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MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas aeruginosa PAO1 PARA
LA SÍNTESIS BIOLÓGICA DE FENAZINA-1-CARBOXILATO
JULIAN CAMILO MARTINEZ GUARNIZO
TRABAJO DE GRADO
Presentado para optar por el título de:
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
DIRECTOR:
DIANA CAROLINA CLAVIJO BURITICA, MSc., Ph.D.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
2019
MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas aeruginosa PAO1 PARA
LA SÍNTESIS BIOLÓGICA DE FENAZINA-1-CARBOXILATO
JULIAN CAMILO MARTINEZ GUARNIZO
___________________________ _________________________
Concepción J. Puerta Bula, Ph.D Marcela Franco Correa, Ph.D
Decana facultad de Ciencias Directora de Carrera
Microbiología Industrial
MODELAMIENTO DE LA RED METABOLICA DE Pseudomonas aeruginosa PAO1 PARA
LA SÍNTESIS BIOLÓGICA DE FENAZINA-1-CARBOXILATO
JULIAN CAMILO MARTINEZ GUARNIZO
___________________________ __________________________
Diana C. Clavijo Buritica, MSc., Ph.D. Jose S. Montaña Lara, Ph.D
Directora Jurado
RESUMEN
La Fenazina-1-carboxilato es una molécula producida por cepas de Pseudomonas
aeruginosa que tiene alta relevancia para el sector agrícola debido a su capacidad
de inhibir el crecimiento de diversos hongos fitopatogenos. En el presente trabajo
se modeló la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la
aproximación de análisis de balance de flujo en estado estacionario (FBA) y en
estado dinámico (DFBA), con en fin de simular la producción de fenazina-1-
carboxilato en este este organismo.
Los resultados obtenidos simulan el metabolismo para la producción de biomasa
en Pseudomonas aeruginosa PAO1, así como la biosíntesis de PCA en estado
estacionario, ya que se observó que las reacciones de síntesis de pared celular,
síntesis de aminoácidos, síntesis de cofactores, síntesis de grupos prostéticos,
síntesis de transportadores de electrones, las reacciones del metabolismo central
y las reacciones de biosíntesis de PCA estaban activas. También se simuló la
producción de biomasa y la biosíntesis de PCA en Pseudomonas aeruginosa
PAO1 en estado dinámico, con lo cual se obtuvo el perfil de concentración de
biomasa y los perfiles de concentración de nutrientes tales como glucosa y sulfato,
evidenciándose que la reacción de síntesis de PCA estaba activa pero no había
presencia de un perfil de concentración de PCA extracelular. Lo que concuerda
con los resultados obtenidos en estado estacionario donde no se observaron
eventos en los que PCA fuera exportado al espacio extracelular.
De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, se hace necesario
realizar estudios posteriores a nivel in vitro e in silico, que permitan determinar el
mecanismo biológico en el que la fenazina-1-carboxilato es exportada al medio
extracelular, para así bajo la aproximación del Análisis de Balance de Flujo
proponer alternativas que permitan mejorar la producción de este metabolito a
escala industrial.
Palabras claves: Fenazina-1-carboxilato, Pseudomonas aeruginosa PAO1, FBA, DFBA.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios, por permitirme llegar hasta esta etapa de mi proceso de formación académica.
A mis padres, por su apoyo y fortaleza en los momentos difíciles.
A mi directora Carolina Clavijo, por darme la oportunidad de trabajar con ella y de conocer el
campo de acción en el que ella se desempeña, por su paciencia y por todo el tiempo dedicado a lo
largo del desarrollo del trabajo de grado.
Al profesor German Combariza, por su apoyo y asesoría en la parte matemática y computacional
del trabajo de grado.
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN. ........................................................................................................................ 9
2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................. 11
3. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................... 13
4. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 20
4.1. OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................... 20
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................................. 20
5. METODOLOGÍA ......................................................................................................................... 21
5.1. Revisión de la biosíntesis de PCA ................................................................................... 22
5.2. Curación del modelo CCBM1737 ..................................................................................... 22
5.2.1. Precursores de biomasa ............................................................................................ 22
5.2.2. Adición de PCA a la reacción de biomasa .............................................................. 23
5.2.3. Patologías de la red .................................................................................................... 23
5.2.4. Detección y solución de ciclos termodinámicamente infactibles ......................... 23
5.3. Análisis de Balance de Flujo (FBA) ................................................................................. 25
5.4. Análisis de Balance de Flujo Dinámico (DFBA) ............................................................. 25
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................ 27
6.1. Descripción del Modelo de la Red Metabólica de Pseudomonas aeruginosa que
involucra la síntesis de PCA ..................................................................................................... 27
6.2. Modelamiento bajo la aproximación de FBA de la Red Metabólica de Pseudomonas
aeruginosa que involucra la síntesis de PCA. ....................................................................... 30
6.3. Modelamiento bajo la aproximación de DFBA de la Red Metabólica de
Pseudomonas aeruginosa que involucra la síntesis de PCA .............................................. 36
7. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 44
REFERENCIAS .............................................................................................................................. 45
ANEXOS .......................................................................................................................................... 49
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Biosíntesis de Fenazina-1-carboxilato en Pseudomonas aeruginosa a partir de
Ácido Corísmico. .............................................................................................................. 14
Figura 2. Metodología para la simulación de la producción de PCA a partir del modelo
CCBM1737. ..................................................................................................................... 21
Figura 3. Número de reacciones activas en cada uno de los sistemas metabólicos activos
durante el modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la
aproximación de FBA. ...................................................................................................... 30
Figura 4 Subsistemas metabólicos activos durante el modelamiento de la red metabólica
de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la aproximación de FBA. ................................. 32
Figura 5. Perfil de concentración in silico de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1,
empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1. ..................... 38
Figura 6. Perfil de consumo de glucosa in silico por Pseudomonas aeruginosa PAO1,
empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1. ..................... 39
Figura 7. Perfil de consumo in silico de sulfato por Pseudomonas aeruginosa PAO1,
empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1. ..................... 40
Figura 8. Perfil de concentración de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1,
empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2. ..................... 41
Figura 9. Perfil de concentración de Glucosa en Pseudomonas aeruginosa, empleando las
condiciones de simulación propuestas para el escenario 2. ............................................. 41
Figura 10. Perfil de concentración de sulfato en Pseudomonas aeruginosa PAO1,
empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2. ..................... 42
Figura 11. Flujo in silico de la reacción de síntesis de PCA bajo las condiciones de
simulación del escenario 3. .............................................................................................. 43
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Genes, reacciones, enzimas y proteínas transportadoras involucradas en la
biosíntesis de fenazina-1-carboxilato. .............................................................................. 28
Tabla 2. Metabolitos involucrados en la síntesis de PCA que fueron incorporados al
modelo CCBM1737 ......................................................................................................... 29
Tabla 3. Flujo de las reacciones de biosíntesis, transporte e intercambio de PCA
obtenidas del modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa bajo la
aproximación de FBA empleando el software GAMS y el programa en R. ....................... 33
Tabla 4. Simulación en GAMS de flujos en estado estacionario restringiendo las
reacciones de transporte e intercambio de PCA. ............................................................. 34
Tabla 5. Reacciones inactivas para la maximización de la producción de PCA ............... 36
Tabla 6. Condiciones de simulación DFBA. ..................................................................... 37
9
1.INTRODUCCIÓN.
Los patógenos de plantas son responsables de hasta un 20% de la reducción del
rendimiento de los cultivos. Razón por lo cual actualmente se han implementado
estrategias tales como el uso de variedades resistentes, la rotación de cultivos, la
sanitización y el uso de fungicidas con el fin de disminuir la presencia de dichos
organismos [1]. Los fungicidas son agentes de origen natural o sintético los cuales actúan
para proteger las plantas de la invasión de hongos o erradicar una infección fúngica ya
establecida. El termino fungicida convencionalmente se aplica para compuestos que
controlan hongos verdaderos, principalmente del género Plasmodiophora y Oomycota [2].
El uso de fungicidas para el control de hongos patógenos inicio en la mitad del siglo XIX
con la incorporación de fungicidas no sistémicos, lo cuales correspondían generalmente a
complejos químicos metal-colorante y posteriormente a finales de los años 60 surgieron
fungicidas sistémicos que a diferencia de los no sistémicos podían penetrar las
estructuras vegetales lo que permitió el control de enfermedades que ya estaban
establecidas en los cultivos, generando un aumento en el uso de este tipo de fungicidas y
promoviendo el desarrollo de nuevos fungicidas sintéticos de este tipo [2].
Aunque los fungicidas sintéticos han sido útiles para reducir las pérdidas económicas
debido a hongos fitopatógenos, su uso ha mostrado tener consecuencias negativas para
la protección de cultivos como el desarrollo de resistencia [1] y sobre el medio ambiente,
como desarrollo de toxicidad sobre organismos vivos. Por tal razón, se ha optado por la
búsqueda de alternativas biológicas que permitan el control de hongos fitopatógenos y el
mejoramiento de los cultivos. Una alternativa es el uso de rizobacterias promotoras del
crecimiento vegetal; en este grupo resaltan las bacterias productoras de fenazinas, en
particular las productoras de fenazina-1-carboxilato(PCA, por sus siglas en inglés:
Phenazine-1-Carboxylic Acid). Pseudomonas aeruginosa es reconocida entre otras cosas
10
por su capacidad de generar antagonismo sobre otros microorganismos [3]. Por lo
anterior, el estudio de la síntesis de PCA en Pseudomonas aeruginosa y la búsqueda de
alternativas que permitan mejorar la producción de este metabolito son necesarias para
llevar a cabo el bioproceso de producción de PCA a escala industrial.
Los estudios en el campo de los bioprocesos pueden desarrollarse in vitro; sin embargo,
estos generan altos costos a nivel de experimentación y costos en tiempo de obtención de
resultados, por lo cual el uso de herramientas como los modelos matemáticos y
algoritmos computacionales provistos por la biología de sistemas, constituyen una
alternativa para los estudios en este campo. Entre las herramientas más empleadas en
biología de sistemas para el estudio de procesos biológicos se encuentra la
reconstrucción y modelamiento de redes metabólicas, las cuales reúnen todas reacciones
bioquímicas presentes en una célula y reflejan la interacción entre todos los metabolitos
involucrados en la misma.
Las redes metabólicas son obtenidas a partir de datos de secuenciación, genes y
reacciones enzimáticas presentes en bases de datos biológicos u obtenidas
experimentalmente. Estas redes permiten el estudio de los procesos metabólicos llevados
a cabo en un organismo de forma cualitativa y cuantitativa. El modelamiento bajo la
aproximación del análisis de balance de flujo (FBA, por sus siglas en inglés: Flux Balance
Analysis) hace posible simular el crecimiento de un organismo y la expresión de
fenotipos(conjunto de rutas metabólicas activas en la célula) por medio de modelos
matemáticos basados en el balance estequiométrico de las reacciones bioquímicas del
organismo y el análisis de flujos metabólicos en estado estacionario o no estacionario. De
modo que si se asume un estado estacionario se debe resolver un problema de
optimización por programación lineal, mientras que si se asume un estado no estacionario
se debe resolver un problema de optimización por programación no lineal cuyas
restricciones son ecuaciones diferenciales [4,5].
Debido a que los protocolos de cuantificación de PCA son costosos y no se han realizado
estudios in silico de la producción de este compuesto en Pseudomonas aeruginosa, el
modelamiento matemático de la red metabólica que involucra la síntesis de este
metabolito en esta bacteria es un método alternativo que permitirá estudiar y entender las
11
condiciones bajo las cuales se lleva a cabo la biosíntesis de PCA, en busca de mejorar la
producción de este metabolito.
2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Hoy en día la reconstrucción y modelamiento de redes metabólicas de microorganismos
ha tomado gran fuerza en el campo de la investigación en ciencias básicas, debido a su
capacidad para predecir el crecimiento y la producción de metabolitos de un organismo
sin la necesidad de recurrir a extensos protocolos in vitro. Las actuales metodologías in
vitro e in vivo para el estudio de bioprocesos resultan ser costosas y dispendiosas. Es así,
como la biología computacional, la bioinformática y la biología de sistemas proporcionan
metodologías que permiten el entendimiento y la comprensión del comportamiento
biológico, haciendo posible, generar posibles alternativas para la solución de problemas
como el que se aborda en este trabajo [6,7].
Uno de los métodos que se emplea con mayor frecuencia para el estudio de redes
metabólicas es el modelamiento in silico bajo la aproximación del análisis de balance de
flujo (FBA, por sus siglas en inglés: Flux Balance Analysis), que permite obtener los flujos
metabólicos de todas las reacciones bioquímicas presentes en la red durante el
crecimiento celular, de modo que es posible proponer modificaciones genéticas y
condiciones de crecimiento específicas con el fin de mejorar la producción de un
metabolito específico [8].
Actualmente existen una gran variedad de redes metabólicas reportadas en bases de
datos (como BioCyc y KEGG), entre las cuales se encuentra la red de Pseudomonas
aeruginosa PAO1 [9,10], la cual puede ser utilizada para predecir la producción de
metabolitos como PCA. Esta molécula es un metabolito secundario producido por cepas
12
Pseudomonas aeruginosa; en estudios como los realizados por Upadhyay y Srivastava en
2011 [11] y Lee y colaboradores en 2003 [12] se ha observado que esta molécula tiene un
efecto inhibitorio sobre hongos fitopatógenos de alta relevancia en el contexto agrícola
como Fusarium oxysporum y Coletotrichum spp. Esta característica de PCA hace que sea
posible su uso como potencial fungicida de origen biológico que permita la reducción del
uso de fungicidas sintéticos y así mismo los efectos negativos que estos pueden generar
al medio ambiente [13].
Para estudiar la producción de PCA in vitro se utilizan medios como PPM(por sus siglas
en inglés: Pigment Producing Medium), GA(por sus siglas en inglés: Glycerol-Alanine) y
LB(Luria Bertani) en los cuales se han estudiado condiciones de crecimiento que
favorecen la producción de PCA, y los mecanismos de regulación para la producción de
este compuesto, como lo es la regulación por Quorum sensing[14,15]. Sin embargo, no se
han llevado a cabo estudios in silico en los cuales se evalúen condiciones de crecimiento
para la producción de PCA.
Por consiguiente, el modelamiento in silico de la red metabólica que involucra la
biosíntesis de PCA en Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la aproximación de FBA,
permitirá entender las condiciones de crecimiento bajo las cuales se lleva a cabo dicho
proceso, y de ser posible proponer una alternativa para mejorar la producción de PCA a
escala industrial en busca de utilizar este compuesto como un fungicida de origen natural
para el control biológico de diferentes cultivos, lo cual permitirá reducir gradualmente el
uso de fungicidas sintéticos.
13
3. MARCO TEÓRICO
Un tema de gran importancia en el sector agrícola es el control de hongos fitopatógenos.
Estos hongos generan un deterioro de los cultivos y por consiguiente generan pérdidas
económicas a los agricultores. Existe una amplia variedad de fungicidas que previenen el
crecimiento de hongos fitopatógenos; sin embargo, los fungicidas han mostrado tener
efectos negativos sobre los ecosistemas, ya que genera toxicidad sobre insectos
polinizadores [16], bacterias en cuerpos de agua y particularmente se ha observado que
reducen las poblaciones de bacterias desnitrificantes [17], lo cual podría generar
eutrofización en cuerpos de agua debido a que estos compuestos terminan en cuerpos de
agua por el proceso de escorrentía, generando un aumento de la concentración de nitrato
en los mismos [18].
De la misma manera, estos compuestos también pueden generar toxicidad sobre
invertebrados acuáticos y algas unicelulares [19,20]. En animales se ha observado que el
uso de benzimidazoles (usados para el control de Fusarium oxysporum y Colletotrichum
spp.) [21,22] se han asociado con toxicidad del desarrollo, oncogénesis, fallas en el
sistema reproductor y desarrollo anormal del feto [23]. Por otra parte, algunos fungicidas
son compuestos orgánicos persistentes por lo cual permanecen en el suelo durante años,
lo que genera que hongos fitopatógenos desarrollen resistencia a estos compuestos
dificultando el control fitosanitario de los mismos [24].
Para enfrentar los efectos negativos producidos por los fungicidas sintéticos se ha optado
por el uso de métodos de control biológico, tales como el uso de fungicidas de origen
natural. Un microorganismo que ha sido utilizado para el estudio de compuestos
biológicos con actividad fungicida es Pseudomonas aeruginosa, que ha demostrado ser
una bacteria que tiene un efecto antagonista sobre hongos fitopatógenos. La interacción
amensalista entre Pseudomonas aeruginosa y estos hongos se ha asociado a la
producción de compuestos conocidos como las fenazinas, que pertenecen a un grupo de
metabolitos secundarios producidos por la ruta del ácido Shikimico usando como
14
intermediario principal el ácido corísmico. Como se puede observar en la Figura 1, ésta
ruta metabólica para Pseudomonas aeruginosa está bien establecida, ha sido estudiada y
se encuentra disponible en bases de datos biológicos, como KEGG y MetaCyc (Figura1).
Figura 1. Biosíntesis de Fenazina-1-carboxilato en Pseudomonas aeruginosa a partir de Ácido
Corísmico. Tomado de : http://www.pseudomonas.com:1555/PSEUDO/NEW-
IMAGE?type=PATHWAY&object=PWYB-5652
15
Las fenazinas han mostrado tener un amplio rango de aplicaciones, entre las que se
encuentra el control de hongos fitopatógenos [25], y debido a que son compuestos de
origen biológico, que no generan toxicidad al medio ambiente [26, 27] hace que su
utilización como biofungicidas sea factible.
Entre las fenazinas que son producidas por Pseudomonas aeruginosa se encuentra la
fenazina-1-Carboxilato (PCA), con la cual se han desarrollado estudios como los
realizados en 2013 por Puopolo y colaboradores, en los que se observó que a
concentraciones de PCA iguales o inferiores a 50 es posible inhibir en más de un
60% el crecimiento de hongos como Fusarium oxysporum, Botrytis cinérea, Alternaria
alternata, Sclerotinia sclerotorum, Colletotrichum gloesporoides y algunos oomycetes y a
concentraciones muy bajas de PCA se consigue inhibir totalmente el crecimiento de
Gaumannomyces graminis var triticii y Phytopthora nicotianae [28].
Aunque la capacidad de PCA para inhibir hongos fitopatógenos, lo hace un compuesto de
interés para el sector agrícola, su producción in vitro e in vivo es baja [29]. Por lo cual, si
se quiere producir este compuesto a nivel industrial es necesario encontrar y proponer
estrategias que ayuden a aumentar su producción. De este modo, es necesario estudiar
los factores involucrados en el proceso metabólico de biosíntesis, incluyendo los sustratos
que son usados como fuente de carbono por el microorganismo y los fenotipos que éste
expresa durante la síntesis de PCA con el fin de mejorar su producción.
Las fuentes de carbono que influencian la biosíntesis de PCA en Pseudomonas
aeruginosa han sido objeto de estudios in vitro [29]; sin embargo, estos estudios suelen
ser dispendiosos debido a que requieren un número elevado de ensayos, y una gran
cantidad de reactivos y tecnologías de alto costo, como HPLC, para la separación o
purificación de compuestos. Por lo anterior, el uso de métodos alternativos que permitan
estudiar los bioprocesos como lo son los estudios in silico deben ser considerados.
Uno de los métodos in silico mas empleado actualmente para acercarse al entendimiento
de la fisiología de un organismo es a través de la reconstrucción, y modelamiento de
redes metabólicas (conjunto de reacciones bioquímicas presentes en un organismo), ya
que con este método se pueden realizar simulaciones y modelar bajo diferentes
condiciones el crecimiento celular y producción de metabolitos en un organismo.
16
El proceso de reconstrucción consiste en obtener un listado preliminar de las reacciones
bioquímicas, las enzimas presentes en la célula, la reacción de biomasa y las reacciones
de transporte e intercambio a partir de datos de anotación genómica [30]. En el caso de la
red metabólica de Pseudomonas aeruginosa (PAO1), la reconstrucción de la misma, fue
realizada entre otros, por Oberhardt y colaboradores en 2008 [31] y actualizada, curada y
modelada para la producción de pioverdina por Clavijo en 2018 [32] quien reportó el
modelo CCBM1737 el cual puede ser curado y modelado para la biosíntesis de PCA.
El proceso de curación de la red metabólica consiste en corregir las inconsistencias que
pudiera presentar la red preliminar y que conllevan a un crecimiento nulo en el
modelamiento de la red. Estas inconsistencias se relacionan principalmente con la
ausencia de reacciones en una ruta metabólica, la ausencia de precursores involucrados
en la formación de biomasa, la presencia de ciclos termodinámicamente infactibles y con
la presencia de metabolitos que se producen y no se consumen o metabolitos que no se
producen y si se consumen en alguna reacción de la red, entre otros. Los detalles del
proceso de curación son explicados en la metodología.
Por otra parte, el modelamiento de la red metabólica reconstruida se puede realizar, entre
otros, bajo la aproximación del Análisis de Balance de Flujo. El FBA es una aproximación
matemática, que se centra en solucionar un problema de optimización basado en
restricciones, para el análisis del flujo de las reacciones a través de una red metabólica.
En este método se representan las reacciones metabólicas por medio de una matriz
estequiométrica (S) de tamaño n*m (n metabolitos y m reacciones), que contiene los
coeficientes estequiométricos de las reacciones. La estequiometria de las reacciones
restringe el flujo de los metabolitos a través de la red, lo que constituye la base del
método FBA [33]. Si se modela la red metabólica como un sistema estacionario se debe
resolver un problema de optimización basado en restricciones por programación lineal
(LP, por sus siglas en inglés: Linear Programming) con el fin de maximizar o minimizar
una función objetivo.
Generalmente la función objetivo en el modelamiento de redes metabólicas, consiste en la
maximización de la biomasa. La ecuación 1 representa el modelo algebráico del problema
de optimización de FBA.
17
∑
Donde, es el número total de metabolitos, el número total de reacciones, es la
función objetivo determinada, la cual comúnmente suele ser la maximización de biomasa;
corresponde al flujo de la reacción , el cual es expresado en . y
corresponde a los límites o valores inferiores y superiores posibles que puede adquirir
y que dependen directamente de la termodinámica de cada reacción; es decir,
comúnmente para reacciones reversibles el y el
y para reacciones irreversibles el y el
. Finalmente, es la matriz estequiométrica, que
representa el coeficiente estequiométrico del metabolito en la reacción [32].
El vector es un vector cuyos componentes representan el flujo de cada una de las
reacciones en la red y corresponde a la solución al espacio nulo de la matriz S (Ecuación
1) que maximiza la función objetivo, es decir, el flujo de la reacción de biomasa en el
problema considerado, de modo que se establece un fenotipo metabólico en el cual se
máxima el crecimiento del organismo en cuestión [34].
El FBA se emplea típicamente para estudiar el flujo metabólico en un estado particular
constante del sistema; sin embargo, este método no permite predecir el comportamiento
de una red metabólica a través del tiempo y asume que las concentraciones de los
metabolitos no varían con el tiempo [35]. No obstante, se debe tener en cuenta que los
sistemas biológicos son dinámicos, por lo cual se puede emplear la resolución del
problema de optimización por programación no lineal (NLP, por sus siglas en inglés: Non
Linear Programing) de un problema de optimización basado en restricciones (Ecuación 2),
propuesto por Mahadevan y colaboradores en 2002 [36], conocido como Análisis de
balance de flujo dinámico (DFBA, por sus siglas en inglés: Dynamic Flux Balance
Analysis).
18
(Ecuación 2)
∑
:
∑
∑
( )
[ ]
Donde es la concentración de los metabolitos extracelulares, y son las
condiciones iniciales para cada metabolito y para la concentración de biomasa
respectivamente, es la concentración de biomasas, es la tasa de crecimiento
específica, es la reacción de peso, es el vector de las restricciones no lineales
(tales como la cinética de consumo de los sustratos), y corresponden al tiempo inicial
y al tiempo final respectivamente, finalmente, indica el número de intervalos en donde
el tiempo es discretizado.
El modelamiento dinámico de una red metabólica genera información acerca de las
concentraciones de los metabolitos y la biomasa a través del tiempo, por lo cual con esta
herramienta es posible simular el crecimiento, producción y consumo de metabolitos por
19
parte de un microorganismo en un cultivo discontinuo, así como modificar las condiciones
iniciales con el fin de mejorar el rendimiento de un metabolito específico [36].
El modelamiento dinámico de redes metabólicas a través del método DFBA se ha
utilizado para simular el crecimiento celular y la producción de compuestos de interés
industrial. Por ejemplo, Serrano y colaboradores en 2016 [37] utilizó este método para
simular el crecimiento y producción de 1,3-propanediol y ácidos orgánicos en Clostridium
sp., usando como sustrato glicerol. Por otra parte, Flassing y colaboradores en 2016 [38]
modelaron bajo la aproximación de DFBA la red metabólica de la microalga Dualinella
salina con el fin de estudiar la producción de biomasa (la cual puede ser usada como
biocombustible) y pigmentos como el -caroteno prediciendo el perfil de producción de
este metabolito, condiciones de luz y fuente de nitrógeno necesaria para llevar a cabo el
bioproceso. Al igual que se ha realizado el modelamiento para estos organismos, se
puede utilizar el método DFBA para obtener los perfiles de PCA y concentraciones
apropiadas de fuente de carbono, nitrógeno y oxígeno que maximizan el crecimiento de
Pseudomonas aeruginosa PAO1 y mejoran la producción de PCA.
20
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL:
Modelar y simular bajo la aproximación de FBA y DFBA la producción de fenazina-1-
carboxilato(PCA) en Pseudomonas aeruginosa PAO1.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1. Complementar y curar el modelo CCBM1737 de la red metabólica de
Pseudomonas aeruginosa con las reacciones involucradas en la síntesis de
fenazina-1-carboxilato.
2. Modelar y simular la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la
aproximación de FBA para la producción de fenazina-1-carboxilato.
3. Modelar y simular la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la
aproximación de DFBA para la producción de fenazina-1-carboxilato.
21
5. METODOLOGÍA
La simulación de la síntesis de PCA en Pseudomonas aeruginosa se realizó tomando
como base el modelo CCBM1737 propuesto por Clavijo y colaboradores en 2018 [32],
conformado por 1123 reacciones y 879 metabolitos. La metodología propuesta para el
desarrollo de éste trabajo se describe a continuación y se puede observar el esquema
general en la Figura 2:
Figura 2. Metodología para la simulación de la producción de PCA a partir del modelo
CCBM1737.
Modelo
CCBM1737
Curación
Integración de las
reacciones propias
de PCA
Simulación bajo
la aproximación
FBA
Simulación bajo
la aproximación
DFBA
Flujos metabólicos
en un instante de
tiempo t arbitrario
[metabolitos] en
función del tiempo
[PCA] en función
del tiempo
Precursores
de biomasa
Patologías
de la red
Ciclos termodinámicos
infactibles
22
5.1. Revisión de la biosíntesis de PCA Tomando como base la ruta metabólica para la síntesis de PCA (Figura 1), la revisión de
literatura y de bases de datos biológicos que contuvieran información metabólica del
microorganismo de interés, "Pseudomonas aeruginosa PAO1", tales como Pseudocyc [39]
y Kegg [40] entre otras, al modelo CCBM1737 se integraron los genes, las enzimas
correspondientes a las reacciones metabólicas propias de la síntesis de PCA que no se
encontraban en el modelo base, asi mismo se integró el sistema y subsistema metabólico
al que pertenecían las reacciones añadidas. Se revisó la estequiometria de estas
reacciones, su localización celular, la direccionalidad y valor de . En adición, se
incluyeron las reacciones de transporte e intercambio requeridas para la adecuada
biosíntesis de este metabolito. Vale mencionar aquí que las reconstrucciones de redes
metabólicas se caracterizan por presentar reacciones metabólicas, reacciones de
transporte y reacciones de intercambio.
5.2. Curación del modelo CCBM1737 La curación de la red metabólica se realizó con el fin de refinar el modelo y obtener un
modelo funcional para la biosíntesis de PCA. En adición a la inserción de las reacciones
faltantes en el modelo pertenecientes a la síntesis y transporte de PCA, dentro del
proceso de curación se revisaron y corrigieron las patologías de los metabolitos presentes
en la red (metabolitos que se consumen en la red pero no son producidos en ninguna
reacción o no son importados desde el medio extracelular y metabolitos que son
producidos en la red y no son consumidos por ninguna reacción o no son exportados al
medio extracelular); también fueron revisados los metabolitos precursores de biomasa con
el fin de asegurar que fueran producidos al interior de la red, finalmente se buscaron y
solucionaron los ciclos termodinámicamente infactibles que puedan llevar a un
crecimiento nulo en el modelamiento de la red. La forma de en la que se llevó a cabo cada
uno de estos procesos de curación de la red es explicada a continuación:
5.2.1. Precursores de biomasa
En el proceso de curación se hace necesario determinar la presencia de algún metabolito
que sea precursor de biomasa o alguno de sus intermediarios que no esté reportado en la
red; es decir, verificar la ruta metabólica puntual que asegure la síntesis de cada uno de
los precursores de biomasa que requiere el microorganismo para crecer. Este proceso se
lleva a cabo por medio de ingeniería reversa, siguiendo la metodología propuesta por
Senger y Papoutsakis en 2008 [41].
23
5.2.2. Adición de PCA a la reacción de biomasa
Debido a que PCA es un metabolito secundario que no pertenece al ―core‖ del
metabolismo de Pseudomonas aeruginosa PAO1, es necesario adicionar este metabolito
a la reacción de biomasa (Reacción que se utiliza en el modelamiento como función
objetivo y que por ende será maximizada al solucionar el problema de optimización) para
que se activen las reacciones metabólicas involucradas en la síntesis y transporte de este
metabolito. El coeficiente estequiométrico de PCA para la reacción de biomasa no se
encuentra reportado en la literatura, por lo cual fue necesario realizar un análisis de
sensibilidad a través de varias simulaciones bajo la aproximación de FBA, en las que el
valor del coeficiente estequiométrico para PCA fue modificado en cada simulación
tomando valores entre 0.001 y 1. La selección del coeficiente estequiométrico se llevó a
cabo con base en el criterio utilizado Clavijo y colaboradores en 2018, es decir, se eligió
aquel valor de coeficiente para PCA que activara el mayor número reacciones de la red en
la simulación.
5.2.3. Patologías de la red
En las reconstrucciones in silico de redes metabólicas pueden surgir dos tipos de
patologías en los metabolitos: (i) metabolitos que no son producidos o no son importados
a la célula desde el medio extracelular (RNP, por sus siglas en inglés: root-non-
production) y (ii) metabolitos que no son consumidos o no son exportados al espacio
extracelular y por ende se acumulan dentro de la célula (RNC, por siglas en inglés: Root-
non-consuption). Este tipo de patologías se identifican y solucionan a través de algoritmos
como los empleados en GapFind y GapFill, el primero permite identificar los metabolitos
que no se producen o no se consumen en la red metabólica y el segundo, a partir de la
lista de metabolitos encontrada con el primer algoritmo, realiza un mínimo de
modificaciones a la red adicionando las reacciones de biosíntesis (anabólicas), de
degradación (catabólicas) o de transporte faltantes en la reconstrucción preliminar de la
red [42].
5.2.4. Detección y solución de ciclos termodinámicamente infactibles
Los ciclos termodinámicamente infactibles conllevan a ciclos no nulos sin alguna
comunicación con el sistema y el ambiente externo, generando errores en la solución del
problema de optimización implicado en el FBA [43,44]. Para detectar y solucionar estos
ciclos se seguir tres pasos:
24
5.2.4.1. Análisis de Variabilidad de Flujo
El método de análisis variabilidad de flujo (FVA, por sus siglas en inglés: Flux Variability
Analysis) permite encontrar los flujos que se encuentran en los máximos o mínimos
establecidos utilizando programación entero mixta (MIP, por sus siglas en inglés Mixed
Integer Programming) [44]. Este método maximiza y minimiza el valor de los flujos
metabólicos de todas las reacciones en la red como se muestra en la Ecuación 3.
(Ecuación 3)
∑
Donde es el número total de reacciones, es la función objetivo determinada, la
cual comúnmente suele ser la maximización de biomasa; corresponde al flujo
de la reacción , el cual es expresado en . y corresponde
a los límites o valores inferiores y superiores posibles que puede adquirir y que
dependen directamente de la termodinámica de cada reacción; es decir,
comúnmente para reacciones reversibles ( el y
el y para reacciones irreversibles ( el
y el . Finalmente, es la matriz
estequiométrica, que representa el coeficiente estequiométrico del metabolito en
la reacción [32].
5.2.4.2. Determinación del espacio nulo
Las reacciones cuyo flujo toma valor en los máximos o mínimos (1000
−1 −1 y -1000 −1 −1 , respectivamente) se utilizan para formar
una matriz ( ), a la cual se le debe hallar espacio nulo (solucionar ). El
conjunto de vectores columna que hacen parte del espacio nulo de esta matriz
25
corresponde a las reacciones que presentan ciclos termodinámicamente
infactibles.
5.2.4.3. Solución de ciclos termodinámicamente infactibles
Para solucionar estos ciclos se pueden aplicar estrategias como cambiar la
direccionalidad de las reacciones según su valor de , eliminación de
reacciones duplicadas y bloqueo de reacciones no relevantes metabólicamente
que puedan ayudar a eliminar el ciclo [32].
Estos tres pasos deben realizar hasta llegar a que la dimensión del espacio nulo
de la matriz sea igual a cero.
5.3. Análisis de Balance de Flujo (FBA) El problema de optimización basado en restricciones para el FBA en estado estacionario
(Ecuación 1), se solucionó programación lineal mediante la implementación del algoritmo
simplex en el software GAMS empleando el solver CPLEX.
En adición, para este trabajo se desarrolló un código en el software libre R que soluciona
el problema de optimización de FBA. Para la construcción del código se utilizó la librería
Rsymphony, la cual permite resolver problemas de programación lineal con un gran
número de restricciones y problemas en los que el vector solución está acotado por un
vector de Lower Bounds y Upper Bounds. La matriz estequiométrica fue importada desde
Excel usando la librería readxl. Los detalles del código son explicados en los anexos.
5.4. Análisis de Balance de Flujo Dinámico (DFBA) Se solucionó el problema de programación no lineal de DFBA en el software GAMS
mediante la aplicación del algoritmo basado en colocación ortogonal en elementos finitos.
Este algoritmo usa puntos de colocación ortogonal, los cuales corresponden a las
soluciones al polinomio de Legendre de grado 4 (Matriz de Legendre) cuyos valores
corresponden a subintervalos de tiempo en los cuales se calcula la concentración de los
metabolitos y el grado del polinomio corresponde al número de puntos de colocación
escogidos para la simulación. Por otra parte, las ecuaciones diferenciales que representan
las restricciones del problema de DFBA son parametrizadas utilizando polinomios de
Lagrange (Matriz de Lagrange), de modo que el sistema de ecuaciones diferenciales se
26
transforma en un sistema de ecuaciones algebraicas. El código en GAMS utiliza el
algoritmo el algoritmo del gradiente reducido (GRG, por sus siglas en inglés: Generalized
Reduced Gradient) modificado[45].
Actualmente del código en software libre para la solución del problema de NLP de DFBA
se encuentra en proceso de construcción. Este estará basado en la implementación del
algoritmo GRG modificado en Python usando las librerías Scipy, las cuales permiten la
solución de problemas de optimización por programación no lineal.
27
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Descripción del Modelo de la Red Metabólica de Pseudomonas
aeruginosa que involucra la síntesis de PCA
A partir de una revisión del metabolismo de Pseudomonas aeruginosa PAO1 y de la ruta
de biosíntesis de fenazinas, específicamente de PCA, en la base de datos PseudoCyc
(MetaCyc [9]) y una revisión del modelo CCBM1707, fueron identificadas un total de trece
reacciones involucradas en la síntesis de PCA a partir de ácido corísmico. De estas trece
reacciones, diez fueron adicionadas al modelo CCBM1737 y las tres restantes ya se
encontraban involucradas en el modelo original.
Cada reacción adicionada al modelo involucra en su descripción los genes y las enzimas
asociadas, su estequiometría, valor de , direccionalidad y localización celular. En la
tabla 1 se presenta la relación gen-proteína-reacción de las reacciones involucradas en la
ruta metabólica de biosíntesis de PCA, donde las reacciones 1124 hasta la 1133
corresponden a la reacciones que fueron adicionadas al modelo CCBM1737.
Igualmente, se realizó una revisión de los metabolitos involucrados en el modelo
CCBM1737 y fueron adicionados los requeridos propiamente para la síntesis de PCA que
no se encontraban en el modelo general. En la tabla 2 se relacionan los siete metabolitos
que fueron incorporados para complementar la información, con el objetivo de tener el
total de metabolitos involucrados en la síntesis de PCA. Estos metabolitos se representan
en el modelo por medio de abreviaturas que han sido establecidas previamente por la
comunidad científica.
28
Tabla 1. Genes, reacciones, enzimas y proteínas transportadoras involucradas en la biosíntesis de fenazina-1-carboxilato. Las reacciones 1124 a 1133 fueron incorporadas al modelo CCBM1737
ID de
Reacción Reacción Descripción Enzima/
Proteína transportadora
Genes
59 [c] : chor + gln-L --> a4dic + glu-L
Síntesis de 2-amino-4-deoxi-chorismate
2-amino-4-deoxychorismate synthase
PA1903, PA4214
228 [c] : a4dic + h2o --> dhha + pyr + h
Hidrolisis de 2-amino-4-deoxi-chorismato
2-amino-4-deoxychorismate hydrolase
PA4213, PA1902
894 pca[e] + adp + pi <==> pca[c] + atp + h2o
Transporte de PCA xenobiotic-transporting ATPase
PA5159
1124 [c] : dhha --> aochc Isomerización de trans-2,3-dihydro-3-hydroxy-anthranilato
trans-2,3-dihydro-3-hydroxyanthranilate isomerase
-
1125 [c] : (2) aochc --> ohpdc + h2o + (2) h
Síntesis de (1R,5a,6R)-4a-hidroxi-1,4,4a,5,5a,6,9,10a-octahidrophenazina-1,6-dicarboxylato
protein PhzB PA1900
1126 [c] : ohpdc --> hhpdc + h2o
Síntesis de 1R,6R)-1,4,5,5a,6,9-hexahidrophenazina-1,6-dicarboxilato
protein PhzB PA1900
1127 [c] : hhpdc + o2 + h --> thpca + h2o2 + co2
Síntesis de (1R,10aS)1,4,10,10a-tetrahidro-phenazina-1-carboxilato
- -
1128 [c] : thpca + o2 --> dhpca + h2o2
Oxidación de (1R,10aS)1,4,10,10a-tetrahidrophenazine-1-carboxilato
pyridoxamine 5'-phosphate oxidase
PA4216
1129 [c] : dhpca --> d5hpca
Síntesis de 5,10dihidrophenazine-1-carboxilate
- -
1130 [c] : d5hpca + o2 --> pca + h2o2
Síntesis de PCA - -
1131 [c] : thpca <==> t1rhpca
Isomerización de (1R,10aS)1,4,10,10a-tetrahidrophenazine-1-carboxilato
- -
1132 [c] : t1rhpca + o2 --> dhpca + h2o2
Oxidación de (1R)-1,4,5,10- tetrahidro-phenazina-1-carboxilato
pyridoxamine 5'-phosphate oxidase
PA4216
1133 [e] : pca_e <=>
Intercambio de PCA - -
Posterior a realizar la incorporación de las reacciones y metabolitos anteriormente
mencionados, el modelo metabólico de Pseudomonas aeruginosa propuesto para este
trabajo está constituido por un total 886 metabolitos y 1133 reacciones, en las que se
incluyen reacciones netamente metabólicas, reacciones de transporte, reacciones de
29
intercambio de metabolitos y una reacción de biomasa. Cabe resaltar que esta reacción
de biomasa hace referencia a la reacción que contiene todos los metabolitos necesarios
para la formación de biomasa(carbohidratos, lípidos, aminoácidos, nucleótidos y ATP) y la
cual se tomará como función objetivo al momento de realizar el modelamiento bajo la
aproximación de FBA y al solucionar el problema de optimización.
Tabla 2. Metabolitos involucrados en la síntesis de PCA que fueron incorporados al modelo CCBM1737
Metabolito Abreviatura
(1R,6S)-6-amino-5-oxociclohex-2-ene-1-carboxilato aochc
(1R,5a,6R)-4a-hidroxi-1,4,4a,5,5a,6,9,10a-octahidrophenazina-1,6-dicarboxilato
ohpdc
(1R,6R)-1,4,5,5a,6,9-hexahidrophenazina-1,6-dicarboxilato hhpdc
(1R,10aS)-1 ,4,10, 10a-tetrahidrophenazina-1-carboxilato thpca
(10aS)-10,10a-dihidrophenazina-1- carboxilato dhpca
5,10dihidrophenazina-1-carboxilato d5hpca
(1R)-1,4,5,10- tetrahidro-phenazina-1-carboxilato t1rhpca
A partir de la red metabólica completa, que incluye las reacciones propias de la biosíntesis
de PCA, se realizó el proceso de curación de la red metabólica siguiendo la metodología
propuesta en la sección 5.2. Como resultado de este proceso de curación se determinó
que no había presencia de precursores de biomasa faltantes, ni patologías tipo RNC y
RNP y tampoco se evidenció la presencia de ciclos termodinámicamente infactibles.
En adición al proceso de curación, se determinó el coeficiente estequiométrico para incluir
a PCA como precursor de biomasa (reacción 914) con un valor de 0.8. Este coeficiente
estequiométrico, se escogió posterior a realizar un análisis de sensibilidad, teniendo en
cuenta el mayor número de reacciones para las cuales se obtuvo un flujo de reacción
distinto a cero (flujo activo) después de realizar el modelamiento de la red bajo la
aproximación de FBA. Empleando el coeficiente estequiométrico de 0.8 para PCA en la
reacción de biomasa se obtuvieron flujos activos para 352 reacciones, entre las cuales se
encuentran las correspondientes a la síntesis y transporte de PCA.
Tanto la inclusión de PCA como precursor de biomasa y la determinación de su
coeficiente estequiométrico, son dos procesos importantes a tener en cuenta en el
modelamiento de la red ya que esto permite la activación de las reacciones de síntesis,
transporte e intercambio de este metabólito. Hay que tener en cuenta que estas
reacciones no pertenecen al ―core‖ del metabolismo de Pseudomonas aeruginosa PAO1
30
puesto que PCA es a un metabolito secundario y por ende no es indispensable para el
crecimiento y supervivencia celular de este microorganismo.
6.2. Modelamiento bajo la aproximación de FBA de la Red Metabólica de
Pseudomonas aeruginosa que involucra la síntesis de PCA.
Posterior al proceso de curación, la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 se
modeló bajo la aproximación de FBA en el software GAMS y con el programa en R
desarrollado específicamente para este trabajo (ver metodología, sección 5.3) .
En general los resultados obtenidos del modelamiento muestran que de las 1133
reacciones que conforman la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 en este
trabajo, 352 estaban activas durante la simulación. Para determinar si realmente las
reacciones activas correspondían a reacciones involucradas en el proceso biológico de
crecimiento bacteriano se realizó un análisis de los sistemas y subsistemas metabólicos a
los que pertenece cada reacción.
Figura 3. Número de reacciones activas en cada uno de los sistemas metabólicos activos durante el modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la aproximación de FBA.
31
En la Figura 3 se presenta un gráfico de barras en el cual se relacionan los principales
sistemas metabólicos que se encuentran involucrados en las reacciones activas durante
el modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la
aproximación de FBA. En esta figura se evidencia que la mayoría de reacciones activas
corresponden a la síntesis de pared celular, seguida del metabolismo de aminoácidos,
síntesis de cofactores, grupos prostéticos, transportadores de electrones y metabolismo
central. Estos sistemas metabólicos son los que presentan el mayor número de
reacciones activas ya que son los que se relacionan principalmente con los procesos de
crecimiento y supervivencia celular. Así, las reacciones de biosíntesis de lipopolisacáridos
(LPS), estan relacionadas con la síntesis de pared celular; las reacciones de biosíntesis
de aminoácidos se relacionan con la síntesis de proteínas tales como proteínas con
actividad enzimática, de transporte o proteínas de pared y membrana, entre otras. Las
reacciones que involucran cofactores y transportadores de electrones están relacionadas
con respiración celular y en general con procesos metabólicos pertenecientes al
metabolismo central
En la figura 3 también se observa que el sistema metabólico correpondiente a la
metabolismo de ácidos grasos y en general de lípidos contiene un número significativo de
reacciones activas, esto puede deberse a que la biosíntesis de ácidos grasos se relaciona
con síntesis de glicerofosfolípidos y en general con lípidos estructurales de pared y de
membrana; asi como , los procesos de degradación de lípidos se relaciona con
producción de energía necesaria para el crecimiento celular. También se puede observar
que otro sistema metabólico importante hace referencia a la síntesis de nucleótidos por
rutas de novo y de salvamento que implican la disponibilidad de estos para síntesis de
ácidos nucléicos, proceso que es indispensable en la proliferación y supervivencia celular.
Así mismo, las reacciones de intercambio y de transporte que permiten el transporte de
metabolitos hacia el medio intra y extracelular se encuentran activas, lo que implica que
se mantenga la homeostasis celular a través del ingreso de nutrientes y exportación de
metabolitos cuya acumulación podría generar toxicidad en la célula. Por otra parte, el
metabolismo de compuestos sulfurados puede estar relacionado con la biosíntesis de
aminoácidos (metionina y cisteína) y la síntesis de grupos prostéticos tales como la
coenzima A.
32
Figura 4 Subsistemas metabólicos activos durante el modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la aproximación de FBA.
En la figura 4 se hace una descripción cualitativa de los resultados teniendo en cuenta las
rutas metabólicas que se encuentran activas durante el modelamiento de Pseudomonas
aeruginosa PAO1. Se observa al igual que en los sistemas metabólicos que las
principales rutas activas son las relacionadas con la síntesis de pared celular (síntesis de
antígeno O y lipopolisacáridos), con la síntesis de membrana celular (síntesis de ácidos
grasos y de aminoácidos como treonina, lisina, isoleucina y aminoácidos aromáticos),
con la síntesis de nucleótidos (metabolismo del folato, rutas de salvamento, síntesis de
purinas y pirimidinas) y con el metabolismo central (glicolisis/gluconeogénesis, vía de las
33
pentosas fosfato, fosforilación oxidativa y rutas de degradación de fuentes de carbono
alternas) principalmente.
Los resultados de los valores de los flujos metabólicos de las reacciones de interés para
la síntesis de PCA obtenidos del modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas
aeruginosa bajo la aproximación de FBA y que fue solucionado tanto con el software
GAMS como con el programa en R desarrollado para este trabajo se muestran en la Tabla
3. En ambos casos se obtuvo un valor para los flujos metabólicos de las reacciones
relativamente igual, lo que indica que el programa construido en R (software libre) fue
diseñado en forma adecuada, logra reproducir los resultados del FBA obtenidos en el
software comercial (GAMS) y se constituye como un aporte para la comunidad científica
en el modelamiento de redes metabólicas bajo la aproximación de FBA.
Tabla 3. Flujo de las reacciones de biosíntesis, transporte e intercambio de PCA obtenidas del modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa bajo la aproximación de FBA empleando el software GAMS y el programa en R.
ID de
Reacción Descripción Flujo en GAMS
(mmol/gDW*h) Flujo en R
(mmol/gDW*h) 914 Biosíntesis de biomasa 0.61587184 0.6158718
59 Síntesis de 2-amino-4-deoxi-chorismate 0.00 0.00
228 Hidrolisis de 2-amino-4-deoxi-chorismato 0.00 0.00
894 Transporte de PCA 0.49269747 0.4926975
1124-1132 Biosíntesis de PCA 0.00 0.00
1133 Intercambio de PCA -0.49269747 -0.4926975
Estos valores de flujo fueron obtenidos de la simulación del FBA en estado estacionario,
donde se observa un flujo para la reacción de biomasa cercano al reportado en la
literatura para Pseudomonas aeruginosa [46]. Sin embargo, los resultados muestran que
las reacciones involucradas en la síntesis de acido corismico (precursor de PCA) y de
PCA no se encuentran activas, esto puede ser debido a que la reacción de transporte
(que involucra un transporte activo) de PCA se encuentra activa siendo la fuente principal
de PCA, que de acuerdo con las condiciones de simulación se requiere como precursor
de biomasa. Esto se puede confirmar también con la inactividad de las reacciones en las
que PCA se consume como precursor de piocianina y que se muestran más adelante en
la tabla 5. Estos resultados obtenidos simulan un evento en el que la célula asimila PCA
del medio extracelular, lo cual tiene sentido desde un punto de vista biológico ya que si la
célula puede adquirir los nutrientes que necesita para su crecimiento, esta lo hará con el
34
fin de gastar la menor cantidad de ATP sintetizando compuestos que requiere para
generar biomasa.
Sin embargo, un escenario en el que PCA es asimilado, pero no es sintetizado por la
célula, no sería de interés en el contexto de este trabajo para la producción de PCA, ya
que no aporta información sobre la distribución de los flujos metabólicos de las reacciones
implicadas en la ruta biosintética de este metabolito. Por lo cual, se planteó otro escenario
de simulación en el que se bloqueo la reacción de transporte de PCA (Reacción 894), con
estas restricciones se esperaría obtener un escenario en el que la célula deba sintetizar y
exportar PCA. Los resultados del modelamiento de la red de Pseudomonas aeruginosa
PAO1 bajo la aproximación de FBA teniendo en cuenta la modificación mencionada
anteriormente para la reacción de transporte de PCA (Tabla 4), muestran que al llevar a la
célula a sintetizar PCA, el flujo de la reacción de biomasa disminuye en un 18% en
comparación con la primera simulación (ver Tabla 3), esto puede darse posiblemente por
el costo energético que implica la síntesis de un metabolito requerido como precursor de
biomasa.
Tabla 4. Simulación en GAMS de flujos en estado estacionario restringiendo las reacciones de transporte e intercambio de PCA.
ID de Reacción
Descripción Flujo (mmol/gDW*h)
914 Biosíntesis de biomasa 0.50588105
59 Síntesis de 2-amino-4-deoxi-chorismate 0.80940969
228 Hidrolisis de 2-amino-4-deoxi-chorismato 0.80940969
894 Transporte de PCA Reacción Bloqueada
1124 Isomerización de trans-2,3-dihydro-3-hydroxy-anthranilato 0.80940969
1125-1132 Biosíntesis de PCA 0.40470484
1133 Intercambio de PCA 0.00
Los resultados también muestran que, aunque las reacciones de síntesis de PCA se
activaron, la reacción de intercambio no se activo (Tabla 4). La inactividad de esta
reacción intercambio posiblemente puede presentarse debido a que para modelar la
biosíntesis de PCA fue necesario añadir este metabolito en la reacción de biomasa, de
modo que en la simulación, PCA es indispensable para la producción de biomasa de
Pseudomonas aeruginosa PAO1 y si este metabolito fuera exportado disminuiría la
disponibilidad del mismo lo que conllevaría a la no producción de biomasa. Sin embargo,
en ensayos in vitro, se ha observado que en Pseudomonas aeruginosa este compuesto
podría ser exportado a través de un sistema conocido como MexGHI-OpmD [23, 47] el
35
cual no fue contemplado en el modelo de la red metabólica de este trabajo, con lo que se
propone para dar continuidad a esta investigación en trabajos futuros se contemple la
participación de los mecanismos de regulación génica y metabólica que implican la
actividad de MexGHI-OpmD.
En adición, trabajos como los reportados por El-Sayed y colaboradores en 2008 [48]
indican que la producción de PCA in vitro después de 48 horas de cultivo no supera los
12.6 . Esta producción natural de PCA en Pseudomonas aeruginosa es baja y no
contempla modificaciones como las que se tuvieron en cuenta para el modelamiento
realizado, lo cual puede abrir puertas a investigaciones futuras.
Debido a que PCA es un metabolito secundario asociado a Quorum-Sensing su máxima
producción se da al final de la fase exponencial donde la densidad poblacional es alta
[49]. De modo que la discrepancia en el proceso de biosíntesis evidenciada en los
resultados de las simulaciones mencionadas anteriormente para el modelo propuesto en
este trabajo, se puede deber a que naturalmente la producción de PCA depende del
crecimiento y de la densidad poblacional de Pseudomonas aeruginosa PAO1, mientras
que el modelo matemático propuesto en este trabajo para la producción de este
metabolito en particular, asume que el crecimiento depende de la presencia o síntesis de
PCA. Con lo anterior, se propone para dar continuidad a este trabajo que se contemplen
el modelo de la red metabólica la regulación de los sistemas de Quorum-sensing para la
expresión de PCA.
Sin embargo, esto no implica que el modelamiento de la producción de PCA no se pueda
llevar a cabo bajo la aproximación de FBA, ya que existen otras rutas metabólicas (de las
cuales se conoce muy poco), en las que podría intervenir esta fenazina. Por ejemplo,
Wang y colaboradores en 2011 [50], mostraron que PCA promovía la adquisición de
hierro durante la formación de biofilm en ausencia de sideróforos, mostrando un
mecanismo por el cual las fenazinas podrán contribuir en la adquisición de hierro, lo cual
involucra el transporte de la fenazina en estado reducido hacia el medio extracelular, una
reacción redox en la cual la fenazina se oxida y el hierro III se reduce y posteriormente se
importan los compuestos.
36
Por otra parte, se ha observado que en Pseudomonas aeruginosa PCA podría sustituir al
NAD+ en reacciones de óxido reducción bajo condiciones anaerobias y de esta manera
producir PCA en estado reducido [51]. De este modo se podría adicionar a la red
metabólica las reacciones involucradas en la adquisición de hierro y reducción de PCA,
realizar la curación de la red y manipular las condiciones redox en la célula a través del
método FBA con el fin de determinar si estas condiciones activan las reacciones de
biosíntesis, transporte e intercambio simultáneamente.
Aunque en la simulación bajo la aproximación de FBA mostrada en la Tabla 4 no se activó
la reacción de intercambio de PCA durante su biosíntesis, se observó durante la
simulación que algunas reacciones, como las involucradas en síntesis de otras fenazinas
como lo son 5-metil-PCA, piocianina y 1-hidroxi-fenazina tienen un flujo nulo (Tabla 5).
Tabla 5. Reacciones inactivas para la maximización de la producción de PCA
ID de Reacción
Subsistema metabólico Precursor
3 Biosíntesis de1-hidroxi-Fenazina PCA
28 Biosíntesis de 5-metil-PCA PCA
174 Biosíntesis de Aminoácidos Aromáticos Ácido Corísmico
420 Biosíntesis de Quinonas Ácido Corísmico
712 Biosíntesis de Piocianina PCA
912 Biosíntesis de Pioverdina Ácido Corísmico
Lo anterior puede estar dado debido a que PCA es el precursor de las fenazinas
anteriormente mencionadas y se constituye como un precursor de biomasa en el modelo
matemático, por ende, estas reacciones adquieren un valor de cero con el fin maximizar la
producción de biomasa e impedir el consumo de PCA. Ocurre de la misma forma para las
reacciones mostradas en la Tabla 5 en las que el ácido corísmico es precursor, estas
reacciones se encuentran inactivas debido a que el ácido corísmico es el precursor
principal de PCA y el modelo matemático distribuye los flujos para la producción de PCA
evitado el consumo de ácido corísmico en las otras reacciones en las que está implicado.
Lo anterior indica el adecuado funcionamiento del modelo de la red metabólica de
Pseudomonas aeruginosa propuesto en este trabajo.
6.3. Modelamiento bajo la aproximación de DFBA de la Red Metabólica de
Pseudomonas aeruginosa que involucra la síntesis de PCA.
37
En cuanto al modelamiento bajo la aproximación de DFBA de la red metabólica de
Pseudomonas aeruginosa que involucra la síntesis de PCA, se consideraron varios
escenarios de simulación (Tabla 6), teniendo en cuenta las siguientes condiciones :
(i) La presencia de PCA en la reacción de biomasa. Como se mencionó
anteriormente, PCA es un metabolito secundario que no pertenece al ―Core‖
del metabolismo de Pseudomonas aeruginosa PAO1, por lo cual para activar
las reacciones relacionadas con la biosíntesis de este metabolito, PCA fue
adicionado como precursor a la reacción de biomasa con un coeficiente
estequiométrico de 0.8.
(ii) Los intervalos fueron definidos de un tamaño de 0.0095 horas, lo cual es el
resultado de dividir el tiempo estándar de crecimiento de Pseudomonas
aeruginosa PAO1 (19 horas) en 2000 intervalos [32].
(iii) La reacción que involucra el mecanismo de transporte de PCA (reacción 894)
fue bloqueada. Dado que en el modelamiento bajo la aproximación de FBA se
observó que las reacciones de biosíntesis de PCA estaban activas cuando el
flujo de esta reacción era cero, lo que conllevaba a que la red metabólica
distribuyera los flujos de las reacciones para la activación de la síntesis de
PCA (Activación de los flujos de las reacciones 1124 a 1132)
(iv) La concentración inicial in silico de los componentes del medio de cultivo (LB,
medio Luria Bertani): La concentración inicial de las fuentes de carbono,
nitrógeno, fosforo, azufre, oxigeno y del inoculo (concentración de biomasa
inicial) para una simulación del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en
medio LB fueron las reportadas por Clavijo y colaboradores en 2018 (55.5 mM
de glucosa, 104.1279mM de amoniaco, 3.8801mM de Pi, 0.2863mM de SO4,
1mM de oxigeno y 0.1g/L de inoculo).
Tabla 6. Condiciones de simulación DFBA. Las casillas marcadas con ―X‖ corresponden a las condiciones utilizadas en la simulación. El escenario 1 considera
Escenario de
simulación
PCA presente en la reacción de biomasa
Transporte de PCA
bloqueado 1
2 X
3 X X
38
En la tabla 6 se muestran los escenarios de simulación con las condiciones empleadas en
cada simulación que se plantearon para este trabajo con el fin de estudiar la producción
de PCA en Pseudomonas aeruginosa PAO1 en estado dinámico. El escenario 1 no
considera ninguna condición y se tomó como escenario control para verificar la
funcionalidad del modelo, el escenario 2 considera la inserción de PCA como precursor en
la reacción de biomasa con un coeficiente estequiométrico de 0.8 y finalmente el
escenario 3 considera tanto la inserción de PCA como precursor en la reacción de
biomasa con un coeficiente estequiométrico de 0.8 como el bloqueo de la reacción de
transporte de PCA (reacción 894).
En la simulación bajo las condiciones planteadas para el escenario 1 (Tabla 6), se
observa que hubo producción de biomasa hasta las 9 horas de simulación
aproximadamente (Figura 5), mostrando un aumento exponencial en el tiempo de la
concentración de biomasa hasta un máximo de 1.33g/L.
Figura 5. Perfil de concentración in silico de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1.
Acorde con este resultado, el modelo indica un consumo del 80% de la glucosa disponible
(Figura 6) y un consumo del 100% del sulfato (Figura 7) que coinciden con la hora 9 de
simulación, hora en la que el perfil de biomasa indica haber alcanzado un estado
estacionario. El cambio abrupto entre la fase exponencial y la fase estacionaria es
observado debido a que el modelo matemático permite simular la producción de biomasa
39
siempre que haya disponibilidad de nutrientes, por lo tanto es posible observar un
aumento de la concentración de biomasa en el tiempo hasta que el consumo de sulfato
es del 100%, sin embargo en un perfil de concentración in vitro de biomasa se esperaría
que la fase estacionaria iniciara gradualmente y antes de que el sulfato fuera consumido
por completo.
Como era de esperarse, de acuerdo con las condiciones de simulación de este primer
escenario, no se observó actividad (presencia de flujos metabólicos) para las reacciones
implicadas en la ruta de biosíntesis de PCA y por ende no se obtuvo un perfil de
concentración de PCA; lo anterior, debido a que no se contempló ninguna condición que
permitiera la activación de dicha ruta metabólica.
Figura 6. Perfil de consumo de glucosa in silico por Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1.
Cabe resaltar, que este primer escenario se planteó como un escenario control, con el fin
de evaluar el funcionamiento del modelo de la red metabólica de Pseudomonas
aeruginosa que involucra la síntesis de PCA propuesto en este trabajo y tener un punto de
partida para las siguientes simulaciones, de modo que como resultado se esperaba
40
obtener el perfil de producción in silico de biomasa y el perfil de consumo in silico de
nutrientes.
Figura 7. Perfil de consumo in silico de sulfato por Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 1.
Al tomar en cuenta las condiciones de simulación propuestas en el escenario 2, los
resultados obtenidos con respecto al perfil de biomasa indican, como se muestra en la
figura 8, que se presenta una producción exponencial de biomasa a lo largo de las
primeras 11 horas simuladas, tiempo en el cual la concentración de biomasa alcanza un
máximo de 1.33 g/L (Figura 8).
41
Figura 8. Perfil de concentración de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2.
Esta producción de biomasa está asociada con un consumo del 100% de la glucosa
(Figura 9) y del sulfato disponibles (Figura 10). Esto se asemeja con lo observado
naturalmente en Pseudomonas aeruginosa, ya que hay producción de biomasa hasta
cuando se agotan algunos de los nutrientes escenciales para el crecimiento disponibles
en el medio y luego la producción de biomasa se mantiene constante, lo que corresponde
biológicamente con la finalización de la fase exponencial y el comienzo de la fase
estacionaria. Schleheck y colaboradores en 2009 [52], entre otros, reportaron que
Pseudomonas aeruginosa, puede crecer exponencialmente hasta cuando el consumo de
glucosa es del 100%, lo que concuerda con los resultados mencionados anteriormente.
Los perfiles de concentración in silico de glucosa, sulfato y biomasa obtenidos en la
simulación bajo las condiciones propuestas para el escenario 3 (presencia de PCA en la
reacción de biomasa y bloqueo de la reacción de transporte de PCA) fueron iguales a los
obtenidos aplicando las condiciones propuestas para el escenario 2 (los datos no se
muestran).
Figura 9. Perfil de concentración de Glucosa en Pseudomonas aeruginosa, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2.
42
El tiempo de producción de biomasa y la concentración de biomasa obtenidas en la
simulación dos son similares a los reportados por Clavijo y colaboradores en 2018 [32], ya
que en este estudio se obtuvo que para Pseudomonas aeruginosa PAO1, el tiempo
durante el cual hubo producción in vitro e in silico de biomasa fue de 14 horas, y la
concentración obtenida al cabo de este tiempo fue de aproximadamente 1.3 g/L, por lo
cual se puede afirmar que el escenario 2 simula de mejor manera la producción de
biomasa en Pseudomonas aeruginosa. Así mismo, Clavijo y colaboradores reportan que
al final de la fase exponencial se observó un consumo in silico de glucosa del 100%, lo
cual también ocurre en el escenario de simulación 2 (figura 9).
Con respecto al consumo de sulfato para este trabajo (Figura 10), bajo las condiciones de
simulación del escenario 2 y 3, la disponibilidad de sulfato al igual que que la
disponibilidad de glucosa mostró ser limitante para la producción in silico de biomasa en
Pseudomonas aeruginosa PAO1.
Figura 10. Perfil de concentración de sulfato en Pseudomonas aeruginosa PAO1, empleando las condiciones de simulación propuestas para el escenario 2.
Por otra parte, en los resultados de las simulaciones bajo las condiciones propuestas para
el escenario 2 y el escenario 3 no se observa producción de PCA a nivel extracelular; sin
embargo, a nivel intracelular el modelo muestra un flujo activo para la reacción de síntesis
de de PCA, el cual es constante (Figura 11), con lo que se puede inferir que el PCA
43
producido está siendo consumido en el modelo para la producción de biomasa, debido a
que se ha tomado este metabolito como precursor de biomasa en el modelo propuesto
para este trabajo (Ver sección 5.2.2).
Figura 11. Flujo in silico de la reacción de síntesis de PCA bajo las condiciones de simulación del escenario 3.
En adición, al igual que en la simulación bajo la aproximación de FBA (estado
estacionario, tabla 4), este resultado puede estar relacionado con la inactividad de las
reacciones de transporte e intercambio de PCA y la actividad de las reacciones de la ruta
de biosíntesis de PCA. Como se mencionó en la discusión de esos resultados (en estado
estacionario), no se conoce el mecanismo exacto por el cual se lleva a cabo la
exportación de PCA, por tal razón no es posible en este trabajo obtener un perfil de
producción de PCA extracelular. Esto abre las puertas para investigaciones futuras, en las
que se estudie el mecanismo de transporte de PCA a nivel in vitro e in silico, tambien se
puede proponer evaluar a futuro otras condiciones celulares de simulación que permitan
aumentar la producción de PCA para que no sea consumido por completo en la reacción
de biomasa y el exceso pueda ser exportado.
Como se había mencionado anteriormente, la producción de PCA está regulada por
Quorum sensing; es así cómo los resultados de estudios in vitro, tales como el realizado
por Cui y colaboradores en 2016 [15], en el que se estudian los genes y las proteinas
involucradas en este mecanismo de regulación y su influencia en la producción de PCA
en Pseudomonas aeruginosa PAO1, pueden ser utilizados para construir la red de
44
Quorum sensing [32] que regula la expresión de los genes implicados en la síntesis de
PCA y pueda ser utilizada para simular y modelar la síntesis metabólica de PCA bajo la
aproximación de FBA y DFBA.
7. CONCLUSIONES
El modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la
aproximación de FBA permite simular el metabolismo para la producción de
biomasa de este microorganismo, ya que las reacciones activas observadas en la
simulación en estado estacionario, estaban relacionadas con el crecimiento y
supervivencia celular.
Se diseño un código en el software libre R que permite simular el metabolismo
para la producción de biomasa en Pseudomonas aeruginosa PAO1 en estado
estacionario, con resultados iguales a los obtenidos en el software comercial
(GAMS)
El modelamiento de la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la
aproximación de DFBA permite obtener perfiles de producción de biomasa,
consumo de glucosa y consumo de sulfato que han sido reportados en la literatura.
La red metabólica utilizada en este trabajo permite la simulación de la biosíntesis
de fenazina-1-carboxilato (PCA) en Pseudomonas aeruginosa PAO1 bajo la
aproximación de FBA y DFBA, pero se deben realizar más estudios con relación al
mecanismo de exportación de PCA para obtener un perfil de producción
extracelular de este metabolito.
45
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49
ANEXOS
1. Solucion al problema de optimización lineal de FBA en el software libre R
library(Rsymphony)
library(readxl)
#CONTRUCCION DE LA FUNCION OBJETIVO
obj=c(rep(0,913),rep(1,1),rep(0,219))
#IMPORTACION DE LA MATRIZ ESTEQUIOMETRICA
mat=read_excel("C:/Users/USER/Downloads/Estacionario/Matriz_PCA.xlsx",
sheet=1,col_names=F)
mat=data.matrix(mat, rownames.force = NA)
#CONSTRUCCION DE dir(Restricción tipo Ax=b)
dir=c('==')
i1=1
while (i1<886){
dir=c(dir,'==')
i1=i1+1
}
#CONSTRUCCIÓN DE rhs ―vector nulo‖
rhs=numeric(886)
#CONSTRUCCIÓN DE BOUNDS
##LOWER BOUNDS ―LBj‖
l1=c(LB1,LB2,…,LB100)
l2=c(LB101,LB102,…,LB200)
l3=c(LB201,LB202,…,LB300)
l4= c(LB301,LB302,…,LB400)
l5= c(LB401,LB402,…,LB500)
l6= c(LB501,LB502,…,LB600)
l7= c(LB601,LB602,…,LB700)
l8= c(LB701,LB702,…,LB800)
l9= c(LB801,LB802,…,LB900)
l10=c(LB901,LB902,…,LB1000)
l11= c(LB1001,LB1002,…,LB1100)
l12=c(LB1101,LB1102,…,LB1133)
#CONSTRUCCIÓN DE val1
val1=c(l1,l2,l3,l4,l5,l6,l7,l8,l9,l10,l11,l12)
50
#CONSTRUCCIÓN DE ind
k1=c(1L , 2L , …, 100L)
k2=c(101L,102L,… ,200L)
k3=c(201L,202L,…,300L)
k4=c(301L,302L,…,400L)
k5=c(401L,402L,…,500L)
k6=c(501L,502L,…,600L)
k7=c(601L,602L,…,700L)
k8=c(701L,702L, …,800L)
k9=c(801L,802L,…,900L)
k10=c(901L, 902L,…,1000L)
k11=c(1001L,1002L,…,1050L)
k12=c(1051L,1052L,…,1123L)
k13=c(1124L, 1125L,…,1132L)
ind=c(k1,k2,k3,k4,k5,k6,k7,k8,k9,k10,k11,k12,k13)
#CONSTRUCCIÓN DE val2
##UPPER BOUNDS‖UBj‖
u1=c(UB1,UB2,…,UB100)
u2=c(UB101,UB102,…,UB200)
u3=c(UB201,UB202,…,UB300)
u4=c(UB301,UB302,…,UB400)
u5=c(UB401,UB402,…,UB500)
u6=c(UB501,UB502,…,UB600)
u7=c(UB601,UB602,…,UB700)
u8=c(UB701,UB702,…,UB800)
u9=c(UB801,UB602,…,UB900)
u10=c(UB901,UB902,…,UB1000)
u11=c(UB1001,UB1002,…,UB1100)
u12=c(UB1101,UB1102,…,UB1133)
val2=c(u1,u2,u3,u4,u5,u6,u7,u8,u9,u10,u11,u12)
bounds=list(lower=list(ind=ind,val=val1),upper=list(ind=ind,val=val2))
#CONSTRUCCION DE types
types=c("C")
i2=1
while (i2<1133){
types=c(types,"C")
i2=i2+1
51
}
#MAXIMIZACIÓN
max=TRUE
#SOLUCIÓN
Rsymphony_solve_LP(obj, mat, dir, rhs, bounds , types ,max , verbosity = -2, time_limit = -
1,node_limit = -1, gap_limit = -1, first_feasible = FALSE,write_lp = FALSE, write_mps = FALSE)
2. Red Metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1
Se entrega la red metabólica de Pseudomonas aeruginosa PAO1 utilizada en este trabajo en
formato digital. La red incluye la información (reacciones, genes, metabolitos, enzimas y valores de
), reportada previamente en el modelo CCBM1737, junto con la información referente a la
biosíntesis de fenazina-1-carboxilato, la cual fue adicionada en este trabajo.