Post on 04-Apr-2015
Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 2
aspartateCarbamyl phosphate carbamyla
spartate
ATCase
BCM311 - rappel comportement
embouts
boite vide
boîte moitié vide - retourner au buffet
- remplir (gants) et mettre à l'endroit pour stérilisation ultérieure (ne pas remettre au buffet)
BCM311 - rappel comportement
remplir flacons laveurs
vider poubelles de table
enlever cuvettes des spectrophotomètres
ne pas laisser des cuvettes pleines sous la hotte
départs hâtifs - manipulations- ménage- vérification du cahier
Jour 1 - variabilité
0 5 10 15 20 250
1
2
3
[Asp] mM
DO
46
6
1/1001/5001/10001/20001/50001/10000
0 5 10 15 20 250
1
2
3
[Asp] mM
DO
46
6
1/1001/5001/1000
0 5 10 15 20 250
1
2
3
[Asp] mM
DO
46
6
1/1001/5001/10001/2 0001/5 0001/10 000
0 5 10 15 20 250
1
2
3
[Asp] mM
DO
46
6
1/1001/5001/10001/20001/50001/10000
Jour 1 - allostérie
0 5 10 15 20 250.0
0.5
1.0
1.5
[Asp] mM
DO
46
6
0 5 10 15 20 250.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
[Asp] mM
DO
46
6
0 5 10 15 20 250.0
0.5
1.0
1.5
[Asp] mM
DO
46
6
0 5 10 15 20 250.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
[Asp] mM
DO
46
6
R2 = 0,9933 R2 = 0,9893
R2 = 0,9961R2 = 0,9997
Jour 1 - faibles préparations
0 5 10 15 20 250.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
[Asp] mM
DO
46
6
1/100
ATCase - but
ATCase est une enzyme allostérique
1ère semaine - préparation de l'enzyme - détermination de la dilution
étudier les propriétés cinétiques de aspartate transcarbamylase (ATCase) d'E. coli
vite
sse
Organigramme - semaine 2
effecteurs d’ATCase (séries A, B et C)
Préparation d’ATCase de la première semaine
Dosage d’ATCase sans effecteur(Série A)
Dosage d’ATCase en présence de CTP
(Série B)
Dosage d’ATCase en présence d’ATP
(Série C)
Courbe standard de carbamyl aspartate
Organigramme - semaine 2
désensibilisation du site allostérique (A,D+E)
Préparation d’ATCase de la première semaine
Dosage d’ATCase sans effecteur(Série A)
Dosage d’ATCase en présence de Hg
(Série D)
Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP
(Série E)
Organigramme - semaine 2
effecteurs d’ATCase (séries A, B et C)
Préparation d’ATCase de la première semaine
Dosage d’ATCase sans effecteur(Série A)
Dosage d’ATCase en présence de CTP
(Série B)
Dosage d’ATCase en présence d’ATP
(Série C)
Courbe standard de carbamyl aspartate
CTP est un inhibiteur d'ATCase ATP est un activateur d'ATCase assure une production égale de purines + pyrimidines
Biosynthèse des pyrimidines
0 10 20 300
1
2
3native+CTP+ATP
Vmax ave
Vmax/2
[aspartate] mM
DO466
ATCase
Vmax ne change pas
Kprime change
+CTP+ATP
À noter: ►Kprime n'est pas la [S] à Vmax/2
►ici à titre d'exemple seulement
ATCase
enzyme allostérique: cinétique non-michaelienne
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
native+ATP
+CTP
[aspartate] mM
Vit
esse
BCM311 - résultats typiques
Michaelis-Menten
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5
2.0native+CTP+ATP
[aspartate] mM
DO
46
6
+CTP+ATP
Michaelis-Menten d'ATCase
Organigramme - semaine 2
désensibilisation du site allostérique (A,D+E)
Préparation d’ATCase de la première semaine
Dosage d’ATCase sans effecteur(Série A)
Dosage d’ATCase en présence de Hg
(Série D)
Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP
(Série E)
Structure d'ATCase - séries A, D + E
enzyme native, C6R6, 300 kDa
Structure d'ATCase - séries A, D + E
sous-unité catalytique (C3) catalysent encore la réaction souvent plus active que l’holoenzyme cinétique michaelienne (courbe hyperbolique) pas sous la régulation de CTP ou d’ATP
Structure d'ATCase - séries A, D + E
Structure d'ATCase - effet de Hg
Michaelis-Menten
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5native+Hg+Hg+CTP
[aspartate] mM
DO
46
6
Michaelis-Menten
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5native+Hg+Hg+CTP
[aspartate] mM
DO
46
6
ATCase+Hg plus active que natif courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP
Structure d'ATCase - effet de Hg
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5native+CTP
Vmax ave
Vmax/2
VitesseMichaelis-Menten
[aspartate] mM
Structure d'ATCase - effet de Hg
Michaelis-Menten
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5native+Hg+Hg+CTP
[aspartate] mM
DO
46
6
Michaelis-Menten
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5native+Hg+Hg+CTP
[aspartate] mM
DO
46
6
ATCase+Hg plus active que natif courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP
Points techniques
préparer suffisamment d’enzyme diluée pour effectuer les séries en question(A-C ou A+D+E)
diluer l’enzyme immédiatement avant son utilisation
garder l’enzyme sur glace en tout temps sauf durant l’incubation
préparer le réactif (attention: H2SO4) colorimétrique juste avant son utilisation (protège-le de la lumière)
préparer seulement le volume du réactif requis (~210 ml; surplus à Will)
lire les DO rapidement après la terminaison des réactions: la couleur diminue avec le temps
Lunettes et gants obligatoire
Points techniques
Réactions à 30oC (bains personnels) réactifs (tubes) préchauffés laissez des intervalles assez longs vérifiez la température des bains
Points techniques
préparation des solutions
1.aspartate 125 mM(préparer 50 ml / table)
2.carbamyl phosphate 36 mM(préparer 50 ml / table)
solutions préparées semaine I
1.acide perchlorique 2%
2.tampon sodium phosphate 0,16 M pH 7,0
Points techniques
Études cinétiques = précision chronométrage concentrations/dilutions/volumes homogène température
Points techniques
ATCase - questions ?
aspartateCarbamyl phosphate carbamyla
spartate
ATCase
ATCase - graphique de Hill
log (V/Vmax-V) vs log [aspartate]
pente = nh
besoin de Vmax
Vmax historiquement déterminé à l’aide des graphiques "linéaires" de Lineweaver-Burk et d'Eadie-Hofstee
0.5 1.0 1.5
-3
-2
-1
0
1
2native+CTP+ATP
log [aspartate]
log
V/V
ma
x-V
ATCase - graphique de Hill
pour un enzyme allostérique, la courbe M+M est sigmoïde
Michaelis-Menten
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5Vmax
[aspartate] mM
Vit
esse
ATCase - graphique de Hill
alors, les graphiques linéaires (LB et EH) ne sont pas
Comment déterminer Km et Vmax ?
Lineweaver-Burk
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0
10
20
30
1/[aspartate] mM-1
1/V
Eadie-Hofstee
0.00 0.02 0.04 0.06 0.080.0
0.2
0.4
0.6
0.8
V/[aspartate] DO/mM
V
Régression non-linéaire ("Curve fitting")
logiciels puissants (Graphpad) utilise le formule MM pour les enzymes
allostériques et détermine Vmax, Kprime et nH pour que la courbe tracée suit les données
Régression non-linéaire ("Curve fitting")
Effecteurs allostériques
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5Série A (natif)Série B (+ CTP)Série C (+ ATP)
[aspartate] mM
DO
46
6
Effecteurs allostériques
0 10 20 300.0
0.5
1.0
1.5
[aspartate] mM
DO
46
6
native+CTP+ATP
GraphPad 6 - utilisation dans BCM311
présentation PowerPoint disponible sur le site internet du cours
régression linéaire (courbe standard) régression non-linéaire (Michaelis-Menten) comparaison de modèles (ex. MM vs sigmoïde)
Analyse des données - Excel
préparez une « super » tableau avec toutes les données AVANT de faire les graphiques pour une série (ex. Série A)
bien identifier les colonnes (unités etc.) copiez le tableau, changez les DO et tous les
calculs se fait automatiquement pour la 2e série
Analyse des données - Excel
Analyse des données - Excel
1 µM = 1 µmole/Lvolume de réaction = 2 ml = 2 x 10-3 L
Alors: µmole CA = µM x 2 x 10-3 L
Analyse des données - Excel
= µmoles CA / (0,5 hr X 0,1 ml)
Analyse des données - Excel
Analyse des données - ExcelSérie A
Série B
Cette semaine
nouvelle courbe standard chaque équipe analyse ses propres résultats analyse des résultats (graphiques MM) avec GraphPad en fin de journée (fichier à Will)
rapport à remettre dans 2 semaines