Metodi per studiare l’espressione dei geni• Northern blot• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-

PCR)• Ibridazione In situ• Trascrizione In vitro• DNA Microarray

Purificazione dell’RNA

• Procedura – Lisi delle cellule con un reagente

che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi

– Rimozione delle proteine– Precipitazione specifica dell’RNA

Northern blot

• Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA

• Studi sull’espressione genica

Northern blot– Elettroforesi dell’RNA in gel

contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare

– Trasferimento dell’RNA su una membrana

– Ibridazione con una sonda marcata

100V 0,2A

+-

generatore di corrente

gel di agarosio

scatola elettroforetica

tampone elettroforeticoes. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

Gel Elettroforesi-

Separa le molecole in base alla dimensione

Trasferimento su supporto solido

Trasferimento dal gel alla membrana

Preparare la sonda per il Northern Blot

Ibridazione

• La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare

Lavaggio

• Rimozione della sonda non legata al supporto solido

Rivelazione degli ibridi

• Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente

• Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

gel

membrana

Dopo il trasferimento

Northern blot

• La rivelazione avviene usando:– DNA marcato con

radioattivo(32P)

– DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb

Northern blot

Svantaggi del Northern Blot

• Richiede grandi quantita’ di RNA

• E’ un processo lungo e laborioso

Trascrittasi Inversa-PCR

• Rivelazione di mRNA molto rari• Analisi di RNA con pochissime

quantita’

Procedura• Purificazione dell’RNA• Aggiungere i primer• mescolare RNA con la trascrittasi

inversa per effettuare la sintesi del primo filamento di cDNA

• Aggiungere la DNA polimerasi termostabile per effettuare la sintesi del secondo filamento di cDNA e per amplificarlo con i cicli della PCR

AAAAA5’ TTTTTPrimer 1 3’ 5’

reverse transcriptase(RNA-dependent DNA polymerase)

AAAAATTTTT

mRNAcDNA

mRNA

Remove RNA(RNase A)

TTTTT 5´cDNA

Add PCR primers

Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR)

TTTTT5’3’

5’ 3’Primer 2Primer 3

5’3’ 5’

3’

3’

3’

Add Taq polymerase. Run PCR

l l se r st l se r st pl

+ + + + - - - - RT

Reverse transcriptase-PCR (= RT-PCR)

Epoxide hydrolase

831947

19042027

564

1584

Ibridazione dell’RNA in situ

Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio

Preparation of RNA probe with in vitro transcription

T7/T3 or SP6 promoter

Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root

RNA in situ hybridization

Colour substrate:

nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)

Northern blottingProbe labeling

pBS-SemaIII

dATP

dGTPdTTP

dCTPRNA isolation

AAAAAA

Gel electophoresis

Blotting

Hybridization

Autoradiography

reverse Northern blotting

Down-regulation of transcripts

Up-regulation of transcripts

**

labeled (specific) probe

target

Northern

**

specific probes

labeled target

reverse Northern

cDNA arrays (continued)

• macro-arrays– low-density

– filter-supported

– radioactive probes (duplicates)

– low sensitivity

– only cDNA clones spotted

– cheap

cDNA arrays (continued)

• micro-arrays– high-density

– glass-supported

– fluorescent probes (single slide)

– high sensitivity

– ability to spot oligonucleotides

– very expensive

Tessuto della prostata, normale

Tessuto della prostata, tumorale

Un microarray è un supporto solido sul quale sono stati posizionati diverse migliaia di cDNA in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un cDNA corrispondente a tale gene.

I microarrays

In questo esempio i cDNA sono stati posizionati su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati per l’istologia.

Microarray technology

http://www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/procedure.htm

Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo “linking”

Probes

si confrontano i profili di espressione genica di due campioni differenti.E’ necessario estrarre le molecole di mRNA dai due campioni.

Tessuto della prostata, normale

Tessuto della prostata, tumorale utilizzo dei microarrays

Estrazione dell’mRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare

Conversione in cDNA

Marcatura con 2 fluorocromi diversi

Riconoscimento tra i cDNA

Eccitazione della fluorescenza tramite laser

Immagine a colori raffigurante il microarray

provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray

(1)

(2)

(3)

(4) (5)

(6)

Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi

I puntini gialli corrispondono a geni che sono espressi in uguale quantità nei due campioni.I puntini verdi corrispondono a geni maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza verde (ad esempio nelle cellule normali).I puntini rossi corrispondono a geni che sono maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza rossa (ad esempio nelle cellule tumorali).

Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi