Post on 04-Oct-2021
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARAacute
Proacute-Reitoria de Poacutes-Graduaccedilatildeo e Pesquisa
Faculdade de Veterinaacuteria
Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Veterinaacuterias
BODESINAS ESPERMADESINAS CODIFICADAS POR GENES DA VESIacuteCULA
SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS (Capra hircus)
Daacutercio Iacutetalo Alves Teixeira
Fortaleza-Cearaacute
2005
13
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARAacute
Daacutercio Iacutetalo Alves Teixeira
BODESINAS ESPERMADESINAS CODIFICADAS POR GENES DA VESIacuteCULA
SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS (Capra hircus)
Tese apresentada agrave Faculdade de Veterinaacuteria
da Universidade Estadual do Cearaacute como
requisito parcial para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
Doutor em Ciecircncias Veterinaacuterias
Aacuterea de concentraccedilatildeo Reproduccedilatildeo e
Sanidade Animal
Orientador Prof Dr Vicente Joseacute de
Figueirecircdo Freitas
Fortaleza-Cearaacute
2005
14
15
Aos meus pais Damiatildeo Alves Maia e Maria
Luiza Teixeira Maia pelo apoio e incentivo
incondicional ao estudo
Dedico
16
Quem reconhece a sua ignoracircncia
Revela a mais alta sapiecircncia
Quem ignora a sua ignoracircncia
Vive na mais profunda ilusatildeo
Natildeo sucumbe agrave ilusatildeo
Quem conhece a ilusatildeo como ilusatildeo
O saacutebio conhece o seu natildeo-saber
E essa consciecircncia do natildeo-saber
O preserva de toda a ilusatildeo
Lao-Tseacute
17
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus por permitir a conquista de mais uma vitoacuteria na minha vida com sauacutede e
com disposiccedilatildeo para continuar lutando
A Universidade Estadual do Cearaacute em especial ao Curso de Doutorado em Ciecircncias
Veterinaacuterias por proporcionar condiccedilotildees para aprender com as disciplinas
Ao Prof Dr Vicente Joseacute de Figueirecircdo Freitas pela constante luta para
desenvolver ciecircncia com qualidade proporcionando aos seus orientandos um aprendizado
constante e sobretudo pela confianccedila e dedicaccedilatildeo durante a realizaccedilatildeo minha poacutes-
graduaccedilatildeo
Ao Prof Dr Benildo Sousa Cavada pela competecircncia e capacidade de reunir
grandes pesquisadores com fins cientiacuteficos sempre procurando incentivar os seus alunos a
unir amizade e competecircncia e tambeacutem por me colocar sempre a disposiccedilatildeo o seu
laboratoacuterio para desenvolver as atividades inerentes agrave pesquisa
Ao Prof Dr Ghandi Rhadis-Baptista pelo empenho neste trabalho sempre a
disposiccedilatildeo de ensinar os seus conhecimentos incansaacutevel em suas tarefas e com humor para
vibrar as vitoacuterias e natildeo se abater nos resultados negativos
As professoras Dra Ana Maria Sampaio Assreuy e Dra Claudia Ferreira Santos que
sempre estatildeo a disposiccedilatildeo para o ensino e por sempre manter o bom relacionamento com o
nosso grupo de pesquisa
Ao Prof Dr Davide Rondina pelo apoio teacutecnico-cientiacutefico confianccedila profissional e
principalmente pela amizade
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Ao Prof MSc Rodrigo Maranguape pela disposiccedilatildeo de todos os equipamentos e
matildeo de obra para realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Doutoranda Luciana Magalhatildees de Melo pela dedicaccedilatildeo e apoio imensuraacutevel na
composiccedilatildeo deste trabalho o qual estaacute apenas comeccedilando
Ao Dr Alexandre Havt pela contribuiccedilatildeo oferecida durante a confecccedilatildeo dos artigos
cientiacuteficos
Aos Professores e funcionaacuterios do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Veterinaacuterias (PPGCV) da UECE pelo apoio teacutecnico e burocraacutetico para o desenvolvimento
deste trabalho
Aos meus amigos da Iniciaccedilatildeo Cientifica do Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da
Reproduccedilatildeo Camila Pontes Albuquerque Deacuteborah de Melo Magalhatildees Francisco Carlos
de Sousa Isadora Machado Teixeira Joatildeo Davi Arauacutejo da Silva Karlliely de Castro
Almeida Raylene Ramos Moura e Suely Renata Gaya Avelar pela dedicaccedilatildeo aos
trabalhos e sobretudo pelo conviacutevio diaacuterio no laboratoacuterio
Aos meus amigos Mestrandos e Doutorandos do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
Ciecircncias Veterinaacuterias MV Iracelma Juliatildeo Arruda MV Aline Lima Souza MV
Anderson Pinto Almeida Quiacutemica Alexsandra Fernandes Pereira Bioacuteloga Maria Luciana
Lira de Andrade MSc Joatildeo Batista Cajazeiras MSc Ney Rocircmulo de Oliveira Paula e o
Dr Ediacutelson Soares Lopes Juacutenior pela dedicaccedilatildeo no Setor de Ovinocaprinocultura
produzindo ciecircncia de excelecircncia e pelas dias e noites de dedicaccedilatildeo ao trabalho
Aos meus amigos do Laboratoacuterio de Moleacuteculas Biologicamente Ativas ndash BIOMOL-
LAB pela dedicaccedilatildeo e esforccedilo em manter uma instituiccedilatildeo de pesquisa de qualidade
Aos Meus grandes Amigos Dr Carlos Alberto de Almeida Gadelha e Dra Tatiane
Santi Gadelha pelo exemplo de casal e apoio durante este doutoramento
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Aos Funcionaacuterios Selmar e Ceacutesar que participam dos trabalhos diaacuterios com
responsabilidade e competecircncia
Agrave minha famiacutelia pela amizade em especial agraves minhas queridas Tias Maria Salete
Silveira e Freitas Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios Joseacute
Luciecirc Teixeira e Antocircnio Alves Maia
Aos Meus Irmatildeos e Irmatildes Delacircndio Luiz Alves Teixeira Daacuterlio Inaacutecio Alves
Teixeira Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira pelo companherismo
e exemplo de dedicaccedilatildeo agrave famiacutelia
Aos meus pais que tanto amo Damiatildeo Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por
tudo que eles me ensinaram na minha vida
Ao meu amor Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensatildeo nos momentos
ausentes e pelo incentivo nas horas difiacuteceis obrigado por estaacute sempre ao meu lado
E finalmente agrave todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuiacuteram para o
conteuacutedo desta tese e pela construccedilatildeo de minha personalidade
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RESUMO
O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas
espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e
equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na
interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena
relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado
em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos
aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica
para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que
codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi
agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram
inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas
do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-
HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a
Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do
testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA
3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da
espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)
de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena
do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave
clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos
cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2
e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave
espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em
conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de
troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem
formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado
essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de
clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)
21
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARAacute
Daacutercio Iacutetalo Alves Teixeira
BODESINAS ESPERMADESINAS CODIFICADAS POR GENES DA VESIacuteCULA
SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS (Capra hircus)
Tese apresentada agrave Faculdade de Veterinaacuteria
da Universidade Estadual do Cearaacute como
requisito parcial para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
Doutor em Ciecircncias Veterinaacuterias
Aacuterea de concentraccedilatildeo Reproduccedilatildeo e
Sanidade Animal
Orientador Prof Dr Vicente Joseacute de
Figueirecircdo Freitas
Fortaleza-Cearaacute
2005
14
15
Aos meus pais Damiatildeo Alves Maia e Maria
Luiza Teixeira Maia pelo apoio e incentivo
incondicional ao estudo
Dedico
16
Quem reconhece a sua ignoracircncia
Revela a mais alta sapiecircncia
Quem ignora a sua ignoracircncia
Vive na mais profunda ilusatildeo
Natildeo sucumbe agrave ilusatildeo
Quem conhece a ilusatildeo como ilusatildeo
O saacutebio conhece o seu natildeo-saber
E essa consciecircncia do natildeo-saber
O preserva de toda a ilusatildeo
Lao-Tseacute
17
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus por permitir a conquista de mais uma vitoacuteria na minha vida com sauacutede e
com disposiccedilatildeo para continuar lutando
A Universidade Estadual do Cearaacute em especial ao Curso de Doutorado em Ciecircncias
Veterinaacuterias por proporcionar condiccedilotildees para aprender com as disciplinas
Ao Prof Dr Vicente Joseacute de Figueirecircdo Freitas pela constante luta para
desenvolver ciecircncia com qualidade proporcionando aos seus orientandos um aprendizado
constante e sobretudo pela confianccedila e dedicaccedilatildeo durante a realizaccedilatildeo minha poacutes-
graduaccedilatildeo
Ao Prof Dr Benildo Sousa Cavada pela competecircncia e capacidade de reunir
grandes pesquisadores com fins cientiacuteficos sempre procurando incentivar os seus alunos a
unir amizade e competecircncia e tambeacutem por me colocar sempre a disposiccedilatildeo o seu
laboratoacuterio para desenvolver as atividades inerentes agrave pesquisa
Ao Prof Dr Ghandi Rhadis-Baptista pelo empenho neste trabalho sempre a
disposiccedilatildeo de ensinar os seus conhecimentos incansaacutevel em suas tarefas e com humor para
vibrar as vitoacuterias e natildeo se abater nos resultados negativos
As professoras Dra Ana Maria Sampaio Assreuy e Dra Claudia Ferreira Santos que
sempre estatildeo a disposiccedilatildeo para o ensino e por sempre manter o bom relacionamento com o
nosso grupo de pesquisa
Ao Prof Dr Davide Rondina pelo apoio teacutecnico-cientiacutefico confianccedila profissional e
principalmente pela amizade
18
Ao Prof MSc Rodrigo Maranguape pela disposiccedilatildeo de todos os equipamentos e
matildeo de obra para realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Doutoranda Luciana Magalhatildees de Melo pela dedicaccedilatildeo e apoio imensuraacutevel na
composiccedilatildeo deste trabalho o qual estaacute apenas comeccedilando
Ao Dr Alexandre Havt pela contribuiccedilatildeo oferecida durante a confecccedilatildeo dos artigos
cientiacuteficos
Aos Professores e funcionaacuterios do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Veterinaacuterias (PPGCV) da UECE pelo apoio teacutecnico e burocraacutetico para o desenvolvimento
deste trabalho
Aos meus amigos da Iniciaccedilatildeo Cientifica do Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da
Reproduccedilatildeo Camila Pontes Albuquerque Deacuteborah de Melo Magalhatildees Francisco Carlos
de Sousa Isadora Machado Teixeira Joatildeo Davi Arauacutejo da Silva Karlliely de Castro
Almeida Raylene Ramos Moura e Suely Renata Gaya Avelar pela dedicaccedilatildeo aos
trabalhos e sobretudo pelo conviacutevio diaacuterio no laboratoacuterio
Aos meus amigos Mestrandos e Doutorandos do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
Ciecircncias Veterinaacuterias MV Iracelma Juliatildeo Arruda MV Aline Lima Souza MV
Anderson Pinto Almeida Quiacutemica Alexsandra Fernandes Pereira Bioacuteloga Maria Luciana
Lira de Andrade MSc Joatildeo Batista Cajazeiras MSc Ney Rocircmulo de Oliveira Paula e o
Dr Ediacutelson Soares Lopes Juacutenior pela dedicaccedilatildeo no Setor de Ovinocaprinocultura
produzindo ciecircncia de excelecircncia e pelas dias e noites de dedicaccedilatildeo ao trabalho
Aos meus amigos do Laboratoacuterio de Moleacuteculas Biologicamente Ativas ndash BIOMOL-
LAB pela dedicaccedilatildeo e esforccedilo em manter uma instituiccedilatildeo de pesquisa de qualidade
Aos Meus grandes Amigos Dr Carlos Alberto de Almeida Gadelha e Dra Tatiane
Santi Gadelha pelo exemplo de casal e apoio durante este doutoramento
19
Aos Funcionaacuterios Selmar e Ceacutesar que participam dos trabalhos diaacuterios com
responsabilidade e competecircncia
Agrave minha famiacutelia pela amizade em especial agraves minhas queridas Tias Maria Salete
Silveira e Freitas Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios Joseacute
Luciecirc Teixeira e Antocircnio Alves Maia
Aos Meus Irmatildeos e Irmatildes Delacircndio Luiz Alves Teixeira Daacuterlio Inaacutecio Alves
Teixeira Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira pelo companherismo
e exemplo de dedicaccedilatildeo agrave famiacutelia
Aos meus pais que tanto amo Damiatildeo Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por
tudo que eles me ensinaram na minha vida
Ao meu amor Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensatildeo nos momentos
ausentes e pelo incentivo nas horas difiacuteceis obrigado por estaacute sempre ao meu lado
E finalmente agrave todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuiacuteram para o
conteuacutedo desta tese e pela construccedilatildeo de minha personalidade
20
RESUMO
O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas
espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e
equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na
interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena
relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado
em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos
aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica
para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que
codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi
agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram
inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas
do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-
HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a
Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do
testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA
3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da
espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)
de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena
do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave
clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos
cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2
e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave
espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em
conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de
troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem
formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado
essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de
clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)
21
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
15
Aos meus pais Damiatildeo Alves Maia e Maria
Luiza Teixeira Maia pelo apoio e incentivo
incondicional ao estudo
Dedico
16
Quem reconhece a sua ignoracircncia
Revela a mais alta sapiecircncia
Quem ignora a sua ignoracircncia
Vive na mais profunda ilusatildeo
Natildeo sucumbe agrave ilusatildeo
Quem conhece a ilusatildeo como ilusatildeo
O saacutebio conhece o seu natildeo-saber
E essa consciecircncia do natildeo-saber
O preserva de toda a ilusatildeo
Lao-Tseacute
17
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus por permitir a conquista de mais uma vitoacuteria na minha vida com sauacutede e
com disposiccedilatildeo para continuar lutando
A Universidade Estadual do Cearaacute em especial ao Curso de Doutorado em Ciecircncias
Veterinaacuterias por proporcionar condiccedilotildees para aprender com as disciplinas
Ao Prof Dr Vicente Joseacute de Figueirecircdo Freitas pela constante luta para
desenvolver ciecircncia com qualidade proporcionando aos seus orientandos um aprendizado
constante e sobretudo pela confianccedila e dedicaccedilatildeo durante a realizaccedilatildeo minha poacutes-
graduaccedilatildeo
Ao Prof Dr Benildo Sousa Cavada pela competecircncia e capacidade de reunir
grandes pesquisadores com fins cientiacuteficos sempre procurando incentivar os seus alunos a
unir amizade e competecircncia e tambeacutem por me colocar sempre a disposiccedilatildeo o seu
laboratoacuterio para desenvolver as atividades inerentes agrave pesquisa
Ao Prof Dr Ghandi Rhadis-Baptista pelo empenho neste trabalho sempre a
disposiccedilatildeo de ensinar os seus conhecimentos incansaacutevel em suas tarefas e com humor para
vibrar as vitoacuterias e natildeo se abater nos resultados negativos
As professoras Dra Ana Maria Sampaio Assreuy e Dra Claudia Ferreira Santos que
sempre estatildeo a disposiccedilatildeo para o ensino e por sempre manter o bom relacionamento com o
nosso grupo de pesquisa
Ao Prof Dr Davide Rondina pelo apoio teacutecnico-cientiacutefico confianccedila profissional e
principalmente pela amizade
18
Ao Prof MSc Rodrigo Maranguape pela disposiccedilatildeo de todos os equipamentos e
matildeo de obra para realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Doutoranda Luciana Magalhatildees de Melo pela dedicaccedilatildeo e apoio imensuraacutevel na
composiccedilatildeo deste trabalho o qual estaacute apenas comeccedilando
Ao Dr Alexandre Havt pela contribuiccedilatildeo oferecida durante a confecccedilatildeo dos artigos
cientiacuteficos
Aos Professores e funcionaacuterios do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Veterinaacuterias (PPGCV) da UECE pelo apoio teacutecnico e burocraacutetico para o desenvolvimento
deste trabalho
Aos meus amigos da Iniciaccedilatildeo Cientifica do Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da
Reproduccedilatildeo Camila Pontes Albuquerque Deacuteborah de Melo Magalhatildees Francisco Carlos
de Sousa Isadora Machado Teixeira Joatildeo Davi Arauacutejo da Silva Karlliely de Castro
Almeida Raylene Ramos Moura e Suely Renata Gaya Avelar pela dedicaccedilatildeo aos
trabalhos e sobretudo pelo conviacutevio diaacuterio no laboratoacuterio
Aos meus amigos Mestrandos e Doutorandos do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
Ciecircncias Veterinaacuterias MV Iracelma Juliatildeo Arruda MV Aline Lima Souza MV
Anderson Pinto Almeida Quiacutemica Alexsandra Fernandes Pereira Bioacuteloga Maria Luciana
Lira de Andrade MSc Joatildeo Batista Cajazeiras MSc Ney Rocircmulo de Oliveira Paula e o
Dr Ediacutelson Soares Lopes Juacutenior pela dedicaccedilatildeo no Setor de Ovinocaprinocultura
produzindo ciecircncia de excelecircncia e pelas dias e noites de dedicaccedilatildeo ao trabalho
Aos meus amigos do Laboratoacuterio de Moleacuteculas Biologicamente Ativas ndash BIOMOL-
LAB pela dedicaccedilatildeo e esforccedilo em manter uma instituiccedilatildeo de pesquisa de qualidade
Aos Meus grandes Amigos Dr Carlos Alberto de Almeida Gadelha e Dra Tatiane
Santi Gadelha pelo exemplo de casal e apoio durante este doutoramento
19
Aos Funcionaacuterios Selmar e Ceacutesar que participam dos trabalhos diaacuterios com
responsabilidade e competecircncia
Agrave minha famiacutelia pela amizade em especial agraves minhas queridas Tias Maria Salete
Silveira e Freitas Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios Joseacute
Luciecirc Teixeira e Antocircnio Alves Maia
Aos Meus Irmatildeos e Irmatildes Delacircndio Luiz Alves Teixeira Daacuterlio Inaacutecio Alves
Teixeira Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira pelo companherismo
e exemplo de dedicaccedilatildeo agrave famiacutelia
Aos meus pais que tanto amo Damiatildeo Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por
tudo que eles me ensinaram na minha vida
Ao meu amor Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensatildeo nos momentos
ausentes e pelo incentivo nas horas difiacuteceis obrigado por estaacute sempre ao meu lado
E finalmente agrave todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuiacuteram para o
conteuacutedo desta tese e pela construccedilatildeo de minha personalidade
20
RESUMO
O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas
espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e
equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na
interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena
relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado
em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos
aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica
para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que
codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi
agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram
inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas
do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-
HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a
Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do
testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA
3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da
espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)
de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena
do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave
clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos
cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2
e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave
espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em
conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de
troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem
formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado
essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de
clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)
21
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
Aos meus pais Damiatildeo Alves Maia e Maria
Luiza Teixeira Maia pelo apoio e incentivo
incondicional ao estudo
Dedico
16
Quem reconhece a sua ignoracircncia
Revela a mais alta sapiecircncia
Quem ignora a sua ignoracircncia
Vive na mais profunda ilusatildeo
Natildeo sucumbe agrave ilusatildeo
Quem conhece a ilusatildeo como ilusatildeo
O saacutebio conhece o seu natildeo-saber
E essa consciecircncia do natildeo-saber
O preserva de toda a ilusatildeo
Lao-Tseacute
17
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus por permitir a conquista de mais uma vitoacuteria na minha vida com sauacutede e
com disposiccedilatildeo para continuar lutando
A Universidade Estadual do Cearaacute em especial ao Curso de Doutorado em Ciecircncias
Veterinaacuterias por proporcionar condiccedilotildees para aprender com as disciplinas
Ao Prof Dr Vicente Joseacute de Figueirecircdo Freitas pela constante luta para
desenvolver ciecircncia com qualidade proporcionando aos seus orientandos um aprendizado
constante e sobretudo pela confianccedila e dedicaccedilatildeo durante a realizaccedilatildeo minha poacutes-
graduaccedilatildeo
Ao Prof Dr Benildo Sousa Cavada pela competecircncia e capacidade de reunir
grandes pesquisadores com fins cientiacuteficos sempre procurando incentivar os seus alunos a
unir amizade e competecircncia e tambeacutem por me colocar sempre a disposiccedilatildeo o seu
laboratoacuterio para desenvolver as atividades inerentes agrave pesquisa
Ao Prof Dr Ghandi Rhadis-Baptista pelo empenho neste trabalho sempre a
disposiccedilatildeo de ensinar os seus conhecimentos incansaacutevel em suas tarefas e com humor para
vibrar as vitoacuterias e natildeo se abater nos resultados negativos
As professoras Dra Ana Maria Sampaio Assreuy e Dra Claudia Ferreira Santos que
sempre estatildeo a disposiccedilatildeo para o ensino e por sempre manter o bom relacionamento com o
nosso grupo de pesquisa
Ao Prof Dr Davide Rondina pelo apoio teacutecnico-cientiacutefico confianccedila profissional e
principalmente pela amizade
18
Ao Prof MSc Rodrigo Maranguape pela disposiccedilatildeo de todos os equipamentos e
matildeo de obra para realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Doutoranda Luciana Magalhatildees de Melo pela dedicaccedilatildeo e apoio imensuraacutevel na
composiccedilatildeo deste trabalho o qual estaacute apenas comeccedilando
Ao Dr Alexandre Havt pela contribuiccedilatildeo oferecida durante a confecccedilatildeo dos artigos
cientiacuteficos
Aos Professores e funcionaacuterios do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Veterinaacuterias (PPGCV) da UECE pelo apoio teacutecnico e burocraacutetico para o desenvolvimento
deste trabalho
Aos meus amigos da Iniciaccedilatildeo Cientifica do Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da
Reproduccedilatildeo Camila Pontes Albuquerque Deacuteborah de Melo Magalhatildees Francisco Carlos
de Sousa Isadora Machado Teixeira Joatildeo Davi Arauacutejo da Silva Karlliely de Castro
Almeida Raylene Ramos Moura e Suely Renata Gaya Avelar pela dedicaccedilatildeo aos
trabalhos e sobretudo pelo conviacutevio diaacuterio no laboratoacuterio
Aos meus amigos Mestrandos e Doutorandos do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
Ciecircncias Veterinaacuterias MV Iracelma Juliatildeo Arruda MV Aline Lima Souza MV
Anderson Pinto Almeida Quiacutemica Alexsandra Fernandes Pereira Bioacuteloga Maria Luciana
Lira de Andrade MSc Joatildeo Batista Cajazeiras MSc Ney Rocircmulo de Oliveira Paula e o
Dr Ediacutelson Soares Lopes Juacutenior pela dedicaccedilatildeo no Setor de Ovinocaprinocultura
produzindo ciecircncia de excelecircncia e pelas dias e noites de dedicaccedilatildeo ao trabalho
Aos meus amigos do Laboratoacuterio de Moleacuteculas Biologicamente Ativas ndash BIOMOL-
LAB pela dedicaccedilatildeo e esforccedilo em manter uma instituiccedilatildeo de pesquisa de qualidade
Aos Meus grandes Amigos Dr Carlos Alberto de Almeida Gadelha e Dra Tatiane
Santi Gadelha pelo exemplo de casal e apoio durante este doutoramento
19
Aos Funcionaacuterios Selmar e Ceacutesar que participam dos trabalhos diaacuterios com
responsabilidade e competecircncia
Agrave minha famiacutelia pela amizade em especial agraves minhas queridas Tias Maria Salete
Silveira e Freitas Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios Joseacute
Luciecirc Teixeira e Antocircnio Alves Maia
Aos Meus Irmatildeos e Irmatildes Delacircndio Luiz Alves Teixeira Daacuterlio Inaacutecio Alves
Teixeira Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira pelo companherismo
e exemplo de dedicaccedilatildeo agrave famiacutelia
Aos meus pais que tanto amo Damiatildeo Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por
tudo que eles me ensinaram na minha vida
Ao meu amor Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensatildeo nos momentos
ausentes e pelo incentivo nas horas difiacuteceis obrigado por estaacute sempre ao meu lado
E finalmente agrave todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuiacuteram para o
conteuacutedo desta tese e pela construccedilatildeo de minha personalidade
20
RESUMO
O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas
espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e
equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na
interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena
relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado
em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos
aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica
para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que
codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi
agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram
inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas
do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-
HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a
Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do
testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA
3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da
espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)
de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena
do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave
clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos
cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2
e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave
espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em
conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de
troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem
formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado
essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de
clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)
21
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
Quem reconhece a sua ignoracircncia
Revela a mais alta sapiecircncia
Quem ignora a sua ignoracircncia
Vive na mais profunda ilusatildeo
Natildeo sucumbe agrave ilusatildeo
Quem conhece a ilusatildeo como ilusatildeo
O saacutebio conhece o seu natildeo-saber
E essa consciecircncia do natildeo-saber
O preserva de toda a ilusatildeo
Lao-Tseacute
17
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus por permitir a conquista de mais uma vitoacuteria na minha vida com sauacutede e
com disposiccedilatildeo para continuar lutando
A Universidade Estadual do Cearaacute em especial ao Curso de Doutorado em Ciecircncias
Veterinaacuterias por proporcionar condiccedilotildees para aprender com as disciplinas
Ao Prof Dr Vicente Joseacute de Figueirecircdo Freitas pela constante luta para
desenvolver ciecircncia com qualidade proporcionando aos seus orientandos um aprendizado
constante e sobretudo pela confianccedila e dedicaccedilatildeo durante a realizaccedilatildeo minha poacutes-
graduaccedilatildeo
Ao Prof Dr Benildo Sousa Cavada pela competecircncia e capacidade de reunir
grandes pesquisadores com fins cientiacuteficos sempre procurando incentivar os seus alunos a
unir amizade e competecircncia e tambeacutem por me colocar sempre a disposiccedilatildeo o seu
laboratoacuterio para desenvolver as atividades inerentes agrave pesquisa
Ao Prof Dr Ghandi Rhadis-Baptista pelo empenho neste trabalho sempre a
disposiccedilatildeo de ensinar os seus conhecimentos incansaacutevel em suas tarefas e com humor para
vibrar as vitoacuterias e natildeo se abater nos resultados negativos
As professoras Dra Ana Maria Sampaio Assreuy e Dra Claudia Ferreira Santos que
sempre estatildeo a disposiccedilatildeo para o ensino e por sempre manter o bom relacionamento com o
nosso grupo de pesquisa
Ao Prof Dr Davide Rondina pelo apoio teacutecnico-cientiacutefico confianccedila profissional e
principalmente pela amizade
18
Ao Prof MSc Rodrigo Maranguape pela disposiccedilatildeo de todos os equipamentos e
matildeo de obra para realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Doutoranda Luciana Magalhatildees de Melo pela dedicaccedilatildeo e apoio imensuraacutevel na
composiccedilatildeo deste trabalho o qual estaacute apenas comeccedilando
Ao Dr Alexandre Havt pela contribuiccedilatildeo oferecida durante a confecccedilatildeo dos artigos
cientiacuteficos
Aos Professores e funcionaacuterios do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Veterinaacuterias (PPGCV) da UECE pelo apoio teacutecnico e burocraacutetico para o desenvolvimento
deste trabalho
Aos meus amigos da Iniciaccedilatildeo Cientifica do Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da
Reproduccedilatildeo Camila Pontes Albuquerque Deacuteborah de Melo Magalhatildees Francisco Carlos
de Sousa Isadora Machado Teixeira Joatildeo Davi Arauacutejo da Silva Karlliely de Castro
Almeida Raylene Ramos Moura e Suely Renata Gaya Avelar pela dedicaccedilatildeo aos
trabalhos e sobretudo pelo conviacutevio diaacuterio no laboratoacuterio
Aos meus amigos Mestrandos e Doutorandos do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
Ciecircncias Veterinaacuterias MV Iracelma Juliatildeo Arruda MV Aline Lima Souza MV
Anderson Pinto Almeida Quiacutemica Alexsandra Fernandes Pereira Bioacuteloga Maria Luciana
Lira de Andrade MSc Joatildeo Batista Cajazeiras MSc Ney Rocircmulo de Oliveira Paula e o
Dr Ediacutelson Soares Lopes Juacutenior pela dedicaccedilatildeo no Setor de Ovinocaprinocultura
produzindo ciecircncia de excelecircncia e pelas dias e noites de dedicaccedilatildeo ao trabalho
Aos meus amigos do Laboratoacuterio de Moleacuteculas Biologicamente Ativas ndash BIOMOL-
LAB pela dedicaccedilatildeo e esforccedilo em manter uma instituiccedilatildeo de pesquisa de qualidade
Aos Meus grandes Amigos Dr Carlos Alberto de Almeida Gadelha e Dra Tatiane
Santi Gadelha pelo exemplo de casal e apoio durante este doutoramento
19
Aos Funcionaacuterios Selmar e Ceacutesar que participam dos trabalhos diaacuterios com
responsabilidade e competecircncia
Agrave minha famiacutelia pela amizade em especial agraves minhas queridas Tias Maria Salete
Silveira e Freitas Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios Joseacute
Luciecirc Teixeira e Antocircnio Alves Maia
Aos Meus Irmatildeos e Irmatildes Delacircndio Luiz Alves Teixeira Daacuterlio Inaacutecio Alves
Teixeira Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira pelo companherismo
e exemplo de dedicaccedilatildeo agrave famiacutelia
Aos meus pais que tanto amo Damiatildeo Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por
tudo que eles me ensinaram na minha vida
Ao meu amor Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensatildeo nos momentos
ausentes e pelo incentivo nas horas difiacuteceis obrigado por estaacute sempre ao meu lado
E finalmente agrave todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuiacuteram para o
conteuacutedo desta tese e pela construccedilatildeo de minha personalidade
20
RESUMO
O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas
espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e
equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na
interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena
relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado
em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos
aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica
para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que
codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi
agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram
inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas
do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-
HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a
Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do
testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA
3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da
espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)
de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena
do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave
clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos
cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2
e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave
espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em
conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de
troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem
formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado
essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de
clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)
21
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus por permitir a conquista de mais uma vitoacuteria na minha vida com sauacutede e
com disposiccedilatildeo para continuar lutando
A Universidade Estadual do Cearaacute em especial ao Curso de Doutorado em Ciecircncias
Veterinaacuterias por proporcionar condiccedilotildees para aprender com as disciplinas
Ao Prof Dr Vicente Joseacute de Figueirecircdo Freitas pela constante luta para
desenvolver ciecircncia com qualidade proporcionando aos seus orientandos um aprendizado
constante e sobretudo pela confianccedila e dedicaccedilatildeo durante a realizaccedilatildeo minha poacutes-
graduaccedilatildeo
Ao Prof Dr Benildo Sousa Cavada pela competecircncia e capacidade de reunir
grandes pesquisadores com fins cientiacuteficos sempre procurando incentivar os seus alunos a
unir amizade e competecircncia e tambeacutem por me colocar sempre a disposiccedilatildeo o seu
laboratoacuterio para desenvolver as atividades inerentes agrave pesquisa
Ao Prof Dr Ghandi Rhadis-Baptista pelo empenho neste trabalho sempre a
disposiccedilatildeo de ensinar os seus conhecimentos incansaacutevel em suas tarefas e com humor para
vibrar as vitoacuterias e natildeo se abater nos resultados negativos
As professoras Dra Ana Maria Sampaio Assreuy e Dra Claudia Ferreira Santos que
sempre estatildeo a disposiccedilatildeo para o ensino e por sempre manter o bom relacionamento com o
nosso grupo de pesquisa
Ao Prof Dr Davide Rondina pelo apoio teacutecnico-cientiacutefico confianccedila profissional e
principalmente pela amizade
18
Ao Prof MSc Rodrigo Maranguape pela disposiccedilatildeo de todos os equipamentos e
matildeo de obra para realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Doutoranda Luciana Magalhatildees de Melo pela dedicaccedilatildeo e apoio imensuraacutevel na
composiccedilatildeo deste trabalho o qual estaacute apenas comeccedilando
Ao Dr Alexandre Havt pela contribuiccedilatildeo oferecida durante a confecccedilatildeo dos artigos
cientiacuteficos
Aos Professores e funcionaacuterios do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Veterinaacuterias (PPGCV) da UECE pelo apoio teacutecnico e burocraacutetico para o desenvolvimento
deste trabalho
Aos meus amigos da Iniciaccedilatildeo Cientifica do Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da
Reproduccedilatildeo Camila Pontes Albuquerque Deacuteborah de Melo Magalhatildees Francisco Carlos
de Sousa Isadora Machado Teixeira Joatildeo Davi Arauacutejo da Silva Karlliely de Castro
Almeida Raylene Ramos Moura e Suely Renata Gaya Avelar pela dedicaccedilatildeo aos
trabalhos e sobretudo pelo conviacutevio diaacuterio no laboratoacuterio
Aos meus amigos Mestrandos e Doutorandos do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
Ciecircncias Veterinaacuterias MV Iracelma Juliatildeo Arruda MV Aline Lima Souza MV
Anderson Pinto Almeida Quiacutemica Alexsandra Fernandes Pereira Bioacuteloga Maria Luciana
Lira de Andrade MSc Joatildeo Batista Cajazeiras MSc Ney Rocircmulo de Oliveira Paula e o
Dr Ediacutelson Soares Lopes Juacutenior pela dedicaccedilatildeo no Setor de Ovinocaprinocultura
produzindo ciecircncia de excelecircncia e pelas dias e noites de dedicaccedilatildeo ao trabalho
Aos meus amigos do Laboratoacuterio de Moleacuteculas Biologicamente Ativas ndash BIOMOL-
LAB pela dedicaccedilatildeo e esforccedilo em manter uma instituiccedilatildeo de pesquisa de qualidade
Aos Meus grandes Amigos Dr Carlos Alberto de Almeida Gadelha e Dra Tatiane
Santi Gadelha pelo exemplo de casal e apoio durante este doutoramento
19
Aos Funcionaacuterios Selmar e Ceacutesar que participam dos trabalhos diaacuterios com
responsabilidade e competecircncia
Agrave minha famiacutelia pela amizade em especial agraves minhas queridas Tias Maria Salete
Silveira e Freitas Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios Joseacute
Luciecirc Teixeira e Antocircnio Alves Maia
Aos Meus Irmatildeos e Irmatildes Delacircndio Luiz Alves Teixeira Daacuterlio Inaacutecio Alves
Teixeira Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira pelo companherismo
e exemplo de dedicaccedilatildeo agrave famiacutelia
Aos meus pais que tanto amo Damiatildeo Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por
tudo que eles me ensinaram na minha vida
Ao meu amor Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensatildeo nos momentos
ausentes e pelo incentivo nas horas difiacuteceis obrigado por estaacute sempre ao meu lado
E finalmente agrave todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuiacuteram para o
conteuacutedo desta tese e pela construccedilatildeo de minha personalidade
20
RESUMO
O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas
espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e
equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na
interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena
relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado
em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos
aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica
para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que
codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi
agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram
inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas
do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-
HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a
Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do
testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA
3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da
espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)
de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena
do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave
clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos
cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2
e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave
espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em
conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de
troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem
formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado
essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de
clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)
21
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
Ao Prof MSc Rodrigo Maranguape pela disposiccedilatildeo de todos os equipamentos e
matildeo de obra para realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Doutoranda Luciana Magalhatildees de Melo pela dedicaccedilatildeo e apoio imensuraacutevel na
composiccedilatildeo deste trabalho o qual estaacute apenas comeccedilando
Ao Dr Alexandre Havt pela contribuiccedilatildeo oferecida durante a confecccedilatildeo dos artigos
cientiacuteficos
Aos Professores e funcionaacuterios do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Veterinaacuterias (PPGCV) da UECE pelo apoio teacutecnico e burocraacutetico para o desenvolvimento
deste trabalho
Aos meus amigos da Iniciaccedilatildeo Cientifica do Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da
Reproduccedilatildeo Camila Pontes Albuquerque Deacuteborah de Melo Magalhatildees Francisco Carlos
de Sousa Isadora Machado Teixeira Joatildeo Davi Arauacutejo da Silva Karlliely de Castro
Almeida Raylene Ramos Moura e Suely Renata Gaya Avelar pela dedicaccedilatildeo aos
trabalhos e sobretudo pelo conviacutevio diaacuterio no laboratoacuterio
Aos meus amigos Mestrandos e Doutorandos do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em
Ciecircncias Veterinaacuterias MV Iracelma Juliatildeo Arruda MV Aline Lima Souza MV
Anderson Pinto Almeida Quiacutemica Alexsandra Fernandes Pereira Bioacuteloga Maria Luciana
Lira de Andrade MSc Joatildeo Batista Cajazeiras MSc Ney Rocircmulo de Oliveira Paula e o
Dr Ediacutelson Soares Lopes Juacutenior pela dedicaccedilatildeo no Setor de Ovinocaprinocultura
produzindo ciecircncia de excelecircncia e pelas dias e noites de dedicaccedilatildeo ao trabalho
Aos meus amigos do Laboratoacuterio de Moleacuteculas Biologicamente Ativas ndash BIOMOL-
LAB pela dedicaccedilatildeo e esforccedilo em manter uma instituiccedilatildeo de pesquisa de qualidade
Aos Meus grandes Amigos Dr Carlos Alberto de Almeida Gadelha e Dra Tatiane
Santi Gadelha pelo exemplo de casal e apoio durante este doutoramento
19
Aos Funcionaacuterios Selmar e Ceacutesar que participam dos trabalhos diaacuterios com
responsabilidade e competecircncia
Agrave minha famiacutelia pela amizade em especial agraves minhas queridas Tias Maria Salete
Silveira e Freitas Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios Joseacute
Luciecirc Teixeira e Antocircnio Alves Maia
Aos Meus Irmatildeos e Irmatildes Delacircndio Luiz Alves Teixeira Daacuterlio Inaacutecio Alves
Teixeira Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira pelo companherismo
e exemplo de dedicaccedilatildeo agrave famiacutelia
Aos meus pais que tanto amo Damiatildeo Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por
tudo que eles me ensinaram na minha vida
Ao meu amor Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensatildeo nos momentos
ausentes e pelo incentivo nas horas difiacuteceis obrigado por estaacute sempre ao meu lado
E finalmente agrave todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuiacuteram para o
conteuacutedo desta tese e pela construccedilatildeo de minha personalidade
20
RESUMO
O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas
espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e
equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na
interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena
relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado
em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos
aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica
para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que
codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi
agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram
inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas
do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-
HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a
Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do
testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA
3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da
espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)
de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena
do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave
clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos
cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2
e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave
espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em
conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de
troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem
formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado
essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de
clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)
21
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
Aos Funcionaacuterios Selmar e Ceacutesar que participam dos trabalhos diaacuterios com
responsabilidade e competecircncia
Agrave minha famiacutelia pela amizade em especial agraves minhas queridas Tias Maria Salete
Silveira e Freitas Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios Joseacute
Luciecirc Teixeira e Antocircnio Alves Maia
Aos Meus Irmatildeos e Irmatildes Delacircndio Luiz Alves Teixeira Daacuterlio Inaacutecio Alves
Teixeira Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira pelo companherismo
e exemplo de dedicaccedilatildeo agrave famiacutelia
Aos meus pais que tanto amo Damiatildeo Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por
tudo que eles me ensinaram na minha vida
Ao meu amor Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensatildeo nos momentos
ausentes e pelo incentivo nas horas difiacuteceis obrigado por estaacute sempre ao meu lado
E finalmente agrave todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuiacuteram para o
conteuacutedo desta tese e pela construccedilatildeo de minha personalidade
20
RESUMO
O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas
espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e
equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na
interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena
relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado
em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos
aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica
para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que
codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi
agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram
inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas
do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-
HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a
Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do
testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA
3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da
espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)
de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena
do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave
clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos
cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2
e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave
espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em
conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de
troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem
formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado
essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de
clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)
21
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
RESUMO
O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas
espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e
equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na
interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena
relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado
em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos
aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica
para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que
codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi
agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram
inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas
do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-
HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a
Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do
testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA
3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da
espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)
de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena
do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave
clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos
cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2
e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave
espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em
conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de
troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem
formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado
essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de
clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)
21
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
ABSTRACT
Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which
are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be
involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of
a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two
steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we
purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we
aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult
Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized
proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins
from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC
Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-
Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the
cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA
3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat
spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained
fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no
heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify
three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three
deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and
the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat
spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies
Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding
proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our
knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)
22
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do
plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein
23
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin
familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100
24
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
α alfa
β beta
γ gama
microl microlitros
AQN espermadesina suiacutena
ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal
AWN espermadesinas suiacutena e equina
Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1
BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode
BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino
degC graus centiacutegrados
Ca++ caacutelcio
cDNA DNA complementar
CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)
CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas
CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar
Da Dalton
ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato
DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico
DPG difosfatidilglicerol
EP losfatidal etanolamina
FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia
Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II
g grama
g gravidade
h hora
HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo
im intramuscular
kDa quilodaltons
25
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
LPC lisofosfatidilcolina
LPE lisofosfatidil etanolamina
M molar
Man-6-P manose-6-fosfato
mg miligrama
min minutos
mL mililitros
mRNA RNA mensageiro
PA aacutecido fosfatiacutedico
PC fosfatidil colina
PE fosfatidil etanolamina
pH potencial hidrogeniocircnico
PI fosfatidil inositol
PM peso molecular
PS fosfatidil serina
PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos
PSP-I unidade I da PSP
PSP-II unidade II da PSP
RNA Aacutecido Ribonucleacuteico
rpm rotaccedilotildees por minuto
RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase
SPH esfingomielina
Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide
SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo
TFA aacutecido trifluoraceacutetico
UECE Universidade Estadual do Cearaacute
Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar
UFC Universidade Federal do Cearaacute
26
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo
a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana
rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o
espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais
merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por
sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio
CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios
CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um
grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas
estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ
(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal
de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-
Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um
sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das
espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA
27
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e
vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA
3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os
genes da bodesina 65
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da
espermadesina
68
28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de
caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela
capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito
30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66
INTRODUCcedilAtildeO
29
Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura
caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento
sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da
ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional
(ANUALPEC 2004)
Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial
continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de
caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta
teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas
proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem
uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de
um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas
As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos
Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na
fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre
as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais
sobre as espermadesinas de caprinos
CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA
30
1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL
11 Definiccedilatildeo
O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas
acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem
de formar o secircmen (CALVETE 1996)
As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo
situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo
formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor
do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem
somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)
Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino
12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal
31
Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel
atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e
pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos
cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas
sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para
desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)
O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos
quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos
espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle
espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)
A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi
verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que
influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa
importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)
Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos
tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos
lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores
imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do
animal (FRAZER amp BUCCI 1996)
Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e
a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde
esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993
GONZALES 2001)
Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um
marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e
motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora
32
da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o
aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste
modo agrave atividade espermaacutetica
O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma
relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na
maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e
motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos
sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)
Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns
constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir
uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido
ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)
Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal
dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)
magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na
avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser
indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em
carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos
verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a
motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)
Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma
grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos
espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)
33
Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a
hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer
altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo
O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua
concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No
plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)
Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal
e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de
espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a
concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)
A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de
algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase
glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida
sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al
2002)
Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo
de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo
inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita
(KAYA et al 2002)
A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com
cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas
de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no
homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al
1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem
sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que
exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores
34
quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio
diluente como o leite e o plasma seminal
A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato
reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente
nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)
Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide
durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes
quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)
Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos
espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp
ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e
suiacutenos (JOHNSON et al 1969)
O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100
g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas
satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no
plasma seminal (Tabela 1)
Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos
Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()
35
Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975
Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de
capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora
do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o
plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino
Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se
prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros
glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a
capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina
jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1993)
Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma
seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp
BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)
No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio
fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3
e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS
amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal
satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)
36
Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas
de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio
fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)
Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al
1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)
caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et
al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido
extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp
THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute
conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do
espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos
presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)
37
Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies
Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2
Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa
Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa
Suiacutena pB1
Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa
Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa
Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa
FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003
Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser
responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura
3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas
do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas
proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente
este processo (THEacuteRIEN et al 1995)
38
Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em
lipiacutedios colina (WAH et al 2002)
Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A
HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do
epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo
sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-
HUNDRIESER et al 2005)
No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido
encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de
CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e
CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo
respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro
caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)
39
Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em
cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-
3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo
Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2
que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12
outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem
um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)
Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante
estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma
seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades
13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo
40
O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-
especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares
localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)
Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a
carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide
e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al
1998)
Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no
trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)
A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e
encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de
suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as
etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas
que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA
ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)
Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na
superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona
peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)
41
Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de
ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato
Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo
Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato
GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac
α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man
15-20- kDa SP1-B34 C Hu
Sp563 C Ra Terminal α - Gal
APz (52 kDa) P
RTK5 95 kDa C Hu
C-type MBP6 Hu D-Manose
SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio
PH ndash 207 11 W
p-105452 P
Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina
54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9
Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos
(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida
A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de
mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a
fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o
42
reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e
inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz
extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo
covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e
serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)
Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido
das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)
2 LECTINAS
21 Definiccedilatildeo
Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e
reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica
confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem
polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que
lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo
cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos
podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN
DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de
ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem
tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra
atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)
22 Histoacuterico das lectinas
43
Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando
ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi
verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava
hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de
1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro
pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi
confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes
a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)
Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888
somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de
Canavalia ensiformis (Tabela 4)
23 Classificaccedilatildeo
PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas
proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em
a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute
satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas
b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos
que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de
lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam
glicoconjugados
c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios
de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que
possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir
independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato
44
d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a
carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados
Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)
Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos
45
1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das
lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner
H Noguchi
Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de
lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H
Raubischek
Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos
1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947
48
WC Boyd KO
Renkonen
Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo
sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de
carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL
Agrawal
Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas
1972 GM Edelman KO
Herdman CF Ainsworth
Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas
1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan
A Raz
Isolamento das lectinas de tumores
1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)
24 Lectinas Animais
241 Galectinas
As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram
localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e
ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al
2004)
46
A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute
predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos
utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais
natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um
sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al
2004)
Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas
em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis
pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp
SHARON 1998)
242 Lectina tipo-C
Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++
para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas
estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-
CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs
famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)
2421 Lectinas endociacuteticas
As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como
receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas
galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas
transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma
hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo
domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)
47
As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem
das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a
extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-
terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs
domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio
fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)
2422 Colectinas
As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no
mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas
ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do
sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos
(LIS amp SHARON 1998)
2423 Selectinas
As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do
papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas
mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-
requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do
leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides
As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E
(115kDa) selectinas-P(140kDa)
243 Lectinas tipo-P
A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem
estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o
48
compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a
manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores
(SHARON amp LIS 2004)
244 Lectina tipo-I
As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas
lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos
contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a
glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal
(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular
similar
Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas
que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de
espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova
classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a
glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo
(CALVETE et al 1995c)
49
Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp
SHARON 1998)
25 Funccedilotildees das Lectinas
A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva
porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda
proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo
proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de
reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para
interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)
Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular
na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor
na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes
efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica
(SHARON amp LIS 1989)
Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das
plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das
lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees
de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se
dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da
simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes
de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos
(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)
As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua
propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das
ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana
50
serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma
variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp
SHARON 1998)
Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas
pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como
moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes
(SHARON amp LIS 2004)
A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta
estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para
propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e
aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um
desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas
tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias
contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo
relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas
Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados
Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de
partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus
Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas
Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo
cromossomal celular e anormalidades cromossomiais
Separaccedilatildeo celular
Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos
Tipagem sanguiacutenea
Transportadores de drogas
Defesa de plantas contra predadores
Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos
Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente
51
Lectinas como marcadores taxonocircmicos
Atividades anti-inflamatoacuteria
Atividades proacute-inflamatoacuteria
Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal
Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram
descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5
No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados
procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da
fecircmea
Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas
Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo
Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de
Nitrogecircnio
52
Animais Calnectin Calreticulin
ERGIC-53
Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas
Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e
apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos
celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e
interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de
manose
Imunidade
Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos
sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais
da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas
imunes e neurais
Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito
3 ESPERMADESINAS
As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de
diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio
conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este
domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)
U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso
(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)
A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas
masculino e feminino (CALVETE et al 1994)
53
As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um
grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo
secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas
proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto
possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN
et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-
glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)
As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)
possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua
sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros
indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas
duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides
epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide
(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991
1992a b e c)
Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a
polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas
possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a
capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida
sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al
1998 MANASKOVA et al 1999)
O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades
(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116
aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional
determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB
desta proteiacutena
54
A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um
heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem
uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II
natildeo possui (CALVETE et al 1995a)
Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho
observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et
al 1998)
As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose
manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al
1995a)
Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de
ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de
ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura
9) (CALVETE et al 1995a)
Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-
IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino
55
para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-
inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro
Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de
dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A
posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-
II (Asn98 bola azul)
Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic
seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa
purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a
clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta
proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do
epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)
A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos
ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)
Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que
varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)
56
A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto
ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)
ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de
19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a
PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente
caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)
A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes
de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada
que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina
(TADESHI et al 2000)
Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7
(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos
homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum
de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas
espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria
nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)
57
Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da
aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos
hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)
Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no
plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a
AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do
Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)
A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da
estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo
necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras
espermadesinas
31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas
Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)
em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras
espeacutecies de mamiacuteferos
Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos
cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005
58
A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que
80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes
correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de
mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre
os animais
A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et
al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das
espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram
hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de
hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)
A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de
diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees
(HAASE et al 2005)
59
Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das
espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et
al 2005)
60
JUSTIFICATIVA
A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor
primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional
desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e
desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de
animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais
produtivo
Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente
melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino
nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o
uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a
reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina
No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de
diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de
fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo
artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies
domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a
presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada
a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal
Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas
espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica
dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas
bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de
outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie
Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este
problema
61
HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS
A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente
purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a
heparina
A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em
especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo
62
OBJETIVOS
Geral
bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a
codifica
Especiacuteficos
bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP
bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP
bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da
BSFP eacute expresso
bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP
63
CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE
UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS
(CAPRA HIRCUS)
Local e Animais Experimentais
O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo
(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de
Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos
localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)
Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro
anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de
aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum
purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham
livre acesso a aacutegua e sal mineral
Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen
O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma
vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita
foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato
de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume
(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a
100)
O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de
espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC
para ser usado posteriormente
64
Isolamento
Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser
congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M
(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi
previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a
coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)
As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram
aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience
Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase
reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)
de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em
acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de
0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)
isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280
nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese
Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo
O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi
realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal
da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied
Biosystems Foster City USA)
As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo
apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas
em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham
Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo
65
Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que
as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da
coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram
colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram
liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente
Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade
A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W
(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de
acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)
RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos
possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al
1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser
diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas
no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et
al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos
homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas
O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de
volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de
acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de
inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)
O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de
troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn
66
063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316
(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial
Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos
A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e
o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl
A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica
sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia
destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por
SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de
12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)
como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada
pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da
massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14
kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada
estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003
JELINKOVA et al 2004)
67
Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada
em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta
Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em
aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em
eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma
seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de
caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)
A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador
automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia
do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e
bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de
similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da
famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo
foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
68
Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas
de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo
CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias
e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento
CLUSTAL W
Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a
carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e
equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo
espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato
presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp
CALVETE 1996 REINERT et al 1996)
Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu
estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras
espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida
por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al
69
1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a
BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma
fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada
por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)
Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-
sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por
Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)
espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa
molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)
glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio
(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)
70
Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)
foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina
(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada
na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos
aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes
As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos
(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente
por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento
No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por
cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para
obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a
purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
71
CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da
famiacutelia das espermadesinas
Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal
O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto
sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem
estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por
procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)
Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas
topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o
isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-
CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a
forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra
utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do
RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets
de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O
RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm
(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a
oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas
por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente
72
Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total
Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA
A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a
uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT
5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e
Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega
Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida
atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-
especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi
desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das
espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer
gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir
da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente
73
(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0
(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os
produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio
Clonagem dos genes da espermadesina de bode
A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega
Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a
reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de
RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta
reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a
formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo
MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs
(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC
A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da
sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)
74
Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli
As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo
contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram
agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo
seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar
e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13
horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e
incubadas em meio LB liacutequido
A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise
alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)
Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro
Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA
Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7
como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As
sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE
(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em
um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for
Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)
75
As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de
caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)
usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP
(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes
alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias
homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo
filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990
P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o
programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European
Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)
RESULTADOS
Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA
76
A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita
completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com
os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo
mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de
aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)
Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula
seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e
SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina
Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode
Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por
screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos
77
M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones
recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)
denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os
trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open
reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos
(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo
3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava
presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente
Tabela 7 cDNAs das espermadesinas
5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena
cod (aa)
Acesso ao
DNA
Referecircncia
Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005
AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854
AJ853855
Haase et al 2005
aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas
Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade
78
As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram
aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs
proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)
tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas
A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98
calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma
Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais
bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma
arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na
posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras
discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles
ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR
A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no
banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias
com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos
conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi
verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)
79
Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)
Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas
em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O
Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de
aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos
elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes
coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly
Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente
carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre
os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e
no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza
DISCUSSAtildeO
80
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-
terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira
espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene
que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois
primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras
espermadesinas
Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA
proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1
Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo
conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado
o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente
(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb
apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em
baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II
e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)
Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que
poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado
que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK
amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a
sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o
primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos
81
obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena
deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena
isolada anteriormente (BSFP)
Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas
implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas
deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina
na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a
um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi
tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia
consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo
siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos
hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi
possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura
da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB
conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo
uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II
(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo
estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees
reprodutivas
Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310
determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves
82
Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB
provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-
terminal
Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que
exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr
Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm
resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)
Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da
proteiacutena
Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a
uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das
espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo
funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas
mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de
equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas
espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-
PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas
realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas
83
CONCLUSOtildeES GERAIS
O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que
estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena
pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica
As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de
multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso
conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas
caprinas (bodesinas)
84
PERSPECTIVAS
Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser
adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos
espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie
Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo
necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas
proteiacutenas codificadas
85
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ABDEL-RAHMAN HA EL-BELELY MS AL-QARAWI AA EL-MOUGY SA
The relation between semen quality and mineral composition of semen in various ram
breeds Small Ruminant Research v 38 p 45-49 2000
ALTSCHUL SF MADDEN TL SCHAumlFFER AA ZHANG J ZHANG Z
MILLER W LIPMAN DJ Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of
protein database search programs Nucleic Acid Research v 25 p 3389-3402 1997
ALTSCHUL SF GISH W MILLER W MYERS EW LIPMAN DJ Basic local
alignment search tool Journal of Molecular Biology v 215 p 403-410 1990
ANUALPEC Satildeo Paulo FNP Consultoria amp Comeacutercio 2004 p 376
ASHDOWN RR DONE S Color Atlas of Veterinary Anatomy The Ruminants
Barcelona CV Mosby 2003 p 1-35
ASSREUY AMS ALENCAR NMN CAVADA BS ROCHA DR FEITOSA
RFG CUNHA FQ CALVETE JJ RIBEIRO RA Porcine spermadhesin PSP-IPSP-
II stimulates macrophages to release a neutrophil chemotactic substance Modulation by
mast cells Biology of Reproduction v 68 p 1836-1841 2003
BERGERON A VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma Molecular Reproduction and
development v71 p461-470 2005
86
BOATMAN DE ROBINS RS Bicarbonate carbon-dioxide regulation of sperm
capacitation hyperactivated motility and acrosome reactions Biology of Reproduction v
44 p 806-813 1991
BOISVERT M BERGERON A LAZURE C MANJUNATH P Isolation of gelatin-
biding bison seminal vesicle secretory proteins Biology of Reproduction v 70 p 656-
661 2004
BORK P Complement components C1rC1s bone morphogenetic protein 1 and Xenopus
laevis developmentally regulated protein UVS 22 share common repeats FEBS Letters v
282 p9-12 1991
BORK P BECKMAN G The CUB domain A widespread module and developmentally
regulated proteins Journal of Molecular Biology v 231 p 539-545 1993
CABALLERO I VAZQUEZ JM RODRIGUEZ-MARTINEZ H GIL MA
CALVETE JJ SANZ L SANZ L GARCIA EM ROCA J MARTINEZ EA
Influence of seminal plasma PSP-IPSP-II spermadhesin on pig gamete interaction Zygote
v 13 p 11-16 2005
CALVETE JJ SANZ L DIAZ-MAURINO T SCHAFER W MANN K TOPFER-
PETERSEN E Characterization of two glycosilated boar spermadhesins European Journal
of Biochemistry v 218 p719-725 1993
CALVETE JJ SOLIacuteS D SANZ L DIAZ-MAURINO T TOumlPFER-PETERSEN E
Glycosilated boar spermadhesin AWNndash1 isoforms biological origin structural
characterization by lectin mapping localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosylation on ligand biding Biological Chemistry Hoppe-Seyler v 375 p 667-673
1994
87
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W RAIDA M SANZ L TOPFER-
PETERSEN E Boar spermadhesin PSP-II location of posttranslational modifications
heterodimer formation with PSP-I glycoforms and effect of dimerization on the ligand-
binding capabilities of the subunits FEBS Letters v365 p179-182 1995a
CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SANZ L REINERT M NESSAU S
RAIDA M TOumlPFER-PETERSEN E Amino acid sequence of HSP-1 a major protein of
stallion seminal plasma Effect of glycosylation on its heparin- and gelatin-binding
capabilities Biochemistry Journal v 310 p 615-622 1995b
CALVETE JJ SANZ L DOSTALOVA Z TOumlPFER-PETERSEN E Spermadhesins
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucida biding Fertilitat v11
p35-40 1995c
CALVETE JJ CARRERA E SANZL TOPFER-PETERSEN E Boar spermadhesin
AQN-1 and AQN-3 oligossccharide and zona pellucida binding characteristics Biological
Chemistry Hoppe-Seyler v377 p521-527 1996
CALVETE JJ RAIDA M GENTZEL M URBANKE C SNAZ L TOPFER-
PETERSEN E Isolation and characterization of heparin and phosphorylcoline-biding
proteins of boar and stalion seminal plasma Primary structure of porcine pB1 FEBS
Letters v 407 p 201-206 1997
CHAKRABARTI D GUHA AB Influence of sperm density and motility on seminal
fructose content of Black Bengal goat (Capra hircus) Indian Journal of Animal Sciences
v63 n7 p733-734 1993
CHENNA R SUGAWARA H KOIKE T LOPEZ R GIBSON TJ HIGGINS
DG THOMPSON JD Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs
Nucleic Acidic Reseach v 31 p 3497-3500 2003
88
CHRISPEELS M J RAIKHEL N V Lectins lectins genes and their role on plant
defence Plant Cell v 13 p 1-9 1991
CONSTATINE KL MADRID M BANYAI L TREXLER M PATTHY L
LLINAacuteS M Refined solution structure and ligand-biding properties of PDC-109 domain b
A collagen-biding type II domain Journal of Molecular Biology v 223 p 281-298 1992
DESNOYERS L MANJUNATH P Major protein of bovine seminal plasma exhibit
novel interaction with phospholipids Journal of Biology Chemistry v 267 p 1149-1155
1992
DIEKMAN AB Glycoconjugates in sperm function and gamete interaction how much
sugar does it take to sweet-talk the egg Cellular and Molecular Life Science v60 p 298-
308 2003
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal ejaculated
and capacitated spermatozoa Biochemical Biophysical Acta v1200 p48-54 1994
DOSTAgraveLOVAgrave Z CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AWN-1 oligosaccharide and zona pellucida binding characteristics
European Journal of Biochemistry v 230 p 239-336 1995
DRICKAMER K Increasing diversity of animal lectin structures Current Opinion in
Structural Biology v5 p 612-616
EINHOFF W FLEIISCHMANN G FREIER T KUMMER H REDIGUER H
Interaction of leguminous seed lectins with seed proteins-lectins as packing aids of storage
proteins In DRIESSCHEE V BOG-HANSEN T C Eds Lectins Biol Biochem
Clinical Biochemistry v 5 p 45-52 1986
89
EINSPANIER R EINSPANIER A WENPE F SCHEIT K-H Characterization of a
new bioactive protein from bovine seminal fluid Biochemical Biophysical Research
Communication v179 p1006-1010 1991
EINSPANIER R KRAUSE I CALVETE JJ TOumlPFER-PETERSEN E
KLOSTERMEYER H KARG H Bovine seminal plasma aSFP localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms FEBS Letters v 344 p 61-64
1994
EKHLASI-HUNDRIESER M SCHAFER B KIRCHHOFF C HESS O BELLAIR
S MULLER P TOPFER-PETERSEN E Structural and molecular characterization of
equine sperm-biding fibronectin-II module proteins Molecular Reproduction and
Development v 70 p 45-57 2005
ENSSLIN M CALVETE JJ THOLE HH SIERRALTA W D ADERMANN K
SANZ LTOumlPFER-PETERSEN E Identification by affinity chromatography of boar
sperm membrane-associate proteins bound to immobilized porcine zona peluacutecida mapping
of the phosphorylethanolamine-biding region of spermadhesin AWN Biological Chemistry
Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995
FRAZER GS BUCCI DM SDS-Page of characterization of the proteins in equine
seminal plasma Theriogenology v46 p 579-591 1996
GONZALES G Function of seminal vesicles and their role male fertility Asian Journal of
Andrology v3 n4 p 251-258 2001
HAASE B SCHLOTTERER C HUNDRIESER ME KUIPER H KUIPER H
DISTL O TOumlPFER-PETERSEN E LEEB T Evolution of the spermadhesin gene
family Gene v 352 p 20-29 2005
90
HARRIS JD HIBLER DW FONTENOT GK HSU KT YUREWICZ EC
SACCO AG Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a
variety of mammalian species the ZPA ZPB and ZPC gene families DNA Sequence v 4
p 361-393 1994
HENKEL R BITTNER J WEBER R HUTHER F MISKA W Relevance of zinc in
human sperm flagella and its relation to motility Fertility and Sterility v 71 n 6 1999
HIGGINS D THOMPSON J GIBSON T THOMPSON JD HIGGINS DG
GIBSON TJ CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting position-specific gap penalties and weight matrix
choice Nucleic Acids Research v 22 p 4673-4680 1994
HINKOVSKA VT MONCHILOVA AB PETKOVA DH KOUMANOV KS
Phospholipase A2 in ram spermatozoa plasma membranes International Journal of
Biochemistry v 19 p 569-572 1987
IBARRA MCB NAVARIDAS AS Variaciones estacionales de los niacuteveles de frutosa
aacutecido ciacutetrico y proteinas totales en ejaculados de moruecos de raza manchega Investigacioacuten
Agraria Produccioacuten y Sanidad Animales v 7 n 3 p 235-240 1992
JAIN YC ANAND SR Phospholipids of gota spermatozoa and the seminal plasma
Biology of Reproduction v 12 p 393-395 1975
JELINKOVA P MANASKOVA P TICHAacute M JONAKOVAacute V Proteinase inhibitors
in aggregated forms of boar seminal plasma proteins International Journal of Biology
Macromolecules v32 p 99-107 2003
91
JELINKOVA P LIBERDA J MANASKOVA P RYSLAVA H JONAacuteKOVAacute V
TICHAacute M Mannan-binding proteins from boar seminal plasma Journal Reproduction and
Immunology v 62 p 167-82 2004
JOBIM MIM ORBERST ER SALBEGO CG WALD VB HORN AP
MATTOS RC BSP- A1A2-like proteins in ram seminal plasma Theriogenology v 63
p 2053-2062 2005
JOHNSON LA GERRITS RJ YOUNG EP Quantitative analysis of porcine
spermatozoa and seminal plasma phospholipids as affected by frequency of ejaculation
Journal of Reproduction and Fertility v 19 p 95 1969
JONAacuteKOVAacute V KRAUS M VESELSKYacute L CEacuteCHOVAacute D BEZOUSKA K
TICHAacute M Spermadhesins of the AQN and AWN families DQH sperm surface protein
and HNK protein in the heparin-binding fraction of boar seminal plasma Journal of
Reproduction and Fertility v 114 p 25-34 1998
KAYA A AKSOY M TEKELI T Influence of ejaculation frequency on sperm
characteristics ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams Small
Ruminant Reseach v 44 p153-158 2002
KILPATRICK DC Animal lectins historical introduction and overview Biochimica et
Biophisica Acta-General Subject v 1572 p187-197 2002
KUNZE H NAHAS N WURI M Phospholipases in human seminal plasma
Biochemistry and Biophysical Acta v 348 p 35-44 1974
LAEMMLI UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 Nature v227 p680-685 1970
92
LEBOEUF B RESTALL B SALAMON S Production and storage of goat semen for
artificial insemination Animal Reproduction Science v62 p113-141 2000
LEFFLER H CARLSSON S HEDLUND M QIAN Y POIRIER F Introduction to
galectins Glycoconjugate Journal v 19 p 433-440 2004
LIENER I E SHARON N GOLDSTEIN I J The Lectins Properties Functions and
Applications in Biology and Medicine Academic Press New York p 600 1986
LIS H SHARON N Lectins Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular
recognition Chemical Reviews v98 p637-674 1998
MANASKOVA P MESZAROSOVA A LIBERDA J VOBURKA Z TICHA M
JONAKOVA V Aggregated forms of heparin-binding and non-heparin-binding proteins
of boar seminal plasma and their binding properties Folia Biologica v45 p 193-201
1999
MANJUNATH P SAIRAM MR Purification and biochemical characterization of three
major acidic proteins (BSP-A1 BSP-A2 and BSP-A3 from bovine seminal plasma
Biochemistry Journal v 241 p 685-692 1987
MANJUNATH P THERIEN M I Role of seminal plasma phospholipids-biding proteins
in sperm modification that occurs during capacitation Journal of Reproduction and
Immunology v 53 p 109-119 2002
MANN T The biochemistry of semen and of the male reproductive tract London
Menthuen p 343-350 1964
MANN T LUTWAK-MANN C Male reproductive function and semen themes and
trends in phisiology biochemistry and investigative andrology Berlin Springer-Verlag
1981
93
MASAKI J HARTREE EF Distribuition of metabolic activity phospholipids and
hyaluronidase between heads and tails of bull spermatozoa Journal of Biochemistry v84
p 347 1962
McLESKEY SB DOWDS C CARBALLADA R WHITE RR SALING PM
Molecules involved in mammalian sperm-egg interaction International Review of
Cytology v177 p 57-113 1998
MENTZ KW BERGER T CLEGG ED Adsorption of seminal plasma proteins by
boar spermatozoa Theriogenology v34 p 691-700 1990
NUNES JF CORTEEL JM COMBARNOUS Y BARIL G Study of the
involvement of seminal plasma constituents in the seasonal variations of goat spermatozoa
motility 3deg International Conference on Goat production and diseases Arizona (USA)
p283 1982
PARRY RV BARKER PJ JONES R Characterization of low mr zona pellucida
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma Molecular Reproduction and
Development v33 p108-115 1992
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Lectin as plant defence proteins Plant
Physiology v 109 p 347-352 1995
PEUMANS WJ VAN DAMME EJM Plant lectins specific tools for the identification
isolation and characterization of O-linked glycans Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology v 33 p 209-258 1998
POLAKOSKI KL KOPTA M Seminal Plasma In ZANEVELD JD
CHATTERTON RT Biochemistry of mammalian reproduction New York Jonh Wiley
p89-117 1982
94
REINERT M CALVETE JJ SANZ L MANN K TOumlPFER-PETERSEN E Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7 a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family European Journal of Biochemistry v 242 p636-640 1996
REINERT M CALVETE JJ SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E Immunohistochemical
localization in the stallion genital tract and topography on spermatozoa of seminal plasma
protein SSP-7 a member of the spermadhesin protein fammily Andrology v 29 p 179-
186 1997
RODRIGUEZ-MARTINEZ H IBORRA A MARTINEZ P CALVETE JJ
Immunoelectronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida Reproduction Fertility and Development v10 p310-
320 1998
ROMAtildeO MJ KOLLN I DIAS JM CARVALHO AL ROMERO A VARELA
PF SANZ L TOPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Crystal structure of acidic
seminal fluid protein (aSFP) at 19 A resolution a bovine polypeptide of the spermadhesin
family Journal Molecular Biology v274 p650-660 1997
ROMERO A VARELA PF SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-IPSPII a heterodimer of two CUB domains FEBS Letters v 382 p
15-17 1996
ROMERO A ROMAtildeO MJ VARELA PF KOLLN I DIAS JM CARVALHO
AL SANZ L TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ The crystal structure of two
spermadhesin reveal the CUB domain fold Nature Structural Biology v 4 p 783-788
1997
RONKKO S Immunohistochemical localization of phospholipase A2 in human and bovine
male reproductive organs Comp Biochemistry and Physiology v 110 p 503-509 1995
95
ROY A Egg yolk coagulating enzyme in the semen and cowperrsquos gland of goat Nature v
159 p 318-319 1957
SAITOU N NEI M The neighbor-goining method a new method for reconstructing
phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution v 4 p 406-425 1987
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER TOumlPFER-
PETERSEN E The amino acid sequence of AQN3 a carbohydrate-biding protein isolated
from boar sperm Location of dissulphide bridges FEBS Letters v291 p33-36 1991
SANZ L CALVETE JJ MANN K SCHAFER W SCHMID ER
AMSELGRUBER W SINOWATZ F EHRHARD M TOumlPFER-PETERSEN E The
complete primary structure of the spermadhesin AWN a zona pellucida-biding protein
isolated from boar spermatozoa FEBS Letters v300 p213-218 1992a
SANZ L CALVETE JJ MANN K SHAFER W SCHMID ER AMSELGRUBER
W TOumlPFER-PETERSEN E The complete primary structure of the boar spermadhesin
AQN-1 a carbohydrate-biding protein involved in fertilization European Journal of
Biochemistry v 205 p645-652 1992b
SANZ L CALVETE JJ JONAKOVA V TOumlPFER-PETERSEN E Boar
spermadhesin AQN-1 and AWN are sperm- associated acrosin inhibitor acceptor protein
FEBS Letters v 300 p63-66 1992c
SANZ L CALVETE JJ MANN K GABIUS HJ TOumlPFER-PETERSEN E
Isolation and biochemical characterization of heparin-biding proteins from boar seminal
plasma A dual role for spermadhesin in fertilization Molecular Reproduction and
Development v35 n 1 p37-43 1993
96
SCHONECK C BRAUN J EINSPANIER R Sperm viability is influenced in vitro by
the bovine seminal protein aSFP effects on motility mithocondrial activity and lipid
peroxidation Theriogenology v 45 p 633-642 1996
SCOTT TW VOGLMAYR JK SETCHELL BP Lipid composition and metabolism
testicular and ejaculated ram spermatozoa Journal of Biochemistry v 102 p 456 1967
SHARON N LIS H Lectins as cell recognition molecules Science v246 p227-234
1989
SHARON N LIS H History of lectins from hemagglutinins to biological recognition
molecules Glycobiology v 14 p53-62 2004
SHIVAJI S SCHEIT KH BHARGAVA PM Protein of Seminal Plasma Wiley and
Sons New York NY 1990
SOLIacuteS D ROMERO A JIMEacuteNEZ M DIacuteAZ-MAURINtildeO T CALVETE JJ Biding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-II a member of the
spermadhesin protein family FEBS Letters v431 p273-278 1998
SORENSEN MB BERGDAHL IA HJOLLUND NH BONDE JP
STOLTENBERG M ERNEST E Zinc magnesium and calcium in human seminal fluid
relation to others semen parameters and fertility Molecular Human Reproduction v 5
p331-337 1999
STRZEZEK J CIERESZKO A Heteroneity of aspartate-aminotransferase (AAT) in ull
Semen Comparative bioquemistry and physiology Biochemistry amp Molecular Biology v
86 n 2 p 373-375 1987
97
TADESCHI G OUNGRE E MORTARINO M NEGRI A MAFFEO G RONCHI
S Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin European Journal
Ciochemistry v 267 p 6175-6179 2000
TEIXEIRA DIA CAVADA BS SAMPAIO AH HAVT A BLOCH C Jr PRATES
MV MORENO FB SANTOS EA GADELHA CA GADELHA TS
CRISOSTOMO FS FREITAS VJF Isolation and partial characterisation of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologous to spermadhesins Protein and
Peptide Letters v 9(4) p331-335 2002
THAKKAR JK FRANSON RC Characterization of a surface-active phospholipase A2
from mouse spermatozoa Federation Proceedings v 42 p7 1983
THEacuteRIEN I BLEAU G MANJUNATH P Phosphatidylcholine-biding proteins of
bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by heparin Biology of
Reproduction v 52 p 1372-1379 1995
THEacuteRIEN I BOUSQUET D MANJUNATH P Effect of seminal phospholipids-biding
proteins and follicular fluid on bovine sperm capacitation Biology of Reproduction v 65
p 41-51 2001
TIENTHAI P JOHANNISSON A RODRIGUEZ-MARTINEZ H Spem capacitation in
the oviduct Animal Reproduction Science v 80 p 131-146 2004
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ SANZ L SINOWATZ F Carbohydrate and
heparin-biding proteins in mammalian fertilization Andrologia v 27 p 303-324 1995
TOumlPFER-PETERSEN E CALVETE JJ Sperm-associated protein candidates for
prymary zona pellucida-binding molecules structure-function correlation of boar
spermadhesins Journal of Reproduction and Fertility v 50 p 55-61 1996
98
TOumlPFER-PETERSEN E ROMERO A VARELA PF EKHLASI-HUNDRIERSER
M DOSTALOVA Z SANZ L CALVETE JJ Spermadhesins A new protein family
Facts hypoteses and perpectives Andrologia v 30 p 217-224 1998
TOumlPFER-PETERSEN E Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon
to fertilization Human Reproduction Update v 5 p 314-329 1999
TOumlPFER-PETERSEN E EKHLASI- HUNDRIERSER M KIRCHHOFF C LEEB T
SIEME H The role of stallion seminal proteins in fertilization Animal Reproduction
Science v 89 p 159-170 2005
VARELA PF ROMERO A SANZ L ROMAtildeO MJ TOumlPFER-PETERSEN E
CALVETE JJ The 24 Aring resolution crystal structure of boar seminal plasma PSP-I-
PSPII a zona pellucida-binding glycoprotein heterodimer of the spermadhesin family built
by a CUB domain architecture Journal Molecular Biology v 274 p 635-649 1997
VILLEMURE M LAZURE C MANJUNATH P Isolation and charactherization of
gelatin-biding protein from goat seminal plasma Reproductive Biology and Endocrinology
v 1 p 39-50 2003
WAH DA FERNANDEZ-TOMERO C SANZ L ROMERO A CALVETE JJ
Sperm coating mechanism from the 18 A crystal structure of PDC-109-phosphorilcoline
complex Structure v 10 p 505-514 2002
WEMPE F EINSPANIER R SCHEIT KH Characterization by cdna cloning of the
messenger-rna of a new growth-factor from bovine seminal plasma - acidic seminal fluid
protein Biochemical and biophysical research communications v 183 p 232-237 1992
WITZENDORFF DV EKHLASI-HUNDRIESER M DOSTALOVA Z RESCH M
RATH D MICHELMANN HW TOumlPFER-PETERSEN E Analisis of N-linked
99
glycans of porcine zona pellucida glycoprotein ZPA by MALDI-TOF MS a contribuition
to understanding zona pellucida structure Glycobiology v 15 p 475-488 2005
YANAGIMACHI R The Physiology of Reproduction Raven Press New York 1988 p
135-185
100