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Universidade Federal de PernambucoCentro de Ciências Exatas e da NaturezaDepartamento de Química Fundamental
Química Analítica 12 – Prof.ª Madalena Areias
Técnicas de Separação:Cromatografia Líquida, Cromatografia Gasosa e Eletroforese Capilar
Aluna: Daniele Cristina Gomes da Cunha Kunze
Recife, 29 de julho de 2014
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem
separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra
estacionária.
O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é
atribuída a um botânico russo ao descrever suas experiências na separação dos
componentes de extratos de folhas. Nesse estudo, a passagem de éter de petróleo (fase
móvel) através de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase
estacionária), à qual se adicionou o extrato, levou à separação dos componentes em
faixas coloridas. Este é provavelmente o motivo pelo qual a técnica é conhecida como
cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar à errônea idéia de que o
processo seja dependente da cor.
Apesar deste estudo e de outros anteriores, que também poderiam ser
considerados precursores do uso dessa técnica, a cromatografia foi praticamente
ignorada até a década de 30, quando foi redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na
área possibilitaram seu aperfeiçoamento e, em conjunto com os avanços tecnológicos,
levaram-na a um elevado grau de sofisticação, que resultou no seu grande potencial de
aplicação em muitas áreas. A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de
compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de
compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos
componentes de uma mistura.
O processo cromatográfico consiste na migração dos componentes de uma
mistura entre a fase móvel e a fase estacionária. No caso da cromatografia líquida, a
fase móvel é um solvente e a estacionária é constituída de partículas sólidas
empacotadas em uma coluna, e é sobre essa coluna que a fase móvel é atravessada.
São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos e as duas fases são
responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna cromatográfica. A diferença na
magnitude dessas forças que determina a resolução e portanto a separação dos solutos
individuais. As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos:
1. Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals;
2. Interações de dipolo induzido;
3. Ligações de hidrogênio;
4. Interações dielétricas;
5. Interações eletrostáticas e coulombianas.
As variáveis que afetarem essas forças intermoleculares irão influenciar o grau
de separação obtido pela passagem dos solutos através da coluna cromatográfica.
Há cinco tipos de fases estacionárias com diferentes mecanismos que regem as
separações cromatográficas na CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fase móvel
é possível utilizar um deles:
1. Cromatografia líquido-sólido (ou por adsorção)
O mecanismo desse tipo de separação se baseia na competição que existe entre
moléculas da amostra e as da fase móvel em ocupar os sítios ativos na superfície de um
sólido (fase estacionária).
O equilíbrio estabelecido é: para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na
fase estacionária, primeiro uma molécula da fase móvel deve ser deslocada da
superfície. Se assumir que o adsorvente possui uma superfície polar (por exemplo: sílica
ou alumina), grupos apolares (por exemplo, hidrocarbonetos) terão pouca afinidade por
essa superfície e não irão deslocar a molécula da fase móvel, por isso, não serão retidos.
Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão fortes
afinidades pela superfície e serão fortemente retidos. Moléculas polarizáveis (por
exemplo, moléculas aromáticas) irão apresentar interação dipolo induzido-dipolo com a
superfície do adsorvente e, portanto, também serão retidas.
O grau de retenção depende da polarização de cada molécula ou grupo funcional. É
importante que as partículas da fase estacionária apresentem uma grande área de
superfície, isto é, um grande número de sítios ativos.
2. Cromatografia líquido-líquido (ou por partição)
O mecanismo de separação neste tipo de cromatografia, ou mecanismo de
distribuição como também é chamado, baseia-se nas diferentes solubilidades que
apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na fase estacionária. Então, os
componentes mais solúveis na fase estacionária são seletivamente retidos por ela,
enquanto os menos solúveis são transportados mais rapidamente pela fase móvel.
O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionária na fase
móvel, o que rapidamente deteriora a coluna, levando a não reprodutibilidade nas
separações repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras: saturando a fase móvel
com a fase estacionária por meio de uma pré-coluna, colocada antes do injetor, que
contenha uma alta percentagem de fase estacionaria; ou utilizando materiais que
contenham a fase estacionária, quimicamente ligada a um suporte sólido.
3. Cromatografia líquida com fase ligada
A fase estacionária para a cromatografia líquida com fase ligada (CLFL) surgiu
como resposta aos problemas com a CLL. Como a fase estacionária é quimicamente
ligada à superfície do suporte, não há mais solubilidade da fase estacionária na fase
móvel.
O mecanismo principal desta técnica baseia-se na partição. Por outro lado, como
esta fase estacionária também apresenta influência de grupos ativos (polares) da
superfície (isto é, também ocorre o mecanismo de adsorção), a maioria dos
pesquisadores considera esta técnica um método separado.
Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionária é possível obter
diferentes tipos de seletividade. Estes grupos podem ser polares, como o grupo amino
(-NH2) e o grupo nitrilo (-CN), que funcionam similarmente às fases polares da CLS,
sendo chamados de fase normal. E há os de natureza apolar, como os grupos octil
(-C8H17), octadecil (-C18H37) e fenil (-C6H5), que são chamados de fase reversa.
Este tipo de cromatografia é muito útil e se aplica a moléculas de baixa ou média
polaridade, não iônicas, de massa molecular inferior a 2000 e solúveis em solvente
orgânico.
4. Cromatografia líquida por troca iônica
Na cromatografia por troca iônica (CTI), a fase estacionária possui grupamentos
iônicos quimicamente ligados que podem ser trocadores de cátions ou de ânions. Esses
grupamentos apresentam contra-íons que são deslocados pelos íons da amostra.
5. Cromatografia líquida por exclusão
Esta técnica é baseada no tamanho efetivo das moléculas dos componentes da
amostra em solução. E existem limites que determinam o intervalo de tamanhos em que
um material é útil. O primeiro é o inferior, chamado de limite de permeação, abaixo do
qual todas as moléculas de menor tamanho são igualmente difundidas dentro dos poros
do material e o segundo é o superior, chamado limite de exclusão, acima do qual todas
as moléculas são muito grandes para penetrar nos poros. Moléculas de tamanho
intermediário entre ambos os limites serão separadas totalmente ou parcialmente de
acordo com a seletividade característica de cada material. Então, serão eluídas sem
resolução as moléculas menores que o limite de permeação e as maiores do que o limite
de exclusão, separando somente as que se encontram dentro destes limites.
Instrumentação
Um equipamento básico de cromatografia líquida contém basicamente cinco
componentes, como pode ser visto no esquema abaixo:
1. Reservatório da fase móvel: A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que
respeite algumas características impostas por esse método analítico. A principal
característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação química
entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fácil purificação, para
que se possam fazer análises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem
interferir na detecção do analito por ultravioleta (UV).
A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e, também possuir
polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da
amostra. Embora existam vários solventes, três deles são mais utilizados: água,
metanol e acetonitrila. As fases móveis polares têm tendência a dissolver oxigênio e
outros gases. Se esses gases são liberados dentro do equipamento, formam bolhas e
podem afetar o funcionamento do detector e a eficiência da coluna. Por esse motivo
é necessário remover os gases dissolvidos na fase móvel. Em muitos equipamentos,
o próprio reservatório está condicionado a efetuar a remoção, por exemplo, pela
aplicação de vácuo no reservatório e agitação da fase móvel sob ação de ultrassom
e/ou aquecimento. O problema da formação de bolhas tem sido reduzido pela
adição de um filtro na saída do detector, o que restringe um pouco a vazão e produz
uma pequena pressão na cela do detector, impedindo a formação de bolhas.
2. Bombas de alta pressão: O grande avanço na cromatografia em coluna foi o
desenvolvimento e a utilização de suportes com partículas diminutas responsáveis
pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão
para a eluição da fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade.
A bomba de alta pressão é o dispositivo que
bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase
móvel (solvente). É composta de um ou mais
pistões acoplados a um sistema de válvulas e
fornece uma alta pressão. A bomba tem que
proporcionar uma vazão razoável através da
coluna, para que a análise não seja lenta, e uma
vazão constante, para não atrapalhar o sistema de
detecção. Podem ser considerados basicamente
dois tipos de bombas, as mecânicas e as
pneumáticas.
3. Válvulas para amostragem: Anteriormente, a introdução da amostra era efetuada
de forma similar à realizada na cromatografia gasosa, ou seja, mediante micro-
seringa que injeta a amostra dentro de uma pequena câmara, de onde é eluída pela
fase móvel.
Os equipamentos modernos empregam válvulas para amostragem, como a ilustrada
abaixo:
A amostra, introduzida na válvula mediante seringa, deve encher o espaço interno
da porção do tubo capilar de aço, a alça de amostragem (carga). Normalmente o
volume contido na alça é de 1 a 100 µL. A amostra é injetada na coluna, ao girar a
válvula para que a posição de entrada e saída mude (injeção na coluna). Desta
forma pode injetar-se na coluna pressurizada um intervalo amplo de volumes de
amostra, dependendo do tubo capilar (alça de amostragem) utilizado, com um alto
grau de reprodutibilidade. As válvulas para amostragem são fabricadas somente de
material inerte, como teflon e aço inoxidável, e seu desenho é tal que resistem a
pressões muito elevadas.
4. Coluna cromatográfica: É feita de um material inerte que resiste a todas as
pressões em que ela vai ser usada. A capacidade da coluna é determinada pelo
comprimento, diâmetro e pelo material de recheio. Geralmente, é utilizada também
uma pré-coluna, que é uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica
e tem como objetivo reter sólidos e, em muitos casos, reter materiais que por
reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.
As colunas geralmente utilizadas são: octadecil (C18, RP18, ODS), octil (C8, RP8),
CN (cianopropil) e NH2 (amina). A fase estacionária mais utilizada é composta de
partículas microporosas de sílica. São permeáveis ao solvente e possuem uma área
superficial de várias centenas de metros por gramas.
5. Detectores: Uma instrumentação melhor é requerida para a CLAE, em relação à
sensibilidade dos detectores, para monitorização do efluente que sai da coluna.
Infelizmente as propriedades físicas ou físico-químicas da amostra e fase móvel
são, muitas vezes, similares. Algumas soluções para o problema de detecção têm
sido procuradas no desenvolvimento da CLAE: medidas diferenciadas de
propriedades gerais de ambas: amostras e fase móvel; medidas de uma propriedade
da amostra que não é apresentada pela fase móvel; e detecção após a eliminação da
fase móvel.
Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em
uma destas soluções. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes
características:
Alta sensibilidade e baixo limite de detecção;
Resposta rápida a todos os solutos;
Insensibilidade a mudanças nas temperaturas e na vazão da fase móvel;
Resposta independente da fase móvel;
Pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do
detector;
Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto;
Não destruição do soluto;
Segurança e conveniência de uso;
Informação qualitativa do pico desejado.
Infelizmente, não existe um detector que apresente todas estas propriedades, a
não ser que ele seja desenvolvido. A tabela abaixo resume algumas das
propriedades dos detectores:
Cromatografia Gasosa
Assim como a cromatografia líquida, a cromatografia gasosa é um método físico
de separação, no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas
fases: a fase estacionária, e a fase móvel. Neste caso, a fase móvel é um gás inerte,
normalmente nitrogênio, hélio ou hidrogênio. A amostra é transportada por uma
corrente de gás através de uma coluna empacotada com um sólido recoberta com uma
película de um líquido.
Devido a sua simplicidade, sensibilidade e efetividade para separar os
componentes de misturas, a cromatografia de gás é uma das ferramentas mais
importantes em química. É amplamente usada para análises quantitativos e qualitativos
de espécies químicas e para a determinar constantes termoquímicas tais como calores de
solução e vaporização, pressão de vapor e coeficientes de atividade. A cromatografia de
gás é também usada para monitorar os processos industriais de forma automática:
analisam-se as correntes de gás periodicamente e realizam-se reações de forma manual
ou automática para compensar variações não desejadas.
O método consiste primeiramente na introdução da mistura de prova ou amostra
em uma corrente de gás inerte, normalmente hidrogênio, hélio, nitrogênio ou argônio,
que atuarão como gás de arraste. As amostras líquidas vaporizam-se antes da injeção no
gás de arrastre. O fluxo de gás passa pela coluna empacotada através da qual os
componentes da amostra se deslocam a velocidades influenciadas pelo grau de interação
de cada componente com a fase estacionária não volátil. As substâncias que têm a maior
interação com a fase estacionária são retidas por mais tempo e, por tanto, separadas
daquelas de menor interação. À medida que as substâncias eluem da coluna, passam por
um detector, que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de material eluido. O
registro deste sinal em função do tempo é o cromatograma, sendo que as substâncias
aparecem nele como picos com área proporcional à sua massa, o que possibilita a
análise.
Existem dois tipos de cromatografia de gás: cromatografia gás-sólido (CGS) e
cromatografia gás-líquido (CGL). A cromatografia gás-sólido se baseia na base sólida
estacionária, na qual a retenção das substâncias analisáveis é a consequência da
absorção física. A cromatografia gás-líquido é útil para separar íons ou moléculas
dissolvidas em um solvente. Se a solução de amostra estiver em contato com um
segundo sólido ou fase líquida, os diferentes solutos interagem com a outra fase em
diferentes graus, devido a diferenças de adsorção, intercâmbio de íons, partição, ou
tamanho. Estas diferenças permitem que os componentes da mistura se separem usando
estas diferenças para determinar o tempo de retenção dos solutos através da coluna.
Instrumentação
Os constituintes básicos de um sistema cromatográfico gasoso são bastante
semelhantes ao líquido:
1. Reservatório de Gás de Arraste
O gás de arraste fica contido em cilindros sob pressão. Assim, a escolha do gás
de arraste independe da amostra a ser separada. O parâmetro mais importante é a sua
compatibilidade com o detector (alguns detectores trabalham melhor quando se usam
determinados gases). Os gases mais empregados são H2, He e N2 e a vazão do gás de
arraste, que deve ser controlada, é constante durante a análise.
2. Sistema de Introdução de Amostra
Na CG, a seção do cromatógrafo gasoso onde é feita a introdução da amostra é o
injetor (ou vaporizador). Na versão mais simples, trata-se de um bloco de metal
conectado à coluna cromatográfica e à alimentação de gás de arraste. Este bloco contém
um orifício com um septo, geralmente de borracha de silicone, pelo qual amostras
líquidas ou gasosas podem ser injetadas com micro seringas hipodérmicas. Amostras
sólidas podem ser dissolvidas em um solvente adequado. O injetor deve estar aquecido a
uma temperatura acima do ponto de ebulição dos componentes da amostra, para que a
amostra se volatilize completa e instantaneamente e seja carregada para a coluna. Se a
temperatura for excessivamente alta, pode ocorrer decomposição da amostra. A amostra
deve entrar na coluna na forma de um segmento estreito, para evitar alargamento dos
picos.
3. Coluna Cromatográfica
Depois de injetada e vaporizada, a amostra é introduzida na coluna
cromatográfica, onde é efetuada a separação. Na CG a "afinidade" de um soluto pela
fase móvel é determinada pela volatilidade do soluto, sua pressão de vapor, que é
função da estrutura do composto e da temperatura. Alterando-se a temperatura, altera-se
também a pressão de vapor e, por conseguinte, a "afinidade" de uma substância pela
fase móvel.
4. Detector
Quantifica e indica o que sai da coluna. Os dois tipos mais utilizados são o
detector por ionização de chama (FID) e o detector fotométrico de chama (FPD).
Um detector de ionização de chama (FID ou DIC) consiste em
uma chama de hidrogênio (H2)/ar e um prato coletor. O efluente passa
da coluna do CG através da chama, a qual divide em moléculas
orgânicas e produz íons. Os íons são recolhidos em um eletrodo
negativo e produzem um sinal elétrico. O FID é extremamente
sensível com uma faixa dinâmica grande. Sua única desvantagem é
que destrói a amostra. Sua maior utilização é na detecção de
hidrocarbonetos. O FID oferece uma leitura rápida, precisa e contínua
da concentração total de HC para níveis tão baixos como ppb.
Já o detector fotométrico de chama (FPD)
permite medições sensíveis e seletivas de enxofre
volátil e compostos de fósforo. O princípio de detecção
é a formação de espécies de enxofre excitado (S2*) e
HOP* em uma chama. Um tubo fotomultiplicador
mede a emissão de quimiluminescência característica
dessas espécies. O filtro óptico pode ser trocado para
permitir ao fotomultiplicador visualizar luz de 394 nm (para a medição de enxofre) ou
526 nm (para fósforo). A resposta do detector ao fósforo é linear, ao passo que a
resposta ao enxofre depende da concentração. Normalmente utiliza-se (N2) como gás de
arrastre.
5. Eletrônica de tratamentos: Purifica os ruídos para melhor análise;
6. Registro de sinal: Analisa e avalia os dados obtidos no processo.
Eletroforese Capilar
Este método de separação pode ser definido como sendo a migração de espécies
carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas
em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada.
Para uma separação eletroforética ocorrer, uma pequena quantidade de amostra é
injetada numa solução tampão aquosa contida em um tubo estreito ou em um suporte
poroso e plano, como papel ou gel semissólido. Aplica-se então, um alto potencial de
corrente contínua ao longo do comprimento do tampão através de um par de eletrodos
localizados nas extremidades. A aplicação desse potencial faz com que os íons da
amostra migrem em direção a um ou a outro eletrodo. As separações são baseadas nas
diferenças das relações carga/tamanho dos analitos da amostra. Se um potencial alto for
aplicado através de um tubo capilar contendo solução tampão, ocorre um fluxo eletro
osmótico, onde o solvente migra em direção ao cátodo ou ao ânodo.
O princípio da separação em eletroforese se baseia na diferença nas velocidades
de migração de compostos diferentes quando aplicado uma ddp entre as extremidades
do capilar.
v=μe × E onde: µe = mobilidade eletroforética
E = força do campo elétrico
Altos potenciais levam a uma velocidade de migração elevada, isto é uma
separação rápida.
A eletroforese capilar (EC) é uma técnica aplicável na determinação de uma
grande variedade de amostras. Uma característica que difere a EC das outras técnicas é
a sua capacidade única para separar macromoléculas carregadas eletricamente de
interesse tanto em indústrias de biotecnologia quanto em pesquisas biológicas.
Na eletroforese capilar é possível empregar diversos modos de separação, cada
qual com seu mecanismo e seletividade característicos. A seguir são apresentadas, de
forma simplificada, as características de cada tipo de separação.
1) Eletroforese capilar de zona (CZE)
A eletroforese de zona em solução livre é a técnica mais utilizada e tem esta
denominação devido ao fato de que o capilar e os reservatórios contendo os eletrodos
são cheios com um tampão (denominado eletrólito carreador), o qual conduz a corrente
elétrica e fornece a capacidade tamponante. A amostra, contendo uma mistura iônica, é
introduzida no capilar como uma banda de pequena espessura. Sob a influência do
campo elétrico, as espécies iônicas da amostra e do tampão migram para o eletrodo
correspondente, isto é, cátions em direção ao catodo e ânions em direção ao anodo,
como é mostrado na figura abaixo:
2) Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC)
Na eletroforese de zona em solução livre não é possível à separação de
diferentes compostos neutros, pois estes migram na mesma velocidade, já que não estão
sob a influência do campo elétrico. Desta forma, para separá-los é necessário utilizar
outra técnica de separação, como por exemplo, a cromatografia eletrocinética. Neste
tipo de eletroforese, a separação do soluto é dependente da distribuição entre as fases
aquosa e micelar, como representado abaixo:
3) Isotacoforese Capilar (CITP)
Na isotacoforese, a amostra é introduzida na interface de um sistema tampão,
consistindo de um eletrólito líder e um eletrólito terminal. Para efetuar a separação,
utilizam-se as diferenças nas mobilidades eletroforéticas de cátions e ânions, em relação
aos íons dos eletrólitos líder e terminal.
Na separação de uma amostra de cátions, por exemplo, o eletrólito líder deve
possuir cátions cuja mobilidade seja maior que a dos íons a serem separados e o
eletrólito terminal deve possuir cátions com mobilidades inferiores aos cátions da
amostra. Desta forma, estabelecem-se zonas de amostras, entre os dois tipos de
eletrólitos, que vão sendo continuamente separadas, até que cada zona contenha um
único tipo de íon. Todas as zonas migram, na mesma velocidade do íon do eletrólito
líder, em direção ao eletrodo correspondente.
4) Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF)
Na focalização isoelétrica, os analitos são separados de acordo com seus pontos
isoelétricos (pI) isto é, o valor do pH no qual o anfólito tem carga residual nula. No pI
não ocorre migração sob a ação de um campo elétrico. A amostra é misturada com uma
série de reagentes, denominados anfólitos carreadores, que possuem boa capacidade
tamponante em seus valores individuais de pI. Um gradiente de pH é obtido quando se
aplica o campo elétrico, fazendo com que ocorra uma movimentação do soluto, de
acordo com o valor do pH. Desta forma, em valores de pH mais baixos que o pI dos
analitos, estes migram para o catodo, pois estão positivamente carregados. Em pH mais
alto, eles migram para o anodo, pois estão carregados negativamente. Este tipo de
eletroforese é utilizado, quase exclusivamente, para a separação de espécies anfóteras,
como proteínas e polipeptídios.
5) Eletroforese Capilar em Gel (CGE)
Este tipo de eletroforese é utilizado quando a razão carga/raio dos analitos é tão
próxima, que não é possível separá-los com o uso da eletroforese de zona tradicional.
A separação é realizada com base na diferença entre o tamanho das moléculas
dos analitos; sendo assim, a maior ou menor facilidade com que os analitos de diversos
tamanhos migram através da matriz de gel é que produz a separação, como mostra a
figura abaixo:
6) Eletrocromatografia Capilar (CEC)
A eletrocromatografia capilar é uma técnica de separação que mistura
características da eletroforese capilar e de HPLC. Este tipo de eletroforese emprega
como fase estacionária micro partículas de sílica fundida, usualmente contendo um
ligante hidrofóbico que retém os solutos. Da mesma forma que em HPLC, na CEC
existe uma fase móvel que é, normalmente, uma mistura de tampões aquosos. A
superfície de sílica possui uma alta densidade de grupos silanóis ionizados, gerando,
desta forma, um elevado fluxo eletroosmótico quando a voltagem é aplicada. O
mecanismo de separação é dependente da natureza da amostra.
Instrumentação
Geralmente o funcionamento de um equipamento de eletroforese capilar (EC)
envolve a aplicação de alta voltagem, tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de diâmetro
reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100 mA. O uso do capilar apresenta várias
vantagens, particularmente com respeito ao aquecimento Joule.
A alta resistência elétrica deste permite a aplicação de campos elétricos altos
pois gera um aquecimento mínimo, além disso o formato de capilar propicia uma
dissipação eficiente do calor gerado. O uso de campos elétricos altos resulta em tempo
de análise curto, alta eficiência e resolução.
Na eletroforese capilar, o capilar é preenchido com uma solução tampão e suas
extremidades são mergulhadas em recipientes que a contém e onde é aplicado um
campo elétrico, que gera uma corrente no interior do capilar. Os eletrodos são feitos de
um material inerte, tal como, platina, e são também mergulhados na solução para fechar
o circuito. O capilar passa através de um detector, usualmente um detector
espectrofotométrico de absorção no UV/Vis.
Uma pequena quantidade de amostra é introduzida em uma das extremidades do
capilar. A aplicação do campo elétrico provoca o movimento dos analitos em direção
aos eletrodos. As separações em EC são baseadas na presença de um fluxo
eletricamente induzido, denominado fluxo eletroosmótico (FEO), um fenômeno
eletroforético que gera o fluxo da solução dentro do capilar, que faz com que os solutos
se movimentem em direção ao detector. Este fluxo pode reduzir significativamente o
tempo de análise ou forçar um íon a reverter a sua tendência de migração em direção a
um eletrodo, pelo qual está sendo atraído, devido ao sinal de sua carga.
O gráfico, gerado pelo detector, tempo em função de resposta do detector é
denominado eletroferograma:
Capilares
Os capilares podem ser de vidro (para l > 280 nm), teflon (flexível, transparente
no UV, porém não pode ser usado com alta voltagem), ou sílica fundida, normalmente
recoberta externamente com uma camada de proteção de poliamida, que produz uma
melhora na resistência mecânica, uma vez que é extremamente frágil e se quebra com
facilidade. Uma pequena porção deste recobrimento é removida a fim de se formar uma
janela para a detecção. A janela é então alinhada ao centro óptico do detector.
Os capilares são, tipicamente, de 25 a 100 cm de comprimento com 15 a 100 µm
de diâmetro interno. Nos instrumentos disponíveis comercialmente, os capilares são
mantidos dentro de um dispositivo, denominado cassete, que facilita a inserção no
instrumento e protege a janela delicada de detecção. A superfície interna do capilar pode
ser quimicamente modificada por meio de ligação covalente com diferentes substâncias.
Estes recobrimentos são utilizados para uma grande variedade de propósitos, tais como,
reduzir a adsorção da amostra ou mudar a carga iônica da parede do capilar.
O controle de temperatura ao redor do capilar é muito importante para assegurar
separações reprodutíveis. O controle é feito geralmente por ar ou líquido refrigerante, os
quais são forçados a passar através do cassete, onde se encontra o capilar.
Introdução da Amostra
Na EC, diferentemente das técnicas cromatográficas (Cromatografia Gasosa -
CG e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE), a amostra não é injetada e sim
introduzida no capilar pelo lado mais distante do detector.
O modo de injeção mais empregado em EC é o denominado hidrodinâmico,
onde o capilar é mergulhado em um frasco contendo a amostra o qual é em seguida
pressurizado, submetido ao vácuo ou erguido (efeito sifão) provocando a entrada de um
certo volume de amostra no capilar. Uma outra alternativa é obtida através da inserção
do capilar e do eletrodo no frasco da amostra seguida da aplicação de uma voltagem,
sendo que solutos neutros são arrastados pelo FEO, ao passo que solutos carregados irão
migrar para dentro do capilar, por causa do FEO e também da migração eletroforética.
Este tipo de injeção é denominado de injeção eletrocinética. A figura abaixo mostra os
esquemas para introdução de amostras:
Detectores
O detector mais frequentemente utilizado em EC é o espectrofotométrico de
absorção no UV/Vis devido à sua natureza quase universal, ou seja, pode ser aplicado
na detecção de várias classes de substâncias. A maioria dos instrumentos tem também
detectores com arranjo de diodos disponíveis, o qual fornece um espectro de UV/Vis
para cada substância detectada.
Alguns detectores alternativos são os de fluorescência, de fluorescência indireta,
de fluorescência induzida por laser, o espectrômetro de massa, o amperométrico e o de
condutividade. O acoplamento de EC com espectrômetro de massas é usualmente
empregado para dar informações estruturais dos analitos.
Bibliografia
1) Análise Instrumental: Cromatografia Líquida de Alta Resolução. CEFET - RJ.
(Disponível em: http://www.ifrj.edu.br/webfm_send/546. Acessado em 20 de julho
de 2014).
2) Cromatografia: um Breve Ensaio. DEGANI, A. L. G., CASS, Q. B., VIEIRA, P.
C. (Disponível em: http://qnint.sbq.org.br/qni/visualizarConceito.php?idConceito=3
3. Acessado em 20 de julho de 2014).
3) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. (Disponível em:
http://pfarma.com.br/
farmaceutico-industrial/130-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia.html.
Acessado em 20 de julho de 2014).
4) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. BOTTOLI, C. B. G. UNICAMP.
(Disponível em: http://www.cg.iqm.unicamp.br/material/qa582/hplc-Fracassi.pdf.
Acessado em 20 de julho de 2014).
5) Cromatografia Gasosa. COSTA, T. CEFET – MG. (Disponível em:
http://www.eba
h.com.br/content/ABAAAAa_4AE/cromatografia-gasosa. Acessado em 26 de julho
de 2014).
6) Cromatografia Gasosa. (Disponível em: http://www.pucrs.br/quimica/professores/
arigony/cromatografia_FINAL/cg.htm. Acessado em 26 de julho de 2014).
7) Cromatografia Gasosa. (Disponível em:
http://hiq.linde-gas.com.br/international/w
eb/lg/br/like35lgspgbr.nsf/docbyalias/anal_gaschrom. Acessado em 26 de julho de
2014).
8) Teoria Geral sobre Eletroforese Capilar. PUC – Rio. (Disponível em:
http://www2.dbd.puc-rio.br/pergamum/tesesabertas/0212144_06_cap_02.pdf.
Acessado em: 26 de julho de 2014).
9) Eletroforese Capilar. SOUSA, R. UFJF. (Disponível em: http://www.ufjf.br/bacca
n/files/2010/10/Aula-11-Eletroforese-Capilar-Modo-de-Compatibilidade.pdf.
Acessado em: 26 de julho de 2014).
10) Eletroforese Capilar. QUEIROZ, S. C. N., JARDIM, I. C. S. F. UNICAMP.
(Disponível em: http://chemkeys.com/br/wp-content/themes/chemkeysbr/articleI.p
hp?u=ZWxldHJvZm9yZXNlLWNhcGlsYXI=. Acessado em: 26 de julho de 2014).