den Kontrollen um den Faktor 3,8 bis auf 4,2 % (± 0,9) am 7. Versuchstag. Zwar fanden
sich bei den licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen keine Hinweise auf das
Vorliegen von Alveolarschäden, dennoch spricht die Zunahme für den Ablauf regenerativer
Prozesse. Nach Erreichen des Maximalwertes erfolgte eine Regression bis zu Tag 14 und im
100
Weiteren sogar eine Überkompensation mit einem Absinken der Zellproliferationsrate auf
unter 50 % des Ausgangswertes (Abb. 26, Anhänge Tabelle 11).
Bei den Tieren der höheren Dosisgruppe (Pferde 3, 4, 5, 6, 7 und 8) zeigte sich in der
exsudativen Phase bereits unmittelbar nach der Applikation von Perillaketon eine
durchschnittliche Zunahme des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl von 4,5
% (± 3,9) auf 10,9 % (± 8,4) an Tag 1 und 8,7 % (± 4,3) an Tag 4. Danach konnte ein
sprunghafter Anstieg beobachtet werden, der am 8. Tag mit 25,6 % (± 7,5) seinen Höchstwert
erreichte und als wesentliches Kennzeichen des Übergangs von der exsudativen zur
proliferativen Phase aufgefasst wurde. Im anschließenden Ausheilungsstadium zeigte sich
eine kontinuierliche Abnahme bis zu Tag 18, jedoch blieb die Zellproliferationsrate auch nach
einer Versuchsdauer von 22 Tagen mit durchschnittlich 9,6 % (± 4,0) um 215 % signifikant
erhöht. Grundsätzlich sank die Zellproliferationsrate bis Ende des Beobachtungszeitraums bei
keinem Pferd der höheren Dosisgruppe zurück auf die Ausgangswerte (Abb. 27, Anhänge
Tabellen 11 + 12). Die an Tag 29 gemessene durchschnittliche Zellproliferationsrate von 10,0
% (± 5,2) war noch immer etwa doppelt so hoch wie die der Kontrollen. Es ist also davon
auszugehen, dass noch längere Zeit nach dem Ausheilungsstadium regenerative und / oder
reparative Prozesse abliefen, die durch rein lichtmikroskopische Betrachtung nicht erfasst
werden konnten.
Auffällig war auch eine vorübergehende Abnahme der Zellproliferationsrate in der
exsudativen Phase bei den Pferden 4, 6 und 7.
101
0
5
10
15
20
25
30
35
40
K 1 4 8 11 15 18 22 24 29
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
0
1
2
3
4
5
6
K 1 3 7 10 14 17 21 24 28
Pferd1
Pferd2A
ntei
l Ki-6
7-po
sitiv
er Z
elle
n an
der
Ges
amtz
ellz
ahl (
%)
Versuchstag
Abb. 26: Zellproliferationsrate (Vorversuch)
Ant
eil K
i-67-
posi
tiver
Zel
len
an d
er G
esam
tzel
lzah
l (%
)
Abb. 27: Zellproliferationsrate (Hauptversuch)
**
**
Versuchstag
* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert
*
*
102
4.2.2 Zelluntergangsrate
Um das Ausmaß des Perillaketon- induzierten Zelluntergangs zu beurteilen, wurden nekroti-
sche und apoptotische Zellen durch terminal dUTP nick end labeling (TUNEL), einem seit
langem bekannten und gut etablierten Verfahren, dargestellt. Mit der Bestimmung des Anteils
TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl zu den jeweiligen Zeitpunkten der Biopsie-
probenentnahme konnte die Rate untergehender Zellen ermittelt werden. Ultrastrukturell fan-
den sich in diesem Zusammenhang bei Alveolarepithelzellen vom Typ I morphologische Kor-
relate zur Nekrose. Veränderungen, wie sie bei Apoptose beobachtet werden können, waren
zwar nicht anzutreffen, da jedoch der Anteil TUNEL-positiver Zellen mit Ausnahme der
Pferde 3 und 5 unmittelbar vor der Euthanasie bei unter 2 % lag, ist es nicht unwahr-
scheinlich, dass apoptotische Zellen bei der punktuellen elektronenmikroskopischen
Untersuchung nicht erfasst wurden.
Der Anteil TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl bei den Pferden 1 und 2 aus dem
Vorversuch zeigte ausgehend von durchschnittlich 0,4 % (± 0,1) zunächst einen geringen
Abfall, stieg von Tag 3 bis Tag 14 gegenüber den Kontrollen um 91 % auf 0,7 % (± 0,1) an
und fiel ab Tag 17 wieder auf das Ausgangsniveau (Abb. 28, Anhänge Tabelle 13). Aufgrund
der Tatsache, dass dieser Prozess erst etwa sieben Tage nach der Applikation von Perillaketon
abläuft, ist ein direkter kausaler Zusammenhang nicht gesichert und indirekte Mechanismen
sind zu diskutieren. Bemerkenswerterweise geht jedoch dem Anstieg eine Zunahme der Pro-
liferationsrate voraus, so dass es sich um einen kompensatorischen Effekt zu einem ablaufen-
den Gewebe-Remodeling handeln könnte. Pferd 1 mit der höheren Zelluntergangsrate wies
auch die höhere Zellproliferationsrate auf.
Im Hauptversuch zeigten die Tiere interindividuell sehr unterschiedliche Reaktionen. Die
stärksten Veränderungen fanden sich bei Pferd 3 und Pferd 5. Hier erfolgte unmittelbar vor
dem Tod am Übergang von der exsudativen zur proliferativen Phase eine erkennbare
Zunahme TUNEL-positiver Zellen. Ausgehend von 1,9 % lag bei Pferd 3 ein Anstieg um den
Faktor 2,2 auf 4,1 % bis zum 8. Tag vor und bei Pferd 5 ausgehend von 0,5 % um das
5,7fache auf 3,0 % bis zum 4. Tag. Diese vergleichsweise massiven Defekte können den
moribunden Zustand der Tiere erklären. Lediglich noch bei Pferd 8 zeigte sich immerhin eine
Steigerung der Zelluntergangsrate gegenüber dem Ausgangswert von 0,9 % um den Faktor
1,7 auf 1,6 % von Tag 1 bis Tag 8, um bis zum 15. Tag wieder abzufallen. Bei diesem Tier
konnten am 4. Versuchstag keine Lungenbiopsieproben gewonnen werden. Bei den Pferden 4,
6 und 7 waren keine signifikanten Abweichungen zu beobachten, obwohl auch hier
Epitheldefekte und als Folge davon eine deutlich erhöhte AII-Proliferation nachgewiesen
103
werden konnten. Ein Effekt der möglicherweise in Betracht gezogen werden muss, ist, dass
untergehende Epithelzellen vor ihrem Nachweis bereits desquamiert und durch die
Mechanismen der bronchioalveolären Clearance abtransportiert wurden. Somit wäre auch bei
den Pferden 3 und 5 nicht das volle Ausmaß untergehender Zellen erfasst (Abb. 29, Anhänge
Tabellen 13 + 14).
104
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
K 1 3 7 10 14 17 21 24 28
Pferd 1
Pferd 2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
K 1 4 8 11 15 18 22 24 29
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
Abb. 29: Zelluntergangsrate (Hauptversuch)
Ant
eil T
UN
EL
-pos
itive
r Zel
len
an d
er G
esam
tzel
lzah
l (%
)
Abb. 28: Zelluntergangsrate (Vorversuch)
Ant
eil T
UN
EL
-pos
itive
r Zel
len
an d
er G
esam
tzel
lzah
l (%
)
Versuchstag
* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert
**
**
Versuchstag
*
*
105
4.2.3 Veränderungen des Anteils von Makrophagen und Granulozyten an der
Gesamtzellzahl
Entzündungszellen spielen eine große Rolle bei der Expression von Cytokinen und nehmen
dadurch erheblichen Einfluss nicht nur auf die Kollagensynthese, sondern auch auf zahlreiche
andere Prozesse im Rahmen eines Entzündungsgeschehens. Als Maß für die ablaufende
Entzündungsreaktion und um ihren Einfluss auf die mittels quantitativer
Polymerasekettenreaktion bestimmte Expression von TGF-β , Interleukin-1β , Prokollagen
a1(I) und a1(III) beurteilen zu können, wurden Granulozyten und Makrophagen
immunhistochemisch durch die Markierung des Myeloid / Histiozyten-Antigens dargestellt
und ihr Anteil an der Gesamtzellzahl bestimmt. Aufgrund ihrer Morphologie handelte es sich
dabei überwiegend um diffus verteilte Makrophagen, während Granulozyten in geringerem
Umfang vertreten waren und zu herdförmigen Ansammlungen neigten.
In der niedrigeren Dosisgruppe zeigte Pferd 1 über den gesamten Beobachtungszeitraum
keine signifikanten Änderungen der Makrophagen- und Granulozytenpopulation, während bei
Pferd 2 ab dem ersten Versuchstag eine kontinuierliche Zunahme ausgehend von einem
Anteil MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl von 1,6 % vor Versuchsbeginn auf
4,8 % an Tag 7 erfolgte. Von Tag 7 bis Tag 10 konnte eine Abnahme etwa bis auf das
Ausgangsniveau beobachtet werden (Abb. 30, Anhänge Tabelle 15).
In der höheren Dosisgruppe erfolgte bei Pferd 5 und 6 in der exsudativen Phase bereits 24 h
nach der Applikation von Perillaketon, bei den anderen Pferden der Gruppe erst ab Tag 1 eine
deutliche Zunahme MAC 387-positiver Zellen. Die durchschnittliche Infiltration mit
Makrophagen und Granulozyten erreichte gleichzeitig mit der Zellproliferationsrate in der
proliferativen Phase ihren Höhepunkt. Ausgehend von 2,5 % (± 0,6) MAC 387-positiven
Zellen in den Kontrollen zeigte sich ein Anstieg um den Faktor 3,6 bis zu einem Maximum
von 9,1 % (± 1,8) am 8. Tag. Eine Ausnahme bildete hier Pferd 5, das bereits nach 5 Tagen
euthanasiert wurde. Im anschließenden Ausheilungsstadium konnte im Gegensatz zur
Zellproliferationsrate ein völliges Abklingen der Entzündungsreaktion bis Tag 15 beobachtet
werden (Abb. 31, Anhänge Tabellen 15 + 16). Eine geringgradige Zunahme lymphozytärer
Infiltrate ließ sich lichtmikroskopisch lediglich in der proliferativen Phase beobachten.
106
0
1
2
3
4
5
6
K 1 3 7 10 14 17 21 24 28
Pferd 1
Pferd 2
0
2
4
6
8
10
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K 1 4 8 11 15 18 22 24 29
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
Abb. 30: Anteil MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (Vorversuch)
Ant
eil a
n de
r Ges
amtz
ellz
ahl (
%)
Versuchstag
Abb. 31: Anteil MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl (Hauptversuch)
Ant
eil a
n de
r Ges
amtz
ellz
ahl (
%)
Versuchstag
** **
* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert
*
*
107
4.2.4 Gehalt der alveolären Septen an kollagenen und retikulären Fasern
Um mögliche fibrotische oder erosive Prozesse beurteilen zu können, die mit einer Zunahme
bzw. Verringerung des Gehalts der alveolären Septen an extrazellulärer Matrix einhergehen,
erfolgte die computergestützte phasenanalytische Auswertung der in der Heidenhainschen
Azanfärbung dargestellten kollagenen und retikulären Fasern bis zum 29. Versuchstag.
In der niedrigen Dosisgruppe zeigte sich auch nach einer Versuchsdauer von 28 Tagen keine
signifikante Änderung des Gehalts kollagener und retikulärer Fasern (Abb. 32, Anhänge Ta-
belle 17).
Bei den Pferden 4, 6, 7 und 8 aus der höheren Dosisgruppe konnte während des gesamten
Beobachtungszeitraums von 29 Tagen keine signifikante Änderung der Menge der in der
Heidenhainschen Azanfärbung dargestellten extrazellulären Matrixbestandteile nachgewiesen
werden. Lediglich bei Pferd 8 ließ sich ein geringer Anstieg der linearen Trendlinie
beobachten, wobei jedoch der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an Tag 29 mit 14,8 %
nur unwesentlich über dem Ausgangswert von 12,5 % lag. Die Pferde 3 und 5 wurden
aufgrund der kurzen Versuchsdauer von nur 7 bzw. 11 Tagen nicht in die Messung
einbezogen (Abb. 33, Anhänge Tabellen 17 + 18).
108
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
K 1 3 7 10 14 17 21 24 28
Pferd 1
Pferd 2
TrendliniePferd 1
TrendliniePferd 2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
K 1 4 8 11 15 18 22 25 29
Pferd 4
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
TrendliniePferd 4TrendliniePferd 6
TrendliniePferd 7
TrendliniePferd 8
Abb. 32: Anteil kollagener und retikulärer Fasern an der Gesamtfläche der alveolären Septen (Vorversuch)
Ant
eil a
n de
r Ges
amtfl
äche
der
al
veol
ären
Sep
ten
(%)
Versuchstag
Abb. 33: Anteil kollagener und retikulärer Fasern an der Gesamtfläche der alveolären Septen (Hauptversuch)
Ant
eil a
n de
r Ges
amtfl
äche
der
al
veol
ären
Sep
ten
(%)
Versuchstag
*
*
* Kontrolle
109
4.3 Untersuchungen zur Genexpression
Mit der Reverse Transkriptase quantitativen Polymerasekettenreaktion stand eine
hochsensitive und -spezifische Methode zur Verfügung, mit der es möglich war, unter
Verwendung sehr geringer Mengen von Lungengewebe die Expression von IL-1β , TGF-β ,
COL1A1 und COL1A3 auf mRNA-Ebene zu bestimmen. Von diesen Faktoren ist bekannt,
dass sie eine wesentliche Rolle in akuten und chronischen Erkrankungen der Lunge bei
verschiedenen Tierspezies und dem Menschen spielen und in diesem Zusammenhang auch als
potenzielle prognostische und diagnostische Parameter gelten. Ziel dieser Untersuchungen
war es, im Vergleich mit der Entwicklung der morphometrisch erfassten
Lungenveränderungen und dem von Frau Dr. Venner untersuchten klinischen Verlauf die
Bedeutung der Genexpression der jeweiligen mRNA-Spezies in den verschiedenen Phasen
der Perillaketon- induzierten Lungenveränderungen festzustellen. Von großem Interesse war
dabei zu prüfen, ob sich die Annahme über ihre mögliche Eignung als diagnostisches
Hilfsmittel oder prognostischer Faktor auf die Untersuchung der Expression dieser mRNA-
Spezies übertragen lässt. Als Probenmaterial diente dabei das regelmäßig während des
Krankheitsverlaufes an mehreren verschiedenen Lokalisationen durch transkutane Biopsie
gewonnene Lungengewebe, wobei die daraus isolierte mRNA der Proben eines
Entnahmetages als Sammelprobe zusammengefasst wurde. Diese Vorgehensweise war
aufgrund der übereinstimmenden lichtmikroskopischen Befunde aller Lokalisationen eines
Entnahmetages gerechtfertigt. Jede einzelne Biopsieprobe wurde vor der Bildung der
Sammelproben dreigeteilt und sowohl zur Durchführung der morphologischen als auch der
morphometrischen und molekularbiologischen Untersuchungen herangezogen. Daher war ein
direkter Vergleich der Ergebnisse der verschiedenen Methoden möglich. Von den mRNA-
Sammelproben wurden die Ct-Werte und die Kopienzahl mit den jeweiligen
Standardabweichungen für IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) und das
hier verwendete „Housekeeping-Gen“ EF-1a bestimmt (tabellarische Zusammenstellung der
Werte aller Messdurchgänge siehe Anhang 9.2). Die Kopienzahlen von der zu untersuchenden
mRNA-Spezies wurden anhand der Werte von EF-1a korrigiert, um die eingesetzten
unbekannten mRNA-Mengen und mögliche unterschiedliche Effizienzen der Reversen
Transkription auszugleichen. Der zeitliche Verlauf der korrigierten Expressionsdaten wurde
zur besseren Übersicht für jedes einzelne Gen pro Pferd als Liniendiagramm dargestellt und
mit den Ergebnissen der morphometrischen Untersuchungen verglichen.
110
4.3.1 Kontrolle der mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese
Um die mRNA-Isolierung und die anschließende cDNA-Synthese mit einer relativ einfachen
aber präzisen Methode zu kontrollieren, wurden von jedem Pferd exemplarisch die zu einem
Pool zusammengefassten mRNA-Isolate eines Entnahmetages mittels Standard-RT-PCR
untersucht. Dabei konnten in allen Proben das „Housekeeping-Gen“ EF-1a und die zu
untersuchenden mRNA-Spezies von IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III)
nachgewiesen werden. Zusätzliche Amplifikationsprodukte wurden nicht beobachtet und bei
den Negativkontrollen traten keine Amplifikate auf.
4.3.2 Ergebnisse der qPCR
Die Gewebeproben wurden in zwei Messdurchgängen mit je dreifacher Probemessung bei
identischen Protokollen untersucht, wobei zwischen diesen beiden Messungen ein
Variationskoeffizient von 5 % nie überschritten wurde (BUSTIN, 2000). Zur Überprüfung des
sicheren Nachweises geringer Kopienzahlen wurde exemplarisch eine Verdünnungsreihe des
cDNA-Mengenstandards von EF-1a von 102 Kopien bis 109 Kopien pro µl erstellt. Aus den
als Triplikaten gemessenen Ct-Werten und den jeweiligen Standardabweichungen (s) geht
hervor, dass auch mit Ausnahme von TGF-ß noch 100 Kopien in der Probe sicher detektiert
und amplifiziert werden konnten. Die Nachweisgrenze von TGF-ß lag bei 103 Kopien.
Grundsätzlich wurde bei keinem der untersuchten Gene in den auszuwertenden Proben eine
Konzentration von weniger als 105 Kopien pro Probe gemessen. Für die Negativkontrollen
wurde DEPC-behandeltes Wasser als Template verwendet.
111
4.3.3 Expressionsrate von Interleukin-1β
Bei den eigenen RT qPCR-Untersuchungen zeigten die Versuchspferde sehr heterogene
Verläufe der Expression des multifunktionalen Cytokins IL-1ß (Abb. 34 + 35, Anhänge
Tabellen 29 + 30). Die einzelnen Kurven zeigten ein sehr unterschiedliches Verhalten und
zum Teil sehr große Schwankungen, die überwiegend in keinem erkennbaren Zusammenhang
mit den morphometrisch erfassten Parametern stehen. Bei den Pferden 1 und 2 aus dem
Vorversuch war jedoch ein durchschnittlicher Anstieg der IL-1ß-Expression von Tag 10 bis
14 um den Faktor 2,4 gegenüber dem Ausgangswert erkennbar, der zeitlich mit dem Verlauf
der Zelluntergangsrate zusammenfiel. Auch bei Pferd 4 aus dem Hauptversuch zeigte sich
eine Zunahme von Tag 8 bis Tag 22 um das Doppelte gegenüber dem Kontrollwert. Ein
einheitlicher Trend war insgesamt jedoch nicht erkennbar. Bemerkenswerterweise verlief die
biphasische Entwicklung der Expression von IL-1ß bei Pferd 6 mit den Höchstwerten an Tag
1 und 18 parallel zur Expressionsrate von Prokollagen a1(I) und a1(III). Diese Höchstwerte
stellen jedoch nur sehr geringe Zunahmen um den Faktor 1,2 bzw. 1,3 gegenüber den
Ausgangswerten dar.
112
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
K 1 3 7 10 14 17 21 24
Pferd 1
Pferd 2
Abb. 34: Expression von Interleukin-1β (Vorversuch)
Kop
ienz
ahl /
105 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
K 1 4 8 11 15 18 22 25 29
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
Abb. 35: Expression von Interleukin-1β (Hauptversuch)
Kop
ienz
ahl /
105 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
**
**
* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert
*
*
113
4.3.4 Expressionsrate von TGF-β
Ebenso wie bei IL-1ß zeigten die Tiere bei der Bestimmung der Expressionsrate von TGF-ß
interindividuell ein sehr unterschiedliches Verhalten. Nur bei den Pferden 1 und 2 der
niedrigen Dosisgruppe und den Pferden 4 und 7 der höheren Dosisgruppe konnten auffällige
Veränderungen beobachtet werden.
Bei Pferd 1 erfolgte ab Tag 3 ein Anstieg der Expression von TGF-β ausgehend von einem
Kontrollwert von 0,65 Kopien pro 103 Kopien EF-1a um das 2,9-fache auf 1,9 Kopien pro 103
Kopien EF-1a an Tag 7, um anschließend bis zum 17. Tag wieder auf das Ausgangsniveau
abzufallen. Bei Pferd 2 zeigte sich eine parallele, jedoch um 4 Tage verzögert eintretende
Zunahme um den Faktor 2,8 bis Tag 10. Auch hier nahmen die Werte wieder bis Tag 17 ab
(Abb. 36, Anhänge Tabelle 31).
In der höheren Dosisgruppe zeigte Pferd 4 im Vergleich zu einem Kontrollwert von 5,8
Kopien pro 103 Kopien EF-1α ab dem 11. Tag eine 2,2-fache Zunahme auf 12,8 Kopien pro
103 Kopien EF-1α an Tag 15, die bis Tag 18 wieder auf das Ausgangsniveau sank. Ein noch
ausgeprägterer Anstieg fand sich bei Pferd 7, der sich über die proliferative Phase bis zum
Ende der Ausheilungsphase erstreckte. Hier erfolgte in Bezug auf den Ausgangswert von
ebenfalls 5,8 Kopien pro 103 Kopien EF-1a ein Anstieg von Tag 4 bis Tag 11 um den Faktor
3,9 auf 22,5 Kopien pro 103 Kopien EF-1a mit einer raschen Regression ebenfalls bis Tag 15.
Bemerkenswerterweise war bei diesen beiden Tieren, die als einzige in der Gruppe eine
signifikante Zunahme der TGF-ß-Expression aufwiesen, auch die größte Zunahme der
Prokollagen a1(I)-Expression festzustellen. Ein gewisser kausaler Zusammenhang mit TGF-ß
als profibrotischen Stimulus erscheint hier möglich. Bei Pferd 7 verliefen die
Expressionsraten von TGF-ß und Prokollagen a1(III) bis zum Erreichen der Höchstwerte
nahezu parallel. Während jedoch TGF-ß in der Ausheilungsphase wieder zum
Ausgangsniveau zurückkehrte, waren die Werte für Prokollagen a1(I) und a1(III) auch noch
am Ende des Beobachtungszeitraums erhöht (Abb. 37 + 39). Die Pferde 3, 5, 6 und 8 wiesen
während der gesamten Versuchsdauer keine signifikanten Änderungen bei der Expression von
TGF-β auf (Abb. 37, Anhänge Tabelle 32).
114
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
K 1 3 7 10 14 17 21 24
Pferd 1
Pferd 2
0
5
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20
25
K 1 4 8 11 15 18 22 24 29
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
Abb. 36: Expression von TGF-β (Vorversuch)
Kop
ienz
ahl /
103 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
Abb. 37: Expression von TGF-β (Hauptversuch)
Kop
ienz
ahl /
102 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
**
**
* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert
*
*
115
4.3.5 Expressionsrate von Prokollagen a1(I)
In der niedrigeren Dosisgruppe konnten keine auffälligen Veränderungen der Genexpression
von Prokollagen a1(I) beobachtet werden (Abb. 38, Anhänge Tabelle 33).
Bei fast allen Tieren der höheren Dosisgruppe zeigte sich im Gegensatz zur sehr heterogenen
Reaktion, wie sie für IL-1ß und TGF-ß festgestellt wurde, eine ähnliche Entwicklung der
Prokollagen a1(I)-Expression. Bereits in den ersten 24 h der exsudativen Phase konnte
durchschnittlich nahezu eine Verdoppelung der Expression von Prokollagen a1(I) festgestellt
werden. Diese Zunahme setzte sich im proliferativen Stadium fort und von Tag 8 bis 15
konnte eine Vervierfachung gegenüber dem Ausgangswert beobachtet werden. Eine Abnahme
erfolgte erst am Ende der Ausheilungsphase ab Tag 18 und die Expression lag auch noch nach
einer Versuchsdauer von 29 Tagen im Durchschnitt 2,7-fach über dem Ausgangsniveau.
Damit erreichte die Expression von Prokollagen a1(I) ihr Maximum um mehrere Tage
verzögert zu Prokollagen a1(III). Pferd 3 und Pferd 5 zeigten unmittelbar ante mortem am
Übergang von exsudativer zu proliferativer Phase eine starke Abnahme der Expression von
Prokollagen a1(I) (Abb. 39, Anhänge Tabelle 34). Aber auch bei den Pferden 4, 6 und 8
konnte in der exsudativen Phase ein vorübergehender Abfall der Prokollagen a1(I)-
Expression beobachtet werden. Die Pferde 4 und 7, bei denen die höchsten Werte anzutreffen
waren, wiesen als einzige Tiere eine signifikante Zunahme der TGF-ß-Expression auf.
Bemerkenswert ist, dass bei der morphometrischen Auswertung der Heidenhainschen
Azanfärbung zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Steigerung des Anteils der extrazellulären
Matrix an den Alveolarsepten zu beobachten war. Im Vergleich zur Zellproliferationsrate und
zur Infiltrationsrate MAC 387-positiver Zellen, die ihr Maximum durchschnittlich bereits am
8. Tag erreichten und danach wieder abnahmen, stieg die Prokollagen a1(I)-Expression weiter
an und deren Höhepunkt fand sich erst an Tag 18. Während die entzündlichen Infiltrate an
Tag 15 wieder auf die Kontrollwerte zurückgingen, blieben Zellproliferation und Prokollagen
a1(I)-Expression bis zum Ende des Beobachtungszeitraums erhöht.
116
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
K 1 3 7 10 14 17 21 24
Pferd 1
Pferd 2
0
0,5
1
1,5
2
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3
K 1 4 8 11 15 18 22 24 29
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
Abb. 38: Expression von Prokollagen a1(I) (Vorversuch)
Kop
ienz
ahl /
102 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
Abb. 39: Expression von Prokollagen a1(I) (Hauptversuch)
Kop
ienz
ahl /
102 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
**
**
* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert
*
*
117
4.3.6 Expressionsrate von Prokollagen a1(III)
In der niedrigen Dosisgruppe zeigten sich bei der Genexpression von Prokollagen a1(III) kei-
ne deutlichen Veränderungen gegenüber dem Ausgangswert (Abb. 40, Anhänge Tabelle 35).
Durch die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte qPCR konnte in der hohen Dosisgruppe
bereits 24 h nach der Induktion eines akuten Alveolarschadens durch Perillaketon ein
deutlicher Anstieg der Expression von Prokollagen a1(III) festgestellt werden. In der
exsudativen Phase lag am ersten Versuchstag die durchschnittliche Genexpression von
Prokollagen a1(III) um den Faktor 2,4 über den Kontrollwerten. Die Zunahme setzte sich bis
zum Ende der proliferativen Phase fort und erreichte an Tag 11 ihr Maximum mit dem
16,6fachen des Kontrollwertes. Bei Pferd 7 erfolgte sogar ein Anstieg um das 20fache. Im
Anschluss daran sanken die Werte wieder, erreichten jedoch bei keinem Pferd das
Ausgangsniveau und waren über die Ausheilungsphase hinaus bis zum Ende des
Beobachtungszeitraums von 29 Tagen noch durchschnittlich 10fach erhöht (Abb. 41,
Anhänge Tabelle 36). Pferd 6 zeigte durch das Fehlen eines deutlichen Anstiegs der
Expression von Prokollagen a1(III) in der proliferativen Phase ein Verhalten gegen den
Trend. Bemerkenswert ist, dass bei der morphometrischen Auswertung der Heidenhainschen
Azanfärbung zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Steigerung des Anteils der extrazellulären
Matrix an den Alveolarsepten zu beobachten war (Abb. 33). Verglichen mit der Entwicklung
von Prokollagen a1(III) erreicht die Expression von Prokollagen a1(I) ihr durchschnittliches
Maximum erst mit einer Verzögerung von 7 Tagen. Betrachtet man den zeitlichen Verlauf der
Zellproliferationsrate und der Infiltrationsrate MAC 387-positiver Zellen, so erreichten diese
zusammen mit der Expression von Prokollagen a1(III) ihre Höchstwerte. Während der Anteil
MAC 387-positiver Zellen durchschnittlich bis zum 15. Tag wieder auf das Ausgangsniveau
fiel, blieben die Zellproliferationsrate und die Expression von Prokollagen a1(III) erhöht.
118
0
5
10
15
20
25
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35
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K 1 3 7 10 14 17 21 24
Pferd 1
Pferd 2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
K 1 4 8 11 15 18 22 24 29
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
Abb. 40: Expression von Prokollagen a1(III) (Vorversuch)
Kop
ienz
ahl /
102 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
Abb. 41: Expression von Prokollagen a1(III) (Hauptversuch)
Kop
ienz
ahl /
102 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
** **
* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert
*
*
119
4.4 Vergleich mit den klinischen Befunden
Als Grundlage für den Vergleich der in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnisse mit
dem klinischen Verlauf wurde der von Frau Dr. Venner anhand der semiquantitativen
Erfassung klinischer Befunde erhobene klinische Score herangezogen (Venner et al., 2003).
Entsprechend dieses Bewertungsschemas zeigte sich bereits ab der Applikation von
Perillaketon ein kontinuierlicher Anstieg des durchschnittlichen klinischen Scores in der
höheren Dosisgruppe, der am 5. Tag mit 8,5 Punkten sein Maximum erreichte und damit für
eine hochgradige, lebensbedrohende Lungenerkrankung sprach. Bis zum 15. Versuchstag
erfolgte eine stetige Abnahme bis zu einer mittleren Scorepunktezahl von 1. Dieser Wert blieb
bis zum 32. Tag konstant und kehrte zwischen Tag 35 und 40 wieder auf den Ausgangswert
zurück. Im Vergleich dazu erreichten die durchschnittliche Zellproliferationsrate und die
Infiltrationsrate mit Granulozyten und Makrophagen erst mit einer Verzögerung von 3 Tagen
am 8. Versuchstag ihr Maximum also zu einem Zeitpunkt, an dem der klinische Score bereits
wieder abnahm. Die Zellproliferationsrate blieb ebenfalls zusammen mit dem klinischen
Score noch nach dem lichtmikroskopisch festgestellten Ende der Ausheilungsphase erhöht,
während der durchschnittliche Anteil granulohistiozytärer Infiltrate an der Gesamtzellzahl an
Tag 15 zusammen mit dem klinischen Score das Niveau des Kontrollwertes erreichte. Die
durchschnittlichen Genexpressionen von Prokollagen a1(III) und a1(I) erreichten ihr
Maximum verglichen mit dem klinischen Score deutlich verzögert an Tag 11 bzw. an Tag 18,
also zu Zeitpunkten, an denen der Grad der klinischen Symptome bereits wieder deutlich
abgenommen hatte. Ein Zusammenhang des Verlaufs der klinischen Symptomatik mit der
Expression von IL-1ß und TGFß konnte nicht beobachtet werden.
120
0
1
2
3
4
5
6
7
8
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11
K 1 3 5 7 10 13 17 20 24 27 30
Pferd 3
Pferd 4
Pferd 5
Pferd 6
Pferd 7
Pferd 8
0
1
2
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5
6
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8
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K 1 3 5 7 10 13 17 20 24 27 30
Pferd 1
Pferd 2
Abb. 42: Klinischer Score (Vorversuch) 1
Kop
ienz
ahl /
102 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
Abb. 43: Klinischer Score (Hauptversuch) 1
Kop
ienz
ahl /
102 K
opie
n E
F-1α
Versuchstag
* Kontrolle ** Pferd 3 und Pferd 5 wurden am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert
** **
*
*
1 Mit freundlicher Genehmigung von Frau Dr. M. Venner (Klinik für Pferde, Tierärztliche Hochschule Hannover)
121
5 Diskussion
Interstitielle Lungenerkrankungen sind eine häufige Folge zahlreicher, sehr heterogener
Insulte und werden bei Sportpferden als eine wesentliche Ursache für eine in zunehmendem
Maße auftretende verminderte Leistungsfähigkeit betrachtet (BUERGELT et al., 1986;
WINDER et al., 1988; DIEKMANN et al., 1990; BUERGELT, 1995). Initial steht dabei im
Krankheitsverlauf ein akuter Alveolarschaden im Zentrum, gekennzeichnet durch Defekte des
Alveolarepithels und –endothels mit fibrinreicher Exsudation in die Alveolarlumina, der mit
einem Funktionsverlust der alveolo-kapillären Einheiten einhergeht. Es folgen im subakuten
und chronischen Stadium regenerative und reparative Prozesse, zu denen vor allem eine
reaktive Proliferation von Alveolarepithelzellen vom Typ II, aber auch von Fibroblasten
gehört. Unter günstigen Voraussetzungen ist eine vollständige Ausheilung möglich, vielfach
werden jedoch als Konsequenz mehr oder weniger stark ausgeprägte irreversible
Veränderungen in Form von Lungenfibrose beobachtet. Hier erfolgt zwar grundsätzlich eine
deregulierte, überschießende Ablagerung aller extrazellulären Matrixproteine, im
Vordergrund steht jedoch die Akkumulation vor allem der Kollagentypen I und III
(DIEKMANN et al., 1990; JUBB, 1991; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995; BRUCE, 1995).
Der Grad der dabei auftretenden restriktiven Lungenerkrankungen kann sehr stark variieren,
und insbesondere Sportpferde im Hochleistungsbereich zeigen schon bei relativ geringer
Beeinträchtigung der respiratorischen Funktionen erkennbare Leistungseinbußen. Aber auch
bei der Nutzung von Pferden aus der Hobby- und Freizeithaltung können sie eine Rolle
spielen (DIEKMANN et al., 1990). Ein Tiermodell der interstitiellen Pneumonie des Pferdes
könnte daher als wertvolles Instrument sowohl für eine Verbesserung der klinischen
Diagnostik und Prognosestellung genutzt werden, als auch zu einem besseren Verständnis der
Pathogenese führen.
Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch Darstellung der pathomorphologischen
Lungenveränderungen auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene sowie durch
immunhistochemische Methoden an transkutan gewonnenen Biopsieproben zu klären, ob
experimentell über einen akuten Alveolarschaden durch eine einmalige intravenöse
Applikation von Perillaketon (1-(3-furyl)4-Methylpentaton) das Bild einer interstitiellen
Pneumonie beim Pferd induziert werden kann. Der Versuchsansatz wurde dabei in Anlehnung
an bereits bestehende Tiermodelle etabliert, in denen Perillaketon zur Induktion
122
nichtkardiogener Lungenödeme und Diffuse Alveolar Damage (DAD) beim Schaf
(BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998; HWANG et al., 2001) oder restriktiver
Lungenerkrankungen beim Pony (BREEZE et al., 1984) verwendet wurde. Nach der
Bestätigung dieser Hypothese, schloss sich als zweite Fragestellung an, welche Rolle die
Genexpressionen der Cytokine Interleukin-1ß und TGF-ß sowie der extrazellulären
Matrixproteinvorläufer Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) im Krankheitsverlauf
spielen. Von diesen Faktoren ist bekannt, dass sie große Bedeutung bei akuten und
chronischen Lungenerkrankungen besitzen und aussichtsreiche Kandidaten als prognostische
Parameter für verschiedene Lungenerkrankungen, vor allem für DAD beim Menschen,
darstellen. In den bisherigen in diesem Zusammenhang stehenden Veröffentlichungen über
IL-1ß, TGF-ß und Parametern für die Kollagensynthese beim Menschen wurden
Untersuchungen überwiegend auf Proteinebene an bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit und
an Trachealaspiraten durchgeführt (KIRK et al., 1984b; HORSLEV-PETERSEN, 1990;
WAYDHAS et al., 1993; CLARK et al., 1995; ASHA et al., 1997; DEHEINZELIN et al.,
1997; MEDURI et al., 1998; BAUER et al., 2000; MARSHALL et al., 2000; MIKUNIYA et
al., 2000).
Bei dem in der vorliegenden Arbeit zur Induktion einer interstitiellen Pneumonie eingesetzten
Perillaketon handelt es sich um das wichtigste toxische Agens der Purpurminze (GARST et
al., 1984). Es ist seit langem bekannt, dass die Aufnahme der Pflanze bei Weidetieren zur
Entstehung einer interstitiellen Pneumonie führt (KERR et al., 1986). Die nach einem
Verfahren von GARST und WILSON (1984) und GARST et al. (1985) synthetisierte
Reinsubstanz wurde bereits auch von mehreren Autoren in Tierversuchen zur Erzeugung
eines akuten Alveolarschadens eingesetzt (BREEZE et al., 1984; GUERRY-FORCE et al.,
1988; BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998; SNAPPER et al., 1999; HWANG et
al., 2001). Im Unterschied zu diesen Untersuchungen wurde in der vorliegenden Arbeit der
Beobachtungszeitraum mit 29 Tagen deutlich länger gewählt und nach 60 Tagen eine
abschließende Sektion geplant, um auch das Stadium der Ausheilung oder - sofern sie sich bei
nur einmaliger Exposition gegenüber dem toxischen Agens einstellen sollte - die Entstehung
einer Lungenfibrose mit erfassen zu können. Grundsätzlich müssen bei der Verwendung von
Pferden im Tierversuch das Fehlen definierter Laborstämme und die hohen Kosten bei der
Anschaffung in Betracht gezogen werden sowie der große Aufwand bei Monitoring,
Unterbringung und Versorgung im Rahmen von einem Untersuchungszeitraum von mehreren
Wochen. Zudem sind im Zusammenhang mit Studien wie sie hier durchgeführt wurden nur
123
lungengesunde Tiere einsetzbar, wodurch die Auswahl geeigneter Tiere erheblich
eingeschränkt wird. In der vorliegenden Arbeit konnte daher nur eine relativ geringe Anzahl
von Tieren eingesetzt werden. Das heterogene Tiermaterial muss zudem als Ursache für die
zum Teil sehr starken interindividuellen Schwankungen der Ergebnisse diskutiert werden. Da
an den Pferden 1 und 2 aus dem Vorversuch nach einer Dosierung von 5 mg Perillaketon / kg
KG als Bolusinjektion nur gering ausgeprägte histomorphologische Alterationen beobachtet
werden konnten, wurden bei den folgenden Tieren 6 mg Perillaketon / kg KG eingesetzt.
Hierdurch konnten ausgeprägtere Veränderungen herbeigeführt werden. Im Vergleich dazu
sind bei Versuchen zur Erzeugung nichtkardiogener Lungenödeme beim Schaf Dosierungen
von 15 bis zu 30 mg PK / kg KG beschrieben, die anästhesierten oder wachen Tieren als
Dauertropfinfusion verabreicht wurden (COGGESHALL et al., 1987; ABERNATHY et al.,
1992). Auch BREEZE et al. (1984) verwendeten zur Induktion restriktiver
Lungenveränderungen beim Pony 18 mg PK / kg KG wobei die Applikation ebenfalls über
Dauertropfinfusion erfolgte. Da die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Versuchspferde
nach der intravenösen Applikation von 6 mg PK / kg KG als Bolusinjektion hochgradige, zum
Teil lebensbedrohliche klinische Symptome zeigten, war eine Steigerung auf die beim Schaf
und Pony beschriebenen Dosierungen nicht sinnvoll. Diese abweichenden Reaktionen können
auf rasse- und speziesspezifische Unterschiede und auch auf die Applikationsform
zurückzuführen sein.
Zur Gewinnung von Lungengewebe kam mit der durchgeführten transkutanen Entnahme von
Biopsieproben mittels der halbautomatischen Biopsiepistole Pro-Mag 2.2 (Fa. USBiopsy
engineered medical products, Franklin, USA) ein für diese Zwecke neuartiges Verfahren zum
Einsatz, das gegenüber der Anwendung einer herkömmlichen True-Cut Nadel hinsichtlich
Probenqualität und Nebenwirkungen für das Pferd deutliche Vorteile besitzt (VENNER et al.,
im Druck). Da von den einzelnen Bioptaten mehrere Teilproben gewonnen wurden, die
jeweils für die morphologischen, morphometrischen und molekularbiologischen
Untersuchungen herangezogen wurden, konnte ein direkter Vergleich zwischen dem Verlauf
der morphologischen Veränderungen und der Expressionsrate der ausgewählten mRNA-
Spezies gezogen werden. Diese Kombination verschiedener Methoden, die an intra vitam
gewonnenem Probenmaterial durchgeführt wurden und eine unmittelbare Gegenüberstellung
der jeweiligen Ergebnisse ermöglicht, besitzt Modellcharakter für zukünftige ähnliche
Untersuchungen. Insbesondere mit der Reverse Transkriptase - quantitativen Polymerase-
kettenreaktion wurde ein hochspezifisches und -sensitives Verfahren etabliert, das sich bei der
124
Auswertung sehr kleiner Gewebemengen wie den hier vorliegenden Minimalbiopsieproben
eignet.
Bei der lichtmikroskopischen und ultrastrukturellen Auswertung der Kontrollbiopsieproben,
die vor Versuchsbeginn von verschiedenen Lokalisationen entnommen wurden, konnte nur
normal strukturiertes Lungengewebe festgestellt werden. Es fand sich physiologischerweise
auftretendes und zum Stützgerüst der Lunge gehörendes kollagenes Bindegewebe. Aufgrund
des bei der Gewinnung der Biopsien verursachten Traumas wurden verschiedene
entnahmebedingte Artefakte beobachtet, die grundsätzlich bei der Beurteilung der Proben mit
in Betracht gezogen werden mussten. Es handelte sich dabei auf lichtmikroskopischer Ebene
um eine unterschiedlich starke Kompression des Lungengewebes bis hin zu subtotaler oder
totaler Atelektase, ein graduell variierendes, überwiegend sehr gering ausgeprägtes alveoläres
Ödem und intraalveolär gelegene Erythrozyten. In sehr wenigen Fällen - bezogen auf alle
gewonnenen Proben - fanden sich in den Randbereichen der Bioptate Lipidtröpfchen und
versprengtes quergestreiftes Muskelgewebe, die eine Kontamination mit Material aus
Unterhautfettgewebe und Interkostalmuskulatur als Folge der transkutanen Entnahmetechnik
darstellten. Elektronenmikroskopisch konnte vereinzelt in einigen Bereichen auch eine
Schwellung des Kapillarendothels beobachtet werden sowie eine ziehharmonikaartige Faltung
der alveolären Septen. Nach der einmaligen intravenösen Applikation von Perillaketon in
einer Dosis von 6 mg / kg KG konnten die hervorgerufenen Lungenveränderungen anhand
ihrer licht- und elektronenmikroskopisch dargestellten Morphologie in drei verschiedene
Phasen eingeteilt werden, die in ihrem Erscheinungsbild den einzelnen der von JUBB (1991)
beschriebenen Stadien der interstitiellen Pneumonie entsprachen: initiale exsudative Phase (1.
bis 4. Tag post applicationem), proliferative Phase (4. bis 11. Tag post applicationem) und bei
den Pferden 4, 6, 7 und 8 Ausheilung (11. bis 18. Tag post applicationem). Pferd 3 und Pferd
5 mussten am 11. bzw. am 9. Versuchstag in moribundem Zustand euthanasiert werden. Mit
der angewandten transkutanen Entnahmetechnik konnten nicht von allen Lungenarealen
Proben gewonnen werden, sondern nur aus einem begrenzten oberflächlichen Abschnitt der
beiden Hauptlappen bis zu einer Tiefe von etwa 1,5 – 2 cm. Da jedoch in den
unterschiedlichen Biopsielokalisationen des gleichen Entnahmetages stets übereinstimmende
morphologische Befunde erhoben wurden, konnte man davon ausgehen, dass die
Lungenveränderungen systemisch auftraten. Die im ersten Stadium angetroffenen
Veränderungen der Alveolarwand mit endothelialen und epithelialen Schäden, interstitiellem
und intraalveolärem Ödem und entzündlicher zellulärer Infiltration entsprechen dem Bild der
in der Literatur beschriebenen exsudativen Phase. Zwar waren keine hyalinen Membranen
125
wie in ausgeprägten klassischen Fällen von interstitieller Pneumonie darstellbar, jedoch
fanden sich multifokal geringgradige Exsudatmengen. Interzellularspalten, wie sie bei in
vitro-Versuchen unter Einfluss von Perillaketon an bovinen aortalen Endothelzellen gefunden
wurden (WATERS et al., 1993), oder Unterbrechungen des Endothelzellverbandes mit
Verlust von Endothelzellen bei in vivo-Studien (KERR et al., 1986; GUERRY-FORCE et al.,
1988) konnten nicht beobachtet werden. Zwar zeigten sich gut umschr iebene, hochgradig
ausgedünnte Bereiche im Zytoplasma von ödematisierten Endothelzellen, kapillarseitig
entblößte Abschnitte der Basalmembranen waren jedoch nicht zu beobachten. Es ist nicht
auszuschließen, dass diese Abschnitte der Blut-Luft-Schranke, bei denen die Basalmembran
kapillarseitig nur noch von extrem dünnen Endothelzellbrücken bedeckt war, neben der
Degeneration von Endothelzellen und dem Verlust von AI-Zellen eine Rolle bei der
Permeabilitätssteigerung der Blut-Luft-Schranke spielen. Grundsätzlich können nach
Angaben verschiedener Autoren kapillarseitig entblößte Basalmembranen bei alveolären
Schäden aufgrund der Regenerationsfähigkeit von Endothelzellen nur selten beobachtet
werden. Zudem werden degenerierende Endothelzellen vor ihrer Ablösung häufig von
Zytoplasmaausläufern benachbarter Zellen unterminiert, um nach deren Verlust eine
Kontinuitätsunterbrechung des Zellverbandes zu vermeiden (CORRIN u. VIJEYARATNAM,
1975; BACHOFEN u. WEIBEL, 1977; JUBB, 1991). Vereinzelt angetroffene intrakapilläre
Makrophagen mit phagozytierten Lamellarkörperchen lassen darauf schließen, dass
ursprüngliche Alveolarmakrophagen nach der Ingestion untergegangener AII-Zellen oder von
intakt ausgeschleusten Lamellarkörperchen wieder über das Interstitium in die Kapillaren
ausgewandert sind. Die pathomorphologischen Veränderungen des zweiten Stadiums vom 4.
bis 11. Tag entsprachen dem Bild der proliferativen Phase der interstitiellen Pneumonie. Der
Übergang dieser beiden Phasen ist klassischerweise durch die beginnende Proliferation von
AII-Zellen gekennzeichnet (JUBB, 1991). Grundsätzlich lag jedoch in der vorliegenden
Arbeit ein fließender Übergang vor, und es konnten in beiden Phasen in unterschiedlichem
Ausmaß sowohl Epitheldefekte als auch proliferierende AII-Zellen nachgewiesen werden. Die
Einteilung der einzelnen Stadien der Perillaketon-induzierten Lungenveränderungen erfolgte
daher vor allem aufgrund des Umfangs der AII-Zellproliferation. Die immunhistochemische
Markierung von Ki-67 hat zudem gezeigt, dass sich proliferierende Zellen - wie für dieses
Stadium der Erkrankung typisch - nicht nur an der luminalen Seite der Alveolen befanden, bei
denen es sich elektronenmikroskopisch um AII-Zellen und deren Übergangsformen im
Rahmen ihrer Differenzierung in AI-Zellen handelte, sondern auch im verbreiterten
Interstitium. Diese plumpkernigen Zellen glichen in ihrem Erscheinungsbild Fibroblasten.
126
Zudem fanden sich elektronenmikroskopisch Fibroblasten mit dilatiertem, endo-
plasmatischem Retikulum als Ausdruck erhöhter Stoffwechselaktivität. Diese Befunde
können in diesem Stadium in Zusammenhang mit der verstärkten Expression von Prokollagen
a1(I) und Prokollagen a1(III) gesehen werden. Die hochgradige Vermehrung von
Alveolarepithelzellen vom Typ II, die den meisten Alveolen ein adenoides Aussehen verlieh,
führte zusammen mit dem ebenfalls beobachteten interstitiellen Ödem und der Schwellung
von Endothelzellen zu einer erheblichen Verbreiterung der Blut-Luft-Schranke, wodurch die
in dieser Phase auftretende respiratorische Insuffizienz erklärbar ist. Nach Erreichen des
Höhepunktes der Proliferation von AII-Zellen erfolgte in der dritten Phase von Tag 11 bis 18
post applicationem bei den Pferden 4, 6, 7 und 8 eine Rückbildung der Veränderungen, bis
rein lichtmikroskopisch im Vergleich zu den Kontrollen keine abweichenden Befunde mehr
erhoben werden konnten. Bei der, mit Ausnahme der Pferde 3 und 5, fortgeführten
Auswertung von Biopsieproben am HE-gefärbten Paraffinschnitt und am Semidünnschnitt bis
zur 8. Woche nach Versuchsbeginn und der anschließenden, pathohistologischen
Untersuchung einer Lunge pro Pferd konnten keine Hinweise auf fibrotische Veränderungen
gefunden werden. Die angetroffenen pathohistologischen und ultrastrukturellen
Veränderungen in der akuten und subakuten Phase entsprechen prinzipiell den
Beschreibungen experimenteller, Perillaketon- induzierter Lungenveränderungen bei Schafen
und Pferden anderer Autoren (BREEZE et al., 1984; GUERRY-FORCE et al., 1988;
BERNARD et al., 1995; SNAPPER et al., 1998; SNAPPER et al., 1999; HWANG et al.,
2001). Sie sind auch vergleichbar mit der bei Rindern beobachteten interstitiellen Pneumonie
nach spontaner Vergiftung durch Aufnahme von Purpurminze beim Weidegang (KERR et al.,
1986) und mit Veränderungen wie bei Chronisch Obstruktiver Bronchitis (COB) des Pferdes
auf alveolärer Ebene (KAUP et al., 1990bc). Bei den Tieren der niedrigeren Dosisgruppe (5
mg PK / kg KG) fanden sich in allen Phasen, sofern überhaupt nachweisbar, im Vergleich mit
der höheren Dosisgruppe (6 mg PK / kg KG) deutlich geringer ausgeprägte Erscheinungen,
was für eine geringe toxische Breite von Perillaketon spricht.
Um das Ausmaß und den genauen zeitlichen Verlauf der festgestellten Veränderungen zu
erfassen, wurden die wesentlichen pathomorphologischen Parameter anhand geeigneter
Methoden dargestellt und morphometrisch quantifiziert. Diese Daten dienten auch als
Grundlage für den Vergleich des zeitlichen Ablaufs der morphologischen Veränderungen mit
den Ergebnissen der Genexpressionsstudien.
127
Folgende Parameter wurden gemessen:
1. die Zellproliferationsrate als Maß für ablaufende regenerative und reparative Prozesse,
bestimmt durch die immunhistochemische Markierung von Ki-67,
2. die Perillaketon- induzierte Zelluntergangrate, bestimmt durch terminal dUTP nick end
labeling,
3. die Infiltrationsrate von Granulozyten und Makrophagen als Parameter für die
ablaufende entzündliche Reaktion, bestimmt durch die immunhistochemische
Markierung des Myeloid / Histiozyten-Antigens und
4. der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären Septen als Parameter
für fibrotische oder erosive Prozesse, phasenanalytisch bestimmt in der
Heidenhainschen Azanfärbung.
Betrachtet man die Zellproliferationsrate, so ließen sich bei den Tieren aus dem Hauptversuch
sehr einheitliche Reaktionen feststellen. Bereits in der exsudativen Phase zeigten sich durch
die Verdoppelung Ki-67-positiver Zellen bis zum 4. Tag in zunehmendem Umfang
ablaufende regenerative Prozesse. Sie erreichten in der proliferativen Phase am 8.
Versuchstag ihr Maximum. Da es sich dabei aufgrund der elektronenmikroskopischen
Untersuchung im Wesentlichen um Alveolarepithelzellen vom Typ II und deren
Übergangsformen handelte, kann dieser hohe Wert nur durch zuvor erfolgte Desquamation
von Alveolarepithelzellen vom Typ I erklärt werden. Der sprunghafte Anstieg der
Zellproliferationsrate von Tag 4 bis Tag 8 unterstützte die in der lichtmikroskopischen
Untersuchung getroffene Festlegung des Übergangs von der exsudativen Phase in die
proliferative. Im anschließenden Ausheilungsstadium erfolgte zwar eine Regression, der
Anteil proliferierender Zellen blieb jedoch auch noch nach dessen Ende an Tag 18 bis zum
Abschluss der Untersuchungen an Tag 29 auf doppeltem Niveau der Ausgangswerte. Daher
muss davon ausgegangen werden, dass über die lichtmikroskopisch festgestellte
Ausheilungsphase des Perillaketon- induzierten akuten Alveolarschadens hinaus eine
überkompensierende Defektheilung und / oder kompensierte reparative Prozesse ablaufen.
Wie in der Auswertung MAC 387-positiver Zellen festgestellt, findet sich keine gleichzeitige,
über die Ausheilungsphase hinaus fortgesetzte entzündliche Reaktion. Bei den beiden Tieren
128
der niedrigeren Dosisgruppe waren licht- und elektronenmikroskopisch keine Veränderungen
im Sinne einer exsudativen Phase zu beobachten, es zeigte sich aber trotzdem von Tag 1 bis
Tag 7 eine Zunahme der Proliferationsrate durchschnittlich um den Faktor 3,8 verglichen mit
den Kontrollen, was auch hier für den Ablauf regenerativer Prozesse spricht. Der bei
mehreren Pferden in der exsudativen Phase beobachtete zeitlich begrenzte Abfall der
Zellproliferationsrate ist eine mögliche Folge der Behandlung mit Methylprednisolon.
Die Perillaketon- induzierte Zelluntergangsrate wurde durch terminal dUTP nick end labeling,
einem seit langem bekannten und gut etablierten Verfahren, als Anteil TUNEL-positiver
Zellen an der Gesamtzellzahl bestimmt. Mit dieser Methode ist zwar eine Differenzierung
zwischen Apoptose und Nekrose nicht möglich und nicht alle nekrotischen Zellen können
erfasst werden, jedoch ist sie für eine Abschätzung des Umfangs untergehender Zellen
durchaus geeignet. Elektronenmikroskopisch waren nur nekrotische Veränderungen von
Alveolarepithelzellen vom Typ I anzutreffen und typische Hinweise auf Apoptose fehlten.
Aufgrund des verhältnismäßig geringen Anteils der Zelluntergänge kann grundsätzlich jedoch
nicht ausgeschlossen werden, dass bei der ultrastrukturellen Auswertung Apoptosen nicht
erfasst wurden. Die stärksten Veränderungen fanden sich bei Pferd 3 und Pferd 5, die bereits
nach wenigen Tagen in moribundem Zustand euthanasiert werden mussten. Hier konnte ab
dem ersten Versuchstag eine signifikante Zunahme der Zelluntergangsrate festgestellt werden.
Diese vergleichsweise massiven Defekte können den moribunden Zustand der Tiere erklären.
Die übrigen Tiere dieser Gruppe zeigten keine erkennbaren Abweichungen, obwohl auch hier
die deutlich erhöhte AII-Proliferation auf die Regeneration von Epitheldefekten hinweist.
Auch in anderen Tierversuchen in denen Perillaketon zur Induktion eines akuten
Alveolarschadens eingesetzt wurde, konnten Untergänge von Alveolarepithelzellen vom Typ
I und Epitheldefekte beobachtet werden, dort jedoch bereits in den ersten Minuten bis zu zwei
Stunden (GARST et al., 1985; KERR et al., 1986; GUERRY-FORCE et al., 1988). Eine
mögliche Erklärung kann darin liegen, dass untergehende Epithelzellen vor ihrem Nachweis
bereits desquamiert und durch die Mechanismen der bronchioalveolären Clearance
abtransportiert wurden. Somit wäre auch bei den Pferden 3 und 5 nicht das volle Ausmaß von
Apoptose und Zellnekrose erfasst. Bemerkenswerterweise konnte auch bei den Tieren der
niedrigen Dosisgruppe, die die am wenigsten ausgeprägten morphologischen Veränderungen
aufwiesen, eine durchschnittliche Zunahme der Nekrose- und Apoptoserate von Tag 3 bis Tag
14 um 91 % gegenüber den Kontrollen beobachtet werden. Die Tatsache, dass dieser Prozess
erst etwa sieben Tage nach der Applikation von Perillaketon abläuft, macht einen
129
Zusammenhang unwahrscheinlich. Bemerkenswerterweise geht jedoch dem Anstieg eine
Zunahme der Proliferationsrate voraus, so dass es sich um einen kompensatorischen Effekt zu
einem ablaufenden Gewebe-Remodeling handeln könnte. Pferd 1 mit der höheren
Zelluntergangsrate wies auch die höhere Zellproliferationsrate auf.
Betrachtet man die Rate granulohistiozytärer Infiltrate, gemessen am Anteil MAC 387-
positiver Zellen an der Gesamtzellzahl, so zeigte sich in der exsudativen Phase bei der Hälfte
der Tiere des Hauptversuchs bereits in den ersten 24 h nach der Applikation von Perillaketon
eine einsetzende entzündliche Reaktion, während sie bei den übrigen Pferden mit einem Tag
Verzögerung eintrat. Es folgte dann eine kontinuierliche Zunahme, bis in der proliferativen
Phase bei allen Pferden am 8. Tag das Maximum erreicht war, und in der anschließenden
Ausheilungsphase eine kontinuierliche Regression. Es zeigte sich somit ein nahezu paralleler
Verlauf der entzündlichen Reaktion zu den an der Zellproliferationsrate festgemachten
regenerativen Prozessen, mit der Ausnahme, dass die Entzündungsreaktion in der
Ausheilungsphase vollständig abklang, die Zellproliferationsrate jedoch weiterhin erkennbar
erhöht blieb. In der niedrigeren Dosisgruppe konnte nur bei Pferd 2 vom 1. bis zum 7. Tag
eine mäßige Infiltration mit Entzündungszellen festgestellt werden, die bereits an Tag 10
wieder auf das Ausgangsniveau zurückging. Eine geringgradige Zunahme von Lymphozyten
konnte lichtmikroskopisch lediglich in der proliferativen Phase beobachtet werden. Als
Ursache für den zeitlich begrenzten Abfall der Infiltrationsrate mit MAC-387-positiven Zellen
am Übergang von der exsudativen zur proliferativen Phase muss die Behandlung mit
Methylprednisolon in Betracht gezogen werden.
Um den Umfang möglicher fibrotischer oder erosiver Prozesse, die mit einer Zunahme bzw.
Verringerung des Gehalts der alveolären Septen an extrazellulärer Matrix einhergehen, genau
erfassen zu können, erfolgte die phasenanalytische Auswertung der in der Heidenhainschen
Azanfärbung dargestellten kollagenen und retikulären Fasern. Bei keinem der Tiere beider
Dosisgruppen konnten nach einem Beobachtungszeitraum von 29 Tagen signifikante
Änderungen im Sinne von Fibrose oder Erosion beobachtet werden. Da die
Zellproliferationsrate noch bis zum Ende des Beobachtungszeitraums um etwa das Doppelte
gegenüber den Ausgangswerten erhöht war und in der proliferativen Phase proliferierende,
interstitielle Zellen und aktive Fibroblasten nachweisbar waren, kann aufgrund dieser Befunde
davon ausgegangen werden, dass ablaufende reparative Prozesse kompensiert wurden.
Lediglich bei Pferd 8 zeigte sich ein leichter Trend zu einer verstärkten Akkumulation
130
extrazellulärer Matrixproteine, jedoch lag der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an den
alveolären Septen an Tag 29 mit 14,81 % nur unwesentlich über dem Kontrollwert von 12,48
%. Diese Ergebnisse, zusammen mit dem Rückgang der Infiltrationsrate MAC 387-positiver
Zellen bis Tag 15 und die lichtmikroskopische Beurteilung lymphozytärer Infiltrate schließen
die Entstehung einer chronisch persistierenden Entzündung und fibrotischer Prozesse bis Tag
29 aus. Im Vergleich dazu konnte in anderen Untersuchungen (ZAPOL et al., 1979;
COLLINS et al., 1984) drei Wochen nach erfolgtem DAD eine Zunahme des
Kollagengehaltes der Lunge um das Dreifache beobachtet werden. Die Ergebnisse der
vorliegenden Arbeit stehen auch in starkem Kontrast zu anderen Tiermodellen für toxisch
induzierte Lungenfibrose. Zum Beispiel wurden nach Bleomycin-bedingtem Alveolarschaden
bei Ratten erhebliche Zunahmen an kollagenen Fasern innerhalb von 7 (OKUDELA et al.,
1999) bzw. 14 Tagen (LAXER et al., 1999) beobachtet. Signifikante Ablagerungen an
extrazellulären Matrixproteinen fanden sich auch binnen 14 Tagen bei Paraquat- induzierten
Lungenschäden in Mäusen (HEMMATI et al., 2002). Auch in den Biopsieproben, die mit
Ausnahme der Pferde 3 und 5 noch bis acht Wochen nach Versuchsbeginn entnommen
wurden, konnten am HE-gefärbten Paraffinschnitt und am Semidünnschnitt keine Hinweise
auf chronisch entzündliche oder fibrotische Prozesse gefunden werden. Bei der
pathohistologischen Untersuchung einer der beiden explantierten Lungen der Pferde 1, 2, 4, 6,
7 und 8 fanden sich ebenfalls keine Anzeichen für Lungenfibrose.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Ergebnisse der morphometrischen
Untersuchungen die licht- und elektronenmikroskopischen Befunde bestätigen. Jedoch zeigte
sich bei der Auswertung der immunhistochemischen Darstellung von Ki-67 auch noch 11
Tage nach Ende der Ausheilungsphase eine erhöhte Zellproliferationsrate, die auf noch
ablaufende regenerative und / oder reparative Prozesse hindeutet. Fibrotische Veränderungen
konnten zusätzlich anhand der phasenanalytischen Auswertung der Heidenhainschen
Azanfärbung ausgeschlossen werden.
Um eine spezifische, quantitative Aussage über den zeitlichen Verlauf der Expressionsraten
der mRNA von IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und a1(III) in den Lungenbiopsieproben
machen zu können, wurde die Reverse Transkriptase-quantitative Polymerasekettenreaktion
(RT-qPCR) im real-time-Modus etabliert. Diese relativ neue Untersuchungsmethode wurde
von GIBSON et al. (1996) entwickelt und kombiniert die Amplifikation, Detektion und
Quantifizierung von Nukleinsäuren in einem Reaktionsansatz. Allgemein zählen zu den
131
Vorzügen dieser Methode ihre hohe Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Daten,
die durch ausgewählte Primer- und Sondenkombinationen erzielt werden. Zusätzlich zu den
Primerpaaren, die als Begrenzung des Amplikons einen wichtigen Beitrag zur Spezifität und
Sensitivität liefern, werden diese noch durch die Verwendung einer Oligonukleotidsonde
erhöht, die während der Anlagerungs- und Extensionsphase der PCR an das Amplikon
hybridisiert (BUSTIN, 2000). Für die RT-qPCR in dieser Arbeit wurde wegen der Stabilität
bei hohen Temperaturen ein so genanntes TaqMan-Assay, bestehend aus Taq-Polymerase und
TaqMan-Sonden, verwendet. Die etablierte Methode erlaubte einen hochsensitiven und
hochspezifischen Nachweis bei gleichzeitiger Quantifizierung der Expression der zu
untersuchenden mRNA-Spezies. Bei der Messung der Gewebeproben konnten bei keiner
mRNA-Spezies pro Reaktion weniger als 105 Kopien festgestellt werden und die
Standardabweichungen lagen, bezogen auf die Werte der gemessenen Triplikate, immer unter
1. Im Gegensatz zur Standard RT-PCR, wo die kleinste nachweisbare Kopienzahl theoretisch
eine Kopie beträgt (WANG u. BROWN, 1999), kann in der RT-qPCR diese Sensitivität in der
Regel nicht erzielt werden (BUSTIN, 2000). Um sicherzustellen, dass eine Amplifikation von
kontaminierender, genomischer DNA und somit eine Verfälschung der Messergebnisse
ausgeschlossen war, wurde die isolierte mRNA einem DNase-Verdau unterzogen.
Als Kriterium für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse kann der Variationskoeffizient
zwischen zwei identischen Messdurchgängen herangezogen werden. Die cDNA der
Lungenbiopsieproben wurde in zwei Messdurchgängen jeweils in Form von Triplikaten
untersucht. Dabei lag der Variationskoeffizient innerhalb und zwischen den Läufen innerhalb
der von BUSTIN (2000) empfohlenen Grenzen von 0 und 5 %. Zur Standardisierung der
Messdaten wurde außerdem die cDNA des Housekeeping-Gens EF-1a in allen Proben über
die Bestimmung der entsprechenden Ct-Werte ermittelt. EF-1a wird in allen Zell- und
Gewebetypen mit konstanter Kopienzahl exprimiert und eignet sich daher als universelle
Referenz-mRNA-Spezies (GRUBER u. LEVINE, 1997). In diesem Zusammenhang wurde in
der vorliegenden Arbeit die cDNA-Sequenz des equinen EF-1a erstmalig bestimmt. Damit
konnten Variationen der eingesetzten mRNA-Mengen, unterschiedliche Effektivitäten der
Reversen Transkription sowie die Wirkungen eventueller Polymerase-Inhibitoren (z. B.
Glykogen, Hämoglobinbestandteile) in den Proben ausgeglichen werden. Um die EF-1a
Expression in den Bioptaten in Kopienzahlen ausdrücken zu können, wurde ebenso wie für
IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und a1(III) je eine Standardkurve erstellt. Diese
Standardkurven wurden trotz der hohen Reproduzierbarkeit der Messergebnisse in jedem
Durchgang bestimmt. Die daraus errechnete Regressionskurve diente als Korrektur für die
132
Werte der untersuchten mRNA-Spezies, die für die Evaluierung der Expressionsraten als
Quotient pro jeweiliger Kopienzahl von EF-1a angegeben wurden. Bei der Interpretation der
gewonnen Ergebnisse muss in Betracht gezogen werden, dass auch bei EF-1a trotz seiner sehr
konstanten Genexpressionrate in gewissem Umfang mit einer Hochregulierung zu rechnen ist.
Es besteht also grundsätzlich die Möglichkeit, dass die tatsächliche Expression der
bestimmten mRNA-Spezies über der gemessenen liegt.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass im Rahmen dieser Arbeit ein präzises
quantitatives und gleichzeitig hochsensitives sowie hochspezifisches Nachweisverfahren für
die mRNA von IL-1ß, TGF-ß, Prokollagen a1(I) und a1(III), ausgehend von
Minimalbiopsieproben, etabliert werden konnte. Als Nachteil des Verfahrens der RT-qPCR
ist jedoch der relativ hohe Kostenaufwand zu nennen. Die Kosten setzen sich im
Wesentlichen aus der Anschaffung eines spektrofluorimetrischen Thermocyclers mit
dazugehöriger, erforderlicher PC-Hard- und Software, aus benötigten speziellen Reaktionskits
und den Fluorophor-markierten Oligonukleotidsonden zusammen. Weiterhin ist die
aufwendige Etablierung jedes Nachweisverfahrens für die einzelnen mRNA-Spezies zu
nennen.
Bei den eigenen RT-qPCR-Untersuchungen zeigten die Versuchspferde hinsichtlich der
Expression des multifunktionalen Cytokins IL-1ß sehr heterogene Reaktionen. Bei den
Pferden 1 und 2 aus dem Vorversuch war ein Anstieg der IL-1ß-Expression von Tag 10 bis 14
erkennbar, der zeitlich mit dem Verlauf der Zelluntergangsrate zusammenfiel. Der von
GOLDBLUM et al. (1988) beobachtete Effekt von IL-1ß, Endothelzellschäden hervorzurufen,
kann hiermit in Zusammenhang stehen. Auch bei Pferd 4 aus dem Hauptversuch zeigte sich
eine Zunahme von Tag 8 bis Tag 22 um das Doppelte gegenüber dem Kontrollwert. Trotz der
von IL-1ß beschriebenen Eigenschaften, Entzündungszellen zu rekrutieren und zu aktivieren
(MIZEL et al., 1981; WARD, 1997), an der Entstehung von Defekten von
Alveolarepithelzellen beteiligt zu sein und gleichzeitig aber auch bei der Regeneration von
Lungenschäden eine Rolle zu spielen (GOLDBLUM et al., 1988; GEISER et al., 2001),
konnte hier im Hauptversuch beim Vergleich mit den pathomorphologischen Befunden, der
Zellproliferationsrate, der Infiltrationsrate MAC 387-positiver Zellen oder der im TUNEL-
Assay bestimmten Zelluntergangsrate kein zeitlicher Zusammenhang festgestellt werden.
BAUER et al. (2000) und MIKUNIYA et al. (2000) vermuteten, dass die Bestimmung von
IL-1ß aus bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit auf Proteinebene mit dem Ausmaß von
Lungenschäden korreliert oder sich als potenzieller prognostischer Faktor, z. B. bei
133
Sarcoidosis des Menschen, eignet. Diese Annahmen konnten im vorliegenden Modell der
interstitiellen Pneumonie des Pferdes nicht auf die Expressionsrate von IL-1ß übertragen
werden.
Ebenfalls zeigten die Tiere bei der Bestimmung der Expressionsrate des Cytokins TGF-ß, das
allgemein als einer der wichtigsten Promotoren fibrotischer Veränderungen angesehen wird
(GIRI et al., 1993; BIENKOWSKI u. GOTKIN, 1995), ein interindividuell unterschiedliches
Verhalten. Nur bei den Pferden 4 und 7 der höheren Dosisgruppe und bemerkenswerterweise
bei den Pferden 1 und 2 der niedrigen Dosisgruppe konnten auffällige Änderungen beobachtet
werden. Der Beginn der hochregulierten TGF-ß-Expression war bei diesen vier Tieren sehr
unterschiedlich und lag zwischen Tag 3 (Pferd 1) und Tag 11 (Pferd 4). KAMINSKI et al.
(2000) konnten im Vergleich dazu im Tiermodell der Maus für Lungenfibrose nach 48 h
TGF-ß-bedingte Effekte feststellen. Bei den Pferden 4 und 7 erstreckte sich die verstärkte
TGF-ß-Expression über die proliferative Phase bis zum Ende der Ausheilungsphase, was
darauf hinweisen kann, dass hier, wie von HOWE et al. (1990) und SHULL et al. (1992)
beschrieben, ein Zusammenhang mit dem Ablauf regenerativer oder antiinflammatorischer
Prozesse bestehen könnte. Allerdings lag bei beiden Tieren bereits vor dem Anstieg von TGF-
ß eine verstärkte Zellproliferation vor, die noch nach dem Rückgang der TGF-ß-Expression
erhöht blieb. Auch eine signifikante Steigerung der Expression durch granulohistiozytäre
Infiltrate, wie von YAMAMURA et al. (1991) beschrieben, ist nicht nachweisbar. Jedoch sind
nach HOWE et al. (1990) auch ortsständige, epitheliale und mesenchymale Zellen in der
Lage, TGF-ß zu bilden. Nach Untersuchungen zahlreicher Autoren (ROBERTS et al., 1986;
IGNOTZ u. MASSAGUE, 1986; VARGA et al., 1986) stellt TGF-ß den stärksten bekannten
Stimulus der Kollagensynthese dar und fördert die Expression von COL1A1 und COL3A1
(ROSSI et al., 1988; RITZENTHALER et al., 1993). Die Pferde 4 und 7 wiesen als einzige
Tiere dieser Gruppe eine signifikante Zunahme der TGF-ß-Genexpression auf und zeigten
auch die größten Maximalwerte der Prokollagen a1(I)- und a1(III)-Expression. Darüber
hinaus lagen unabhängig von der Genexpression von TGF-ß bei diesen beiden Tieren in der
exsudativen Phase und auch noch nach Ende der Ausheilungsphase erhöhte
Genexpressionsraten von Prokollagen a1(I) und a1(III) vor. Bei den Pferden 3, 4, 5, 6 und 8
zeigte sich in allen Stadien eine Zunahme der Prokollagenexpressionen ohne nachweisbar
hochregulierte TGF-ß-Expression. Auch FINE et al. (1990) konnte in vitro keine positiven
Effekte von TGF-ß auf die Expression von COL1A2 an embryonalen, humanen Fibroblasten
feststellen. Im Gegensatz dazu beobachteten KELLEY et al. (1985) und HOYT und LAZO
134
(1988) an Mäusen mit Bleomycin- induzierter Lungenfibrose eine maximale TGF-ß-
Expression zum Zeitpunkt der maximalen Kollagensynthese. Bei der Interpretation der
Ergebnisse muss in Betracht gezogen werden, dass die Aktivität von TGF-ß auch in
erheblichem Maße posttranslational reguliert wird. Nach MUNGER et al. (1999) und PITTET
et al. (2001) existieren große Mengen an latentem TGF-ß-Protein, die z. B. durch Integrin
avβ6 lokal aktiviert werden können. Eine Steigerung der TGF-ß-Aktivität ist somit
unabhängig von einer verstärkten Genexpression möglich. Die Feststellung verschiedener
Autoren, dass TGF-ß großen Anteil an der Pathogenese verschiedener akuter und chronischer
Lungenerkrankungen besitzt (DENIS u. GHADIRIAN, 1992; MORELAND et al., 1992;
XING et al., 1992; KHALIL et al., 1996; KOTECHA et al., 1996; MAGNAN et al., 1996;
BÜHLING et al., 1999), kann aufgrund der Ergebnisse für den vorliegenden Fall allenfalls
nur partiell für seine Genexpression vermutet werden. Eine Eignung der Genexpressionsrate
von TGF-ß als potenzieller prognostischer Marker für interstitielle Lungenerkrankungen war
allein aufgrund der interindividuell sehr heterogenen Reaktionen hier nicht ersichtlich.
Grundsätzlich ist im vorliegenden Modell aufgrund der Ergebnisse der pathohistologischen
Untersuchungen und der Bestimmung des Anteils der extrazellulären Matrix an den
alveolären Septen davon auszugehen, dass mögliche profibrotische Wirkungen von TGF-ß
kompensiert wurden.
Die Tatsache, dass in den licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen sowie in der
morphometrischen Auswertung der Heidenhainschen Azanfärbung keine Hinweise auf die
Ausbildung fibrotischer Veränderungen festgestellt werden konnten, steht in Kontrast zu den
Ergebnissen der Expressionsstudien bezüglich der Prokollagengene COL1AI und COL3AI.
Durch die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte RT-qPCR konnte in der hohen
Dosisgruppe bereits 24 h nach der Erzeugung eines Perillaketon- induzierten akuten
Alveolarschadens ein deutlicher Anstieg der Genexpression sowohl von Prokollagen a1(I) als
auch von Prokollagen a1(III) festgestellt werden. Damit vergleichbar berichten
DEHEINZELIN et al. (1997) von einer frühzeitigen Hochregulierung von Kollagen Typ I-
mRNA-Spezies bei Patienten mit ARDS. Im Gegensatz zur sehr heterogenen Reaktion, wie
sie für IL-1ß und TGF-ß festgestellt wurde, zeigte sich hier bei fast allen Tieren dieser Gruppe
eine ähnliche Entwicklung. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit bereits existierenden
Veröffentlichungen über Parameter der Kollagensynthese als mögliche diagnostische und
prognostische Faktoren in der Frühphase beim ARDS des Menschen. Gut untersucht sind in
diesem Zusammenhang vor allem das N-terminale Propeptid von Prokollagen Typ III und das
135
C-terminale Propeptid von Prokollagen Typ I in bronchioalveolärer Lavageflüssigkeit oder
Trachealaspiraten (WAYDHAS et al., 1993; CLARK et al., 1995; ASHA et al., 1997;
MEDURI et al., 1998), deren Konzentrationen bereits sehr früh innerhalb von 24 h ansteigen
und auf eine verstärkte Kollagensynthese hinweisen. Entsprechend zeigte sich im
vorliegenden Versuch ein Anstieg der durchschnittlichen Expressionsrate von Prokollagen
a1(III) während der exsudativen Phase, die in der proliferativen Phase an Tag 11 ihr
Maximum erreichte. Parallel dazu, mit einem gut erkennbar um mehrere Tage verzögert
erreichtem Maximalwert, erfolgt die Zunahme von Prokollagen a1(I). Hier finden sich die
Höchstwerte erst an den Tagen 15 und 18, also gegen Ende der Ausheilungsphase. Auch
VUORIO et al. (1989) konnten nach der Inhalation von Silikatstäuben an Ratten einen
Anstieg des mRNA-Levels in der Lunge von Kollagen Typ III vor Kollagen Typ I
beobachten. In den eigenen Untersuchungen erfolgte nach Erreichen des Maximums wieder
eine Regression, jedoch blieben die Werte bis zum Ende des Untersuchungszeitraumes von 29
Tagen deutlich über dem Ausgangsniveau.
Der bei mehreren Pferden während der exsudativen Phase oder am Übergang zur
proliferativen Phase beobachtete zeitlich begrenzte Abfall der Genexpression ist
möglicherweise als eine Folge der Behandlung mit Methylprednisolon anzusehen.
Bemerkenswert ist, dass bei der morphometrischen Auswertung der Heidenhainschen
Azanfärbung zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Steigerung des extrazellulären
Matrixanteils der Alveolarsepten zu beobachten war. Es ist also davon auszugehen, dass die
verstärkte Genexpression von Prokollagen a1(I) und a1(III) durch nachgeschaltete
Mechanismen im multiregulierten Kollagenstoffwechselweg kompensiert wurde. Die
durchschnittliche Genexpression von Prokollagen a1(III) verlief in der hohen Dosisgruppe
während der exsudativen Phase bis zum Ausheilungsstadium in etwa parallel zur
Zellproliferationsrate, wobei die Tiere mit der höchsten Zellproliferationsrate in der Regel
auch die höchsten Werte für Prokollagen a1(III) aufwiesen. Einige Tage dazu verzögert
verlief die Entwicklung der Prokollagen a1(I)-Genexpression. Auch die Zellproliferationsrate
blieb nach Erreichen ihres Höchstwertes bis zum Ende der Untersuchungen über dem
Ausgangsniveau. Nur zu Anfang verhielten sich die Durchschnittswerte der Infiltrationsrate
MAC 387-positiver Zellen, die durch die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren und
Cytokinen die Kollagensynthese stimulieren können, wie die Expressionen der gemessenen
Prokollagengene. Der Anteil granulohistiozytärer Infiltrate fiel jedoch im Ausheilungsstadium
auf den Ausgangslevel zurück, so dass sich die weiterhin erhöhten mRNA-Level von
Prokollagen a1(I) und a1(III) nicht durch eine entzündliche Reaktion erklären ließen. Eine
136
geringgradige Zunahme lymphozytärer Infiltrate konnte lichtmikroskopisch nur in der
proliferativen Phase beobachtet werden.
Zusammengefasst ist also davon auszugehen, dass die Genexpressionen von Prokollagen
a1(I) und a1(III) innerhalb von 24 h nach der Induktion eines akuten Alveolarschaden durch
Perillaketon hochreguliert wird. Darüber hinaus erfolgte noch nach Ende der
Ausheilungsphase eine kompensie rte Überexpression dieser Prokollagengene. Die Tatsache,
dass die Genexpressionen von Prokollagen a1(I) und a1(III) bei allen Tieren die
pathohistologische Veränderungen und klinische Symptome im Sinne einer interstitiellen
Pneumonie aufwiesen, bereits unmittelbar nach der Induktion hochreguliert wurde, ist eine
Eigenschaft, wie sie von einem potenziellen prognostischen Marker erwartet wird.
Grundsätzlich stellen jedoch aufgrund der vorliegenden Ergebnisse die Expressionen von
Prokollagen a1(I) und a1(III) keine aussichtsreichen Kandidaten als prognostische Faktoren
für interstitielle Lungenerkrankungen dar. Unter welchen Bedingungen und ab welchem
Ausmaß eine verstärke Expression zur Lungenfibrose führt, konnte in der vorliegenden Arbeit
nicht geklärt werden. Ihre Eignung die Tendenz zur Entstehung chronisch-persistierender
Veränderungen beurteilen zu können, muss nach diesen grundsätzlichen, sondierenden
Versuchen in umfangreicheren klinischen Studien abgeklärt werden. Es kann jedoch gesagt
werden, dass eine deutliche Hochregulation der Genexpressionen von Prokollagen a1(I) und
Prokollagen a1(III) innerhalb des Beobachtungszeitraumes von 29 Tagen und auch bis zur
erfolgten Sektion nach acht Wochen aufgrund hier nicht geklärter gegenregulatorischer
Mechanismen im multiregulierten Stoffwechselweg nicht zur Entstehung einer Lungenfibrose
führen muss. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass im Rahmen einer interstitiellen
Pneumonie neben einer verstärkten Genexpression von Prokollagenen noch weitere Faktoren
vorhanden sein müssen um zu einer Lungenfibrose zu führen.
Bei der Beurteilung des klinischen Verlaufs anhand des von Frau Dr. Venner erhobenen
klinischen Scores, zeigte sich bis zum 5. Tag nach der Applikation von Perillaketon eine
Zunahme des Ausmaßes der klinischen Symptome. Der zu Beginn der proliferativen Phase
erreichte Maximalwert von durchschnittlich 8,5 Scorepunkten sprach dabei für das Vorliegen
einer hochgradigen, lebensbedrohenden Lungenerkrankung. Bis zum 15. Tag erfolgte eine
steige Abnahme bis zu einer mittleren Scorepunktzahl von 1 und die Pferde waren somit als
klinisch gesund zu beurteilen. Die Tatsache, dass die stärksten klinischen Erscheinungen drei
Tage vor den ausgeprägtesten histomorphologischen Veränderungen auftraten, kann damit in
Zusammenhang stehen, dass bei der transkutanen Biopsieentnahme nicht von allen Bereichen
137
der Lunge Gewebe gewonnen werden konnte. Ein unterschiedliches Ausmaß und ein
unterschiedlicher zeitlicher Verlauf der Alterationen in verschiedenen Lungenabschnitten
müssen als Ursache diskutiert werden. Diese Tatsache muss auch bei der Verwendung von
transkutan gewonnenen Lungenbiopsieproben in der klinischen Diagnostik berücksichtigt
werden. Wie elektronenmikroskopisch und in der immunhistochemischen Markierung von
Ki-67 dargestellt, tragen proliferierende Zellen vor allem in der proliferativen Phase erheblich
zur Verbreiterung der Blut-Luft-Schranke bei. Dennoch zeigen sich im Vergleich des
klinischen Scores mit den Ergebnissen der computergestützten, morphometrischen Analyse
erstaunlicherweise größere Parallelen zur Rate granulohistiozytärer Infiltrate als zur
Zellproliferationsrate. Die Frage die dadurch aufgeworfen wird, welchen genauen Anteil
entzündliche Infiltrate und proliferierende Zellen jeweils an der Entstehung der klinischen
Symptomatik besitzen, kann möglicherweise Einfluss auf eine Therapie der interstitiellen
Pneumonie in der proliferativen Phase besitzen. Zu deren Klärung wären weitere
Untersuchungen an einem umfangreicheren Patientengut erforderlich.
Insgesamt kann gesagt werden, dass durch die einmalige intravenöse Applikation von 6 mg /
kg KG Perillaketon, wobei die Dosis auf zwei Injektionen im Abstand von 30 min verteilt
wurde, das pathomorphologische Bild einer interstitiellen Pneumonie bis zu ihrer Ausheilung
erzeugt werden konnte. Bei der Verwendung Perillaketon- induzierter Lungenveränderungen
als Modell muss jedoch mit in Betracht gezogen werden, dass die Substanz in der benötigten
Dosierung große Nebenwirkungen besitzt. Zwei Pferde mussten bereits deutlich vor Ablauf
des festgesetzten Untersuchungszeitraums euthanasiert werden und die übrigen Tiere wurden
als lebenserhaltende Maßnahme über einen Zeitraum von 48 h mit Methylprednisolon und
Furosemid behandelt. Insbesondere die Anwendung steroidaler Antiphlogistika kann Einfluss
auf den Krankheitsverlauf nehmen und muss bei der Interpretation der Ergebnisse
einschränkend berücksichtigt werden. Wegen der immunsuppressiven Eigenschaften ist mit
einer Dämpfung der entzündlichen Reaktion zu rechnen, zudem ist auch die Hemmung der
Synthese von extrazellulären Matrixproteinen in Betracht zu ziehen. Es ist nicht
auszuschließen, dass im vorliegenden Versuch die Ausbildung einer chronisch-persistierenden
Entzündung oder fibrotischer Veränderungen unterdrückt wurde, obwohl aufgrund der
Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen und der Reverse Transkriptase-
quantitativen Polymerasekettenreaktion sowie der Kürze der Behandlungsdauer mit hoher
Wahrscheinlichkeit von einem zeitlich auf wenige Tage begrenzten Effekt auszugehen ist. Ein
weiterer Aspekt ist die interindividuelle Variabilität der Reaktion auf Perillaketon, wie sie
138
auch bei Versuchen an Schafen beschrieben wurde (COGGESHALL et al., 1987). Mit
Ausnahme von Pferd 3 und Pferd 5 wurden für die vorliegende Untersuchung pro Tier über
die Untersuchungsdauer von 29 Tagen in regelmäßigen Abständen insgesamt 36
Lungenbiopsieproben transkutan entnommen. An den Gewebeproben der Pferde 1 und 2 aus
dem Vorversuch konnte nach dem Abklingen der durch Perillaketon- induzierten
Veränderungen im Vergleich zu den Kontrollproben keine abweichenden Befunde mehr
erhoben werden, obwohl weiterhin Bioptate entnommen wurden. Auch die
Zellproliferationsrate, die Zelluntergangsrate und der Anteil an Entzündungszellen
normalisierten sich bei weiterhin erfolgter Probenentnahme. Trotz dieser hohen Zahl an
Eingriffen an der Lunge kann also davon ausgegangen werden, dass sie keinen erkennbaren
Einfluss auf die Versuchsergebnisse besitzen. Grundsätzlich ist also das neu etablierte
Tiermodell des Pferdes geeignet, verschiedenste Fragestellungen in Zusammenhang mit
interstitiellen Lungenerkrankungen des Pferdes auch in Zukunft zu bearbeiten.
139
6 Zusammenfassung
Morphologische Charakterisierung und molekulare Pathogenese Perillaketon-induzierter
Lungenveränderungen beim Pferd als Modell für die interstitielle Pneumonie
Stefan Schmidbauer
Um einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Pathogenese interstitieller Lungener-
krankungen zu leisten, wurden im Rahmen dieser Arbeit über einen Zeitraum von vier Wo-chen
transkutan entnommene Lungenbiopsieproben von sechs ausgewachsenen Pferden un-tersucht.
Bei den Tieren sollte durch die einmalige intravenöse Applikation von Perillaketon (1-(3-furyl) 4-
Methylpentaton) über einen akuten, diffusen Alveolarschaden eine interstitielle Pneumonie
induziert werden. Die morphologischen Veränderungen wurden auf licht- und
elektronenmikroskopischer Ebene untersucht. Als wesentliche Parameter zur Charakterisie-rung
des Krankheitsverlaufs wurden die Zellproliferations- und die Zelluntergangsrate, die Rate
granulohistiozytärer Infiltrate und der Anteil kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären
Septen durch computergestützte, morphometrische Analyse ermittelt. Aufgrund ihrer gr oßen
Bedeutung bei akuten und chronischen Lungenerkrankungen und ihre mögliche Eignung als
prognostische Faktoren quoad vitam und quoad valitudinem, erfolgte darüber hinaus die
Bestimmung der Expressionsraten des Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß), von Interleukin-
1ß (IL-1ß), Prokollagen a1(I) (COL1A1) und Prokollagen a1(III) (COL3A1). Mit der Reverse
Transkriptase-quantitativen Polymerasekettenreaktion (RT-qPCR) stand hie rfür eine
hochsensitive und -spezifische Untersuchungsmethode zur Verfügung, die für
Genexpressionsstudien anhand von Minimalbiopsieproben geeignet war.
Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:
1. Durch die einmalige intravenöse Applikation von 6 mg Perillaketon / kg KG konnten bei
sechs Pferden Veränderungen induziert werden, wie sie für die exsudative (Tag 1 – 4), die
proliferative (Tag 4 – 11) und die Ausheilungsphase (Tag 11 – 18) der interstitiellen
Pneumonie beschrieben sind. Von der exsudativen Phase bis in die proliferative Phase
konnten in unterschiedlichem Umfang epi- und endotheliale Defekte der alveolä ren Septen
mit geringgradiger Exsudation in die Alveolarlumina beobachtet werden. Die
Zellproliferationsrate als Ausdruck regenerativer und reparativer Prozesse stieg ab dem 1.
Versuchstag deutlich an und erreichte an Tag 8 ihren Maximalwert. Nach einem
Rückgang war auch 11 Tage nach Ende der Ausheilungsphase noch eine verstärkte
140
Zellproliferation feststellbar. Die Rate granulohistiozytärer Infiltrate stieg ebenfalls von
Tag 1 bis zu ihrem Maximum an Tag 8 an. Im Anschluss erfolgte eine Regression auf das
Ausgangsniveau bis Tag 15. Lediglich in der proliferativen Phase lag lichtmikroskopisch
feststellbar eine geringgradige Zunahme lymphozytärer Infiltrate vor. Bei zwei Tieren, die
aufgrund der Perillaketon-induzierten Lungenveränderungen in moribundem Zustand
euthanasiert werden mussten, zeigte sich unmitte lbar ante mortem ein deutlicher Anstieg
der Zelluntergangsrate.
2. Bei allen Tieren, die Veränderungen wie bei interstitieller Pneumonie aufwiesen, konnte
bereits nach 24 h in der exsudativen Phase eine Hochregulierung der Expression von
COL1A1 und COL3A1 beobachtet werden, die bis zum Abschluss des
Beobachtungszeitraums am 11. Tag nach Ende der lichtmikroskopisch festgestellten
Ausheilungsphase noch anhielt. Eine signifikante Zunahme extrazellulärer
Matrixbestandteile an den alveolären Septen oder morphologische Korrelate von
Lungenfibrose konnten im Beobachtungszeitraum von 29 Tagen nicht nachgewiesen
werden. Grundsätzlich ist aus diesen Ergebnissen zu schließen, dass eine deutliche
Hochregulierung von Prokollagen a1(I) und Prokollagen a1(III) bei Perillaketon-
induzierter interstitie ller Pneumonie nicht zu Entstehung von Lungenfibrose führen muss.
Als Ursache sind hier ungeklärte gegenregulatorische Mechanismen im multiregulierten
Stoffwechselweg anzunehmen. Die Eignung der Genexpressionsraten von COL1A1 und
COL3A1 als prognostische Faktoren für Lungenfibrose nach interstitieller Pneumonie ist
aufgrund der gewonnenen Ergebnisse fraglich. Unter welchen Bedingungen und ab
welchem Ausmaß eine verstärke Expression beim Pferd zur Lungenfibrose führt, konnte
in der vorliegenden Arbeit nicht geklärt werden. Hierfür sind nach diesen grundsätzlichen,
sondierenden Versuchen umfangreichere, klinische Studien erforderlich.
3. Bei je zwei Pferden mit pathomorphologischen Veränderungen wie bei interstitieller
Pneumonie konnte eine Hochregulierung der TGF-ß-Expression und der IL-1ß-Expression
beobachtet werden. Diese verstärkte Expression führte bei den betroffenen Tieren jedoch
nicht zu messbarer Fibrose.
In der vorliegende n Arbeit wurden erstmals umfangreiche und zusammenhängende
Untersuchungen in allen Stadien der interstitiellen Pneumonie beim Pferd bis zur Ausheilung
durchgeführt. Die Kombination der transkutanen Entnahmetechnik intra vitam, umfangreicher
morphologischer und morphometrischer Untersuchungen sowie der RT-qPCR an
Minimalbiopsieproben der Lunge des Pferdes stellt eine methodische Innovation dar, die
Modellcharakter für zukünftige molekularpathologische Studien am lebenden Tier haben kann.
141
7 Summary
Morphological characterization and molecular pathology of perilla-mint ketone induced acute
alveolar damage in horses as a model for interstitial pneumonia
Stefan Schmidbauer
In order to gain a better understanding upon the pathogenesis of interstitial lung diseases
transcutaneous lung biopsies of six adult horses were examined. In order to induce interstitial
pneumonia these horses received once 6 mg perilla ketone (1-(3-furyl) 4 –methylpentatone)
per kg body weight intravenously. The results of the lung biopsies were examined over a
period of four weeks post application (post appl.). The morphological changes were
investigated by light- and transmission electron microscopy. As parameters for the disease
follow-up, the cellular proliferation rate, cell death rate, rate of granulo-histiocyte infiltration
and the percentage of collagenous and reticular fibers were evaluated by computer aided
morphometric analysis. Because these factors are commonly accepted to play an important
role in acute and chronic lung diseases, the expression rates of transforming growth factor-ß
(TGF-ß), interleukin –1ß (IL-1ß), procollagen α1(1) (COL1A1) and procollagen α1(III)
(COL3A1) were analyzed.. The reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction
(RT-qPCR) were used as a highly sensitive and specific method for studying these gene
expressions.
The following results were obtained:
1. Following intravenous application of 6 mg perilla ketone per kg body weight six
horses developed changes typical for the exsudative (day 1 – 4), proliferative (day
4 – 11) and healing phase (day 11 – 18) of interstitial pneumonia. In the
exsudative phase and in the proliferative phase an epithelial and endothelial
damage of the alveolar septa in varying degree and low grade exsudation were
observed. The cellular proliferation rate, as a marker for regenerative and
reparative processes, significantly increased beginning on the first day of
examination and reached a maximum value on day eight post appl.. After
regression, eleven days after the end of the healing phase, an increased cellular
proliferation was still detectable. The granulo-histiocyte infiltration also increased
from day one post appl. and reached a maximum value at day eight. Afterwards a
142
decrease to the control level till day 15 occurred. Light microscopically, a low
grade lymphocyte infiltration was seen in the fibriproliferative phase. In two
moribund horses, that had to be euthanized because of the perilla ketone induced
changes a significant increase of the cell death rate was detected.
2. In all animals with induced interstitial pneumonia an upregulation of COL1A1
and COL3A1 was observed after the first 24 hours of the exsudative phase, lasting
till day eleven post appl. after the end of the light microscopic evaluated healing
phase, not leading to morphological changes of any lung fibrosis. It can be
concluded that in perilla keton induced interstitial pneumonia an overexpression
of procollagen α1(1) and procollagen α1(III) in between the observation period of
29 days must not lead to lung fibrosis. This must be due to antiregulatory
mechanisms in the multiregulated metabolic pathway of collagene. It remains
unclear, if the gene expression rates of COL1A1 and COL3A1 will serve as
valuable markers for the prognostic factors of lung fibrosis after interstitial
pneumonia. The conditions under which an upregulated expression leads to a lung
fibrosis in the horse were not evaluated. More basic clinical studies are necessary
to deal with this specific problem.
3. TGF-ß and IL-1ß upregulation was observed in two horses each, respectively.
These increased expressions did not lead to detectable lung fibrosis.
This work constitutes the first extensive and coherent study dealing with all stages of
interstitial pneumonia in the horse until the healing phase. The combination of transcutaneous
biopsy, extensive morphologic and morphometric analysis in combination with the reverse
transcriptase polymerase chain reaction in minimal biopsies constitutes a methodic innovation
with possible model character for future molecular pathological studies in living animals.
143
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205
9 Anhänge
9.1 Ergebnisse der morphometrischen Untersuchungen (Rohdaten)
Tabelle 11: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zellproliferationsrate anhand
der immunhistochemischen Markierung von Ki-67 (Pferd 1 – 4)
Pferd 1 Pferd 2
Versuchstag x Ki-67-pos. Zellen (%) s x Ki-67-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 0,8 0,6 1,3 00,3
1 0,7 0,4 1,6 00,3
3 4,2 2,2 2,8 01,6
7 4,8 1,8 3,6 00,3
10 1,2 0,9 2,0 01,5
14 1,0 0,8 1,8 01,3
17 0,6 0,0 2,3 01,5
21 0,7 0,3 0,3 00,1
24 0,2 0,1 0,8 00,7
28 0,6 0,5 0,2 00,2
Pferd 3 Pferd 4
Versuchstag x Ki-67-pos. Zellen (%) s x Ki-67-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 00,7 0,5 01,9 13,0
1 02,6 1,9 18,4 09,4
4 04,0 0,7 08,7 02,3
8 15,8 5,2 21,3 12,4
11 * * 18,1 12,9
15 05,1 02,4
18 05,8 02,0
22 03,6 05,0
25 05,8 02,4
29 02,5 03,4
x Ki-67-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl aller
Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller
Kontrolleproben; s = Standardabweichung
* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
206
Tabelle 12: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zellproliferationsrate anhand
der immunhistochemischen Markierung von Ki-67 (Pferd 5 – 8)
Pferd 5 Pferd 6
Versuchstag x Ki-67-pos. Zellen (%) s x Ki-67-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 0,4 0,2 08,1 34,0
1 3,1 1,1 05,4 06,3
4 4,9 3,3 12,3 23,0
8 * * 34,4 21,0
11 26,0 10,5
15 15,2 10,6
18 05,3 02,7
22 10,9 03,4
25 05,8 03,7
29 14,3 11,0
Pferd 7 Pferd 8
Versuchstag x Ki-67-pos. Zellen (%) s x Ki-67-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 09,3 05,7 06,5 03,7
1 22,3 06,7 13,7 66,6
4 13,8 07,5 25,3 10,0
8 31,4 11,8 ** **
11 36,3 16,2 14,7 06,9
15 28,6 10,8 13,7 06,6
18 10,0 00,7 14,5 05,1
22 11,8 11,0 12,1 03,8
25 13,8 01,0 03,4 01,8
29 11,7 08,8 11,4 04,6
x Ki-67-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils Ki-67-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl aller
Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller
Kontrolleproben; s = Standardabweichung;
* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
207
Tabelle 13: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zelluntergangsrate anhand der
Darstellung nekrotischer und apoptotischer Zellen durch terminal dUTP nick end
labeling (Pferd 1 – 4)
Pferd 1 Pferd 2
Versuchstag x TUNEL-pos. Zellen (%) s x TUNEL-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 0,4 0,2 0,3 0,1
1 0,2 0,2 0,2 0,1
3 0,2 0,1 0,1 0,1
7 0,3 0,4 0,4 0,1
10 0,7 0,5 0,2 0,0
14 0,7 0,3 0,6 0,5
17 0,1 0,1 0,5 0,2
21 0,1 0,1 0,5 0,3
24 0,2 0,1 0,4 0,6
28 0,4 0,3 0,2 0,1
Pferd 3 Pferd 4
Versuchstag x TUNEL-pos. Zellen (%) s x TUNEL-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 1,9 1,4 1,1 0,7
1 1,2 1,0 0,6 0,3
4 2,0 0,0 0,7 0,1
8 4,1 2,0 0,5 0,8
11 * * 0,7 0,5
15 0,4 0,3
18 0,6 0,4
22 0,9 0,5
25 0,8 0,4
29 0,6 0,5
x TUNEL-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl aller
Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller
Kontrolleproben; s = Standardabweichung;
* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
208
Tabelle 14: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zelluntergangsrate anhand der
Darstellung nekrotischer und apoptotischer Zellen durch terminal dUTP nick end
labeling (Pferd 5 – 8)
Pferd 5 Pferd 6
x TUNEL-pos. Zellen (%) s x TUNEL-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 0,6 0,2 0,5 0,4
1 0,5 0,3 0,7 0,4
4 3,0 2,4 0,4 0,3
8 * * 0,2 0,2
11 0,4 0,3
15 0,2 0,2
18 0,3 0,2
22 0,4 0,2
25 0,3 0,2
29 0,5 0,2
Pferd 7 Pferd 8
x TUNEL-pos. Zellen (%) s x TUNEL-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 0,9 0,8 1,0 0,6
1 0,2 0,3 1,0 0,5
4 0,4 0,3 ** **
8 0,5 0,2 1,6 1,2
11 0,5 0,2 1,1 0,6
15 0,8 0,5 0,8 0,2
18 1,0 0,5 1,0 0,6
22 0,5 0,4 0,6 0,3
25 0,7 0,4 1,6 1,0
29 0,4 0,5 0,8 0,4
x TUNEL Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils TUNEL-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl aller
Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller
Kontrolleproben; s = Standardabweichung;
* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
209
Tabelle 15: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zellinfiltrationsrate von
Makrophagen und Granulozyten anhand der immunhistochemischen Markierung
MAC 387-positiver Zellen (Pferd 1 – 4)
Pferd 1 Pferd 2
Versuchstag x MAC 387-pos. Zellen (%) s x MAC 387-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 1,9 1,3 1,6 0,9
1 3,2 0,8 1,0 0,6
3 2,2 1,9 2,3 1,9
7 2,8 2,4 4,8 0,0
10 2,3 1,5 1,3 0,6
14 3,4 1,4 1,6 1,9
17 2,4 0,9 1,7 0,5
21 2,0 1,3 2,1 1,0
24 1,6 0,9 1,5 0,6
28 1,3 0,6 4,0 0,8
Pferd 3 Pferd 4
Versuchstag x MAC 387-pos. Zellen (%) s x MAC 387-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 1,5 1,1 3,1 2,3
1 0,5 0,8 4,2 2,6
4 2,0 1,4 4,0 1,5
8 6,5 3,8 8,0 6,2
11 * * 3,7 0,9
15 1,8 0,7
18 3,3 0,8
22 2,1 1,1
25 2,8 0,3
29 2,3 1,1
x MAC 387-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl
aller Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller
Kontrolleproben; s = Standardabweichung;
* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
210
Tabelle 16: Ergebnisse der morphometrischen Bestimmung der Zellinfiltrationsrate von
Makrophagen und Granulozyten anhand der immunhistochemischen Markierung
MAC 387-positiver Zellen (Pferd 5 – 8)
Pferd 5 Pferd 6
Versuchstag x MAC 387-pos. Zellen (%) s x MAC 387-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 2,5 1,9 02,2 1,1
1 6,4 2,5 07,3 3,7
4 6,1 2,0 07,0 3,4
8 * * 10,0 9,2
11 02,5 1,7
15 02,5 1,4
18 04,6 1,4
22 02,0 0,4
25 01,8 1,2
29 02,1 0,3
Pferd 7 Pferd 8
Versuchstag x MAC 387-pos. Zellen (%) s x MAC 387-pos. Zellen (%) s
x Kontrolle 3,1 1,9 04,0 2,4
1 2,6 0,6 02,6 2,3
4 8,5 4,7 ** **
8 9,5 2,6 11,2 5,2
11 6,2 1,9 07,8 4,7
15 4,1 1,5 01,9 0,9
18 2,9 0,4 02,0 0,8
22 1,6 0,6 01,5 0,6
25 4,7 2,6 02,8 1,9
29 2,0 1,0 01,8 0,8
x MAC 387-pos. Zellen = arithmetisches Mittel des Anteils MAC 387-positiver Zellen an der Gesamtzellzahl
aller Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller
Kontrolleproben; s = Standardabweichung;
* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
211
Tabelle 17: Ergebnisse der phasenanalytischen Bestimmung des Anteils kollagener und
retikulärer Fasern an der alveolären Septen anhand der Darstellung in der
Heidenhainschen Azanfärbung (Pferd 1, 2, 4, 6)
Pferd 1 Pferd 2
Versuchstag x Anteil kollagener und
retikulärer Fasern (%) s
x Anteil kollagener und
retikulärer Fasern (%) s
x Kontrolle 010,3 09,1 11,8 07,6
1 08,7 06,8 14,8 04,3
3 10,1 03,5 08,7 03,0
7 16,2 06,9 10,5 06,1
10 13,2 16,7 10,7 04,3
14 04,9 02,1 14,0 09,2
17 08,5 02,2 08,2 02,9
21 08,6 04,7 16,7 10,8
24 07,8 01,9 08,1 03,3
28 15,7 08,7 06,4 02,5
Pferd 4 Pferd 6
Versuchstag x Anteil kollagener und
retikulärer Fasern (%) s
x Anteil kollagener und
retikulärer Fasern (%) s
x Kontrolle 07,1 2,4 07,6 1,8
1 14,0 3,1 07,6 4,6
4 05,6 1,7 08,1 2,9
8 08,3 8,0 03,2 2,5
11 07,9 4,9 08,2 3,6
15 06,9 3,3 09,1 8,1
18 08,7 1,4 12,4 8,5
22 08,9 5,7 07,1 5,2
25 08,9 5,4 06,9 2,7
29 09,6 5,5 06,3 3,3
x = arithmetisches Mittel des Anteils kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären Septen aller
Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller
Kontrolleproben; s = Standardabweichung;
212
Tabelle 18: Ergebnisse der phasenanalytischen Bestimmung des Anteils kollagener und
retikulärer Fasern an der alveolären Septen anhand der Darstellung in der
Heidenhainschen Azanfärbung (Pferd 7 + 8)
Pferd 7 Pferd 8
Versuchstag x Anteil kollagener und
retikulärer Fasern (%) s
x Anteil kollagener und
retikulärer Fasern (%) s
x Kontrolle 10,9 4,2 12,5 5,9
1 10,0 4,0 09,4 2,2
4 06,0 2,6 ** **
8 09,9 5,1 05,5 4,2
11 07,6 4,7 08,2 3,2
15 10,9 5,3 05,9 2,6
18 06,1 2,9 09,7 3,7
22 09,4 6,7 10,8 4,3
25 07,4 3,9 13,1 9,8
29 08,5 4,4 14,8 5,0
x = arithmetisches Mittel des Anteils kollagener und retikulärer Fasern an den alveolären Septen aller
Biopsielokalisationen eines Entnahmetages; x Kontrolle = arithmetisches Mittel der Werte aller
Kontrolleproben; s = Standardabweichung;
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
213
9.2 Ergebnisse der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (Rohdaten)
Tabelle 19: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von IL-1ß-mRNA von Pferd 1 - 4
Pferd 1 Pferd 2
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 29,63 0,63 1043950 316211 28,21 0,19 2541667 800396
Kontrolle 2 28,52 0,46 2179333 396213 27,92 0,14 3058167 834847
1 27,18 0,60 5.586.333 5.586.333 28,10 0,15 2.700.333 708.745
3 27,84 0,65 3.578.000 3.578.000 27,04 0,18 5.568.000 138.2386
7 26,78 0,60 7.333.167 7.333.167 27,82 0,16 3.269.167 805.613
10 28,05 0,57 3.068.500 3.068.500 28,07 0,18 2.768.667 778.373
14 26,43 0,45 9.195.500 9.195.500 26,45 0,20 8.337.000 175.4401
17 26,74 0,63 7.606.333 7.606.333 27,03 0,12 5.554.167 886.487
21 27,19 0,79 5.726.667 5.726.667 29,19 0,14 1.266.900 292.794
24 27,92 0,56 3.356.167 3.356.167 28,22 0,18 2.471.833 559.842
Pferd 3 Pferd 4
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 27,91 0,63 3807000 1121032
Kontrolle 2 28,49 0,42 2474333 445988 28,04 0,60 1775667 199068
1 27,70 0,34 4.257.667 650.627 28,65 0,61 1.199.833 148.210
4 28,06 0,46 3.355.000 681.382 27,85 0,60 2.003.833 187.421
8 26,65 0,42 8.793.833 1.567.931 27,03 0,54 3.380.000 203.250
11 * * * * 26,69 0,51 4.240.500 426.825
15 27,00 0,64 3.482.167 499.068
18 27,73 0,62 2.182.500 324.455
22 26,99 0,67 3.528.333 671.086
25 27,67 0,55 2.256.000 349.425
29 27,60 0,49 2.350.333 263.875
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
214
Tabelle 20: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von IL-1ß-mRNA von Pferd 5 - 6
Pferd 5 Pferd 6
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 31,57 0,48 313750 112536 30,79 0,64 228533 48465
Kontrolle 2 32,25 0,39 193417 55615 30,84 0,42 218183 22798
1 30,40 0,41 691.733 178.964 29,05 0,41 690.633 34.622
3 28,87 0,35 1.960.667 473.571 28,33 0,42 1.103.667 65.065
7 * * * * 28,65 0,42 896.000 71.625
10 29,73 0,51 446.617 48.787
14 29,37 0,30 564.767 55.896
17 30,55 0,36 262.033 20.529
21 29,75 0,28 440.500 40.949
25 29,87 0,25 408.950 48.277
Pferd 7 Pferd 8
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 28,32 0,30 1453167 225762 27,48 0,27 2798833 497097
Kontrolle 2 28,07 0,21 1711333 168613 27,46 0,07 2793833 99425
1 26,53 0,14 4.982.167 507.799 26,98 0,13 3.907.833 278.929
4 26,20 0,23 6.265.167 737.158 ** ** ** **
8 26,62 0,23 4.702.667 487.299 27,43 0,28 2.904.833 516.687
11 27,02 0,11 3.553.667 413.238 26,98 0,19 3.913.333 403.712
15 27,79 0,26 2.112.833 477.373 28,35 0,18 1.512.167 146.128
18 26,47 0,19 5.252.167 770.236 27,29 0,11 3.150.833 320.673
22 26,73 0,23 4.382.500 623.626 26,87 0,14 4.208.167 310.062
25 26,81 0,25 4.127.500 588.872 27,21 0,23 3.363.167 522.699
29 27,14 0,20 3281.833 474.255 26,77 0,18 4.516.000 394.258
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
215
Tabelle 21: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von TGF-ß-mRNA von Pferd 1-4
Pferd 1 Pferd 2
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 31,81 0,99 1.184.120 677.522 31,74 0,28 4.334.800 2.686.663
Kontrolle 2 30,61 0,72 2.129.683 866.394 32,89 0,79 1.659.740 727.546
1 29,65 0,46 3.626.000 901.120 32,54 0,63 1.951.000 641.401
3 29,24 0,35 4.632.167 980.347 31,68 0,44 4.333.800 2.487.382
7 28,51 0,58 7.452.667 2.610.796 31,79 0,66 3.853.400 2.384.003
10 28,63 0,63 6.630.000 2.753.472 32,66 0,97 2.652.000 2.294.842
14 29,42 0,70 4.532.200 1.665.279 31,68 0,63 4.589.400 3.178.256
17 30,79 0,79 2.036.400 1.125.832 31,84 0,59 2.971.167 982.441
21 30,15 0,91 2.932.333 1.463.888 34,40 1,00 862.340 675.226
24 30,63 1,04 2.197.125 1.150.109 32,26 0,82 2.542.667 1.468.307
Pferd 3 Pferd 4
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 27,62 0,49 4.903.667 2.515.710 ** ** ** **
Kontrolle 2 29,42 0,37 1.479.867 806.839 29,34 0,37 4.428.500 835.244
1 29,01 0,42 1.988.533 1.028.206 29,70 0,47 3.554.667 647.317
4 29,15 0,17 1.757.800 8.66.004 29,43 0,70 4.347.000 1.400.627
8 27,03 0,57 7.262.500 4.246.329 27,25 0,75 16.529.500 5.712.273
11 * * * * 28,22 0,48 8.799.167 1.866.666
15 28,03 0,81 10.602.167 4.817.919
18 29,56 0,77 4.203.667 2.100.636
22 29,89 0,67 3.294.333 1.149.657
25 30,11 0,27 2.769.667 543.540
29 30,18 0,58 2.704.500 713.630
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
216
Tabelle 22: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von TGF-ß-mRNA von Pferd 5 - 8
Pferd 5 Pferd 6
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 30,16 0,24 1.028.417 585.025 29,82 0,54 2.548.833 784.904
Kontrolle 2 30,49 0,30 852.917 523.927 30,43 0,72 1.784.067 656.481
1 29,64 0,44 1.483.650 1.034.325 29,64 0,54 2.839.333 798.983
4 28,22 0,44 3.442.000 1.590.873 28,77 0,83 5.122.000 2.191.137
8 * * * * 28,16 0,74 7.435.167 3.365.408
11 27,86 0,90 9.177.333 4.308.620
15 29,45 0,58 3.241.000 1.183.812
18 30,19 0,56 2.018.167 562.134
22 30,53 0,40 1.604.500 339.616
25 30,18 0,51 2.024.333 581.614
Pferd 7 Pferd 8
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 28,55 0,23 7.938.000 1.193.994 28,69 0,15 6.893.333 3.716.932
Kontrolle 2 29,43 0,37 4.639.333 1.127.808 29,08 0,56 4.850.333 1.156.157
1 29,26 0,46 5.226.167 1.456.491 29,47 1,02 3.862.667 1.180.806
4 28,33 0,74 9.734.833 4.276.467 ** ** ** **
8 27,01 0,15 20.568.333 1.818.322 27,59 0,85 12.586.667 4.500.533
11 26,63 0,77 28.878.333 15.290.237 27,97 0,98 9.730.833 2.389.754
15 28,49 0,56 8.574.167 3.263.166 27,89 0,82 10.755.333 5.782.834
18 29,72 0,56 3.966.167 1.343.887 28,91 0,89 5.044.000 2.340.783
22 30,92 0,72 1.938.217 833.125 30,08 1,00 2.762.500 1.245.669
25 29,53 0,91 4.828.833 2.484.381 29,49 1,03 4.484.800 1.640.233
29 29,54 0,76 4.673.833 2.252.251 29,79 0,89 2.818.000 865.407
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
217
Tabelle 23: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von Prokollagen a1(I)-mRNA
von Pferd 1 - 4
Pferd 1 Pferd 2
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 27,97 0,23 1.810.500 463.868 27,01 0,26 2.796.167 928.756
Kontrolle 2 26,96 0,21 3.492.167 787.875 26,62 0,29 3.569.333 984.622
1 25,94 0,37 6.996.833 2.132.558 26,47 0,24 3.924.833 1.003.266
3 25,44 0,26 9.553.500 2.428.944 25,10 0,38 9.800.833 2.706.515
7 25,96 0,23 6.804.167 1.689.667 25,75 0,41 6.324.500 1.711.699
10 26,19 0,28 5.846.000 1.570.143 27,29 0,12 2.281.500 515.589
14 26,12 0,24 6.110.667 1.345.851 26,07 0,21 5.159.333 1.423.130
17 26,67 0,30 4.265.833 1.119.563 25,90 0,37 5.783.000 1.581.422
21 26,11 0,29 6.188.667 1.707.925 27,77 0,24 1.668.833 431.995
24 26,98 0,37 3.513.000 1.050.468 25,86 0,30 5909.833 1.707.552
Pferd 3 Pferd 4
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 27,13 0,24 2.929.833 559.774 ** ** ** **
Kontrolle 2 28,08 0,15 1.536.667 202.728 27,14 0,21 3.002.667 404.521
1 26,10 0,10 5.722.000 432.841 26,64 0,27 4.204.167 730.159
4 24,92 0,10 12.530.000 969.103 25,50 0,33 9.072.167 1.866.780
8 25,95 0,15 6.330.500 691.985 24,67 0,14 15.585.000 1.416.203
11 * * * * 24,04 0,23 23.816.667 3.615.913
15 24,62 0,16 16.083.333 1.684.324
18 25,34 0,27 10.018.167 1.733.701
22 25,36 0,26 9.902.500 1.648.394
25 25,88 0,23 6.948.667 1.042.623
29 26,02 0,25 6.337.167 1.005.572
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
218
Tabelle 24: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von Prokollagen a1(I)-mRNA
von Pferd 5 - 8
Pferd 5 Pferd 6
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 27,71 0,08 2.158.167 118.916 27,35 0,18 2.801.500 262.032
Kontrolle 2 27,98 0,15 1.813.000 190.043 28,25 0,25 1.547.500 252.335
1 27,95 0,18 1.847.333 214.423 25,37 0,21 10.564.000 1.429.733
4 26,24 0,23 5.786.500 834.813 24,46 0,21 19.561.667 3.092.620
8 25,35 0,09 10.425.167 560.314 24,43 0,14 19.868.333 1.575.911
11 * * * * 24,37 0,20 20.561.667 2.166.614
15 25,45 0,29 10.129.167 2.010.495
18 25,50 0,34 9.818.000 1.819.110
22 28,26 0,34 7.276.400 1.245.028
25 25,10 0,29 12.814.667 2.195.815
Pferd 7 Pferd 8
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 26,37 0,15 4.339.333 696.349 25,98 0,07 5.967.000 796.429
Kontrolle 2 26,01 0,26 5.570.333 1.151.406 25,99 0,13 5.928.000 1.037.662
1 26,15 0,16 5.061.333 868.219 24,72 0,19 13.821.667 2.230.744
4 24,89 0,25 11.789.167 2.508.777 ** ** ** **
8 23,84 0,23 23.706.667 4.853.393 23,80 0,14 25.498.333 4.226.769
11 22,74 0,17 51.631.667 7.778.405
15 23,03 0,22 40.718.333 8.471.726 23,39 0,10 33.316.667 2.887.412
18 23,42 0,40 32.043.333 9.230.744 23,43 0,19 32.820.000 6.228.416
22 23,98 0,38 21.845.000 6.104.319 24,53 0,24 15.770.000 2.977.724
25 25,14 0,32 10.074.167 2.471.003 24,36 0,30 17.686.667 3.781.527
29 24,23 0,40 18.485.000 4.637.606 24,11 0,36 21.116.667 5.213.892
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
219
Tabelle 25: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von Prokollagen a1(III)-mRNA
von Pferd 1 - 4
Pferd 1 Pferd 2
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 27,95 0,51 1824.476 319.311 26,82 0,31 3667.667 929.681
Kontrolle 2 27,09 0,38 3304.381 666.681 26,32 0,13 5047.000 586.812
16 25,26 0,38 11.426.238 2.226.568 25,82 0,13 7.105.000 946.869
3 24,91 0,62 14.397.619 3.177.500 24,59 0,06 16.326.667 1.303.897
7 25,16 0,40 12.199.476 1.975.767 25,18 0,16 10.997.167 1.652.361
10 30,62 0,60 5.795.000 708.114 27,36 0,30 2.539.000 622.123
14 25,02 0,49 13.159.524 1.440.686 25,79 0,20 7.300.000 1.311.911
17 25,94 0,40 7.190.381 1.264.831 25,60 0,33 8.409.000 2.074.726
21 25,06 0,33 13.347.143 3.219.259 27,34 0,23 2.544.167 444.969
24 25,65 0,36 8.837.429 1.897.917 25,28 0,15 10.277.500 1473.084
Pferd 3 Pferd 4
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 25,60 0,24 3.337.850 2.509.896 ** ** ** **
Kontrolle 2 27,23 0,08 1.174.433 933.394 26,48 0,34 7132167 1.344.368
1 24,25 0,08 8.849.000 6.971.813 25,74 0,33 11621667 1.057.855
4 24,50 0,11 7.485.833 5.944.525 24,05 0,25 36733333 3.834.025
8 22,17 0,17 3.6092.667 28.214.428 22,32 0,27 118483333 8.194.002
11 * * * * 21,89 0,53 160550000 24.470.860
15 23,07 0,30 71.585.000 6.343.787
18 23,88 0,35 41.540.000 5.900.881
22 23,57 0,40 51.078.333 3.549.577
25 24,15 0,42 34.368.333 2.233.154
29 24,38 0,24 29.351.667 3.566.149
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
220
Tabelle 26: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von Prokollagen a1(III)-mRNA
von Pferd 5 - 8
Pferd 5 Pferd 6
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 26,75 0,50 1.343.000 1.024.459 26,54 0,69 5.753.000 1.266.323
Kontrolle 2 26,45 0,66 1.780.133 1.463.738 27,19 0,65 3.692.167 629.326
1 24,85 0,51 4.842.000 3.969.508 23,10 0,81 59.121.667 3.531.750
4 23,38 0,54 13.748.000 10.932.376 22,56 0,74 85.851.667 8.352.787
8 * * * * 22,21 0,70 108.208.333 6.831.868
11 22,82 0,79 72.343.333 10.558.058
15 23,51 0,78 44.760.000 4.248.459
18 23,76 0,73 37.783.333 2.674.933
22 23,70 0,67 39.295.000 3.041.307
25 23,20 0,94 57.048.333 13.044.043
Pferd 7 Pferd 8
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 26,31 0,35 12.134.333 3.379.357 24,81 0,42 39.791.667 10.920.147
Kontrolle 2 24,86 0,30 32.425.000 7.103.539 24,91 0,31 36.613.333 7.644.168
1 24,81 0,33 33.555.000 8.013.570 23,74 0,41 82.515.000 21.941.246
4 23,40 0,23 86.496.667 13.241.925 ** ** ** **
8 21,40 0,30 338.333.333 57.764.060 21,36 0,29 407.450.000 57.885.534
11 20,86 0,32 492.350.000 93.169.711 21,40 0,26 394.533.333 51.887.327
15 22,15 0,29 203.300.000 35.185.338 22,10 0,31 246.083.333 44.292.908
18 22,50 0,30 160.466.667 29.644.876 21,88 0,29 285.233.333 41.378.336
22 23,75 0,47 70.308.333 22.239.879 23,12 0,04 122.033.333 5.374.632
25 22,29 0,28 185.450.000 34.168.216 22,16 0,20 23.621.667 28.394.465
29 21,91 0,40 242.533.333 5.984.153 22,20 0,24 230.216.667 30.782.814
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
221
Tabelle 27: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von EF-1a-mRNA von Pferd 1 - 4
Pferd 1 Pferd 2
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 26,98 0,17 2.427.333.333 403.837.426 28,45 0,54 1.139.500.000 115.250.597
Kontrolle 2 26,86 0,13 2.635.166.667 437.847.652 28,16 0,46 1.440.500.000 427.388.699
1 26,29 0,29 3.921.000.000 1.020.226.838 26,98 0,49 3.292.500.000 721.224.722
3 25,82 0,17 5.317.000.000 762.219.129 26,32 0,31 5.343.666.667 1.433.983.914
7 26,29 0,29 3.925.500.000 1.071.801.428 26,57 0,48 4.445.166.667 92.7076.966
10 26,13 0,07 4.286.833.333 405.028.106 28,68 0,44 977.383.333 177.968.800
14 26,65 0,27 3.096.666.667 857.157.551 27,38 0,74 2.445.000.000 352.331.662
17 25,96 0,24 4.804.166.667 444.427.459 27,06 0,46 3.075.666.667 327.370.534
21 26,61 0,10 3.088.166.667 356.080.562 29,31 1,43 783.260.000 405.408.976
24 27,19 0,11 2.099.000.000 406.411.122 26,96 0,41 3.341.833.333 776.930.992
Pferd 3 Pferd 4
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 27,43 0,22 1.241.716.667 462.852.635 ** ** ** **
Kontrolle 2 27,64 0,23 1.064.333.333 419.714.011 28,13 0,16 761.633.333 147.595.537
1 26,94 0,46 1.844.516.667 825.979.541 28,65 0,25 526.433.333 135.650.045
4 27,08 0,34 1.661.683.333 722.116.335 27,12 0,35 1.626.000.000 437.045.078
8 25,98 0,25 3.712.166.667 1.420.270.878 26,56 0,29 2.475.166.667 762.520.404
11 * * * * 27,18 0,25 1.542.500.000 325.377.780
15 28,02 0,23 828.783.333 178.908.898
18 27,92 0,23 886.083.333 174.999.799
22 28,15 0,22 753.200.000 162.577.637
25 28,27 0,16 682.083.333 113.204.778
29 28,26 0,22 683.366.667 68.796.182
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 3 wurde am 11. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
222
Tabelle 28: Ergebnisse der qPCR für den Nachweis von EF-1a-mRNA von Pferd 5 - 8
Pferd 5 Pferd 6
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 28,97 0,15 241.500.000 96963354 29,40 0,75 485.216.667 246.159.878
Kontrolle 2 28,50 0,17 331.550.000 92542158 29,30 0,61 496.283.333 172.497.437
1 28,21 0,20 409.850.000 105182941 28,10 0,64 1.239.283.333 425.785.901
4 26,53 0,26 1.478.000.000 416694612 26,79 0,71 3.230.333.333 617.833.850
8 * * * * 26,36 0,42 4.495.000.000 995.074.068
11 26,49 0,91 4.168.166.667 1.200.865.757
15 27,99 0,27 1.305.933.333 312.986.176
18 28,45 0,34 926.783.333 221.781.247
22 27,99 0,62 1.281.000.000 114.579.230
25 27,46 0,43 1.922.333.333 319.215.079
Pferd 7 Pferd 8
Versuchs-
tag x Ct s x Kop. s x Ct s x Kop. s
Kontrolle 1 27,26 0,26 1.013.466.667 289.475.821 27,88 0,31 1.417.633.333 645.154.167
Kontrolle 2 26,96 0,33 1.238.366.667 388.435.089 27,70 0,42 1.590.250.000 645.230.637
1 27,15 0,25 1.090.566.667 299.005.489 27,63 0,29 1.679.533.333 724.402.738
4 26,16 0,32 2.055.000.000 571.714.264 ** ** ** **
8 26,68 0,28 1.466.000.000 416.460.322 25,84 0,28 5.643.166.667 2.801.765.259
11 26,88 0,28 1.283.300.000 316.638.810 26,50 0,41 3.834.500.000 2.299.758.487
15 26,63 0,30 1.518.166.667 424.698.207 26,64 0,30 3.347.833.333 1.656.497.319
18 27,06 0,44 1.132.300.000 206.387.965 27,20 0,24 2.142.833.333 737.682.158
22 27,31 0,28 978.200.000 250.037.941 27,27 0,05 2.050.500.000 717.659.181
25 26,96 0,52 1.201.333.333 167.900.764 26,83 0,22 2.937.666.667 1.462.966.393
29 26,94 0,21 1.246.783.333 357.753.918 27,40 0,25 2.010.333.33 1.002.748.556
x Ct = arithmetisches Mittel der Threshold Cycle aus Messdurchgang 1 + 2; x Kop. = arithmetisches Mittel
der Kopienzahlen aus Messdurchgang 1 + 2; s = Standardabweichung der Werte aus Messdurchgang 1 + 2;
* Pferd 5 wurde am 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
223
Tabelle 29: Kopienzahl IL-1ß-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Vorversuch)
Versuchstag Pferd 1 Pferd 2 x s
x Kontrolle 0,63 2,18 1,40 1,09
1 1,42 0,82 1,12 0,43
3 0,67 1,04 0,86 0,26
7 1,87 0,74 1,30 0,80
10 0,72 2,88 1,80 1,53
14 2,97 3,64 3,30 0,47
17 1,58 1,79 1,69 0,14
21 1,85 1,76 1,81 0,07
24 1,60 0,70 1,15 0,63
Tabelle : Kopienzahl IL-1ß-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Hauptversuch)
Versuchstag Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6 Pferd 7 Pferd 8 x s
x Kontrolle 2,70 2,33 0,79 0,46 1,41 1,87 1,60 0,86
1 2,31 2,28 1,69 0,56 4,57 2,33 2,13 1,44
4 2,02 1,23 1,33 0,34 3,05 ** 1,67 1,00
8 2,37 1,37 * 0,20 3,21 0,51 1,50 1,13
11 * 2,75 0,21 2,77 1,02 1,69 1,28
15 4,20 0,34 1,39 0,45 1,60 1,80
18 2,46 0,61 4,64 1,47 2,30 1,74
22 4,68 0,20 4,48 2,05 2,86 2,13
25 3,31 0,23 3,44 1,14 2,03 1,60
29 3,44 ** 2,63 2,25 2,77 0,61
x Kontrolle = arithmetisches Mittel aller Kontrollwerte; x = arithmetisches Mittel; s = Standardabweichung;
* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
224
Tabelle 30: Kopienzahl TGF-ß-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Vorve rsuch)
Versuchstag Pferd 1 Pferd 2 x s
x Kontrolle 0,65 2,48 1,56 1,29
1 0,92 0,59 0,76 0,23
3 0,87 0,81 0,84 0,04
7 1,90 0,87 1,38 0,73
10 1,55 2,75 2,15 0,85
14 1,46 2,00 1,73 0,38
17 0,42 0,96 0,69 0,38
21 0,95 1,20 1,07 0,18
24 1,05 0,72 0,89 0,23
Tabelle 31: Kopienzahl TGF-ß-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Hauptversuch)
Versuchstag Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6 Pferd 7 Pferd 8 x s
x Kontrolle 2,67 5,81 3,42 4,42 5,79 3,96 4,34 1,27
1 1,08 6,75 3,62 2,29 4,79 2,30 3,47 2,05
4 1,06 2,67 2,33 1,59 4,74 ** 2,48 1,41
8 1,96 6,68 * 1,65 14,03 2,23 5,31 5,29
11 * 5,70 2,20 22,50 2,54 8,24 9,64
15 12,79 2,48 5,65 3,21 6,03 4,70
18 4,74 2,18 3,50 2,35 3,19 1,19
22 4,37 1,25 1,98 1,35 2,24 1,46
25 4,06 1,05 4,02 1,53 2,66 1,60
29 3,96 ** 3,75 1,40 3,04 1,42
x Kontrolle = arithmetisches Mittel aller Kontrollwerte; x = arithmetisches Mittel; s = Standardabweichung
* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
225
Tabelle 32: Kopienzahl Prokollagen a1(I)-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Vorversuch)
Versuchstag Pferd 1 Pferd 2 x s
x Kontrolle 0,10 0,25 0,18 0,10
1 0,18 0,12 0,15 0,04
3 0,18 0,18 0,18 0,00
7 0,17 0,14 0,16 0,02
10 0,14 0,24 0,19 0,07
14 0,20 0,23 0,21 0,02
17 0,09 0,19 0,14 0,07
21 0,20 0,23 0,22 0,02
24 0,17 0,17 0,17 0,00
Tabelle 33: Kopienzahl Prokollagen a1(I)-mRNA / 102 Kopien EF-1a (Hauptversuch)
Versuchstag Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6 Pferd 7 Pferd 8 x s
x Kontrolle 0,19 0,39 0,65 0,44 0,44 0,40 0,42 0,15
1 0,31 0,80 1,41 0,85 0,46 0,82 0,78 0,38
4 0,75 0,56 0,71 0,61 0,57 ** 0,64 0,09
8 0,17 0,63 * 0,44 1,62 0,45 0,66 0,56
11 * 1,54 0,49 1,35 1,13 0,56
15 1,94 0,78 2,68 1,00 1,60 0,88
18 1,13 1,06 2,83 1,53 1,64 0,82
22 1,31 0,57 2,23 0,77 1,22 0,74
25 1,02 0,67 0,84 0,60 0,78 0,19
29 0,93 ** 1,48 1,05 1,15 0,29
x Kontrolle = arithmetisches Mittel aller Kontrollwerte; x = arithmetisches Mittel; s = Standardabweichung;
* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
226
Tabelle 34: Kopienzahl Prokollagen a1(III)-mRNA / 105 Kopien EF-1a (Vorversuch)
Versuchstag Pferd 1 Pferd 2 x s
x Kontrolle 10,03 33,61 21,82 16,68
1 29,14 21,58 25,36 05,35
3 27,08 30,55 28,82 02,46
7 31,08 24,76 27,92 04,47
10 13,52 26,37 19,95 09,09
14 42,50 31,86 37,18 07,52
17 14,97 27,05 21,01 08,55
21 43,22 35,39 39,31 05,53
24 42,10 29,26 35,68 09,08
Tabelle 35 : Kopienzahl Prokollagen a1(III)-mRNA / 102 Kopien EF-1a (Hauptversuch)
Versuchstag Pferd 3 Pferd 4 Pferd 5 Pferd 6 Pferd 7 Pferd 8 x s
x Kontrolle 18,96 93,64 54,65 96,48 190,78 2,55 76,18 67,84
1 47,97 220,76 118,14 477,06 307,68 4,91 196,09 176,96
4 45,05 225,91 93,02 265,77 420,91 ** 210,13 148,95
8 97,23 478,69 * 240,73 2307,87 7,22 626,35 956,73
11 * 1040,84 173,56 3836,59 10,29 1265,32 1772,84
15 863,74 342,74 1339,12 7,35 638,24 585,21
18 468,80 407,68 1417,17 13,31 576,74 595,54
22 678,15 306,75 718,75 5,95 427,40 336,62
25 503,87 296,77 1543,70 8,04 588,10 668,73
29 429,52 ** 1945,27 11,45 795,41 1017,51
x Kontrolle = arithmetisches Mittel aller Kontrollwerte; x = arithmetis ches Mittel; s = Standardabweichung;
* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine auswertbaren Biopsieproben gewinnbar
227
Tabelle 36: Klinischer Score (Vor- und Hauptversuch) 2
x = arithmetisches Mittel; s = Standardabweichung;
* Pferd 3 und 5 wurden am 11. bzw. 9. Tag in moribundem Zustand euthanasiert
** keine Untersuchungen durchgeführt
2 Mit freundlicher Genehmigung von Frau Dr. M. Venner (Klinik für Pferde, Tierärztliche Hochschule Hannover
Versuchstag K 1 3 5 7 10 13 17 20 24 27 30 Pferd 1 0 0 2 1 0 0 0 0 0 ** 1 0
Pferd 2 0 1 1 1 1 1 1 1 0 ** 1 1
Pferd 3 0 0 0 8 10 *
Pferd 4 0 1 6 8 8 4 4 1 1 ** 1 1
Pferd 5 1 2 8 10 *
Pferd 6 1 2 6 6 4 0 0 0 2 ** 0 0
Pferd 7 0 1 2 10 8 6 5 4 1 ** 1 1
Pferd 8 0 1 8 10 4 2 1 0 0 ** 0 0
s 0,5 0,8 3,2 3,8 3,8 2,4 2,1 1,6 0,8 0,5 0,6
x Score 2 7 30 52 34 12 10 5 4 0 2 2
228
9.3 Reaktionslösungen und Färbungen
1. Cacodylatpuffer (0,1 M, pH 7,0)
Stammlösung:
Cacodylsäure-Natriumsalz 21,4 g
Aqua dest. 1000 ml
Gebrauchslösung:
Stammlösung 500 ml
HCl (0,1 M) 41,5 ml
Aqua dest. ad 1000 ml
2. Citratpuffer
gebrauchsfertige Lösung: 20 ml Citrat-Puffer-Konzentrat (ProTaqstura, Vertrieb über quartett
GmbH, Berlin) ad 1000 ml Aqua dest.
3. Glutardialdehydlösung (5%)
Glutardialdehydlösung (25%) 200 ml
Cacodylatpuffer (1 M, pH 7,0) 800 ml
4. 4%ige Paraformaldehydlösung
Paraformaldehyd 40 g
Calciumchlorid-2-Hydrat 735 mg
Cacodylatpuffer (0,1 M, pH 7,0) 1000 ml
Die Lösung auf 70°C erwärmen und so lange rühren lassen, bis sie klar ist. pH-Wert mit 0,1
M HCl-Lösung auf 7,4 einstellen.
229
5. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
NaCl 40,0 g
NaH2PO 7,8 g
Aqua dest. 5,0 l
mit 1N Natronlauge auf pH=7,0 bis 7,2 einstellen.
6. DEPC-behandeltes Wasser (0,1 Vol% DEPC)
DEPC (Pyrokohlensäurediethylester) 2 ml
Aqua bidest. ad 2 l
Inkubation im Schüttelwasserbad für 2 h und anschließendes Autoklavieren (20 min, 120°C,
2,5 bar)
7. Heidenhainsche Azanfärbung
Azokarminlösung:
0,1g Azokarmin G/ 100ml Aqua dest. kurz aufkochen lassen, nach dem Abkühlen filtrieren
und Zugabe von 1ml Eisessig
Alkoholische Anilinlösung:
96%iges Ethanol 1000 ml
Anilinöl 1 ml
Anilinblau-Orange-Essigsäure-Stammlösung:
Anilinblau 0,5 g
Orange G 2 g
Aqua dest. 100 ml
Eisessig 8 ml
Anilinblau-Orange-Essigsäure-Gebrauchslösung:
Stammlösung mit der doppelten Menge Aqua dest. verdünnen
230
Essigsaurer Alkohol:
96%iges Ethanol 1000 ml
Eisessig 10 ml
8. Hämalaun-Eosin-Färbung (im Färbeautomaten Varistain 24-3, Fa. Shandon,
Frankfurt)
1. Entparaffinieren und Rehydrieren:
Xylol 4 x 2 min
Isopropanol 1 min
Ethanol 96% 1 min
Ethanol 70% 1 min
Ethanol 50% 1 min
2. Spülen in Aqua dest. 2 min
3. Färben in (Hämalaun nach Mayer) 10 min
4. Wässern unter fließendem Leitungswasser 15 min
5. Färben in Eosin 2 min
6. Spülen in Aqua dest. 1 min
7. Dehydrieren:
Ethanol 50% 30 s
Ethanol 70% 30 s
Ethanol 96% 30 s
Isopropanol 2 min
Xylol 1 3 x 2 min
8. Eindecken der gefärbten Schnitte mit Corbitbalsam (Fa. Hecht, Kiel)
231
9. TUNEL-Assay (ApopTag , Kat.-Nr.: S7101, Fa. Appligene Oncor,
Heidelberg)
Verdaupuffer:
Tris-HCl (1M, pH 8,0) 5 ml
EDTA (0,5M, pH 8,0) 10 ml
Tween 20 0,5 ml
DEPC-H2O ad 100 ml
autoklavieren und Lagerung bei 4°C
Proteinase K-Stammlösung (10mg/ml):
Proteinase K 100 mg
Tris-HCL (1M, pH 8,0) 2 ml
CaCl2 (0,1M) 20 µl
DEPC-H2O ad 10 ml
Sterilfiltration und Lagerung bei -20°C
Proteinase K-Gebrauchslösung:
4µl Proteinase K-Stammlösung in 1996µl Verdaupuffer für 20 Schnitte
Working-Strength-TdT-Solution:
760µl Reaction-Buffer und 320µl TdT-Enzyme für 20 Schnitte
Stop-Wash-Buffer:
5ml Stop-Wash-Konzentrat und 170ml Aqua dest.
232
Danksagung
Mein herzlicher Dank gilt Herrn Professor Dr. Dr. h.c. mult. W. Drommer für die
Überlassung des Themas, die Betreuung und Unterstützung bei der Erstellung der Arbeit im
Rahmen des Ph.D.-Studiums.
Weiterhin vielen Dank an die Mitglieder meiner Betreuungsgruppe, Herrn Professor Dr. Pabst
und Herrn Professor Dr. Löscher, für ihre Unterstützung und ihr Interesse an meiner Arbeit.
Herrn Professor Dr. A. Gruber gilt mein besonderer Dank für die jederzeit gewährte und
freundliche Hilfestellung, die zahlreichen guten Ratschläge und die Einarbeitung in die
molekularbiologischen Präparationen.
Vielen Dank an Frau Dr. Venner für die Überlassung der Biopsieproben und die kollegiale
Zusammenarbeit, die viel Freude gemacht hat.
Bei Herrn PD Dr. G. von Samson-Himmelstjerna und Frau Sandra Buschbaum möchte ich
mich für die Einarbeitung in die quantitative Polymerasekettenreaktion und die Unterstützung
bei der Etablierung der Methode bedanken.
Mein besonderer Dank gilt Frau Käthe Franke und Frau Kerstin Rohn für Freundlichkeit,
tatkräftige Unterstützung, Ratschläge und Motivation zu jeder Zeit. Ich möchte diese
Zusammenarbeit nicht missen.
Meinen Mitdoktoranden, Dorthe Harmeier, Bettina Horstmeier und Ina Leverköhne, danke
ich für Kollegialität und fachlichen Austausch. Die Zusammenarbeit hat großen Spaß
gemacht.
Vielen Dank auch Dir Indra, für Deine Geduld, Dein Verständnis und Deine Hilfe.
Dank auch meinen Eltern, die mich ein Leben lang unterstützt haben.