Post on 05-Oct-2015
description
Metabolizam lipoproteina i ateroskleroza
Predavanja iz Laboratorijske dijagnostike poremeaja metabolizma
kolska 2014/2015. godina
Uloga oksidativnog stresa u nastanku
ateroskleroze
Hipoteze o nastanaku ateroskleroze
- Hipoteza odgovora na povredu (disfunkcija endotela)
-Lipidna hipoteza
-Hipoteza oksidativne modifikacije lipoproteinskih estica
- Hipoteza inflamacije
Hipoteza oksidativne modifikacije lipoproteinske
estice
Steinberg uloga oksidativno modifikovanih LDL estica u nastanku ateroskleoroze
Oksidativni status
Oksidativni status predstavlja odnos markera oksidativnog stresa i antioksidativne zatite.
Oksidativni stres predstavlja poremeaj ravnotee oksidoredukcionih procesa koji nastaje zbogpoveanog stvaranja slobodnih radikala koje elijski homeostatski mehanizmi nisu u stanju da neutraliu.
Slobodni radikali
Slobodni radikali atomi, atomske grupe
ili molekuli sa jednim ili vie nesparenih elektrona
Slobodni radikali mogu nastati:
- gubitkom elektrona iz ne-radikala ili dodatkom elektona ne-radikalu
- raskidanjem kovalentne veze homolitika fizija
Pored slobodnih radikala u oksidoredukcionim procesima uestvuju i neradikalska jedinjenjakoja nemaju nesparen elektron ali uestvuju u reakcijama stvaranja radikala:
- Hidrogen peroksid H2O2- Hipohlorna kiselina HOCl
- Ozon
Izvori slobodnih radikala
Izvori slobodnih radikala mogu biti egzogeni i endogeni.
Endogeni izvori slobodnih radikala
- metabolike transformacije- metabolizam ksenobiotika
Oksidativni metaboliki procesi u kojima nastaju slobodni radikali: - respiratorni lanac mitohondrija
- oslobaanje kiseonika u toku fagocitoze
- sinteza eikozanoida
- enzimske reakcije oksidaza i oksigenaza
Egzogeni izvori slobodnih radikala:
- jonizujue zraenje- ultravioletna radijacija
- ultrazvuk
- duvanski dim
Izvori slobodnih radikala
1O2
O2e
O2
HO2
H+
H2O2 + O22H+O2
ClHOCl
HO + HO
Fe2+
Fe3+OONO
NO
superoksid anjon radikal
hipohlorna kiselina
Singlet kiseonik
hidroperoksil radikalperoksinitril
hidroksil radikal
1O21O2
O2e
O2e
O2
HO2
H+
H2O2 + O22H+O2
H2O2 + O22H+O2
ClHOCl
HO + HO
Fe2+
Fe3+OONO
NO
OONO
NO
superoksid anjon radikal
hipohlorna kiselina
Singlet kiseonik
hidroperoksil radikalperoksinitril
hidroksil radikal
OHeHO 22 244 +++ Kiseonik je snaan oksidans u procesu oksidativne
fosforilacije u unutranjim membranama mitohondrija
u procesu oksidativne fosforilacije.
+ .22 OeO Delimina redukcija kiseonika do superoksid anjon radikala (0.4-4%)molekulskog kiseonika.
Izvori slobodnih radikala
22.
2 OHH2e2O +++ U mitohondrijama se O2.- prevodi u H2O2 dejstvom
enzima superoksid dizmutaze (SOD).
H2O2 se dalje u mitohondrijama prevodi do molekula vode (H2O) i O2 pomou enzima glutation peroksidaze (GPx), a ukoliko pree u citozol, ovu reakciju katalizuje
antioksidativni enzim katalaza (CAT) .
1O2
O2e
O2
HO2
H+
H2O2 + O22H+O2
ClHOCl
HO + HO
Fe2+
Fe3+OONO
NO
superoksid anjon radikal
hipohlorna kiselina
Singlet kiseonik
hidroperoksil radikalperoksinitril
hidroksil radikal
1O21O2
O2e
O2e
O2
HO2
H+
H2O2 + O22H+O2
H2O2 + O22H+O2
ClHOCl
HO + HO
Fe2+
Fe3+OONO
NO
OONO
NO
superoksid anjon radikal
hipohlorna kiselina
Singlet kiseonik
hidroperoksil radikalperoksinitril
hidroksil radikal
U prisustvu jona prelaznih metala (gvoe, hrom, mangan, plemeniti metali) H2O2 stvara vrlo reaktivne slobodne radikale
(HO., HO-) i ova reakcija je poznata kao "Fentonova reakcija.
Nastali vodonik- peroksid u prisustvu jona
gvoa i bakra daje i jako potentan slobodni radikal hipohloritni jon (OCl-) uz uee enzima mijeloperoksidaze.
++ OHkiselinahipohlornaHOClClOH )(22
+ + OClHHOCl
Fentonova
reakcija
Izvori slobodnih radikala u vaskularnom
sistemuEnzimski izvori
- NAD(P)H-oksidaze- membranski enzim
- Ksantin oksidaza
- Mijeloperoksidaza MPO i njeni produkti
- Lipooksigenaza
15,12-lipooksigenaza
5-lipooksigenaza 5-LO
fosfolipaza A2
- NOS (azot oksid sintaza) endotelna
- Inducibilna NOS iNOS
Ne-enzimski izvori
- Tranzicioni metali : Cu 2+ i Fe 3+
- Respiracija u mitohondrijama
Curenje elektrona
Oksidativna modifikacija lipoproteina
Oksidativna modifikacija lipoproteina je posledica lipidne peroksidacije koja se deava pod dejstvom
slobodnih radikala. Lipidnoj peroksidaciji su podlone pre svega nezasiene masne kiseline koje se nalaze vezane za holesterol ili u fosfolipidima LDL estice. Lipidna peroksidacija se odvija u tri faze:
Produkti lipidne peroksidacije su ciklini peroksidi, ciklini endoperoksidi, malondialdehid i nonenal.
Oksidativna modifikacija lipoproteina
Faze lipidne peroksidacije
1.Inicijacija
Prve reakcije u lancu
Oduzimanje H+ jona pomou ROS (OH)
Stvaranje lipidnog radikala (LH)
Stvaranje peroksi radikala (LOO, ROO
)
2. Propagacija
Oduzimanje H+ sa lipidnim
peroksil radikalom (LOO)
3. Terminacija
Interakcija radikala
ne-radikalski produkt
Faze procesa oksidativne modifikacije LDL
esticeOksidativna modifikacija LDL estica se odvija u 4 faza:
1) Faza inicijacijeU ovoj fazi je znaajna uloga metalnih jona u zapoinjanju procesa. Tokom ove faze setroe antioksidativne komponente LDL estica (vitamin E) lag faza
2) Faza propagacijeU ovoj fazi dolazi do oksidacije nezasienih masnih kiselina do LOOH i ovaj proces se odvija jako brzo
3) Faza dekompenzacijeU ovoj fazi se lipidni hidroperoksidi konvertuju do reaktivnih aldehida ( malondialdehid
i 4- hidroksinonenal)
4) Fragmentacija apo B-100 i gubitak funkcije vezivanja za LDL receptoreLizin iz apo B-100 proteina LDL estice biva zamenjen reaktivnim aldehidima usled ega dolazi do fragmentacije apo B-100 gubi mogunost vezivanja za LDL receptore.Modifikovana LDL estica se vezuje za scavenger receptore na makrofagama i dovodi do akumulacije holesterola u makrofagama i stvaranja penastih elija.
Aterogene karakteristike oksidovane LDL
estice
- Oksidovani LDL stimulie hemotaksu
monocita.
- Oksidovani LDL inhibira izlazak monocita
kroz vaskularni zid.
- Oksidovani LDL biva lake preuzet od strane makrofaga koje ga akumuliraju i prelaze u penasteelije.
- Oksidovani LDL dovodi i do disfunkcije i oteenja endotela.
- Oksidovani LDL dovodi do nekroze penastih elija, oslobaanja lizomalnih enzima i stvaranja
nekrotinog tkiva.
Antioksidativna zatita
Antioksidansi slue za neutralizaciju slobodnih radikala u organizmu. U zdravom organizmupostoji ravnotea izmeu prooksidanasa i antioksidanasa.
elija
Antioksidansi imaju sposobnost doniranja
elektrona slobodnom radikalu !!!
Podela antioksidanasa:
Po lokalizaciji
- elijski (citoplazmatski i membranski)- Ekstracelularni
Po funkciji
- Enzimski
- Neenzimski
Hidrosolubilni
Liposolubilni
Enzimska antioksidativna zatita
Najvaniji enzimski antioksidansi su: superoksid dizmutaza (SOD), glutation peroksidaza (GPX),katalaza, glutation reduktaza, glutation S-transferaza, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, hem
oksigenaza, paraoksonaza.
Superoksid dizmutazaIzoenzimi:
- intracelularna Cu, Zn SOD (SOD I)
- mitohondrijalna Mn-SOD (SOD II)
- ekstracelularna SOD (SOD III)
Katalaza (CAT)-uklanja H2O2 i spreava oksidativnu modifikaciju proteina i lipidnu peroksidaciju
Glutation peroksidaza (GPx)- uklanja perokside, ak i lipidne hidroperokside
Neenzimska antioksidativna zatita
Neenzimski hidrosolubilni antioksidansi su: albumin, glutation, bilirubin vezan za albumin,
mokrana kiselina i vitamin C.
Uloga glutationa
Glutation titi membranu
eritrocita od lipidne peroksidacije
i spreava hemolizu.
Neenzimski liposolubilni antioksidansi su: vitamin E, ubihinon Q10, - karoten, likopeni polifenoli (flavonoidi) iz crvenog vina (rezervatrol, katehin)
Francuski paradoks
Mehanizmi antioksidativne zatite
Mehanizmi antioksidativne zatite:
- Direktna zatita od ROS
Superoksid dismutaza, glutation peroksidaza, katalaza
- Nespecifini redukcioni sistemi
Glutation, vitamin C
- Zatita od lipidne peroksidacije
Glutation peroksidaza, vitamin E, karoten
- Vezivanje metala
Transferin, laktoferin, feritin, metalotionein
- Sistemi reparacije
Enzimi reparacije DNK, makrooksiproteinaze, glutation transferaza
Mehanizmi antioksidativne zatite LDL
estice
LDL estice se tite od oksidacije inkorporacijom antioksidanasa.Inkorporacija antioksidanasa u vaskularne elije dovodi do manje oksidacije LDL estica,manje adhezije monocita, manjeg stvaranja penastih elija, manje citotoksinosti i poboljanja endotelne funkcije.
Laboratorijska dijagnostika oksidativnog
statusa
Markeri oksidativnog stresa
Merenje slobodnih radikala
Superoksidni anjon, vodonik peroksid, NO, peroksinitrit
Markeri oksidacije biomolekula
Produkti lipidne peroksidacije (TBARs, lipidni hidroperoksidi, malondialdehid, PGF2-Izoprostani,konjugovani dieni, 4-hidroksinonenal
Produkti hidroksilacije DNK (8-OH gvanozin)
Produkti oksidativne modifikacije proteina (produkti nitrozilacije, karbonili, AOPP, itd)
TOS-totalni oksidantni status
OxLDL
Markeri antioksidativne zatite
- SOD
- GPX
- Katalaza
- Paraoksonaza
- Glutation
- SH grupe
- TAS-totalni antioksidativni status
- PAB- prooksidativno-antioksidativni
balans
Antiaterogena uloga HDL estica
Rezultati Framingam studije : niske koncentracije HDL holesterola- nezavisni
prediktor koronarne srane bolestiFramingamska studije je poela 1948. godine, obuhvatala 5209 odraslih ispitanika, cilj jeprocena rizika za razvoj kardiovaskularnih bolesti. Studija je longitudinalna, traje jo uvek
(trea generacija). Framingam risk score procena rizika (%) za razvoj kardiovaskularnih bolesti u narednih
godina
Antiaterogena uloga HDL estica
0
1
2
3
2,6 4,1 5,7
0,65
1,68
2,2
1,16
Re
lati
vn
i ri
zik
od
KS
B p
osl
e 4
go
din
e
LDL holesterol (mmol/l) HDL h
oleste
rol
(mmo
l/L)
Framingamska studija
Porast nivoa HDL-H za 1% smanjuje rizik od KVB za 2-3 %
Antiaterogena uloga HDL estica
Antiaterogene uloge HDL setica:
- Reversni trasnport holesterola
- Inhibicija oksidacije LDL estica (enzim paraoksonaza 1)- Inhibicija ekspresije adhezionih molekula
- Inhibicija agregacije trombocita
- Spreava inhibiciju azot oksid sintaze
Antiaterogena uloga HDL estica
Struktura HDL estica
HDL je lipoprotein velike gustine koji
sadri 50% apolipoproteina, apo AI iapo AII.
50% lipidi
fosfolipidi 27%
holesterol 20%
trigliceridi 3%
HDL estice se sintetiu u jetri i intestinumu, u nascentnoj, diskoidnoj pre- formikoja se ugavnom sastoji od apolipoproteina i fosfolipida.
pre -HDL
Diskoidni HDL
Reversni transport holesterola
HDL estica ostvaruje svoju ateriprotektivnu ulogu tako to preuzima holesterol iz perifernih elija, makrofaga i taj holesterol vraa u jetru gde se on metabolie u une kiseline i izluujeputem ui.
- mesto sinteze nascentnog, diskoidnog HDL-a (hepatociti i intestinum)
- metabolizam u cirkulaciji
- metabolizam u jetri
- put izluivanja: jetra i bubrezi
Reversni transport holesterola se odvija u 4 faza:
- Preuzimanje holestrola iz perifernih elija vezivanjem HDL estica pomou apo AIEfluks holesterola se odvija pomou ABC A1 transportera(ATP vezujui kasetni transporter klase A1)
- Esterifikacija holesterola u holesterol estre (LCAT)- Indirektan transport holesterol estara u jetru putem transfera na lipoproteine koji su bogati
trigliceridima (CETP)- Direktan transport holesterol estara u jetru vezivanjem za SR BI receptore
Reversni transport holesterola
Lp A-I Lp A-I:A-IIpre-
HDL 2b
HDL 2a
HDL 3a
HDL 3b
HDL 3c
7,2 7,8 8,2 8,8 9,7 12Dijametar (nm)
Gu
stin
a(k
g/L
)
1,125
1,210
1,063
Dijametar (nm)
Gu
stin
a (k
g/L
)
HDL SUBFRAKCIJE
HDL 2 fenotip
HDL 3 fenotip
male, guste HDL male, guste HDL esticeestice
Mehanizmi regulacije metabolizma lipoproteina
U regulaciji metabolizma lipoproteina vanu ulogu imaju transkripcioni faktori (SREBP) i transkripcioni faktori koji se aktiviraju vezivanjem odgovarajuih liganada (LXR, PPAR, RXR).
PPAR Peroxisome Proliferator Activated Receptor
(receptori koji se aktiviraju proliferacijom peroksizoma)
PPAR su nuklearni transkripcioni faktori koji utiu na modulaciju genske ekspresije proteina i enzima koji uestvuju u homeostazi lipida.
Aktiviraju se vezivanjem liganada.
Endogeni ligandi: masne kiseline, eikozanoidi, oksisteroli
Egzogeni ligandi: lekovi (fibrati)
Postoje tri osnovna subtipa PPAR receptora:
PPAR- alfa (jetra)
PPAR gama (adipozno tkivo)
PPAR delta (miino tkivo)
Mehanizmi regulacije metabolizma lipoproteina
Struktura PPAR alfa transkripcionog faktora
PPAR-alfa transkripcioni faktor se sastoji iz tri domena:
- Ligand vezujui domen- Domen dimerizacije
- DNK vezujui domen (Cinkovi prsti)
Aktivacija PPAR alfa receptora
Aktivacija PPAR- alfa receptora se odvija u dve faze:
- Prva faza
Vezivanje endogenih i egzogenih liganada
Heterodimerizacija sa drugim transkripcionim faktorom RXR (retinoid X receptor)
Aktivacija PPAR alfa receptora
Aktivacija PPAR- alfa receptora se odvija u dve faze:
- Druga faza
Prepoznavanje gena u hepatocitima od strane heterodimera PPAR-RXR
PPRE- PPAR responsive element sekvenca nukleotida na molekuli DNK koju prepoznaje
DNK vezujui domen strukture PPAR-alfa AGGTCA-AGGTCA
Uticaj PPAR-alfa transkripcionih faktora na
metabolizam lipoproteina
Metabolizam HDL estica je regulisan pomou PPAR-alfa transkripcionih faktora koji utiu naekspresiju gena za sintezu apo AI, apo AII, ABC A1, LPL i SRB I u hepatocitima.
Na matabolizam VLDL estica utiu tako to u hepatocitima stimuliu beta-oksidaciju masnihkiselina, smanjuje se koncentracija slobodnih masnih kiselina a time i sinteza VLDL estica.PPAR-alfa inhibiraju sintezu apo CIII, inhibitora lipoproteinske lipaze, poveava se uklanjanjeVLDL estica , to posledino smanjuje i broj malih, gustih LDL estica.
Mehanizam dejstva fibrataFibrati su lekovi koji se koriste u terapiji hiperholesterolemije. Mehanizam dejstva je poveanasinteza enzima LPL, inhibicija sinteze apo CIII i poveana sinteza apo AII, preko PPAR alfa transkripcionih faktora.
Dislipidemije - Dislipoproteinemije
Hiperlipoproteinemije
Ciljevi ispitivanja lipidnog statusa
- Postavljanje dijagnoze dislipidemije
- Procena rizika za nastanak kardiovaskularne bolesti
- Primena terapije za leenje dislipidemija
Klasifikacija dislipidemija
- Klasifikacija po Fredericksonu
- beta klasifikacija
- WHO klasifikacija
-Hiperlipoproteinemije i Hipolipoproteinemije
-Disbetalipoproteinemije i Disalfalipoproteinemija
- Poremeaji u egzogenom, endogenom metabolizmu ili reversnomtransportu holesterola
Etioloka podela hiperlipoproteinemija
- Primarne (genetski uslovljene)
- Sekundarne ( nastale kao posledica neke druge bolesti)
- Kombinovane
Nedostaci: ne obuhvata sve dislipoproteinemije (samo hiperbetalipoproteinemije)
ne ukazuje na etiologiju bolesti
ne obuhvata hipolipoproteinemije
Dislipidemije Dislipidemije DislipoproteinemijeDislipoproteinemije
Primarne
Hiperhilomikronemija
Hiperholesterolemija *
Disbetalipoproteinemija *
Hipertrigliceridemija *
Genetski defekti na nivou:
Apolipoproteina
Receptora
Enzima
Transportera
Sekundarne1.Metabolike bolesti: DM tip I i DM Tip II
2.Poremeaji funkcije organa:jetre, bubrega, tireoideje
3.Dejstvo lekova
4.Gojaznost
5. Socijalne navike: fizika neaktivnost, puenje, aterogena ishrana, itd
Kombinovane hiperlipidemije *
* rana i vrlo izraena ateroskleroza, naroito koronarnih krvnih sudova
Primarne dislipidemije
Poremeaji vezani za LDL estice
Hiperbetalipoproteinemije
poveana koncenbtracija LDL-holesterolaPorodina hiperholesterolemija
- defekt LDL receptora (poremeaj sinteze LDL receptora). LDL estice ne mogu da se metaboliu, koncentracija LDL- holesterola je jako visoka
- defekt u primarnoj strukturi apo B-100 (na poziciji 3500 glutamin zamenjen argininom)
Familijarna apo B-3500 hiperholesterolemija
Poremeaji vezani za HDL esticeHipoalfalipoproteinemije
niske koncentracije HDL-holesterola, poveani aterogeni rizikuzroci: genski defekti na nivou apo AI, enzimima (LCAT) i transporteru ABC A1.
Familijarna hiperholesterolemija
Laboratorijska dijagnostika dislipidemija
Lipidni staus podrazumeva odreivanje sledeih parametara:- koncentracija ukupnog holesterola
- koncentracja triglicerida
- koncentracija LDL-holesterola
- koncentracija HDL-holesterola
Odreivanje apolipoproteina obuhvata:
- koncentracija apo AI ( antiaterogeni apolipoprotein)
- koncentracija apo B-100 (aterogeni apolipoprotein)
Aterogeni indeksi:
-ukupan holesterol/HDL-holesterol
- LDL-holesterol/HDL-holesterol
- Apo B/Apo A
- Trigliceridi/HDL-holesterol
- Non HDL-holesterol: ukupan holesterol - HDL-holesterol
LDL i HDL subfrakcije u proceni rizika od KVB
Aterogenost LDL estica se moe proceniti sledeim laboratorijskim odreivanjima:
- Koncentracija LDL-holesterola
- Koncentracija apolipoproteina B-100
- Veliina LDL estica
- Koncentracija holesterola i apo B-100 u LDL subfrakcijama
LDL SUBFRAKCIJE
LDL I
LDL II
LDL III
LDL IV
22,0 24,2 25,5 27,2 28,5Dijametar (nm)
Gu
stin
a(k
g/L
)
1,038
1,063
1,019
Dijametar (nm)
Gu
stin
a (k
g/L
)
LDL fenotip A
LDL fenotip B
male, guste LDL male, guste LDL esticeestice
Visok rizik
Nizak rizik
LDL subfrakcije
Razdvajanje LDL subfrakcija i HDL subfrakcija
- ultracentrifugiranje (razdvajanje na osnovu gustine)
- elektroforeza na poliakrilamidnom gelu (gradijent gel elektroforeza)
- nuklearna magnetna rezonanca
Nain obeleavanja:
mali gusti LDL
LDL1, LDL2, LDL3, LDL4
fenotip A i fenotip B
LDL I, LDL II, LDL III i LDL IV
Fenotip A dominiraju velike LDL estice
Fenotip B - dominiraju male LDL estice
Diferencijacija fenotipova - dijametar estica
> 25,5 nm fenotip A
< 25,5 nm fenotip B
Gu
stin
a (k
g/L
)Dijametar (nm)
LDL subfrakcije
Na ekspresiju LDL B fenotpia utiu sledei faktori: - genetski faktor (autozomalno-dominantno nasleivanje) 35-45%
- pol (ene pre menopauze pod manjim rizikom, 5-10%)- abdominalna gojaznost
- hipertrigliceridemija
- rezistencija na insulin
Aterogenost malih, gustih LDL estica
LDL SUBFRAKCIJE KAO POTENCIJALNI
BIOMARKERI ATEROSKLEROZE
Kliniki znaaj
Male, guste LDL i HDL estice doprinose razvoju ateroskleroze nezavisno od drugih faktora rizika
Nema zvaninih preporuka za rutinsko odreivanje LDL i HDL subfrakcija
Ispitivanje LDL i HDL subfrakcija za procenu Ispitivanje LDL i HDL subfrakcija za procenu
rezidualnog rizika i prarezidualnog rizika i praenje progresije enje progresije
ateroskleroze.ateroskleroze.
Principi razdvajanja LDL subfrakcija
1.gustina
ultracentrifugiranje
2. naelektrisanje
hemijska precipitacija
elektroforeza na agarozi
3. veliina i naelektrisanje
gradijent gel elektroforeza
hromatografske tehnike
4. sastav apolipoproteina
imunohemijske metode
5. lipidni sastav
NMR spektroskopija
Lipoprotein a - Lp (a)
Lp (a) je lipoprotein izuzetno bogat holesterolom. Sastoji se iz dve strukturne komponente
apolipoproteina (a) koji je preko disulfidnog mosta vezan za apo B iz LDL estice.
Apolipoprotein (a) ima specifinu strukturukringl.
LDL estice i Lp (a) razliit metabolizam
- obrnuta korelacija Lp (a) koncentracije i veliineapo (a)
Lp (a) se sintetie u jetri a na povrini hepatocita se
udruuje sa apo B. Elektroforetski se izdvaja kao pre beta lipoproteinska frakcija.
Lipoprotein a kao faktor rizika za razvoj
kardiovaskularnih bolesti
Strukturna analogija sa plazminogenom
Lp(a) vezuje metabolizam lipida sa vaskularnom trombozom i fibrinolizom
Lp(a) inhibira lizu ugruka i smanjuje aktivaciju plazminogena
pomou aktivatora tkivnog plazminogena
Kliniki znaaj odreivanja Lp(a)
Proaterogena i protrombogena aktivnost Lp(a)
Funkcionalni znaaj jo uvek nije jasan. Nezavisni prediktor koronarne bolesti
Rizine vrednosti > 300 mg/L
Genetski polimorfizam apo (a)
Lp(a) je polimorfan u veliini i ima vie izomera. Koncentracija Lp(a) je genetski uslovljena, postoji veza genotipa i koncentracije Lp(a)