Post on 24-Jan-2019
Melhoramento genético visando
resistência a insetos
Melhoramento genMelhoramento genéético visando tico visando
resistência a insetosresistência a insetos
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
Programa de PPrograma de Póóss--GraduaGraduaçção em ão em GenGenéética e Melhoramento de Plantastica e Melhoramento de Plantas
LGN 5799 – SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
LGN 5799 – SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Doutoranda: Michelle da Fonseca Santos
Orientador: José Baldin Pinheiro
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 – Caixa Postal 83, CEP:13400-9710 – Piracicaba – São Paulo – Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 – Fax: (0xx19) 3433-6706 – http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
1782 – 1º registro RI: variedade Underhill de trigo
resistente a mosca-de-Hesse (Mayetiola destructor);
1831 - 1º relato de uso de RPI: macieira Winter Majetin
resistente ao pulgão lanígero (Eriosoma lanigerum);
Panda & Kush, 1995
HISTÓRICO DA RPI
1863 - Caso clássico de sucesso no controle através da
RPI: filoxera-da-videira (Phylloxera vitifoliae);
Variedades americanas – porta-enxertos
Variedades européias – enxertosENXERTIA
Lara, 1991
1881 – Primeiras pesquisas visando à obtenção de
variedades RI (Califórnia-EUA) M. destructor ;
1916/17 - Primeiros estudos de herança da RPI:
resistência de algodão à cochonilha Saissetia nigra e ao
ácaro Eriophies gossypii;
1931 – Liberação dos primeiros materiais resistentes.
Estação Experimental do Kansas – variedades de trigo
resistentes a mosca de Hesse.Panda, 1979
HISTÓRICO DA RPI
Períodos de pesquisa em RPI
1º Anterior à II Guerra Mundial
Ortman & Peters, 1980
2º Imediatamente posterior à II Guerra Mundial
3º Atual (a partir de 1960)
HISTÓRICO DA RPI
MARCADORES MOLECULARES e TRANSGENIA
Vendraminm & Nishikawa, 2001
Novo período na RPI:
Definições:
“RPI é a soma relativa de qualidades
hereditárias apresentadas
pela planta, as quais influenciam
o grau de dano causado pelo inseto”
Painter, 1951
“Planta resistente é aquela que devido a sua
constituição genotípica, é menos danificada que uma
outra, em igualdade de condições”
Rossetto, 1973
RESISTÊNCIA DE PLANTAS A INSETOS
Graus de resistência
Lara, 1991
• Imunidade
• Alta resistência
• Resistência moderada
• Suscetibilidade
• Alta suscetibilidade
RESISTÊNCIA DE PLANTAS A INSETOS
Não preferência ou preferência (Antixenose):
Variedade é menos utilizada para alimentação,
oviposição ou abrigo que as outras variedades em
geral.
Antibiose: variedade, embora normalmente consumida
pelo inseto, provoca efeito adverso em
sua biologia
Tolerância: variedade menos danificada que as demais,
sob um mesmo nível de infestação do
inseto, e sem provocar efeito no
comportamento ou biologia desta.
Mecanismos de resistência
Painter, 1951
RESISTÊNCIA DE PLANTAS A INSETOS
RESISTÊNCIA DE PLANTAS A INSETOS
Genética da RPI
Fehr, 1987
Resistência vertical ou específica
• monogênica ou oligogênica (caráter qualitativo)
• vantagem: mais fácil de ser incorporada
• desvantagem: vulnerabilidade a novos biótipos
Resistência horizontal ou geral
• poligênica (caráter quantitativo)
• vantagem: controla amplo espectro de biótipos
• desvantagem: baixa herdabilidade
MELHORAMENTO VISANDO RPI
Etapas de um programa de melhoramento
Pessoal: equipe multidisciplinar
Definição do inseto praga-chave
Fontes de resistência:
Variabilidade genética do germoplasma inicial
a) Parentes silvestres
b) Populações locais e cultivares primitivas
c) Cultivares obsoletas
d) Linhas avançadas de melhoramento e mutações
e) Cultivares modernas Hoyt, 1992
Definição do método de melhoramento
Vendramim & Nishikawa., 2001
• Grau de melhoramento das fontes de resistência:
Com boas características agronômicas
Espécies selvagens, raças locais e material exótico
Controle quantitativo (Pré-melhoramento)
• Sistema reprodutivo da espécie
Alógama
Autógama
Etapas de um programa de melhoramento
RESISTÊNCIA DE PLANTAS A INSETOS
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Hill et al., 2001
Nativo da Ásia
2000: Meio-oeste (EUA) América do Norte
Danos: enrolamento, murcha, amarelecimento e queda prematura das folhas
Hartman et al., 2001
DiFonzo & Hines, 2002
Perda de rendimento > 50%
Redução da qualidade das sementes
Transmissão de vírus
� Identificar resistência ao pulgão da soja
� Determinar o tipo de resistência
� Examinar a variação entre clones do pulgão
� Comparar a performance agronômica de cultivares
resistentes e suscetíveis sob infestação severa do pulgão e
quando protegidas por um inseticida sistêmico.
1542 acessos de soja
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Teste com/sem chance de escolha
Figura 1 – Ilustração da escala de classificação visual usada para estabelecer o Índice de Dano (ID)
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Teste com chance de escolhaTabela 1 – Populações de pulgões da soja sobre planta nos estágios V1 e V2 de três genótipos de soja resistentes e quatro suscetíveis em dois testes com chance de escolha
6127Média
150c71d‘Ina’
152c55cd‘Pana’
187c48c‘Loda’
186c42c‘Williams 82’
53b19bPI 71506
11a15b‘Dowling’
15a9a‘Jackson’
Estágio VcEstágio V1Genótipos
Número de pulgões por planta
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Teste sem chance de escolhaTabela 2 – Populações de pulgões da soja sobre plantas V1 e V2 de 5 genótipos de soja resistentes e 4 suscetíveis em 2 experimentos sem chance de escolha
60c104c‘Loda’
2a1a‘Palmeto’
1113Média
67cnão testado‘Ina’
24bc57c‘Williams 82’
não testado49c‘Pana’
15b35c‘CNS’
28bc29bcPI 71506
1a2a‘Dowling’
1a1a‘Jackson’
Estágio VcEstágio V1Genótipos
Número de pulgões por planta
• 1º relato - germoplasma da América do Norte
• Resistência – Dowling, Jackson e PI71506
• Palmetto e CNS (ancestrais) – doadores de resistência
• Dowling, Jackson e Palmetto – antibiose
• PI71506 e CNS – antixenose ou não preferência
• Expressão da resistência em todos os estágios
• Dowling Imidacloprid
• 3 clones – único biótipo ou mesmo clone
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
PI 567543C, PI 567597C, PI 567541B e PI 567598B
antixenose antibiose
2147 acessos de soja
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Dowling (R) ♀ XLoda (S) ♂
Williams 82 (S) ♂
F1
F2
0, 1 ou 2
F2:3
Teste com chance de escolha
Colonização: 0 - 4
3 ou 4
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Tabela 1 – Proporção de colonização de pulgões observada e esperada em plantas F2 resultantes de Dowling x Loda e os pais, 21 dias após infestação.
31132Loda
0,1618,01Heterogeneidade0,900,0244,25132,7545132177Grupos
03232Dowling
0,880,023,7511.254111543440,690,164,7514,25415194531
0,720,132,57,5281043100,102,672,06,00884343
18,02Total
0,025,561,54,542643080,410,672,06,03584307
0,630,233,259,7549134309
0,500,443,09,0481243040,053,763,7511,2578154306
02222Dowling x Loda (F1)
0,600,272,758,25291143030,063,672,758,250111143020,560,334,012,03131643010,760,093,510,53111442810,890,024,7514,25514194021
PX2SR SRNo de plantasGenótipos (Família F2)
Esperado (3:1)Observado
3:1
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
0,0910,8Heterogeneidade
0,143,925,55125,5335019102Grupo
14,7Total
0,223,04,258,54,25782174531
0,870,32,755,52,75362114344
0,900,22,552,5352104309
0,055,93,573,5734144306
0,820,42,552,5262104303
0,114,5363390124301
0,780,5363453124281
1,000,0484484164021
PX2SHRSHR
Esperado (1:2:1)ObservadoNo de famílias F2:3Família F2
Tabela 2 – Proporção de colonização de pulgões observada e esperada em famílias F2:3 resultantes de Dowling x Loda 21 dias após infestação.
1:2:1
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
033Dowling x Williams 82 (F1)
20020Williams 82
01919Dowling
0,890,0044,75134,25441351794041 (família F2)PX2SRSR
No de plantasGenótipos EsperadoObservado
0,810,423264323063351284041
PX2SHRSHR
Esperado (1:2:1)ObservadoNo de famílias F2:3Família F2
Tabela 3 – Proporção de colonização de pulgões observada e esperada em plantas F2 resultantes de Dowling x Williams 82 21 dias após infestação pelo pulgão da soja.
Tabela 4 – Reações de famílias F2:3 de soja resultantes de Dowling x Williams 82Loda 21 dias após infestação pelo pulgão da soja.
3:1
1:2:1
Dowling – herança dominante monogênica
Rag 1
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
1º gene de R a A. glycines
Aphis glycines
Introgressão de Rag 1 retrocruzamentos
SAM
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
21rr (F2:3 suscetíveis)4Rr (F2:3 resist. e susc.)1RR (F2:3 resistentes)97Suscetível (3-4)
0rr (F2:3 suscetíveis)82Rr (F2:3 resist. e susc.)
42RR (F2:3 resistentes)247Resistente (0-2)
No de famílias F2:3Genótipo de plantas F2No de plantas F2Fenótipo de plantas F2
3:11:2
Jackson – herança dominante monogênica
Gene de Jackson X Rag1 ?
Tabela 1 – Segregação de progênies F2:3 de plantas F2 de Jackson X Loda para resistência ao pulção da soja, 21 após infestação.
123
26
Dowling (R) XLoda
Williams 82F1
F2
F2:3
(S) Jackson (R) X Loda (S)
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Objetivos: mapear e localizar Rag1 e o gene de Jackson sobre o mapa genético da soja
F1
F2
F2:3
Figura 2 - Mapas de ligação mostrando a localização dos genes de resistência ao pulgão da soja em Dowling (Rag1) e Jackson (Rag)que foram mapeados sobre o grupo de ligação M.
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
3,3
9,3
D x L D x W
2,1
8,9
J x L
4,2
7,9
D x LD x W
1º relato da localização de genes de resistência ao pulgão no mapa da soja
Dowling (R) X Loda (S)
F1
F2 (R)
F2:3
X Loda (S)
BC3F2 (R)
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
� Dowling e Jackson – não adaptados ao meio-oeste
� SAM
PI 243540 (R): < ou = 2 Wyandot (S) : > ou = 4X
Figura 1 - Géis de agarosemostrando que as bandas SSR de ambos pais estápresente nas plantas F1. P1: Wyandot, P2: PI 243540 e números 1 a 11: plantas F1.
Herança monogênica dominante
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
--10(Titan x PI 567598B) F1
3,0012(E00075 x PI 567598B) F1
3,306(E00075 x PI 567541B) F1
4,0013‘Titan’4,008E00075
1,01212PI 567598B1,099PI 567541B
ClassificaçãoPlantas resistentesPlantas testadasGenótipos
F2 – 15:1 suscetíveis/resistente
Herança: dois genes recessivos
Tabela 1 – Linhas de soja parentais e F1 classificadas como resistentes ao pulgão da soja.
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Biótipo de Ohio (0-4)
‘Wyandot’ (S) X PI 243540 (R)
F1
F2
F2:3
Teste com chance de escolha
F2 - 3R:1S
1,000,000,143,950815746Rag20,152,120,342,132964937Satt4900,670,180,890,242944543Sat_375
0,860,030,960,090944545Sct_1880,370,800,630,931864651Satt3620,600,270,223,038775247Sct_033
0,700,150,124,163815743Satt3340,640,220,461,541875343SOYHSP1760,410,660,601,033844750Sat_234
0,520,410,019,9931052749Sat_229-H (Rr)b (RR)a (rr)
P valorX2 3:1PX2 1:2:1No de F2 em cada
categoria Locus
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Tabela 1 – Teste de X2 da segregação do gene (Rag2) de resistência ao pulgão da soja e 9 marcadores SSR entre 184 plantas F2 de uma população de mapeamento de ‘Wyandot’ x PI 243540.
138 R46 SF2:3 - 1:2:1Rag 2
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Figura 1 – a) Segmento relevante do grupo de ligação (GL) F (Choi et al, 2007), b) Posição de Rag2 sobre o GL F quando Rag2 foi mapeado como um gene dominante, c) Posição de Rag2 sobre o GL F quando Rag2 foi mapeado como um gene co-dominante.
PI 243540 – Rag2
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Mapeamento fino
Clonagem posicional
Mapeamento fino
Clonagem posicional
Figura 1 – Mapa de ligação para o loco de resistência ao pulgão com SNPs (Single NucleotidePolymorphisms) identificados por hibridização.
Grupo de ligação M
cM Marcadores
Rag1
Campo - mistura
Casa de vegetação – um clone
Teste com chance de escolha
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
PI 567541B (R) Skylla (S)X
F3:4
50 linhagens
melhoradas
PI 567541B (R) E00003 (S)X
F3:4
Validação de QTL
Figura 1 - Localização dos QTLs de resistência ao afídeo da soja usando
o método de mapeamento por intervalo composto.
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Dowling e Jackson
Figura 2 - Produtos de PCR amplificados pelos marcadores
Satt299, Satt435, Satt649 e Satt343 para E00003(E), Skylla(S),
PI567541B (P), Jackson (J) e Dowling (D).
PULGÃO DA SOJA ( Aphis glycines Matsumura)
Limitações do melhoramento convencional
Necessidade de cruzamento de muitas plantas durante
gerações múltiplas;
Restrito ao uso de fonte de resistência nas espécies
selvagens;
Longo tempo para obtenção de variedades;
Transferência de porções indesejáveis do genoma.
RESISTÊNCIA DE PLANTAS A INSETOS
Redução do tempo para obtenção de novas cultivares;
Transferência de genes entre organismos
filogeneticamente diferentes
> precisão – transferência apenas dos genes desejáveis;
Características podem ser introduzidas de uma única vez
sem complicações de genes extras e retrocruzamento;
RESISTÊNCIA DE PLANTAS A INSETOS
Vantagens da engenharia genética
Plantas transgênicas
“Aquelas que possuem genes que originalmente não
constituem seu genoma, isto é, sofreram uma
transferência gênica”
� Estratégias de planta RI
Bacillus thuringienses, lectinas, inibidores de α-amilase, inibidores de proteinases, quitinas, peroxidases, entre outras.
ENGENHARIA GENÉTICA PARA RPI
Ribeiro et al, 1991
Bt
Esporos uma ou várias proteínas Cry
(δ-endotoxinas ou Insecticidal Crystal Proteins (ICPs)
ENGENHARIA GENÉTICA E RPI
Who, 1999
Modo de ação das toxinas Bt em
insetos
Tabela 1 - Plantas modificadas com genes cry de B. thuringiensis, resistentes a insetos-praga de importância agrícola (adaptado de Fontes et al., 2002).
Plantas Bt X Resistência a toxina
Piramidação de genes
2002 – Bollgard II (Cry 1Ac e Cry2Ab2)
ENGENHARIA GENÉTICA E RPI
Zhao et al., 2003
Utilização de planta transgênica juntamente com suscetível (refúgio);
RR rr
Rr
ENGENHARIA GENÉTICA E RPI
Tratamentos:
1) Pirâmide - 80% piramidadas (Cry1Ac/Cry1C) + 20% refúgio
2) Mosaico - 40% Cry1Ac + 40% Cry1C + 20% refúgio
3) Sequencial - 80% Cry1Ac + 20% refúgio / 80% Cry1c + 20% refúgio
� 4 populações de Plutella xylostella
Geração
Larv
a e
pulp
apo
r pl
anta
Bt
Figura 1 - Populações de Plutella xylostella resistentes a Cry1Ac/Cr1Cem gaiolas com diferentes tratamentos de brócolis Bt.
ENGENHARIA GENÉTICA E RPI
Tabela 1 – Sobrevivência de larvas de Plutella xylostella resistentes a Cry1Ac/Cr1Cem gaiolas, sobre diferentes plantas de brócolis Bt.
ENGENHARIA GENÉTICA E RPI
[0;0;0;1,0][0;0;0;1,0][69;71;74;78]
0,25 (0,25) B0,25 (0,25) B73 (2,0) BSequencial
[2,1;4,1;4,2;5,1][3,1;6,1;6,3;12][90;95;96;96]
3,9 (0,64) A6,9 (1,9) A94 (1,5) AMosaico
[0;0;0;0][0;0;0;0][3,1;3,2;2,4;6,1]
0 B0 B4,1 (0,7) CPirâmide24
0,25 (0,25) B0,25 (0,25) B87 (0,38) ASequencial
5,9 (2,8) A6,1 (2,5) A98 (0,98) AMosaico
0,25 (0,25) B0,25 (0,25) B4,8 (2,9) BPirâmide18
2 genesCry1CCry1Ac
Sobrevivência média (%) sobre plantas BtTratamentoGeração
ENGENHARIA GENÉTICA E RPI
0,00,00043Freq r1,835 famíliasCN
5781,2Max RR1992-1993 a 2002-2004
64 biótiposEUA
Helicoverpa zea
LC50 (µg Cry 1Ac por ml de dieta)
Pro
porç
ão d
e bi
ótip
os
Figura 1 - Resistência de Helicoverpa zea a algodão Bt. a) Antes da comercialização de algodão Bt (1992-1993), b) após a comercialização de algodão Bt (2002-2004).
a
Pro
porç
ão d
e bi
ótip
os
LC50 (µg Cry 1Ac por ml de dieta)
b
ENGENHARIA GENÉTICA E RPI
ENGENHARIA GENÉTICA E RPI
a
Ano
s pa
ra r
esis
tênc
ia
Refúgio (%)
b
Refúgio (%)A
nos
para
res
istê
ncia
Figura 2 – Efeito simulado de abundância de refúgio (%) sobre resistência de pragas à culturas Bt.
Ha, Helicoverpa amigera; Hz, Helicoverpa zea; Hv, Helicoverpa virescens; On, Ostrinia nubilalis,
Pg, Pectinophora gossypiella; Sn, Sesamia nonagrioides.
Polipeptídio produzido pelas plantas
Mecanismo de defesa contra insetos e patógenos
Abundantes principalmente em sementes e órgãos de
reserva de gramíneas, leguminosas e solanáceas
Defesa constitutiva ou induzida pelo dano do inseto
ENGENHARIA GENÉTICA PARA RPI
Inibidores de proteinases
ENGENHARIA GENÉTICA PARA RPI
Inibidores de proteinases
• Classificação: proteinases serínicas; cisteínicas; aspárticas e metalo-proteinases.
• 1ª planta transgênica que expressava um gene de inibidor de proteinase.
Manduca sexta
Tabaco (CpTi)
IP serínica de feijão-de-corda (Vigna unguiculata).
Habibi & Fazili, 2007
Tabela 2 – Bioensaios de plantas transgênicas expressando genes de inibidores de proteinases introduzidos.
Hilder & Boulter, 1999
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A engenharia genética aliada ao desenvolvimento
de novos genótipos resistentes nos programas de
melhoramento, contribuirão sobremaneira no manejo
de pragas. Isto porque a incorporação de cultivares
resistentes assume grande importância por ser
compatível com outras táticas de controle
possibilitando a minimização do uso de inseticidas
químicos, o que reflete na redução de custos de
produção e de riscos de impacto ambiental negativo.