Post on 13-Nov-2018
1
Metodi di laboratorio nel controllo microbiologico degli alimenti: classici ed innovativi
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Torino, 10-11 Giugno 2013
S.S. Laboratorio Controllo Alimenti fabio.zuccon@izsto.it
2
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
• Aspetti normativi• Metodi normati
• Metodi alternativi
Cosa tratteremo…
• Aspetti pratici• Per il laboratorio
• Per l’utenza
3
REGOLAMENTO (CE) N. 882/2004 DEL
PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO
del 29 aprile 2004
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla
normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla
salute e sul benessere degli animali
4
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
I metodi di campionamento e di analisi utilizzati nel contesto dei controlli ufficialisono conformi alle pertinenti norme comunitarie
oppure...
ART. 11Metodi di campionamento e di analisi
se tali norme non esistono, a norme o protocolli riconosciutiinternazionalmente , ad esempio quelli accettati dal Comitato europeo dinormalizzazione (CEN) o quelli accettati dalla legislazione nazionale ;
oppure...
in assenza, ad altri metodi utili al raggiungimento degli obiettivi o sviluppaticonformemente a protocolli scientifici .
5
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
REGOLAMENTO (CE) n. 2073/2005 DELLA COMMISSIONEdel 15 novembre 2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti
alimentari
Reg. CE 882/04 – art. 11I metodi di campionamento e di analisi utilizzati nel contesto dei controlli ufficialisono conformi alle pertinenti norme comunitarie
Articolo 5 - Norme specifiche per le analisi e il campionamento
• I metodi di analisi, i piani e metodi di campionamento di cui all’allegato I sono applicati come metodi di riferimento.
• ...
6
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Metodiche classiche
• Metodi qualitativi
• Metodi quantitativi: conteggio ufc/g o ufc/mL
• Metodi semiquantitativi: MPN
7
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Metodi qualitativi tradizionali (ISO)...• Pesata del campione
• Prearricchimento
• Arricchimento
• Isolamento
• Conferma: biochimica e sierologica
8
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
...Metodi qualitativi tradizionali (ISO)...• Pesta del campione
• Prearricchimento
• Arricchimento
• Isolamento
• Conferma: biochimica e sierologica
9
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
...Metodi qualitativi tradizionali (ISO)...• Pesta del campione
• Prearricchimento
• Arricchimento
• Isolamento
• Conferma: biochimica e sierologica
10
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
...Metodi qualitativi tradizionali (ISO)...• Pesta del campione
• Prearricchimento
• Arricchimento
• Isolamento
• Conferma: biochimica e sierologica
11
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Salmonella spp.ISO 6579
Se negativo: esito in 72 ore
12
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Metodi quantitativi:
Conteggio ufc/g o mL
• Pesata
• Diluizione in base 10
• Semina diretta in piastra (per inclusione o spatolamento)
• Conteggio colonie
• Prove di conferma, se richieste
Batteri patogeni ed indicatori igiene conteggiati: Listeria monocytogenes, carica batterica totale, enterobatteri, E. coli ß glucuronidasi +, stafilococchi coagulasi positivi
13
∑CN =
V x (n1 + 0.1n2) x d
10 g o 10 ml di campionein 90 ml di brodo BPW
Preparazione diluizione decimalisuccessive in acqua peptonata
Semina su terreno BP-RPF
Incubazione in aerobiosi a 37°CValutazione dopo 24-48 ore
Conteggio colonie tipiche
Assenza di colonie sospetteEsito come
< 10 ufc/g o <100 ufc/g
Emissione RdP
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Numerazione Stafilococchicoagulasi positiviConteggio colonie
ISO 6888-2
Emissione RdP
∑C = sommatoria colonie di due diluizione successiveV = volume di inoculo in ogni piastre (mL)n1 = numero di piastre della prima diluizionen2 =numero di piastre della seconda diluzioned = fattore di diluzione della prima diluizione considrerata
14
10 g o 10 ml di campionein 90 ml di brodo BPW
Preparazione diluizione decimalisuccessive in acqua peptonata
Semina su terreno MYP
Incubazione in aerobiosi a 30°CValutazione dopo 48 ore
Conteggio colonie tipiche
Assenza di colonie sospetteEsito come
< 10 ufc/g o <100 ufc/g
Emissione RdP
Presenza di colonie sospetteProve di conferma
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Numerazione Bacillus cereusConteggio colonie
IS O 7932
ba = x C
A
a = numero di microrganismi identificatib = n. colonie confermateC =n. di colonie conteggiateA = n. colonie usate per la conferma
15
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Metodi semi-quantitativi:
Most probable number (MPN)
• Pesata
• Diluizione in base 10
• Semina diretta in brodo
• Se tubi +, semina in piastra
• Prove di conferma
Batteri patogeni ed indicatori igiene conteggiati: Listeria monocytogenes, E.
coli ß glucuronidasi +,
16
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
L’impiego di metodi d’analisi alternativi è accettabile quando tali metodi sono validati in base al metodo di riferimento di cui all’allegato I e se è utilizzato un metodo proprietario certificato da una terza parte in base al protocollo definito nella norma EN/ISO 16140 o ad altri protocolli analoghi accettati a livello internazionale.
ART. 5Norme specifiche per le analisi e il campionamento
17
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
I metodi alternativi• Metodiche immunoenzimatiche
• ELFA (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E.coli O157, …) (AFNOR …)
• Automatizzati o semiautomatici
• MPN in card - sistema TEMPO (AFNOR …)
• Metodiche biomolecolari
• Real Time (Salmonella spp , Listeria monocytogenes, VTEC, …) (ISO,
AFNOR …)
• End-point (Salmonella, stafilococchi enterotossigeni, …) (Centro di
Referimento Nazionale, EU-RL, …)
• PFGE (Salmonella, Listeria, S. aureus) (Centro di Referimento Nazionale,
EU-RL, …)
18
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Metodiche ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay )
Immunoenzimatici
• Rilevamento della presenza del target
attraverso la detection di antigeni specifici.
• Utilizza un sistema automatizzato (VIDAS)
• Kit pronto all’uso
19
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Se negativo: esito in 48 ore
Salmonella spp.ELFA
20
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Sistema TEMPO
Il campione è inoculato in card e l’analisi viene letta in maniera automatica dopo incubazione.È un sistema chiuso che rende il risultato in ufc/g o mL
Automatizzati o semiautomatici
21
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Metodiche Real-Time PCR
• PCR: amplificazione della sequenzatarget di DNA grazie a primer specifici
• Nella PCR tradizionale l’amplificazioneviene visualizzata dopo corsaelettroforetica e colorazione del gel dicorsa
• Nella RealTime PCR il DNA amplificatoviene rilevato in tempo reale dallostrumento e non è quindi previstanessuna manipolazione post-amplificazione
22
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Il protocollo R-Ti PCR
• Pesata del campione (25 g),
arricchimento e prima incubazione
(18-24 ore)
• Estrazione , amplificazione
• Risultato (PRESENZA/ASSENZA DI
DNA)
• DNA ≠ da batterio vivo e vitale
23
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Se negativo: esito in 24 ore
Salmonella spp.R-Ti PCR
24
Perchè un metodo alternativo?
• Più rapido
• Ridotto impiego di personale
• Ridotto uso di reagenti
• Migliore performance
• Multitarget
• Patogeni emergenti
• Intervento in emergenze sanitarie
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
25
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Come si procede ?
• Individuare il metodo più adatto
• Applicarlo in laboratorio
• Validare il metodo
• Accreditare la prova
• Renderlo applicabile sui campioni ufficiali
26
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
-Aggiornamento bibliografico relativamente alle
principali tecniche rapide d’indagine, biochimiche
e biomolecolari, in grado di individuare il target
prescelto.
Individuare il metodo più adatto:
-Valuazione della possibilità di utilizzare kit pronti
presenti in commercio o metodi in-house
27
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
1. Stesura Procedura Operativa
2. Allestimento e ottimizzazione in laboratorio dei
metodi individuati.
3. Vincere la iniziale diffidenza del personale
Applicarlo in laboratorio
28
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
I risultati concreti in laboratorio
POS
10CA073
e
10CA074
29
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
1. Se il metodo ha una validazione commerciale,
effettuare la verifica delle performance in
laboratorio
2. Le metodiche alternative e rapide verranno
validate secondo quanto previsto dalla norma ISO
16140 contro il metodo gold standard (es. ISO) o
procedure equivalenti (PGS condivisa tra II.ZZ.SS.)
Validare il metodo
30
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Accuratezza Sensibilità Specificità
AFNOR BRD (07/10-04/05)L. monocytogenes
98,30% 97,50% 98,90%
Un esempio…
31
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
• L'autorità competente designa i laboratori che possono
eseguire l'analisi dei campioni prelevati durante i controlli
ufficiali.
Accreditare la prova - Reg CE 882/04 (art. 12)
• Le autorità competenti, tuttavia, possono designare
soltanto i laboratori che operano, sono valutati e
accreditati conformemente alle seguenti norme europee:
• EN ISO/IEC 17025
• EN 45002
• EN 45003
32
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
I risultati concreti con ACCREDIA …due esempi
POS 10CA073 e 10CA074 accreditate dal dicembre 2007
33
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Applicazioni pratiche
• Oggi tutti i campioni di alimenti prelevati per la
determinazione di di Listeria monocytogenes e
Salmonella sp vengono processati con metodo Real-
Time PCR
– Reg CE 2073/2005 e s.m.i.
– PRISA
– PIF
– UVAC
– MTA
34
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Punti di forza metodi in Real Time PCR
• Tempi di risposta migliorati (campioni negativi in 30 h)
• Buona parte della procedura è automatizzata (minor errore
umano)
• Lettura automatica (minor errore umano)
• Kit pronti all’uso (migliore gestione reagenti a magazzino)
• Sistema miniaturizzato riduce i rifiuti speciali in laboratorio
35
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Criticità dei metodi in Real Time PCR• I positivi devono essere confermati con metodi
tradizionali
36
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Criticità dei metodi in Real Time PCR• Iniziale difficoltà interpretativa del RdP
37
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Un cenno sulla PFGE …• Metodo per la separazione di frammenti di DNA e
successivo confronto profili ottenuti
• Separazione di grossi frammenti di DNA prodotti
tramite enzimi di restrizione
• Si ricorre ad una lisi in situ (in un piccolo cubetto di
agarosio)
• � il DNA immobilizzato nell’agarosio preserva la sua
integrità
38
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Tappe principali della PFGE
• Incorporazione dei batteri in agarosio
• Lisi in situ delle cellule batteriche
• Rimozione dei detriti cellulari
• Restrizione del DNA mediante endonucleasi
• Separazione dei frammenti (gel 1%)
• Visualizzazione con transilluminatore
• Stoccaggio immagine del profilo di bande
• Analisi e interpretazione dei profili
40
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Interpretazione• In alcuni casi è possibile distinguere ad occhio la
presenza di profili identici o differenti per una o
più bande. Per profili con più di 10 bande:
– Nessuna banda di differenza = indistinguibili
– 2-3 bande di differenza = strettamente correlati
– 7 o più bande di differenza = non correlati
• Nel caso di molti campioni in esame è necessario
ricorrere all’utilizzo di software per l’analisi dei dati
41
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Elaborazione dei dati
L’elaborazione dei
dati mediante
l’utilizzo di
programmi
informatici specifici
consente di
calcolare i
coefficienti di
similitudine
42
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Applicazione della PFGE
• Confronto di isolati epidemiologicamente
correlati
• Studio di episodi MTA
43
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Applicazione di PFGE nel Laboratorio Controllo
Alimenti IZS PLV
1
2
3