Post on 25-Feb-2020
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LEONARDO THIAGO DUARTE BARRETO NOBRE
FUCANA ATIVA VIA DAS MAP QUINASES E INIBE A
PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE OVÁRIO DE HAMSTER CHINÊS (CHO)
NATAL 2011
LEONARDO THIAGO DUARTE BARRETO NOBRE
FUCANA ATIVA VIA DAS MAP QUINASES E INIBE A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE OVÁRIO DE HAMSTER
CHINÊS (CHO)
NATAL 2011
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Nobre, Leonardo Thiago Duarte Barreto.
Fucana ativa via das map quinases e inibe a proliferação de células de ovário de hamster chinês (CHO) /
Leonardo Thiago Duarte Barreto Nobre. – Natal, RN, 2011.
83 f. : Il.
Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências.
Departamento de Bioquímica.
1. Polissacarídeos sulfatados – Dissertação 2. Fucoidan. 3. Câncer – Dissertação. I. Rocha, Hugo
Alexandre de Oliveira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 577.114.4
DEDICATÓRIA
À Deus por ter me presenteado com uma família tão
maravilhosa e me dar forças continuar nos momentos mais
díficeis!!
À meus pais por sempre acreditarem que sou capaz e se
orgulharem quando consigo conquistas importantes!!!
Agradecimentos
Mais uma vez a Deus por tudo que me deu e por tudo que me
permite lutar para conquistar!
Agradeço imensuravelmente a meus pais Barreto e Tânia por
tamanho apoio e fé em mim e por sempre estarem presentes
mesmo quando distantes...um dos momentos mais difíceis da
minha vida!! Obrigado Pai! Obrigado Mãe! Tudo que eu sou e
que conquistei devo a vocês!! Exemplo de vida sempre!!!
Agradeço aos meus irmãos Thalis, Andreza e Andréia por toda
a força e torcida que sempre demonstraram me ajudando
sempre e por todos os momentos de felicidade que me
proporcionaram!!!
Agradeço especialmente a uma pessoinha que muda
completamente meu humor pra melhor!! Amandinha o tio te
ama muito e mesmo quando você me atrapalha não me
deixando estudar pra brincar contigo você ao mesmo tempo me
ajuda proporcionando momentos únicos de felicidade!!O tio
querido lindo vai sentir muitas saudades enquanto estiver
longe, mas você sempre estará no meu coração!!!
Agradeço aos meus avós Lino e Vitória os únicos que tenho hoje
por seu apoio em todas as horas!!!
Agradeço imensamente as minhas tias Baia (também
madrinha) e Ivonete (Titia) por seu apoio incondicional!!
Vocês foram as minhas avós maternas já que não conheci
minha avó Flora. Amo muito vocês!!
Não poderia faltar aqui um agradecimento a Fofinha!! A gata
mais terrorista de todos os tempos por vários momentos de
diversão com seus lugares exóticos para dormir!
Agradeço a Prima, Cresy que me levaram para a Bioquímica e
por várias saídas e conversas importantes além do apoio!
Agradeço também aos demais amigos da Bioquímica: Virgínia,
Tici, Paulinha, Norberto, Celina, Monique, Thuane, Dayse,
Roberta, Fernanda e Raquel dentre outros que o cansaço me
impede de lembrar no momento!
Agradeço aos amigos do Biopol: Arthur, Cinthia, Daniel,
Dayanne,Fernando, Gabriel, Hugo, Ivan, Jailma, Joanna,
Kaline, Karol, Leandro, Letícia, Mariana, Moacir, Nednaldo,
Pablo, Rafael, Raniere, Roni, Sara,Vinícius e Ruth! Em especial
aos mais antigos Ivan (desde a arca de Noé), Leandro (o
tirador de onda), Sara e Mariana (sempre um nome composto),
Jailma (contemporânea de entrada no laboratório e
especialista em assuntos do Microsoft Office) e Nednaldo ou seus
incontáveis apelidos sendo um pilar de referencia dentro do
laboratório! Obrigado a todos pelos ensinamentos e pela
oportunidade de ensiná-los o pouco que sei!! Gostaria de
descrever um pouco de cada um, mas como sabem algumas
informações devem ficar somente nos bastidores!!!
Agradecimento especial não poderia faltar a Rafael
(Magoel) por sua ajuda e apoio nos momentos científicos e
alcoólicos!!! A Ruth ou seus inúmeros apelidos que não posso
citar aqui pela ajuda (sem muito valor!Haha!) prestada nesse
trabalho e pelas conversas sem nenhum cunho científico! E
principalmente pela grande amizade que nós três temos nesses
últimos anos!!Obrigado por me terem como amigo e mesmo a
distância terem me dado tanto apoio!! Vocês também têm
muita sorte em me ter como amigo!!kkkkkk (Sou Phoda)
Aos amigos da turma de mestrado!! Em epecial a Luciana que
até antes do mestrado era uma simples estranha e depois passou
a ser uma figura altamente inoxidável na minha vida!!Muito
obrigado pelo apoio nos momentos de conversas
pabulatórias!!!kkkk
Agradeço também a Jana por ser a grande companheira das
madrugadas no MSN!! O seu apoio mesmo à distância me
ajudou muito!!
Agradeço também a Rominne pelo apoio que sempre me deu! O
fim de um relacionamento não significou o fim de uma
amizade!Obrigado pelo apoio desde o início de tudo!
Agradeço aos professores do Departamento pelos seus
ensinamentos!! Em especial agradeço aos professores da banca
de qualificação: Profa. Adeliana, Profa. Naissandra e Prof.
Carlos Eduardo.
Agradeço aos meus grandes amigos Wladimir e Matheus que
sempre estiveram presentes!!! Vocês são os CARAS!!!
Agradeço aos amigos de São Paulo!!! Impossível nomear todos
aqui, mas cito alguns: Valquíria e Edgar que me ajudaram
imensamente desde o início de minha estadia no INFAR!!
Amigos que fizeram a permanência longe de casa mais fácil
como: Thaís, Rafael, Aninha, Gigi, Tarsis, Vivien, Gabriel, Dayse,
Sheyla, Marcelly, Guilherme, Lívia, todas as Carois (não lembro
todos os sobrenomes), enfim, a todos do INFAR que fizeram parte
dessa jornada!!
Agradeço aqui também aos amigos de fora do INFAR que foram
importantes no momento em que estive longe da família!!
Agradeço especialmente aqui aos companheiros de lar que tive
em terras distantes!! Marcelo, Duda e Renan vocês me
receberam e me fizeram sentir-me em casa!! Duda e Marcelo
que abriram as portas pra um cara não muito silencioso
enquanto dorme quanto eu...Agradeço muito aos dois!!
Agradeço especialmente a Renan e Duda também por terem me
apresentado outros amigos e pelas inúmeras ocorrências
alcoólicas!!!Não que eu beba!!Longe de mim!! Só em dia de
feira!! Renan obrigado por abrir as portas de sua casa e me
permitir conhecer sua família! Com certeza me senti mais em
casa!! Obrigado caras!!Vocês são F..!!!!
Agradeço a um grande amigo dos últimos anos Popó pelas
conversas de futuro e as sem futuro!! Por proporcionar a trilha
sonora do laboratório nos finais de semana!!E principalmente
por ter me apresentado a Piaccelo (a pizza explosão de sabor)!!
Obrigado por tudo meu amigo!!
Agradeço imensamente a Profa. Helena Nader por me receber
no INFAR com toda a estrutura que possibilitou grande parte
desse trabalho ser realizado!! Um exemplo de pesquisadora a ser
seguido!! Obrigado também por me receber como um aluno de
doutorado!!
Faltam até palavras para agradecer a um orientador-amigo
como Hugo!!! O seu apoio e ensinamento durante todos esses
anos de BIOPOL foram extremamente importantes para minha
formação!!! As conversas não científicas, as pedaladas, o
paintball, enfim, todos os momentos que você nos proporciona
na sua companhia fora do laboratório também são
extremamente importantes para nossa formação!!! Não se
preocupe estou indo para longe, mas espero contar sempre com
sua ajuda, apoio e conselhos, como amigo e grande
pesquisador!! Obrigado por me deixar fazer parte do BIOPOL!!
Grandes anos da minha vida passei dentro desse laboratório,
pequeno, mas que cabe uma imensidão de idéias e amigos!!!
Agradeço por fim a todos aqueles que de forma direta ou
indireta fizeram parte dessa jornada! Pelos conselhos
científicos, pelas conversas de corredor, pelas saídas para fumar
(mesmo não fumando), com certeza tudo isso ajudou na minha
formação!!Obrigado!!
Agradeço a CAPES e CNPq que propiciaram os meios para que
esse trabalho fosse realizado!!!
Por fim, mas nunca menos importante, agradeço a mim!!!
Minha força de vontade, meus princípios, minha insistência
(ou teimosia), minha vontade de sempre lutar e nunca desistir
foram extremamente importantes para que esse trabalho fosse
realizado assim como todas as outras pessoas citadas
anteriormente!!Ahhh!!! A minha humildade também!!rsrsrsrs
Passar Bem!!!
“Não são as respostas que movem o mundo, são as perguntas!!!” (propaganda publicitária Canal Futura)
RESUMO
Fucana é um termo utilizado para denominar polissacarídeos sulfatados ricos em L-Fucose. As fucanas têm sido estudadas devido suas atividades farmacológicas: antitrombótica, antiproliferativa e antioxidante. Nós extraímos três frações de fucanas da alga Spatoglossum schröederi. Essas fucanas, denominadas de Fuc B 1, Fuc B 1.5 e Fuc B 2, apresentam uma composição muito similar como demonstrado pela eletroforese em gel de agarose, e conteúdo de açúcar e sulfato. O efeito antiproliferativo foi determinado pelas metodologias de MTT e BrdU em células CHO. O efeito na inibição da proliferação das três frações foi de cerca de 40%. Assim, procedemos somente com a Fuc B 2 devido seu maior rendimento. Não houve indicação de apoptose usando a marcação com anexina V-FITC/ Iodeto de Propídeo. Identificamos uma parada na fase G1 do ciclo celular. Os ensaios de western blotting mostraram que PKC, pFAK e pERK 1/2 são ativadas quando as células são tratadas com Fuc B. O tratamento com o inibidor de MAPK PD98059 aboliu o efeito da fucana. Esses efeitos indicam que a fucana age via ERK para inibir a proliferação das células. Palavras-Chaves: Polissacarídeos Sulfatados, Fucoidan, Câncer, Efeito Citostático, ERK
ABSTRACT
Fucan is a term used to denominate L-fucose rich sulfated polysaccharides. The fucans have been studied due their pharmacological activities like antithrombotic, antiproliferative and antioxidant. We have extracted three fucan fractions from the brown seaweed Spatoglossum schröederi. These fucans were denominated Fuc B 1, Fuc B 1.5 and Fuc B 2. The chemical analyzes show that the fucans have very similar composition as demonstrated by agarose electrophoresis gel, sugar and sulfate content. The antiproliferative effect was determined by MTT and BrdU methodologies in CHO cells. The inhibition of proliferation effect of the three fractions was about 40%. Therefore this we proceed just with the Fuc B 2 due the higher yield. There is no apoptosis indication using the anexin V/propidium iodide test. We found a cell cycle phase G1 arrest. The western blotting show that the PKC; pFAK; pERK 1/2 are activated when the cells were treated with fucans. The treatement with inhibitor of MAPK PD98059 extinguished the fucan effect. These results indicates that fucan act by the ERK pathway inducing the cell death.
Word Keys: Sulfated Polysaccharides, Fucoidan, Cancer, Cytostatic effect, ERK
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Lâmina de eletroforese em gel de agarose das fucanas A, B e C
da alga Spatoglossum schröederi...................................................
22
Figura 2. Estrutura proposta por Leite e colaboradores (1998) para a
fucana A da alga S. schröederi.......................................................
24
Figura 3. Estrutura proposta para a fucana B da alga S. schröederi
proposta por Rocha [2005]..............................................................
25
Figura 4. Interações entre célula e matriz extracelular................................... 31
Figura 5. Estrutura das subunidades da integrina, um receptor de
superfície para matriz extracelular..................................................
32
Figura 6. Via de sinalização da FAK em funções celulares normais e no
câncer............................................................................................
33
Figura 7. Alga marinha marrom Spatoglossum schröederi (C. Agardh)
KÜTZING.......................................................................................
36
Figura 8. Obtenção dos polissacarídeos sulfatados da alga S.
schröederi......................................................................................
41
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose das frações polissacarídicas........ 47
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose das frações obtidas na
cromatografia de troca iônica..........................................................
48
Figura 11. Espectroscopia de infravermelho das fucanas B obtidas da alga
Spatoglossum schröederi................................................................
50
Figura 12. Efeito das fucanas B obtidas da alga Spatoglossum schröederi na
viabilidade de diferentes células de ovário de Hamster chinês
tratadas por 24 h e avaliadas por MTT............................................
51
Figura 13. Efeito das fucanas obtidas da alga Spatoglossum schröederi na
proliferação de células CHO-K1 tratadas por 24h e analisadas
através da incorporação de BrdU....................................................
52
Figura 14. Efeito do sulfato na atividade antiproliferativa de Fuc B 2 e suas
derivadas dessulfatadas quimicamente por um período de 1h e
5h.....................................................................................................
53
Figura 15. Inibição da proliferação em células CHO-K1 tratadas com a
fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi e
diferentes concentrações de soro fetal bovino................................ 54
Figura 16. Inibição da proliferação das células CHO-K1 plaqueadas sobre
moléculas de matriz extracelular e tratadas com Fuc B 2 por
24h...................................................................................................
55
Figura 17. Expressão de pFAK por células CHO-K1 tratadas com Fuc B 2
por 12, 24 e 48h na concentração de 500 µg/mL............................
56
Figura 18. Expressão de PKC por células CHO-K1 tratadas por 12, 24 e 48h
com Fuc B 2 na concentreação de 500 µg/mL................................
57
Figura 19. Efeito da fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi
na proliferação de células CHO-K1 na ausência ou presença do
inibidor de PKC...............................................................................
58
Figura 20. Expressão de Ras por células CHO-K1 tratadas por 12, 24 e 48h
com Fuc B 2 na concentreação de 500 µg/mL................................
59
Figura 21. Expressão de pErk ½ por células CHO-K1 tratadas com Fuc B 2
por 12, 24 e 48h na concentração de 500 µg/mL............................
60
Figura 22. Efeito da fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi
na proliferação de células CHO-K1 na ausência ou presença do
inibidor de MEK1/2.........................................................................
61
Figura 23. Citometria de fluxo utilizando marcação com anexina V e iodeto
de Propídeo.....................................................................................
62
Figura 24. Análise do ciclo celular das células CHO-K1 tratadas com a
F2.0M..............................................................................................
63
Figura 25. Representação esquemática do mecanismo de ação proposto
para a fucana Fuc B, da alga Spatoglossum schröederi, exercer
seu efeito antiproliferativo em células CHO-K1...............................
70
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fucanas encontradas em algas marrons........................................ 21
Tabela 2. Atividades farmacológicas descritas de polissacarídeos
sulfatados extraídos de algas..........................................................
23
Tabela 3. Composição química parcial dos polissacarídeos sulfatados
obtidos da alga Spatoglossum schröederi.......................................
49
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
ATCC
BIOPOL
BrdU
CDKs
CETAVLON
CHO-K1
CHO-745
CS
DTT
EGTA
ERK
FAK
FITC
FN
Fuc A
Fuc B
Fuc C
GAGs
HL-60
HPLC
HS
HT-29
IP
IUPAC
JNK
MAPK
MEC
mg
mL
American Type Culture Collection
Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais da UFRN
Bromo-deoxi-uridina
Ciclinas dependentes de kinases
Brometo de cetiltrimetilamônio
Linhagem tumorigênica de ovário de hamster chinês
Linhagem mutante em xilosil-transferase de ovário de
hamster chinês
Condroitim sulfato
Ditiotreitol
Ácido etilenoglicol tetraacético
Kinase regulada por sinal extracelular
Quinase de adesão focal
Isotiocianato de Fluoresceína
Fibronectina
Fucana A
Fucana B
Fucana C
Glicosaminoglicanos
Células pro-mielocíticas humanas
Cromatografia líquida de alta performance
Heparam sulfato
Adenocarcinoma de cólon humano
Iodeto de propídio
União Internacional de Química Pura e Aplicada
c-Jun-N-Terminal Kinase
Proteína Quinase ativada por Mitógeno
Matriz extracelular
miligrama
Mililitro
MTT
nm
OMS
ON
PBS
PDA
PGs
PS
SFB
TBS
WHO
µg
µL
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
Nanômetro
Organização Mundial de Saúde
Óxido nítrico
Tampão Fosfato Salino
1,3 diamino propano acetato
Proteoglicanos
Polissacarídeos sulfatados
Soro fetal bovino
Tampão salino Tris
World Health Organization
Micrograma
Microlitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
1.1 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS 17
1.1.1 Fucanas 20
1.2 CÂNCER X MORTE CELULAR: UMA VISÃO GERAL 26
1.3 FUCANAS ANTIPROLIFERATIVAS 28
1.4 MATRIZ EXTRACELULAR 29
1.5 INTEGRINAS E SINALIZAÇÃO INTRACELULAR 31
2 OBJETIVOS 35
3 MATERIAIS E MÉTODOS 36
3.1 MATERIAIS 36
3.1.1 Material biológico 36
3.1.2 Linhagens celulares e cultura das células 37
3.1.3 Outros materiais 37
3.1.4 Aparelhos 38
3.2 MÉTODOS 39
3.2.1 Extração e purificação da fucana B 39
3.2.1.1 Obtenção do pó cetônico 39
3.2.1.2 Proteólise 39
3.2.1.3 Fracionamento com concentrações crescentes de acetona 40
3.2.1.4 Cromatografia em coluna de troca iônica 40
3.2.2 Caracterização química dos polissacarídeos obtidos 42
3.2.2.1 Eletroforese em gel de agarose 42
3.2.2.2 Composição monossacarídica 42
3.2.2.3 Dosagem de açúcares totais 42
3.2.2.4 Dosagem de sulfato 42
3.2.2.5 Dosagem de proteínas 43
3.2.2.6. Espectroscopia de infravermelho 43
3.2.3 Atividade antiproliferativa 43
3.2.3.1 MTT 43
3.2.3.2 Incorporação de bromo-deoxi-uridina (BrdU) 44
3.2.3.3 Marcação com Anexina V-FITC e iodeto de propídio 44
3.2.3.4 Western blotting 45
3.2.4 Dessulfatação dos polissacarídeos 46
3.2.5 Análise estatística 46
4 RESULTADOS 47
4.1 EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA
SPATOGLOSSUM SCHRÖEDERI 47
4.2 PURIFICAÇÃO DA FUCANA B POR CROMATOGRAFIA DE
TROCA-IÔNICA 48
4.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DAS FRAÇÕES DE FUC B 48
4.4 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO DAS FUCANAS 49
4.5 EFEITO ANTIPROLIFERATIVO DAS FUCANAS EM CÉLULAS CHO-K1
E CHO-745 50
4.6 AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIPROLIFERATIVO DE FUC B 2 EM CÉLU-
LAS CHO-K1 ATRAVÉS DA INCORPORAÇÃO DE BrdU 51
4.7 PARTICIPAÇÃO DOS GRUPOS SULFATO NA ATIVIDADE
ANTIPROLIFERATIVA DE FUC B 2 52
4.8 LOCALIZAÇÃO DO ALVO MOLECULAR RESPONSÁVEL PELA ATIVIDADE
ANTIPROLIFERATIVA DE FUCB 2 53
4.9 IDENTIFICAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO DA FUCANA 55
4.10 MARCAÇÃO UTILIZANDO ANEXINA V E IODETO DE PROPÍDEO 61
4.11 ANÁLISE DO CICLO CELULAR 62
5 DISCUSSÃO 64
6 CONCLUSÃO 71
7 REFERÊNCIAS 72
17
INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
1. INTRODUÇÃO
1.1 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS
Polissacarídeos sulfatados (PS) são polímeros de açúcar cujos resíduos
podem apresentar como substituinte o grupamento SO3 ligados covalentemente
ao oxigênio remanescente de uma hidroxila, o que leva a formação do grupo SO4
(sulfato). Em muitos casos a substituição pode ocorrer em mais de uma posição
no resíduo, originando os resíduos di ou trissulfatados, porém não há registros de
resíduos naturalmente tetrassulfatados. Há relatos de vários tipos de
monossacarídeos, sulfatados ou não, encontrados em PS, como fucose, xilose,
manose, glicose, arabinose, galactose (Li et al., 2008, Wijesekara et al., 2011),
glucosamina, ácidos urônicos (Nader et al., 2004). Estes resíduos podem ser
unidos pelos organismos para formarem homo e heteropolissacarídeos
sulfatados. Além disso, há relatos da presença de outros substituintes, além do
sulfato, como grupos acetis, aminos, piruvato (Farias et al., 2008, Wijesekara et
al., 2011). Estes fatores, em conjunto, fazem dos PS moléculas muito complexas,
o que dificulta a proposta de estruturas destes compostos, mas por outro lado dá
aos PS um grande potencial farmacológico e biotecnológico (Rocha 1998, Rocha
et al., 2001).
Apesar dos polissacarídeos serem encontrados na quase totalidade dos
seres vivos da Terra, os PS apresentam uma distribuição mais restrita. Eles são
encontrados em todas as espécies de animais, desde esponjas até humanos
(Medeiros et al., 2000); e de algas marinhas (Jiao et al., 2011; Rocha et al.,
2006). Todavia, em outros grupos de seres vivos há raros relatos de sua
presença. Como por exemplo, há o registro da presença de PS em apenas sete
espécies de vegetais, sendo três vegetais de origem marinha (Aquino et al. 2005,
Costa, 2008), três macrófitas de ambiente dulcícola (Dantas, 2007) e um de
origem terrestre (Choosawad et al., 2005).
Em animais, os principais PS encontrados são denominados de
glicosaminoglicanos devido ao fato de apresentarem, na sua estrutura resíduos
de açucares aminados (glucosamina ou galactosamina). São descritos como
glicosaminoglicanos os seguintes polissacarídeos: heparan sulfato, queratan
sulfato, heparina, dermatan sulfato, condroitim sulfato, ácido hialurônico (Nader te
18
INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
al., 2004) e acharan sulfato, este último descrito apenas no molusco Achatina
fulica (Park et al., 2008).
Os glicosaminoglicanos, com exceção do ácido hialurônico e do acharan,
aparecem unidos covalentemente a um esqueleto protéico, formando moléculas
denominadas proteoglicanos (PGs). Estes são glicoconjugados encontrados
intracelularmente em grânulos secretórios, na superfície celular, matriz
extracelular e membrana basal. Os proteoglicanos são, portanto, compostos de
alta massa molecular, formados por um esqueleto protéico ao qual se ligam
covalentemente, cadeias de glicosaminoglicanos e oligossacarídeos N- e/ou O-
ligados (Bernfield et al., 1999).
A atividade biológica de cada proteoglicano depende das propriedades do
seu esqueleto protéico, da estrutura química do(s) glicosaminoglicano(s)
covalentemente ligado(s) e sua localização. Os PGs desempenham importantes
papéis biológicos, entretanto são as cadeias de GAGs que determinam a função
dessa classe de moléculas (Teocharis et al., 2010).
O estudo de suas funções biológicas utilizando animais transgênicos tem
indicado que certos proteoglicanos são essenciais para a vida (Teocharis et al.,
2010). Atualmente, são conhecidos mais de 30 tipos diferentes de proteoglicanos,
os quais exercem uma grande variedade de funções biológicas, tais como:
organização de tecido; crescimento celular; maturação de tecidos especializados;
têm um importante papel na formação e permeabilidade de membrana;
modulação da atividade de determinados fatores de crescimento; regulação da
hidrólise de colágeno; crescimento e invasão tumoral; adesão, proliferação,
diferenciação e migração celular; alterações morfológicas durante o
desenvolvimento, remodelagem e mudanças ocorridas durante o ciclo celular;
transparência da córnea; crescimento de neuritos; bem como em patologias
cardiovasculares, diabetes, doenças amilóides, mucopolissacaridoses e
interações com patógenos; entre outras funções. (Teocharis et al., 2010).
Os polissacarídeos de algas se localizam na matriz mucilagenosa desses
organismos e sua função biológica parece estar relacionada com a proteção
contra desidratação solar em períodos de baixa maré. Além disso, oferece uma
maior flexibilidade à alga, permitindo assim, o seu crescimento em ambiente
aquático, e uma rigidez suficiente para permanecer estendida e assim captar a luz
e os nutrientes com mais eficácia (Percival & McDowell, 1967). Recentemente, foi
19
INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
proposto que a presença dos PS em algas também seria uma forma de
adaptação destes organismos ao ambiente marinho, ao stress salino, já que eles
não são encontrados em vegetais terrestres, salvo algumas exceções (Aquino,
Gravitol & Mourão, 2011).
As estruturas dos PS de algas marinhas variam de acordo com cada
espécie, além disso, algumas espécies sintetizam mais de um tipo de PS (Dietrich
et al., 1995; Li et al.,2008, Bilan et al., 2002, Jiao et al., 2011). Vale salientar
também que cada um dos três grandes grupos de macroalgas sintetiza um grupo
peculiar de polissacarídeos que lhes são inerentes.
Nas algas vermelhas encontram-se agaranas, carragenanas e outros tipos
de galactanas sulfatadas. Porém, há alguns raros relatos da presença de outros
tipos de polissacarídeos sulfatados que podem ser encontrados nas algas
vermelhas como xilomananas sulfatadas (Cardoso et al., 2007) e
glucogalactomanana sulfatada (Lim & Ryu 2009). Estes polissacarídeos
geralmente são utilizados pela indústria alimentícia e cosmética, principalmente
devido a suas propriedades espessantes e gelificantes. Todavia, existem vários
relatos na literatura sobre atividades farmacológicas atribuídas a galactanas de
algas vermelhas como antiviral (Huheihel et al., 2002; Zhou et al., 2004),
antiparasitária (Adams et al., 2005), antiinflamatória (Zvyagintseva et al., 2000) e
bactericida (Medina, 2001).
Os polissacarídeos sulfatados de algas verdes são ricos em galactose,
manose, xilose, glicose, arabinose e/ou ácidos urônicos (Matsubara, 2004), porém
já foram descritos homopolissacarídeos como arabinanas (Hayakawa et al., 2000)
e galactanas (Farias et al., 2008). Sua importância farmacológica foi evidenciada
por se ter verificado as atividades antiviral, anticoagulante e antitumoral,
entretanto, o número de trabalhos realizados com estes polissacarídeos ainda é
pequeno quando comparado com aqueles descritos para PS de outras algas.
Ultimamente, vários trabalhos têm relatado a estrutura molecular de
polissacarídeos de algas verdes, o que poderá facilitar a elucidação dos
mecanismos de ação destes compostos, bem como a relação atividade/estrutura
(Bilan et al., 2007; Farias et al., 2008; Lahaye & Robic, 2007).
As algas marrons sintetizam homo e heteropolímeros que apresentam na
sua composição L-fucose sulfatada. As fucanas são os PS de algas mais
estudados (Pomin, 2010).
20
INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
1.1.1 Fucanas
O termo fucana pode ser utilizado para definir um polissacarídeo que
apresenta na sua composição L-fucose sulfatada (Rocha et al., 2006, Almeida-
Lima et al., 2010). Devido à existência de homo e heterofucanas a IUPAC
recomenda que o termo fucana seja utilizado para definir uma molécula que
contem mais de 90% de fucose, já aqueles polímeros que contém menos de 90%
de fucose sejam denominados de fucoidan (Berteau & Mulloy, 2003). Contudo, a
questão de nomenclatura das fucanas ainda não está totalmente definida. Um
exemplo clássico é o de homofucanas extraídas da alga Fucus vesiculosus, que
devido ao nome da alga são chamadas de fucoidans (Jiao et al., 2011).
Além das algas marrons as fucanas também foram encontradas na camada
de geléia de ovos de ouriços do mar e também da parede do corpo de pepinos do
mar (Pomin, 2010).
Estes polissacarídeos foram primeiramente isolados de algas marinhas no
início do século XX (Berteau & Mulloy, 2003). A fucana mais estudada e
comumente utilizada é o fucoidan de Fucus vesiculosus a qual é comercializado
há décadas e que teve sua estrutura caracterizada inicialmente por Percival e
Ross (1950), porém foi reavaliada por Patankar e col. (1993). Fucanas foram
descritas em diversas ordens de algas marinhas pardas como, por exemplo,
Dictyotales, Fucales, Laminariales, Chordariales, Ectocarpales (Tabela 1).
Fucanas encontram-se presentes em todas as algas pardas até agora estudadas.
Por outro lado não são encontradas nos demais grupos de algas marinhas como
algas verdes e vermelhas (Rocha et al.,2006).
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INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Tabela 1. Fucanas encontradas em algas marrons
Ordem Gênero Fucanas xilofucoglucuronanas Glucuronogalactofucanas
e/ou glucuronofucogalactanas
Ectocarpales Ectocarpus + Sorocarpos + +
Chordariales Chorda + + Heterochordaria + Leathesia + Nemacystus + Sphaerotrichia + Tinocladia +
Desmerestiales Desmarestia + + + Dictyosiphonales Asperococcus + Seytosiphonales Colpomenia +
Scytosiphon + + Sphacelariales Stypocaulon + Dictyotales Canistrocarpus + +
Dictyopeteris + + Dictyota + Lobophora + + Padina + + Taonia +
Spatoglossum + + Laminariales Alaria +
Ecklonia + Eisenia + + Kjellmaniella + + Laminaria + Lessonia + + Macrocystis + Nereocystis + Undaria + + Ascophyllum + + +
Fucales Bifurcaria + + Fucus + + Halidrys + Himanthalia + + Hizikia + Pelvetia + + Sargassum + + Turbinaria + +
Modificada a partir Kloareg & Quatrano (1988)
O grupo em que está inserido este trabalho tem estudado a presença de
fucanas em diversas espécies de algas marrons encontradas no litoral do Rio
Grande do Norte. A metodologia utilizada combina precipitação com solvente
apolar, cromatografia de troca iônica, gel filtração e eletroforese em gel de
agarose com tampão 1,3 diaminoacetato (Dietrich et al., 1995; Leite et al., 1998;
Rocha et al., 2005). Assim, se confirmou que todas as algas até agora estudadas
sintetizam mais de um tipo de fucana e que estas apresentam mobilidades
diferentes em gel de agarose. Atualmente, estas fucanas são denominadas de
acordo com sua mobilidade eletroforética: fucana A (menor mobilidade), fucana B
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INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
(mobilidade intermediária) e fucana C (maior mobilidade) (Rocha et al., 2005). Na
figura 1 observam-se as três fucanas sintetizadas pela alga Spatoglossum
schröederi.
Figura 1. Lâmina de eletroforese em gel de agarose das fucanas A, B e C da alga
Spatoglossum schröederi. Foram aplicados 50 µg de cada fucana e após a corrida foram
coradas com azul de toluidina. Fuc A – fucana A; Fuc B – fucana B; Fuc C - fucana C. Fonte: Hugo
A O Rocha (Rocha, 2002)
As fucanas são os PS de origem não animal mais estudados (Pomin, 2010)
devido ao seu grande potencial farmacológico. Na Tabela 2 têm-se resumo de
algumas das atividades atribuídas as fucanas.
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INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Tabela 2. Atividades farmacológicas descritas de polissacarídeos sulfatados extraídos de algas.
Atividade Alga Referência
Anti-adesiva S. schröederi, Ascophyllum nodosum (Rocha, Franco et al., 2001), (Liu et
al., 2005) Anti-adipogênica Fucus vesiculosos (Kim, K. J., Lee, O. H. et al., 2010)
Anti-angiogênica F. vesiculosos, A nodosum, (Cumashi, Ushakova et al., 2007)
Anticoagulante Dictyota menstrualis, Laminaria japônica, Canistrocarpus cervicornis, F. vesiculosus
(Albuquerque, Queiroz et al., 2004); (Wang, Zhang et al., 2010); (Câmara, Costa et al., 2011) (Azevedo et al., 2009)
Anticomplemento A. nodosum, Laminaria cichorioides (Tissot e Daniel, 2003); (Zvyagintseva, Shevchenko et al., 2000)
Anti-inflamatória Laminaria saccharina, Fucus evanescens, Lobophora variegata, F. vesiuclosus
(Cumashi, Ushakova et al., 2007) (Cardoso et al., 2010)(Medeiros et al., 2007)
Antimetastática F. vesiculosos (Coombe, Parish et al., 1987)
Antioxidante L. variegata, Padina gymnospora, C. cervicornis, Dictyoperis delicatula, Sargassum filipendula
(Olalye & Rocha, 2007; Paiva et al., 2011;Câmara et al., 2011; Magalhães et al., 2011; Costa et al., 2011)
Antiproliferativa C. okamuranus, F. vesiculosos, S. filipendula, D. delicatula
(Teruya, Konishi et al., 2007); (Yamasaki-Miyamoto, Yamasaki et al., 2009)(Magalhães et al., 2011; Costa et al., 2011)
Antitrombótica S. schröederi (Leite, Medeiros et al., 1998), (Barroso
et al., 2008)
Antitumoral Sargassum stenophillum, F. vesiculosos
(Dias, Siqueira et al., 2005); (Zhou, Sun et al., 2004); (Kim, K. J., Lee, O. H. et al., 2010)
Anti-úlcera F. vesiculosos (Shibata, 2003)
Antiviral (HIV, Dengue 2, HSV 1 e 2)
C. okamuranu, Cystoseira indica (Hidari, Takahashi et al., 2008); (Mandal, Mateu et al., 2007)
Estimulo da síntese de heparan sulfato
S. schröederi (Rocha et al., 2005); (Rocha, Bezerra et al., 2005)
Hepatoprotetora F. vesiculosos (Hayashi, Itoh et al., 2008)
Proliferativa Capsosiphon fulvescens, A. nodosum
(Go, Hwang et al., 2010); (Jiang, Okimura et al., 2010)
Adaptado de ROCHA (2006)
Apesar deste grande número de atividades atribuídas as fucanas, os
estudos estruturais não caminham na mesma velocidade. Parte deste problema
existe devido à complexidade estrutural que as fucanas apresentam, e ainda,
devido a pouca capacidade que as técnicas existentes atualmente têm para
elucidar as estruturas das fucanas (Li et al., 2008). Apesar disto as estruturas das
fucanas A e B de S. schröederi foram propostas (Leite et al., 1998; Rocha et al.,
2005).
A fucana A de S. schröederi é uma molécula de 21 kDa, é composta por
um esqueleto de ácido glucurônico unidos por ligações β(1-3), com ramificações
em C-4 formadas por trissacarídeos de fucose unidos por ligações α(1-3). A
maioria dos resíduos de fucose geralmente é substituída em C-4 com
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grupamentos sulfato, e algumas ainda são substituídas em C-2 por dissacarídeos
de xilose unidos por ligações β(1-4). 50 % das xiloses são sulfatadas. A estrutura
proposta para a Fuc A está representada na figura 2. Essa fucana A apresenta
uma baixa atividade anticoagulante, entretanto possui efeito antitrombótico in vivo
(Barroso et al., 2008). Foi proposto que esta atividade estava relacionada com a
capacidade desta fucana em estimular células endoteliais a sintetizarem heparam
sulfato (Leite et al.,1998). Além disso, foi demonstrado que essa fucana não
apresenta potencial genotóxico ou mutagênico (Almeida-lima, 2010).
Figura 2. Estrutura proposta por Leite e colaboradores (1998) para a fucana A da alga S.
schröederi.
A fucana B por sua vez, trata-se de uma xilogalactofucana de 21,5kDa
composta por um esqueleto de galactoses unidas por ligações β(1-4), sendo que
50 % delas encontra-se sulfatada em C-3. Há ramificações em 25% dos resíduos
de galactose, e estes são compostos por fucoses unidas por ligações α(1-4)
ligadas e sulfatadas em C-3, no terminal não redutor encontram-se um ou dois
resíduos de xilose não sulfatada (figura 3). Essa fucana também apresenta efeito
antitrombótico in vivo, embora não apresente atividade anticoagulante (Rocha et
al., 2005).
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INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 3. Estrutura proposta para a fucana B da alga S. schröederi proposta por Rocha
[2005]
Estudos com células também foram realizados com esta fucana. Nesses
estudos, utilizou-se as linhagens de ovário de Hamster chinês CHO-K1
(selvagem) e CHO-745 (mutante). Ambas as linhagens celulares, selvagem e
mutante, mostraram-se tumorigênicas quando inoculadas na parede abdominal de
camundongos (Esko et al., 1988; Lebaron et al., 1988). O mutante CHO-745 é
deficiente na enzima xilosiltransferase, enzima que incorpora a xilose ao resíduo
de serina do “core” protéico de proteoglicanos (PG), sendo esse o primeiro passo
para a biossíntese de glicosaminoglicanos (GAGS). Assim, a síntese de heparam
sulfato (HS) e condroitim sulfato (CS) pelas CHO-745 é deficiente, sendo ela
capaz de sintetizar apenas 5 % da quantidade dos GAGS sintetizados pela CHO
selvagem (Esko, 1991). Devido a tais diferenças, estas se apresentaram como
ferramentas interessantes para se avaliar o potencial efeito de compostos na
adesão celular, pois se há similaridade da potencialidade antiadesiva do
composto nas duas linhagens isto exclui de imediato a possibilidade de observar
um simples efeito de repulsão de cargas, e indica a existência de sítios
específicos para o composto exercer seu efeito. Os estudos com estas células e a
Fuc B mostram que a fucana inibe a adesão celular. Também foi observado que
quando a Fuc B foi biotinilada e utilizada como sonda fluorescente se identificou
que o alvo molecular de Fuc B se encontrava na matriz extracelular (Rocha et al.,
2005).
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INTRODUÇÃO
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1.2 CÂNCER X MORTE CELULAR: UMA VISÃO GERAL
Segundo dados da OMS (Organização Mundial de Saúde) em 2008 três
diferentes tipos de câncer (carcinoma broncopulmonar, carcinoma colo-retal e
câncer de mama) estavam entre as dez principais causas de morte nos países
desenvolvidos (WHO, 2008). Câncer é o termo utilizado para definir neoplasias,
células que proliferam de maneira anormal, malignas (King e Robins, 2006). Para
uma neoplasia, também chamada de tumor, ser considerada um câncer é
necessário que suas células tenham habilidade para invadir os tecidos adjacentes
(Alberts, Wilson et al., 2008). Essa doença é caracterizada como um processo
envolvendo três estágios diferentes: iniciação, proliferação e progressão (Rocha,
2011). A iniciação do tumor requer vários fatores que irão influenciar diretamente
na promoção do mesmo, ou seja, o crescimento desse tumor através da
proliferação das células alteradas. Durante a progressão do tumor há uma
seleção entre as células tumorais com a capacidade de crescer mais
agressivamente (Lewin, 2004). A progressão é responsável pela metástase,
caracterizada pela invasão de outros tecidos do organismo por células do tumor
original. Atualmente, o prognóstico de um câncer é preferencialmente
determinado pela progressão da metástase do câncer do que pelo tumor primário
propriamente dito (Zhu, Liu et al., 2010). Esse prognóstico também é influenciado
pelo tipo de resposta do paciente aos tratamentos utilizados e principalmente se
não há resistência a esses tratamentos. As principais terapias utilizadas no
combate ao câncer envolvem o ataque direto as células tumorais e menos
comumente a o uso de imunoestimulantes (Boon, 1993). O ataque ao tumor pode
ocorrer através de remoção cirúrgica, uso de radioterapia, e principalmente, uso
de quimioterápicos altamente tóxicos. Muitos desses fármacos apresentam
mínimos benefícios à sobrevivência do paciente, incluindo variados fatores como
resistência ao medicamento, efeitos colaterais além da elevada toxicidade
(Macdonald e Astrow, 2001; Rabik e Dolan, 2007). A grande busca dos centros de
pesquisa contra o câncer foca no problema de como promover a morte seletiva
das células cancerígenas (Fentiman, 1991; Pastan & Fitzgerald, 1991; Kim et al.,
2010).
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INTRODUÇÃO
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Nos últimos anos os compostos derivados de fontes naturais têm sido foco
de considerável atenção dos pesquisadores que procuram desenvolver agentes
terapêuticos para o combate ao câncer, devido à ausência de toxicidade que
esses compostos geralmente apresentam (Yamasaki-Miyamoto, Yamasaki et al.,
2009; Jin, Song et al., 2010). Um dos objetivos é encontrar compostos que
promovam a indução da apoptose ou parada do ciclo celular em células tumorais.
Uma das marcantes características do câncer é a inibição da apoptose, uma via
de suicídio celular universal e eficiente (Hanahan e Weinberg, 2000). O bloqueio
da morte celular programada, apoptose, contribui para o crescimento do tumor,
promove a progressão neoplásica e a resistência a agentes citotóxicos anticâncer
(Bedi, Pasricha et al., 1995). A apoptose pode ocorrer por duas vias principais
conhecidas como: Via Intrínseca ou via mitocondrial e a via extrínseca ou via dos
receptores de morte. A via intrínseca pode ser ativada por uma variedade de
estímulos apoptóticos que levam a mitocôndria liberar o citocromo c para o
citoplasma. As duas vias convergem para ativação da caspase 3 e
subseqüentemente na ativação de outras proteases e nucleases que coordenam
os eventos terminais da apoptose (Yamasaki-Miyamoto, Yamasaki et al., 2009;
Jin, Song et al., 2010; Kim, Park et al., 2010). A via extrínseca, por sua vez, é
ativada através da ligação de ligantes indutores de morte aos respectivos
receptores presentes na superfície celular o que desencadeia todo um processo
com ativação de outros mensageiros no interior da célula culminando na morte
celular. Outra forma de interromper a progressão do crescimento de tumores é
através da parada do ciclo celular das células cancerígenas. Existem vários
fatores relacionados à progressão ou parada do ciclo de uma célula. Dentre esses
fatores podem-se destacar os checkpoints que nada mais são do que pontos
específicos durante o ciclo celular em que a célula realiza uma checagem de sua
maquinaria e material genético para poder prosseguir para a próxima fase (Alberts
et al., 2008). Existem várias vias associadas ao controle da progressão do ciclo
celular. Uma das mais conhecidas e estudadas é a via da MAPK (Mitogen-
Activated Protein Kinase) que abrange proteínas como a MEK (Mitogen-Activated
Proteín Kinase Kinase), ERK (Extracellular Signal-Regulated Kinase) e JNK (c-
Jun N-terminal kinase) (Jin et al., 2010; Kim et al., 2010; Wei, Xie et al., 2010).
Outras proteínas estão também diretamente envolvidas como as ciclinas e as
ciclinas dependentes de kinases, conhecidas como CDKs, que se associam para
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INTRODUÇÃO
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controlar a progressão do ciclo celular (Braun, Holzl et al., 1998; Wei, Xie et al.,
2010). Em linhas gerais, o destino de uma célula é dependente de estímulos
internos e externos que afetem sua integridade e que podem levar a uma parada
total da progressão do seu ciclo celular assim como também pode culminar no
processo apoptótico.
1.3 FUCANAS ANTIPROLIFERATIVAS
O efeito antiproliferativo “in vitro” de fucanas frente a diversas linhagens
tumorais já vem sendo estudado há um longo tempo. Como, por exemplo, pode-
se citar o efeito antiproliferativo de fucanas frente a células oriundas de carcinoma
broncopulmonar (Riou, Colliec-Jouault et al., 1996), hepatoma (Nagamine,
Hayakawa et al., 2009), carcinoma de Ehrlich (Zhuang, Itoh et al., 1995),
adenocarcinoma de mama (Yamasaki-Miyamoto, Yamasaki et al., 2009),
carcinoma de cervix uterino (Costa, Telles et al., 2011), leucemia (Jin, Song et al.,
2010), câncer de colo retal (Kim, Park et al., 2010) e linfoma (Aisa, Miyakawa et
al., 2005). Sua ação sobre a proliferação celular ocorre principalmente por duas
maneiras: promove parada do ciclo celular e/ou induz morte celular, Porém os
estudos aqui citados mostram que esse efeito antiproliferativo se dá devido a uma
ação direta das fucanas. Relata-se também que para que esses PS
desempenhem seus efeitos nas células o teor de sulfato presente em suas
moléculas é de importância crucial (Koyanagi, Tanigawa et al., 2003; Haroun-
Bouhedja, Ellouali et al., 2000)
A fucana mais estudada com relação ao seu mecanismo de ação
antiproliferativo é a fucana de F. vesiculosus conhecida como fucoidan. Este PS
promove a ativação de caspase-3, o que consequentemente induz apoptose de
células de linfoma humano (HS-sultan cells). Contudo, quando estas células
foram incubadas com fucoidan e um inibidor de caspases concomitantemente,
observou-se que o efeito do fucoidan foi parcialmente anulado. Os autores
mostraram que o fucoidan não afetava a via da p38 quinase e da AKT, mas
diminuía a fosforilação de ERK (Extracellular Regulated-Kinase) e que este efeito
também levava as células entrarem em apoptose (Aisa et al., 2005). Quando este
fucoidan de F. vesiculosus foi avaliado com células de carcinoma de colo humano
(HCT-15), observou-se que também estimulava apoptose nas HCT-15 por ativar
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caspases. Contudo, nestas células o fucoidan, ao contrario do visto
anteriormente, aumentava a fosforilação de ERK e de p38 quinase e bloqueava a
via da PI3K/AKT. Os dados mostraram que este efeito era responsável pela
atividade antiproliferativa do fucoidan (Hyun, Kim et al., 2009). Já quando o
mecanismo antiproliferativo deste mesmo fucoidan foi avaliado em células pro-
mielocíticas humanas (HL60), verificou-se que além de ativar as caspases e
aumentar os níveis de fosforilação de ERK, o efeito antiproliferativo do fucoidan
também era dependente do aumento da produção de Óxido Nítrico (ON) e da
diminuição dos níveis de glutationa citoplasmáticos (Jin et al., 2010). Por outro
lado, em células de câncer de colo humano (HT-29), o fucoidan não modificou os
níveis de fosforilação de ERK, porém verificou-se que o fucoidan ativava
caspases, promovia a liberação de fatores mitocondriais pró-apoptóticos
(citocromo C e Smac/Diablo) para o citoplasma e aumentava os níveis de “death
receptor 5 proteins”. Em suma, o mecanismo antiproliferativo do fucoidan nas
células HT-29 é mediado por duas vias: a via mitocondrial (intrínseca) e a via
ativada por receptores de morte (extrínseca) (Kim et al., 2010).
Ainda não se conhecem todos os mecanismos intracelulares que as
fucanas usam para desempenhar suas atividades antiproliferativas. O motivo
principal é a sua diversidade estrutural e o fato desses polissacarídeos poderem
se associar a uma gama de moléculas. Contudo, parece que esse efeito
antiproliferativo não é somente dependente do sulfato presente nas fucanas, mas
também da distribuição desses grupamentos na molécula (Li et al., 2008;
Wijesekara et al., 2011), uma vez que algumas delas não apresentaram efeito
frente algumas linhagens de células tumorais, apesar de serem sulfatadas,
enquanto que outras fucanas se mostraram bastante eficazes (Ellouali et al.,
1993).
Apesar das fucanas apresentarem atividade antiproliferativa em diferentes
tipos celulares e em alguns casos existir semelhança entre os seus mecanismos
de ação, a maioria dos trabalhos existentes na literatura utilizaram o fucoidan de
F. vesiculosus e devido às diferenças estruturais esse mecanismo de ação não
pode ser generalizado para fucanas presentes em outras espécies de algas.
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INTRODUÇÃO
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1.4 MATRIZ EXTRACELULAR
A matriz extracelular (MEC) é uma rede intrincada de macromoléculas que
preenchem o volume de um tecido ou órgão no espaço extracelular. Essa matriz é
composta por uma variedade de proteínas versáteis e polissacarídeos que são
secretados localmente e montados em uma organizada rede em uma íntima
associação com a superfície das células que a produz. A matriz extracelular é
produzida pelas células epiteliais e outras células estromais encontradas na
própria matriz como, por exemplo, fibroblastos. Cada tipo de tecido possui uma
matriz extracelular característica com relativas quantidades de cada tipo de
moléculas de matriz. Essa variação dá origem a uma diversidade de estruturas
adaptadas para a função de cada tecido específicamente (Alberts et al., 2008)
Para que as células desempenhem normalmente suas funções, precisam
estar apropriadamente suportadas, estabelecendo contato com as células
vizinhas e/ou com a matriz extracelular. A MEC provém muito do suporte
estrutural disponível para as células parenquimais nos tecidos. A proteína
primária presente na matriz é o colágeno, uma proteína estrutural helicoidal com
cerca de 30 tipos (Kim et al., 2011). A função primária do colágeno é agir como
suporte estrutural com regiões de ligação a outras proteínas da MEC. Juntamente
com o colágeno a elastina é a principal proteína estrutural da matriz extracelular
(Kielty, Sherratt et al., 2002). Esta proteína responde pela flexibilidade inerente a
diversos tecidos. A MEC contém também algumas proteínas adesivas que
possuem múltiplos domínios, cada uma com sítios específicos de ligação para
outras macromoléculas de superfície e para receptores de superfície celular.
Assim, essas proteínas assim contribuem para a organização da matriz e auxiliam
na adesão das células. A mais bem caracterizada dessas proteínas é a
fibronectina (FN). Esta é uma glicoproteína encontrada em todos os vertebrados.
A FN é um dímero composta de duas imensas subunidades unidas por um par de
pontes dissulfeto (Lehninger et al., 2008; Alberts et al., 2008). A fibronectina
participa diretamente da adesão celular, migração, invasão e sobrevivência
celular através da ligação aos receptores de membrana conhecidos como
integrinas (Kamarajan & Kapila, 2007).
O principal tipo de comunicação entre as células e as moléculas da matriz
extracelular ocorre através da ligação dessas moléculas às integrinas presentes
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INTRODUÇÃO
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na superfície celular como mostrado na figura 4 (Alberts et al., 2008; Zhao &
Guan, 2009). Essa comunicação é responsável pela exposição da célula a fatores
que resultarão em proliferação celular, diferenciação ou parada no crescimento
dependendo do repertório de integrinas que foi ativado assim como a constituição
da matriz extracelular a qual aderiu. Entretanto a natureza desses sinais integrina-
específicos e o mecanismo pelo qual está acoplado a maquinaria celular ainda
não é completamente compreendido (Mettouchi et al., 2001).
Figura 4. Interações entre célula e matriz extracelular. A associação entre células e proteoglicanos da matriz extracelular é mediada pela proteína de membrana (Integrina) e pela proteína da matriz (fibronectina neste exemplo). Adaptado de Lehninger (2005).
1.5 INTEGRINAS E SINALIZAÇÃO INTRACELULAR
A família das integrinas é a maior classe de mediadores da adesão da
célula à matriz extracelular compreendendo proteínas heterodiméricas formadas
por duas subunidades α e β, as quais são glicoproteínas trasmembranares com
um pequeno domínio citoplasmático que se comunica com o citoesqueleto de
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actina no interior da célula (figuras 4 e 5), formando uma estrutura denominada
contato focal (Zhao e Guan, 2009; Guan, 2010). Uma vez perdida essa interação
entre célula e a matriz a célula entra em “anoikis”, um processo de morte celular
induzido por desprendimento da célula da matriz e perda das interações dos
contatos focais, daí a importância dessa interação (Demers, Thibodeau et al.,
2009; Benoit, Larrivee et al., 2010; Gagne, Groulx et al., 2010).
Figura 5. Estrutura das subunidades da integrina, um receptor de superfície para matriz extracelular. Adaptado de Alberts (2008).
Além do grupo de integrinas, múltiplas moléculas de sinalização estão
presentes na adesão focal. A principal dessas moléculas é a FAK (Quinase de
Adesão Focal). A FAK é uma proteína quinase citoplasmática não receptora
predominantemente localizada nas adesões focais de células aderentes. A FAK
possui um importante papel em diversos processos biológicos em células normais
e cancerígenas (figura 6) fazendo com que essa proteína seja um alvo potencial
na terapia contra o câncer (Hao et al., 2009; Benoit et al., 2010; Guan, 2010). A
adesão celular mediada por integrina é o principal evento ativador da FAK. A FAK
ativada encontra-se no estado fosforilada, para sua ativação completa é
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INTRODUÇÃO
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necessária a fosforilação de pelo menos seis sítios de tirosina em diferentes
regiões da proteína. Uma vez ativada a FAK participa da regulação de processos
celulares que envolvem apoptose, migração e diferenciação celular, progressão
do ciclo celular e proliferação (Hao et al., 2009; Zhao & Guan, 2009). A
fosforilação específica do resíduo de tirosina 925 leva a um acoplamento da FAK
a outra molécula de sinalização chamada Grb2 o que resulda na ativação da via
de sinalização Ras-MAPK (Demers, Thibodeau et al., 2009; Zhao e Guan, 2009;
Guan, 2010). Essa via é responsável por diferentes processos relacionados à
sobrevivência e progressão do ciclo celular (Zhao & Guan, 2009).
Figura 6. Via de sinalização da FAK em funções celulares normais e no câncer. FAK é ativada através da ligação da matriz extracelular às integrinas. A FAK ativada irá ativar outras vias que regulam a sobrevivência da célula e apoptose, além da progressão do ciclo celular, diferenciação e proliferação. Adaptado de Zhao & Guan (2009).
A via da MAPK é uma via amplamente estudada devido sua singularidade.
O nome da família das MAP quinases reflete diretamente na sua identificação
como proteíno-quinases ativadas por mitogenos (do inglês, mitogen-activated
protein kinases). Um dos principais efeitos da ativação da Ras é convergir para a
ativação dessa via. A via da MAPK é caracterizada por uma cascata que se inicia
com a ativação da MEK até os produtos finais que irão determinar os efeitos na
célula. Cada quinase é responsável por fosforilar outras proteínas alvo as quais,
por sua vez, irão seguir uma cascata de fosforilações. Resultando na ativação de
fatores de transcrição que desencadeiam mudanças no fenótipo celular variando
de crescimento, diferenciação ou até mesmo morte celular (Lewin, 2004).
Dentre as proteínas que formam a via da MAPK encontra-se a ERK que
está relacionada com as principais funções desempenhadas pela célula. A
inibição da fosforilação de ERK foi associada à morte celular por apoptose
(Pukac, Carter et al., 1997; Religa, Kazi et al., 2000; Aisa, Miyakawa et al., 2005).
Entretanto outros autores afirmam que a ativação da via envolvendo a fosforilação
34
INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
de ERK leva também a apoptose (Nabeyrat, Jones et al., 2003; Schweyer, Soruri
et al., 2004; Li, Liu et al., 2005; Liu, Mao et al., 2008; Kim, W. J., Lee, S. J. et al.,
2010).
Existe a possibilidade de varias respostas celulares desencadeadas
através da ativação da Via Ras-MAPK, como já citado anteriormente. O
mecanismo exato associado a cada tipo de resposta decorrente da ativação da
família da MAPK não está completamente compreendido. Entretanto acredita-se e
há comprovações parciais de que essas respostas estão diretamente
relacionadas ao tempo e intensidade do estímulo ativador da via e a localização
da ERK, se citoplasmática ou nuclear (Lewin, 2004; Cagnol e Chambard, 2010).
Foi visto também que a morte celular seja esta por apoptose, ativada pela via
intrínseca ou extrínseca, autofagia ou senescência está diretamente relacionada a
uma ativação de ERK atipicamente prolongada (Cagnol e Chambard, 2010).
O grupo em que está inserido este trabalho vem dando ênfase à
prospecção de fucanas com diversas atividades incluindo antioxidante,
antiproliferativa e antinflamatoria (Costa, Fidelis et al., 2010; Paiva et al.,
2011;Câmara et al., 2011; Magalhães et al., 2011; Costa et al., 2011). Uma das
fucanas mais estudadas pelo grupo é uma fucana extraída da alga Spatoglossum
schröederi. Esta molécula é denominada fucana B (Fuc B), e foi inicialmente
denominada de banda B por Leite (1995). Esta fucana foi capaz de inibir a adesão
de células CHO-K1 e CHO-745 sobre fibronectina (Rocha et al., 2001, Rocha et
al., 2005). Contudo, os trabalhos com a Fuc B com relação a seu efeito nas
células CHO não tiveram continuidade. Nesta trabalho, resgataram-se os estudos
dos efeitos da Fuc B sobre as células CHO.
35
INTRODUÇÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
2. OBJETIVOS
2.1 Principal
Este trabalho tem como objetivo geral a extração, purificação e
caracterização de uma fucana obtida da alga Spatoglossum schröederi e a
análise de seu efeito antiproliferativo sobre células tumorigênicas de ovário de
hamster chinês (CHO).
2.2 Específicos
- Avaliar o efeito antiproliferativo da fucana B em células tumorigênicas de ovário
de hamster chinês (CHO).
- Desvendar o mecanismo ativado pela fucana B identificando o alvo molecular
desse composto.
47
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
4. RESULTADOS
4.1 EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA
SPATOGLOSSUM SCHRÖEDERI
A extração baseada na proteólise com a enzima prozima seguida de uma
precipitação seqüencial com volumes crescentes de acetona resultou na obtenção
de sete frações polissacarídicas (F0.5; F0.6; F0.7; F0.9; F1.1; F1.3 e F2.0).
Realizada a eletroforese em gel de agarose e coloração com azul de toluidina
verificou-se (figura 9) que estas frações apresentavam diferentes populações de
polissacarídeos.
Como se pode observar existe uma relativa variedade entre as frações,
devido à presença de populações distintas de polissacarídeos sulfatados
chamados de fucanas. Os PS precipitados com os menores volumes de acetona
correspondentes as frações F0.5 e F0.6 são ricas em Fuc A, a F0.7 contém uma
mistura de Fuc A e Fuc B, enquanto a F0.9V é rica quase exclusivamente em Fuc
B, já as frações F1.1 e F1.3 apresentam-se enriquecidas tanto em Fuc B como
em Fuc C e a fração F2.0 tem como principal característica a presença massiva
de Fuc C.
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose das frações polissacarídicas.Foram aplicados 50μg de cada fração em cada poço. Fuc A- Fucana A; Fuc B- Fucana B; Fuc C- Fucana C. As setas indicam a migração eletroforética típica para cada fucana.
48
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
4.2 PURIFICAÇÃO DA FUCANA B POR CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA
A fração F0.9 possui um alto teor de Fuc B sem apresentar grande
contaminação com outros tipos de polissacarídeos sulfatados e devido a isto, a
referida fração foi escolhida para purificação de Fuc B. Assim essa fração foi
submetida a cromatografia de troca iônica utilizando volumes de diferentes
molaridades de NaCl. Os PS precipitados com metanol foram secos e em seguida
quando submetidos a uma eletroforese em gel de agarose foi observado que as
três frações obtidas eram constituídas por Fuc B: F1.0M; F1.5M; F2.0M (Figura
10).
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose das frações obtidas na cromatografia de troca iônica. Foram aplicados 50μg de cada fração. Or.-Origem. Fuc B- Fucana B.
4.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DAS FRAÇÕES DE FUC B
Como as frações F1.0; F1.5 e F2.0 são constituídas por Fuc B passaram a
ser denominadas de Fuc B 1; Fuc B 1.5 e Fuc B 2. As análises químicas das três
fucanas foram realizadas e os resultados estão representados na tabela 3.
49
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Tabela 3. Composição química parcial dos polissacarídeos sulfatados obtidos da alga Spatoglossum schröederi
nd- não detectado.* P<0.05 comparado as outras frações.
Os dados mostram que Fuc B 1.5 e Fuc B 2 são moléculas muito
semelhantes em relação a sua constituição monossacarídica, sendo compostas
por fucose, galactose e xilose, porém Fuc B 2 apresenta-se mais sulfatada (19%)
do que Fuc B 1.5 (17%). Por outro lado, Fuc B 1 apresentou uma menor
quantidade de xilose em comparação com as outras duas fucanas, além disso
apresentou manose em sua constituição, monossacarídeo esse que não foi
detectado em Fuc B 1.5 e Fuc B 2. Além disso, nenhuma das três fucanas
apresentou teor de proteínas detectável em sua constituição.
4.4 ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO DAS FUCANAS
A espectroscopia de infravermelho é uma técnica interessante para se
verificar a identidade de um composto. Portanto as fucanas FucB 1, FucB 1.5 e
FucB 2 foram analisadas por espectroscopia de infravermelho e os resultados
obtidos podem ser visualizados na Figura 11. Os picos mais característicos de
fucanas foram encontrados em todos os espectros: em aproximadamente 3448
cm-1 tem-se um sinal decorrente da vibração de elongação de grupos OH dos
anéis glicídicos; em aproximadamente 2931 cm-1 observa-se um sinal
correspondente a grupos C-H dos anéis glicídicos, bem como, dos grupos metis
das fucoses; por volta de 1648 cm-1 observa-se um pico correspondente a
carboxila dos ácidos urônicos, este pico se sobrepõem aos sinais de H de
moléculas de água da camada de solvatação; Os sinais em 1257, 1248 e 848 cm-
1 são provenientes da presença dos grupos sulfato, e este último indica a
presença de fucose sulfatada em posição axial no carbono 3. Uma análise mais
ampla dos espectros mostra uma quase sobreposição dos espectros de Fuc B 1.5
50
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
e Fuc B 2, indicando, como visto na análise química, como estas moléculas são
muito semelhantes.
Figura 11. Espectroscopia de infravermelho das fucanas B obtidas da alga Spatoglossum
schröederi. A- Espectro obtido da Fuc B 1; B- Espectro obtido da Fuc B 1.5; C- Espectro obtido
da Fuc B 2.
4.5 EFEITO ANTIPROLIFERATIVO DAS FUCANAS EM CÉLULAS CHO-K1 E
CHO-745
Com a composição química das fucanas determinada resolveu-se verificar
se as sutis diferenças detectadas influenciam na atividade antiproliferativa das
Fuc B 1; 1.5 e 2. Essa atividade foi testada utilizando células de ovário de
hamster chinês (CHO) selvagem (K1) e mutante (745). Na figura 12 pode-se
observar efeito das fucanas em ambas as células CHO-K1 (A) e CHO-745 (B).
Em contato com as células selvagens (CHO-K1) todas as fucanas diminuíram a
proliferação celular nas concentrações testadas. Porém apenas com a presença
de Fuc B 1 esse efeito foi dose-dependente, nas outras duas fucanas o efeito foi
semelhante, independentemente das concentrações testadas. Comparando os
resultados entre as fucanas pode-se verificar que não há diferença estatística
quanto a concentração de 400 µg/mL. O percentual de inibição médio de todas as
fucanas foi de aproximadamente 40%.
51
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 12. Efeito das fucanas B obtidas da alga Spatoglossum schröederi na proliferação de diferentes células de ovário de Hamster chinês tratadas por 24 h e avaliadas por MTT. A- células CHO-K1 (linhagem selvagem). B- células CHO-745 (linhagem mutante). CTRL- Controle. * P< 0.05; ** P<0.01; *** P<0.001 quando as células tratadas são comparadas ao controle. a- P<0.001 quando a concentração de 100μg/mL é comparada a 400 μg/mL. b- P<0.05 quando comparada a 100 μg/mL. c- P< 0.01 quando comparada a 200 μg/mL. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
O efeito também foi semelhante na linhagem mutante CHO-745 (Figura
12B), porém um pouco menor, pois na presença das fucanas identificou-se uma
diminuição de aproximadamente 35% da viabilidade das células. Com esta
linhagem, apenas a Fuc B 2 apresentou efeito dose dependente. Os testes
posteriores foram realizados somente com a linhagem selvagem uma vez que os
resultados foram muitos semelhantes entre as duas linhagens.
4.6 AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIPROLIFERATIVO DE FUC B EM CÉLULAS
CHO-K1 POR INCORPORAÇÃO DE BrdU
Os resultados com o MTT indicam que há uma diminuição na proliferação
celular, e para se confirmar este resultado utilizou-se BrdU como marcador
proliferativo (figura 13). As fucanas inibiram a proliferação quando analisadas
52
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
através da incorporação do BrdU. Para realização deste e dos demais testes foi
utilizada somente uma concentração de 500 µg/mL uma vez que essa é próxima a
concentração que obteve os resultados mais significativos para as três frações na
análise de viabilidade por MTT. O efeito antiproliferativo verificado para as
fucanas utilizando o BrdU como marcador foi semelhante àquele observado
através do MTT ocorrendo uma inibição de cerca de 40%. Mais uma vez não
houve diferença entre as taxas de inibição de proliferação das células na
presença das três fucanas.
Ctrl Fuc B 1 Fuc B 1.5 Fuc B 20
20
40
60
80
100
120
*** ******
% p
roli
fera
ção
Figura 13. Efeito das fucanas obtidas da alga Spatoglossum schröederi na proliferação de
células CHO-K1 tratadas por 24h e analisadas através da incorporação de BrdU. *** P<0.001
comparando tratados e controle. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
Até este momento, as análises físico-químicas e os testes em células
mostraram que as três fucanas apresentam propriedades muito semelhantes,
indicando que as três são compostos similares e a principal diferença entre elas é
o conteúdo de sulfato. Contudo, esta diferença no teor de sulfato não influenciou
na atividade das fucanas B. Assim, como Fuc B 2 foi obtida com maior rendimento
e como a sua estrutura já foi proposta por Rocha e colaboradores em 2005, esta
foi escolhida para os testes posteriores.
4.7 PARTICIPAÇÃO DOS GRUPOS SULFATO NA ATIVIDADE
ANTIPROLIFERATIVA DE FUC B 2
Como visto anteriormente a diferença entre o teor de sulfato das três
frações não foi determinante para diferenças entre o efeito antiproliferativo
53
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
apresentado por estas. Porém, para se determinar a faixa do teor de sulfato
necessária para se ter atividade antiproliferativa da Fuc B 2 esta foi submetida a
um processo de dessulfatação por 1 e 5 h. Após as dosagens de sulfato do
material resultante do processo de dessulfatação foi obtida uma fucana B com 82
% (Fuc B 2 1h) e 40% (Fuc B 2 5h) do teor de sulfato da fucana original,
respectivamente. Em posse destas fucanas dessulfatadas fez-se o ensaio
antiproliferativo realizado por incorporação de BrdU (figura 14) BrdU. Com a perda
de cerca de 20 % dos grupos sulfato a FucB já fica desprovida de sua atividade
antiproliferativa.
CTRL FucB FucB 1h FucB 5h0
20
40
60
80
100
***
% p
roli
fera
ção
Figura 14. Efeito do sulfato na atividade antiproliferativa de Fuc B 2 e suas derivadas dessulfatadas quimicamente por um período de 1h e 5h. *** P<0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
4.8 LOCALIZAÇÃO DO ALVO MOLECULAR RESPONSÁVEL PELA ATIVIDADE
ANTIPROLIFERATIVA DE FUC B 2.
Com intuito de verificar se Fuc B 2 necessitava se associar a alguma
molécula existente no soro fetal bovino, foi realizado um teste antiproliferativo
como descrito anteriormente e a variável que foi utilizada foi a concentração do
SFB. Os resultados deste teste estão resumidos na figura 15. Pode-se verificar
que o soro presente no meio celular quando utilizado na concentração de até 15%
não exerce influência no efeito antiproliferativo da Fuc B 2. Isto comprova que o
alvo molecular desta fucana não está presente no meio de cultivo celular.
54
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
CTRL 2.5% 5% 10%0
20
40
60
80
100
*** *** ***
% p
roli
fera
ção
Figura 15. Inibição da proliferação em células CHO-K1 tratadas com a fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi e diferentes concentrações de soro fetal bovino. ** P<0.01; *** P< 0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
Para se verificar se o alvo molecular da fucana se encontrava na matriz
extracelular, superfícies de placas de cultura foram incubadas com diferentes
moléculas de matriz extracelular, e posteriormente, sobre estas, células CHO-K1
foram cultivadas na presença de Fuc B 2. Os resultados podem ser observados
na figura 16. A fucana foi capaz de inibir a proliferação das células CHO já com
0,01mg/mL quando plaqueada sobre a fibronectina, este efeito atingiu um valor
máximo em torno de 60% na concentração em torno de 0,4mg/mL estabilizando-
se. Já quando as células CHO foram plaqueadas sobre vitronectina o efeito
inibitório de Fuc B 2 só foi observado a partir da concentração de 0,4 mg/mL e
chegou ao máximo em torno de 45% com 1,0 mg/mL. Não se observou efeito
antiproliferativo de Fuc B 2 quando colágeno I, colágeno IV ou laminina foram
utilizadas como substrato (dados não mostrados).
A partir da análise dos dados até aqui apresentados pode-se propor que o
alvo molecular de ação da Fuc B localiza-se na matriz extracelular, mais
especificamente, associando-se a fibronectina para exercer seu efeito
antiproliferativo nas células CHO.
55
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Fibronectina Vitronectina0
20
40
60
80
0,01mg/mL
0,1mg/mL
0,2mg/mL
0,4mg/mL
0,5mg/mL
% in
ibiç
ão
Figura 16. Inibição da proliferação das células CHO-K1 plaqueadas sobre moléculas de matriz extracelular e tratadas com diferentes concentrações de Fuc B 2 por 24h. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
4.9 IDENTIFICAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO DA FUCANA
A fibronectina tem como principal receptor de membrana celular a integrina
α5β1. Esta integrina ativa uma gama de vias intracelulares, inclusive vias de
sobrevivência celular, por ativar a quinase de adesão focal (FAK). Como se
identificou a fibronectina como alvo molecular de Fuc B 2, resolveu-se avaliar o
efeito de Fuc B 2 sobre a FAK. Para isso, utilizou-se a técnica de western blotting.
Observa-se na figura 17 (A e B) que Fuc B 2 promoveu uma elevação nos
níveis da forma fosforilada de FAK (ativação), indicando que essa pode ser uma
proteína chave para o desencadeamento do efeito antiproliferativo da Fuc B 2.
56
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 17. Expressão de pFAK por células CHO-K1 tratadas com Fuc B 2 por 12, 24 e 48h na concentração de 500 µg/mL. A- Expressão da pFAK em células CHO-K1 analisadas por western blotting. B- Expressão de pFAK das células avaliadas por western blotting e normalizados pela actina. CTRL- Controle não tratado. ** P<0.01; ***P<0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
A FAK pode levar a ativação da proteína quinase C, que é uma proteína
envolvida em várias vias celulares, inclusive sobrevivência celular. Portanto,
avaliou-se os níveis desta proteína após a exposição das células CHO-K1 a Fuc B
2. Na figura 18 (A e B) observa-se o resultado obtido utilizando-se western
blotting referente aos níveis de PKC ativa. Como pode ser visto houve um
significante aumento nos níveis de PKC após 12h de incubação das células com
Fuc B 2. Estes níveis celulares altos de PKC diminuíram e, após 48 de incubação,
voltaram a valores próximos a aqueles observados no controle.
57
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 18. Expressão de PKC por células CHO-K1 tratadas por 12, 24 e 48h com Fuc B 2 na concentração de 500 µg/mL. Expressão da PKC em células CHO-K1 analisadas por western blotting. B- Expressão de PCK das células avaliadas por western blotting e normalizados pela actina. CTRL- Controle não tratado. ***P<0.001. Os resultados representam a média de três experimentos realizados em separado.
Para se certificar que a fucana agia unicamente pela via da PKC foi
utilizado um inibidor específico para essa quinase. O bisindolilmaleimido é um
inibidor reversível da PKC. Na presença de inibidor foi realizado um ensaio
proliferativo utilizando o BrdU para analisar se sua presença era capaz de
suprimir o efeito da fucana. Na figura 19 é possível verificar que apesar de haver
uma pequena diminuição no efeito da Fuc B 2 essa diminuição não foi
significativa. O que indica que a FucB 2 pode ativar a expressão de PKC durante
o seu efeito antiproliferativo, entretanto essa proteína não é determinante para
essa atividade.
58
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Ctrl F2.0M F2.0M +BISINDOL0
20
40
60
80
100
******
% p
rolife
ração
Figura 19. Efeito da fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi na proliferação de células CHO-K1 na ausência ou presença do inibidor de PKC. Ctrl- Controle Não tratado. BISINDOL- Bisindolilmaleimido. *** P<0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
A FAK é uma proteína que quando ativa apresenta-se fosforilada sendo
responsável pela ativação de outras proteínas de importância para as vias de
sobrevivência celular como, por exemplo, as MAP Quinases. Porém uma proteína
responsável pela ativação da via da MAPK através da ativação da FAK e que
também é alvo da PKC quando esta é ativada é a Ras. Sabendo disso, esse foi o
próximo alvo de investigação. Na figura 20 (A e B) tem-se a alteração nos níveis
de Ras seguindo o mesmo padrão de alteração da FAK e da PKC. Há uma
elevação acentuada no período de tratamento de 12 h e em seguida uma queda
no tratamento com 24h para uma normalização dos níveis em 48 h. Em seguida
as MAPKs ERK 1/2 fosforiladas foram analisadas.
Na figura 21 (A e B) pode-se observar, de forma semelhante às proteínas
investigadas anteriormente, que houve um aumento nos níveis de ERK 1/2
fosforilado (ativo) no período de 12 h com uma posterior diminuição do efeito após
48 h.
59
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 20. Expressão de Ras por células CHO-K1 tratadas por 12, 24 e 48h com Fuc B 2 na concentreação de 500 µg/mL. Expressão da Ras em células CHO-K1 analisadas por western blotting. B- Expressão de Ras das células avaliadas por western blotting e normalizados pela actina. CTRL- Controle não tratado. ***P<0.001. Os resultados representam a média de três experimentos realizados em separado.
60
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 21. Expressão de pErk 1/2 por células CHO-K1 tratadas com Fuc B 2 por 12, 24 e 48h na concentração de 500 µg/mL. A- Expressão da pErk 1/2 em células CHO-K1 analisadas por western blotting. B- Expressão de pErk 1/2 das células avaliadas por western blotting e normalizados pela actina. CTRL- Controle não tratado. ** P<0.01; ***P<0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
A via que envolve a ativação da ERK 1/2 é uma via complexa na qual
também estão envolvidas outras MAPKs. A utilização de um inibidor da MAPK
MEK 1/2 foi de grande utilidade para determinar se o efeito antiproliferativo
apresentado pela fucana é regulado através dessa importante via. Na figura 22
tem-se o resultado do teste proliferativo utilizando como marcador o BrdU. Pode-
se observar que o efeito de Fuc B 2 foi quase que completamente inibido quando
o inibidor da MAPK MEK 1/2 foi utilizado, não foi detectado diferença significativa
entre a proliferação das células na presença de Fuc B 2 + inibidor e o controle.
Isso indica que a MEK 1/2 uma quinase presente anteriormente à ERK 1/2 na via
da MAPK, está diretamente relacionada à atividade antiproliferativa da fucana.
61
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Ctrl Fuc B 2 Fuc B +PD980590
20
40
60
80
100
***
% p
rolife
ração
a
Figura 22. Efeito da fucana Fuc B 2 obtida da alga Spatoglossum schröederi na proliferação de células CHO-K1 na ausência ou presença do inibidor de MEK1/2. Ctrl- Controle Não tratado. PD98059- inibidor de MEK 1/2. *** P<0.001. a- Diferença significativa entre tratado com Fuc B 2 e Fuc B 2 + inibidor. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
4.10 MARCAÇÃO UTILIZANDO ANEXINA V E IODETO DE PROPÍDEO
Como a Fuc B 2 apresentou atividade antiproliferativa frente as células
CHO-K1, utilizou-se a técnica de citometria de fluxo para verificar se a fucana
estava induzindo morte celular. Para tal as células após período de incubação
com Fuc B 2 foram marcadas com anexina (indicador de apoptose) e iodeto de
propídeo (indicador de necrose). Na figura 23 têm-se gráficos representativos dos
resultados obtidos. Pode-se observar que não houve diferença significativa entre
o controle não tratado e as células tratadas tanto para os valores positivos para
anexina quanto para os valores correspondentes para iodeto de propídeo. Isso
significa que o efeito antiproliferativo de Fuc B 2 não ocorre por apoptose nem por
necrose.
62
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 23. Citometria de fluxo utilizando marcação com anexina V e iodeto de Propídeo. A- Células controle. B- células tratadas com 500 µg/mL de Fuc B 2 por 24h. FL2H- Filtro referente ao Iodeto de Propídeo. FL1H- Filtro referente a Anexina V- FITC (Fluorescein isothiocyanate). Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
4.11 ANÁLISE DO CICLO CELULAR
A análise do ciclo celular é uma ferramenta importante na investigação de
compostos com atividade antiproliferativa como a fucana alvo de estudo desse
trabalho. Como se observa na figura 24 o tratamento das células CHO com a Fuc
B 2 foi capaz de alterar o ciclo celular dessas células. Houve um aumento
significativo no número de células na fase G1 enquanto ao mesmo tempo ocorreu
uma diminuição no número de células que estavam na fase S. Isso indica
claramente que a fucana age especificamente no ciclo celular levando a uma
parada do ciclo celular na fase G1.
63
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
CTRL Fuc B 2 CTRL Fuc B 2 CTRL Fuc B 2 CTRL Fuc B 20
20
40
60
80G1/G0
S
G2/M
**
***
a
b
SubG1
Fases d
o c
iclo
celu
lar
(%)
Figura 24. Análise do ciclo celular das células CHO-K1 tratadas com a F2.0M. a- diferença na fase G1 entre tratada e controle. b- diferença na fase S entre tratada e controle. CTRL- Controle não tratado. ** P<0.01; ***P< 0.001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
64
DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
5. DISCUSSÃO
O câncer tem sido considerado um fator altamente danoso a sociedade
humana por apresentar alta taxa de mortalidade e morbidade. Porém, vale
salientar, que a palavra câncer não se refere a um tipo de doença e sim a pelo
menos mais de cem tipos de doenças correlacionadas. Estes fatores têm levado a
uma incessante busca pela descoberta e aprimoramento de ferramentas que
tenham caráter preventivo até curativo do câncer. Um das grandes frentes de
trabalho é a busca por moléculas que isoladamente ou em conjuntos com outras
possam combater ou prevenir o câncer ou seus efeitos no organismo (Bode e
Dong, 2009).
Há uma grande variedade de ferramentas utilizadas na identificação de
compostos que possam combater o câncer. A complexidade dessa doença tem
feito com que sejam utilizados testes in vitro e in vivo não só focalizados na
descoberta de compostos citotóxicos e/ou citostáticos para células tumorais, mas
também, na descoberta de compostos com outras atividades como
imunoestimuladores, antimetastáticos, antiangiogênicos, antioxidantes.
Apesar dos avanços da Química Farmacêutica, que utiliza ferramentas de
bioinformática para o desenho de novas moléculas ativas, os produtos naturais
são de longe as principais fontes de novas moléculas potencialmente utilizáveis
no tratamento e prevenção do câncer. A escolha das fontes de prospecção de
produtos naturais muitas vezes é baseada na cultura de um povo. Como exemplo,
nos países asiáticos algas marinhas (macerados, infusões, etc) vem sendo
utilizadas no tratamento do câncer ha séculos. Isto levou a procura por
compostos antitumorais em algas, dentre aqueles descobertos, pode-se citar os
polissacarídeos sulfatados, e dentre os polissacarídeos sulfatados de algas, os
estudos que mais avançaram foram aqueles referentes à fucanas (Li et al., 2008).
Seguindo nessa linha, o grupo (BIOPOL-UFRN) em que está inserido este
trabalho vem dando ênfase à prospecção de fucanas com diversas atividades
incluindo antioxidante, antiproliferativa e antinflamatoria (Costa et al., 2010;
Câmara et al., 2011; Magalhães et al., 2011; Costa et al., 2011). Uma das
fucanas mais estudadas pelo grupo é uma fucana extraída da alga Spatoglossum
schröederi. Esta fucana é denominada fucana B (Fuc B), e foi inicialmente
denominada de banda B por Leite (1995). Contudo, sua estrutura molecular só foi
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DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
proposta dez anos depois, trata-se de galactofucana que contém resíduos de
xilose em sua estrutura (Rocha et al., 2005) (Figura 3). Esta fucana foi capaz de
inibir a adesão de células CHO-K1 e CHO-745 sobre fibronectina (Rocha et al.,
2001, Rocha et al., 2005). Contudo, os trabalhos com a Fuc B com relação a seu
efeito nas células CHO não tiveram continuidade. Neste trabalho, resgataram-se
os estudos dos efeitos da Fuc B sobre as células CHO.
Utilizando a mesma metodologia proposta por Rocha e colaboradores
(2005) foi possível purificar a Fuc B, que nesta dissertação foi denominada de Fuc
B 2. As análises química e de infravermelho mostraram que a Fuc B 2 é
essencialmente a Fuc B descrita por Rocha (Rocha et al., 2005). Outro fato
relevante, é que Fuc B 1 e principalmente Fuc B 1.5 também são muito
semelhantes a Fuc B 2, sendo a principal diferença entre elas o grau de
sulfatação (tabela 3).
Nos últimos anos o número de artigos publicados demonstrando fucanas
com atividade antiproliferativa aumentou consideravelmente (Nakayasu et al.,
2009; Aisa et al., 2005; Hyun et al., 2009; Costa et al., 2011; Jin et al., 2010). Com
o conhecimento a respeito da composição química das três fucanas resolveu-se
verificar se as sutis diferenças estruturais destas fucanas influenciam de alguma
forma em seus efeitos na proliferação de células de ovário de Hamster chinês
selvagem (CHO-K1) e mutante (CHO-745). Escolheu-se estas células porque a
mutante sintetiza apenas 5% da quantidade de glicosaminoglicanos sintetizados
pelas células CHO-K1 (Esko, 1991). Portanto, se fosse observado o mesmo efeito
nas duas linhagens celulares, poder-se-ia de imediato excluir um simples efeito de
repulsão de cargas ente a Fuc B e os glicosaminoglicanos da superfície das
células. Outro fato que foi relevante é que não há descrição na literatura de
estudos do efeito de fucanas frente a estas linhagens celulares. A partir dos
dados aqui apresentados pode-se propor que as fucanas apresentam efeito
antiproliferativo nas células CHO independente das linhagens utilizadas.
A quantidade e principalmente a distribuição dos grupos sulfato pela
molécula da fucana tem sido revisado por vários autores como uma das
características determinantes para que uma fucana apresente atividade
farmacológica (Li et al., 2008; Wijesekara et al., 2011). No início da década
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DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
passada Haroun-Bouhedja e col. (2000) mostram que fucanas quando foram
dessulfatadas tiveram sua atividade anticoagulante diminuída, por outro lado, a
atividade antiproliferativa contra fibroblastos CCL39 não foi afetada com a
dessulfatação. Estes dados mostraram que podem ser importantes para algumas
atividades das fucanas enquanto que para outras atividades não são tão
relevantes. Tendo-se isto em mente, avaliou-se a importância dos grupos sulfato
de Fuc B em sua atividade antiproliferativa utilizando-se três fucanas B com
diferentes graus de sulfatação: Fuc B 2 (19%), Fuc B 1.5 (17.8%), Fuc B 1
(14.1%), a as fucanas B dessulfatadas quimicamente: Fuc B 2 1h (15,%) e Fuc B
2 5h (7,6 %). Observou-se que mesmo a diferença entre o grau de sulfatação
entre Fuc B 2 e Fuc B 1 não influenciou no efeito antiproliferativo de Fuc B, pois
as duas apresentaram atividades semelhantes. Contudo, quando avaliamos Fuc B
2 1h, por exemplo. A mesma apresenta um grau de sulfatação maior do que Fuc
B 1, e mesmo assim, apresentou uma baixíssima atividade antiproliferativa. De
forma semelhante Fuc B 5h também teve um efeito muito baixo na proliferação
das células, semelhante à Fuc B 1h mesmo tendo um grau de sulfatação menor.
A técnica de dessulfatação utilizada neste trabalho promove a retirada dos grupos
sulfato de forma inespecífica. Porém, não foi possível realizar estudos estruturais
com Fuc B 2 1h, portanto, não se sabe quais grupos foram mais afetados pelo
processo de dessulfatação. Contudo, os dados indicam claramente que a
atividade antiproliferativa de Fuc B não é dependente do seu grau de sulfatação,
mas que existem grupos sulfatos que são determinantes para a sua atividade.
Estudos futuros serão realizados para se identificar quais grupos sulfatos são
importantes para estas atividades.
Tendo estes resultados em mãos e considerando também a semelhança
entre as três fucanas B e considerando que a Fuc B 2 foi obtida com maior
rendimento e como a sua estrutura já foi proposta por Rocha e col. (2005), esta foi
escolhida para os testes posteriores.
Neste trabalho, os dados obtidos com ensaio da atividade antiproliferativa
de Fuc B com diferentes concentrações de SFB mostraram que esta não precisa
se associar a nenhuma molécula do soro para inibir a proliferação das células
CHO. Vários trabalhos mostram que polissacarídeos sulfatados como heparina e
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DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
heparam sulfato podem se associar a proteínas e a outros fatores solúveis e
assim atuarem sobre diferentes linhagens celulares (Nader et al., 2005; Mulloy,
2005). Fucanas também são capazes de se associarem a diversas proteínas
como cofator II da heparina (Shanmugam & Mody, 2000) e antitrombina (Colliec et
al., 1991), e a componentes do SFB. Quando fucanas sulfatada de baixo peso
molecular foram obtidas de Ascophyllum nodosum estas apresentaram atividade
antiproliferativa sobre algumas das diversas linhagens tumorais estudadas. Foi
observado que esses compostos inibiam em 85% a proliferação celular de células
de adenocarcinoma de cólon (Colo320 DM) (Ellouali et al., 1993). Essa inibição se
mostrou reversível, dependente da concentração de soro fetal bovino (SFB) e não
estava relacionada com a internalização das fucanas (Ellouli et al., 1994).
Logeart e col. (1997) demonstraram que fucanas da alga Ascophyllum
nodosum inibem a proliferação de células de músculo liso (SMC). Neste estudo
observaram que as fucanas eram internalizadas, mas que a sua degradação não
era necessária para as fucanas apresentarem atividade. Contudo, os autores não
conseguiram comprovar se a internalização da fucana era necessária para que
esta desenvolvesse seu efeito. Por outro lado, fucanas também da alga A.
nodosum inibiram a adesão de células sem serem internalizadas, foram capazes
de associarem a fibronectina e inibirem a adesão de células de câncer de mama
(MDA-MB-231) (Liu et al., 2005). Estes dados estão em acordo com os dados
obtidos por Rocha e colaboradores (2005) que mostraram que Fuc B quando
biotinilada e incubada com células CHO era detectada, por miscroscopia confocal,
na matriz extracelular e que não precisa ser internalizada para desenvolver seu
efeito. Quando células CHO plaqueadas sobre diferentes moléculas de matriz
foram tratadas com Fuc B, observou-se que seu alvo molecular encontra-se na
matriz extracelular, principalmente na fibronectina.
A comunicação célula-matriz extracelular ocorre principalmente através da
ligação das proteínas de matriz aos receptores presentes na superfície celular,
que no caso particular da fibronectina, essa ligação ocorre com as integrinas de
membrana (Cabodi et al., 2010). Diante do exposto decidimos investigar quais
proteínas intracelulares que são responsáveis pela sinalização poderiam estar
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DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
sendo afetadas pela fucana. A primeira a ser investigada foi a quinase de adesão
focal (FAK), pois esta está intimamente associada à integrinas.
O principal evento que leva a ativação da (FAK) é a adesão celular
mediada por integrina. Quando em seu estado fosforilado (ativado) a FAK irá
sinalizar para a maquinaria celular que controla diversos processos celulares
relacionados à sobrevivência e progressão do ciclo celular. Sua função faz dessa
quinase um alvo no desenvolvimento de fármacos com potencial terapêutico
contra o câncer (Dunn, Heffler et al., 2010). A exposição das células CHO a Fuc B
levou a um aumento significativo na ativação de FAK. Um trabalho anterior com a
fucana A de S. schröederi mostrou que esta era capaz de induzir células
endoteliais sintetizarem um heparan sulfato antitrombótico por promover a
ativação de FAK (Medeiros, 2008). Contudo, não foi possível identificar na
literatura trabalhos que mostram fucanas promovendo a ativação de FAK
induzindo efeito antiproliferativo. Esse é o primeiro relato associando a ativação
de FAK por fucanas com o efeito antiproliferativo em células CHO.
A ativação de FAK leva a ativação de várias vias intracelulares (Cabodi et
al., 2010), dentre elas, a via da proteína quinase C (PKC). Observou-se que as
células após a exposição à Fuc B apresentaram ativação da PKC. Quando as
células foram incubadas com a Fuc B e o inibidor específico da PKC, o efeito
antiproliferativo de Fuc B não foi significantemente afetado, apesar de apresentar
uma tendência em diminuir. Outra via ativada pela ativação de FAK é a via das
MAP quinases, já que FAK que por sua vez ativa Ras e esta ativa a via das MAP
quinases. A ativação desta última tem sido correlacionada com regulação da
proliferação e ciclo celular.
Os dados obtidos por “western blotting” e proliferação na presença de
inibidores levaram a indicação de que Fuc B tem como principal mecanismo
antiproliferativo das células CHO a ativação da via das MAP quinases. Este fato
se mostrou interessante, pois há trabalhos na literatura que mostram que fucanas
possuem atividade antiproliferativa por induzir morte celular ao promover a
inibição da via das MAP quinases (Xu et al., 2011; Roy et al., 2010; Aisa et al.,
2005). Por outro lado, outros estudos mostram fucanas induzindo apoptose de
células tumorais por ativar a via das MAP quinases (Nabeyrat et al., 2003;
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DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Schweyeri et al., 2004; Li et al., 2005; Liu et al., 2008; Kim et al., 2010). Contudo,
análises por citometria de fluxo mostram que Fuc B não aumenta a taxa de
células marcadas por anexina-V, o que indica que Fuc B, apesar de ativar a via
das MAP quinases, não induz apoptose.
Os ensaios de citometria mostraram também que o tratamento com Fuc B
resultou na parada do ciclo celular na fase G0/G1. Outras fucanas também
apresentaram efeito semelhante sobre células em cultura. Fucanas da alga A.
nodosum inibiram a proliferação de células de carcinoma de pulmão NSCLC-N6
bloqueando a passagem das células pela fase G1 (Riou et al.,1996). Fucanas de
Turbinaria ornata também apresentaram atividade antiproliferativa contra células
de carcinoma de pulmão por bloquearem a passagem dessas pela fase G1 do
ciclo celular (Deslande et al., 2001). Contudo, estes autores não mostraram que
vias intracelulares estavam sendo ativadas pelas fucanas e que fossem
responsáveis pelo seu mecanismo.
A ativação da via Ras/MEK/ERK pode promover a parada do ciclo celular
em alguns tipos de câncer (Mccubrey et al., 2007; Chang et al., 2003). Também
tem sido sugerido que algumas terapias objetivando o aumento de Raf, e
posterior aumento das MAP quinases, podem induzir senescência ou parada do
ciclo celular em alguns tipos de câncer de próstata (Ravi et al., 1999). Já em
alguns cânceres avançados pode ser vantajoso induzir a ativação de ERK 1/2
visando promover a parada do ciclo celular (Robertson et al., 2010). Estes dados
da literatura associados aos dados encontrados com a Fuc B levam a proposta de
que o principal mecanismo antiproliferativo de Fuc B sobre as células CHO está
em bloquear a passagem destas pela fase G1 do ciclo celular. A figura 25 resume
os dados encontrados até o momento e propõe o mecanismo de ação de Fuc B.
Inicialmente a Fuc B se associa a matriz extracelular, mais especificamente a
fibronectina, esta, por estar também associada à integrinas, promovem a ativação
destas. As integrinas por sua vez ativam a FAK levando a posterior ativação de
Ras, que então irá ativar MEK 1/2 através da ativação prévia de Raf. MEK 1/2
seguirá o caminho de ativação da via das MAPKs e irá fosforilar ERK 1/2 ativando
esta quinase. Uma vez ativada Erk 1/2 pode ser translocada para o núcleo onde
controla a expressão gênica de diversas proteínas e regular a progressão do ciclo
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DISCUSSÃO
Leonardo T.D.B. Nobre Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
celular, porém Erk 1/2 também pode desempenhar seu papel no citoplasma
controlando proteínas relacionadas a adesão celular e do citoesqueleto.
Figura 25. Representação esquemática do mecanismo de ação proposto para a fucana Fuc B, da alga Spatoglossum schröederi, exercer seu efeito antiproliferativo em células CHO-K1. Setas azuis- via de ativação. Linha vermelha- inbidor. PD98059- Inibidor de MEK 1/2.
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CONCLUSÕES
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6. CONCLUSÕES Com a metodologia utilizada foi possível extrair e caracterizar quimicamente três subfrações de Fuc B da alga S. schröederi, todas as subfrações apresentaram efeito antiproliferativo em células de ovário de Hamster Chinês (CHO) interrompendo o ciclo celular na fase G1. Para que isto ocorra a Fuc B associa-se a matriz extracelular que se liga a integrina de membrana o que ativa FAK e resulta na ativação da via das MAP quinases com ativação de ERK 1/2 que regula a progressão do ciclo celular.
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