Post on 03-Apr-2015
Les techniques histologiques
Ou…les principes fondateursOu…les principes fondateurs
Les principes fondateursLes principes fondateurs
1 - Histologie = microscopie !…
• Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit l’apparence d’un objet.• Une lentille est un focalisateur de rayonnement
Mais qu’est ce qu’un microscope ?…
De particules subatomiques :lentille électromagnétique
Photonique :lentille en verre
Convexe Concave
Mais qu’est ce qu’un microscope ?…
• Un microscope est un appareil contenant une (ou une série de) lentille(s), qui grossit l’apparence d’un objet.• Une lentille est un focalisateur de rayonnement• Un microscope fournit une image, perçue par l’œil. Il faut donc obtenir en sortie du microscope des rayons lumineux.• Pour fournir une image perceptible, il faut que l’objet modifie le rayonnement. Il peut modifier son amplitude (intensité), sa longueur d’onde (couleur), ou sa phase.
Le premier « microscope… »
Janssen, 1595
Robert Hooke : l’acte de naissance de la cellule
Micrographia (1665)
« De la structure du liège et des cellules ou des pores de quelques corps
spongieux du même genre »
Antonin van Leeuwenhoek
1830 à 1860 : la théorie cellulaireBrown (1831) : noyau cellulaire des cellules d’orchidéeSchwann (1839) : « Recherches microscopiques sur la concordance dans la structure et dans la croissance des animaux et des végétaux »
1674 : « animalcules »1683 : bactéries
REFLECTION
TRANSMISSION
Le premier Nikon (1900)
Un Olympus récent… (1998)
Source de lumière
Condensateur
(Objet)
Oculaire
Objectif
Rétine
Quel est donc le principe du microscope ?…
Loupe
GROSSIR…GROSSIR…
Rétine
Quel est donc le principe du microscope ?…
Loupe
GROSSIR…GROSSIR…
Rétine
Quel est donc le principe du microscope ?…
Oculaire
GROSSIR…GROSSIR…
Objectif
Grossissement = Objectif x OculaireGrossissement = Objectif x Oculaire
Mais comment grossir ?…
10 x 100 = ?…
Mais comment grossir ?…
RESOLUTION
Le grossissement peut se faire sans résolution...
Photode
journal
Photode
livre d’art
100X
…si l’information initiale est insuffisante !
Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope
Pour un microscope utilisant le rayonnement photonique, un grossissement de plus de 1500 fois donne une image trouble : Quelle que soit la qualité des lentilles, la résolution d’un microscope est limitée.
Rayon directsRayonréfractés
• La « quantité d’information » est donc d’autant plus importante que des spectres de diffraction d’ordres supérieurs peuvent participer à la formation de l’image.• Les spectres secondaires sont répartis dans l’espace ; le fait de capter un plus grand nombre de rayons doit donc donner une meilleure image...
Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope
• Abbe utilise une théorie à la mode : il admet que l’image créée par un microscope est liée à des interférences entre les rayons non modifiés par l’objet, et les rayons diffractés par l’objet.
Et ça marche...
Le nombre de spectres secondaires récupérés par un objectif dépend de son :
ouverture numériqueouverture numérique
n car cela permet de modéliser les performances des objectifs à immersion…O.N. =n.sinα
L’ouverture numérique est le sinus de l ’angle que fait le dernier rayon qui pénètre dans l’objectif avec l’axe de celui-ci, multiplié par l ’indice de réfraction du milieu traversé par les rayons lumineux.
Sinus car fonction croissante
et de comprendre le prix de ces objectifs (pensez aux bords…) ou des objectifs à grande distance frontale (pourquoi ?….) !
Vers 1870, Abbe découvre et modélise la limite intrinsèque du microscope
Dans ce modèle, la distance minimum entre deux points pour qu’ils soient détectés peut alors être évalué
Grosso modo, la résolution est limitéeà la moitié de la longueur d’onde du rayonnement
d=kλ
n.sinα
n.sin = ouverture numérique de l’objectif = longueur d'onde de la lumière incidentek = coefficient variant entre 0,5 et 1,22(en fonction des capacités de l'œil, en particulier à distinguer les différences de luminosités, et de l’orientation de la source lumineuse. En règle générale, on prend k = 0,61)
Les meilleurs objectifs ont une ouverture numérique de 1,4 ( = 70°, huile à immersion d’indice 1,15 ) :D’où d = 194 nm pour les radiations bleues (450 nm)… C’est la limite de résolution théorique du microscope optique
Université de Toronto (1938)
Porter KR, Claude A & Fullam EF (1945) J. Exp. Med. 81 : 233-246
RCA scope (1956) JEOL (années 1980)
UHV-TEM de JeolLe petit dernier de Philips...
Les principes fondateursLes principes fondateurs
1 - Histologie = microscopie !…
2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste
Problème : transmission….Il faut passer au travers de l’objet !
D’où l’idée de le couper en tranches fines
- couper implique de durcir… par congélationpar inclusion paraffine
plastique
- inclure implique de maintenir...
- observer implique de contraster...
par fixation chimique
par coloration généraleélective
par histochimiepar immunocytologie
D’où le déroulement classique :
• Fixation de l’objet• Inclusion• Coupe• Coloration / contraste et enfin… Observation
qui sera adapté - en fonction des contraintes des techniques microscopiques- en fonction du but recherché...
- fixateurs coagulants (précipitants)- fixateurs non coagulants (pontants)- fixateurs coagulants (précipitants)
• Fixation : le pari impossible• Inclusion• Coupe• Coloration / contraste / observation
Stabiliser la structure sans l’altérer…
Formaldehyde Glutaraldehyde Tétroxyde d’osmium
- Méthanol, éthanol, acétone- Acide acétique, acide picrique- Composés mercurés
- fixateurs coagulants (précipitants)
- fixateurs coagulants (précipitants)- fixateurs non coagulants (pontants)
• Fixation : le pari impossible• Inclusion• Coupe• Coloration / contraste / observation
Stabiliser la structure sans l’altérer…
Et leurs mélanges : Formol, liquide de Bouin, de Carnoy, de Zencker, ...
Gray (1954) dresse un liste de 700 mélanges fixateurs … et précise qu’elle est très incomplète !
Fixer est un art aussi difficile que la cuisine...
Milieu liquide qui peut se solidifier… suffisamment pour être coupé fin !
• Fixation : le pari impossible• Inclusion : réussir le melting pot• Coupe• Coloration / contraste / observation
Enrober la structure sans la déformer…
• Paraffine• Résines plastiques (Araldite, Epon, Métacrylates…)
Problème… : ce sont des milieux hydrophobes !Nécessité de déshydrater après fixation : alcool, acétone,...
Inclure demande de la patience...
• Fixation : le pari impossible• Inclusion : réussir le melting pot• Coupe : jouer avec le fil du rasoir• Coloration / contraste / observation
Optique :
5 à 20 µmMicrotome
couteau acier
Trancher la structure suffisamment fin…
Couper demande du doigté...
Electronique :
50 à 80 nmUltramicrotome
rasoir verre / diamant
Les principes fondateursLes principes fondateurs
1 - Histologie = microscopie !…
2 - Le tiercé infernal : Fixation/inclusion/contraste- couper implique d’inclure
- inclure implique de fixer
- observer implique de contraster...
3 - Les principaux types de microscopie
Fond clair
Contraste de phase
Nomarski(contraste d’interférence différentielle)
Fond noir
Optique
Optique
Microscopie à fond clair : colorations
Des recettes de cuisine !!!
Hémalun - Eosine
Azan
Optique
Microscopie à fond clair : colorations électives
Des recettes de cuisine !!!
Optique
Microscopie à fond clair : histochimie
Des recettes de cuisine !!!
Problème particulier :Comment préserver l’activité enzymatique
Optique
Microscopie à fluorescence
& al. : F-microscopies (FRAP, FLIP, FRET…)microscopies à effet tunnel, ...
Problème particulier :Comment préserver à la fois l’antigénicité et la structure...
Remarques techniques…Colorants :• Affinité pour les molécules chargées négativement (acides nucléiques…) :
- Les colorants sont chargés positivements (« bases »)Exemple : Hématoxyline, Hémalun,
- Les structures sont dites basophilesExemple : noyau, ribosomes (donc REG…)
• Affinité pour les molécules chargées positivement :- Les colorants sont chargés négativement (« acide »)
Exemple : éosine- Les structures sont dites acidophiles
Exemple : cytoplasme
QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)
sont requis pour visionner cette image.
QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)
sont requis pour visionner cette image.
Remarques techniques…Artéfacts… :• Rétraction :
- espaces non colorés- lié à la fixation / déshydratation
REMARQUE : tout espace non coloré…… n’est pas forcément un artéfact !
Remarques techniques…Artéfacts… :• Rétraction :
- espaces non colorés- lié à la fixation / déshydratation
• Stries / plis :- lié à la coupe / étalement
Remarques techniques…Artéfacts… :• Rétraction :
- espaces non colorés- lié à la fixation / déshydratation
• Stries / plis :- lié à la coupe / étalement
• Crapoteries variées et diverses… :- lié à la poussière ambiante, aux colorants, ….
Electronique : transmission
Coupes Ultrafines(50 à 80 nm = 10 fois la membrane plasmique…)
Contraste :Sels de métaux lourds(Acétate d’uranyl, citrate de plomb)
Electronique : transmission
Apparté : Tomographie...
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cette image.
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Apparté : Tomographie...
Apparté : Tomographie...
Apparté : Tomographie...
Electronique : transmission
Electronique : balayage
ou… le retour de laREFLECTION
Electronique : balayage
Electronique : balayage