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Le Tecniche di P.M.A.
Università degli Studi di Messina Dipartimento di Scienze Ginecologiche Ostetriche e
Fisiopatologia della Riproduzione
Messina 05 giugno 2012
Una coppia è considerata infertile quando non è stata in grado di concepire e di procreare un bambino dopo 12/24 mesi di rapporti sessuali non protetti, mentre èsterile la coppia nella quale uno o entrambi i coniugi sono affetti da una condizione fisica permanente che non rende possibile la procreazione
Art. 7 – Legge n° 40/2004
Abate Lazzaro Spallanzani(1729 – 1791)
Sacerdote della congregazione della Beata Vergine di Modena
Docente di storia naturale all’ Università di Pavia
Nel 1765 pubblica il saggio sugli “animaletti”
Nel 1783 ottiene la nascita di tre cuccioli mediante F.A. e
diede inizio alla storia di questo metodo procreativo
Nel 1937 si fonda a Pavia il primo centro per la F.A. in campo animale a lui dedicato, che ha permesso di ricostruire il patrimonio zootecnico italiano dopo la decimazione della prima guerra mondiale.
Nel 1949 J. Hammonds sviluppa in vitro embrioni di topo oltre 8 cellule
Nel 1959 Chang porta a termine la prima nascita dopo I.V.F nel topo
Nel 1965 R. Edwards presenta i primi esperimenti su colture di ovociti umani
Robert Edwards(Nobel Medicina 2010)
Patrick Steptoe
Louise Brown
25 luglio 1978Oldham Hospital Manchester
1984
Ettore Cittadini
Domenico Geraci
Annunciano la nascita della prima bambina italiana con
tecniche di PMA
L’infertilità di coppia rappresenta un importante problema medico e sociale, interessando circa il 15 – 20 %
delle coppie in età fertile nei paesi industrializzati.
EpidemiologiaEpidemiologia
ISS 4ISS 4°° report 2009report 2009
Infertilità maschile (35,4 %)
Infertilità femminile (35,5 %)
Infertilità maschile e femminile (15 %)
Infertilità idiopatica (13,2 %)
Altro (1%)
Linee guida 2008
ISS 4ISS 4°° report 2009report 2009
ISS 4ISS 4°° report 2009report 2009
CAUSE PRE-TESTICOLARI
IPOTALAMO IPOFISARIE
CAUSE TESTICOLARI
DANNI TESTICOLARI
CAUSE POST -TESTICOLARI
EPIDIDIMARIE
PROSTATICHE
VESCICOLARI
EIACULATORIE
InfertilitInfertilit àà maschilemaschile
FSH ED LH
NORMALI / RIDOTTI
T < 1,0
IPOGONADISMO IPOGONADOTROPO
IDIOPATICO
S. DI KALLMANN
ADENOMI NON FUNZIONANTI
SELLA VUOTA
IPER-PRLFSH ED LH
NORMALI / RIDOTTI
T >1,0; PRL ELEVATA
PRL-OMI
FARMACI
LESIONI PEDUNCOLO
CAUSE PRE TESTICOLARI
IPOTALAMO IPOFISARIE
FSH ED LH
NORMALI - ELEVATI
T NORMALE
IPOGONADISMO NORMOGONADOTROPO
??
MICRODELEZIONI CROMOSOMA Y
MALDISCESA E RETRATTILITA’
VARICOCELE
C. AMBIENTALI / LAVORATIVE
OBESITA’
FARMACI
RECETTORE ANDROGENICO
CAUSE TESTICOLARI
DANNI TESTICOLARI
FSH, LH, T, PRL
NORMALI
NORMOFUNZIONE
ENDOCRINA
???
FLOGOSI
ANOMALIE STRUTTURALI
VARICOCELE
C. AMBIENTALI / LAVORATIVE
ANOMALIE SVUOTAMENTO (LESIONI MIDOLLO SPINALE)
FARMACI
RECETTORE ANDROGENICO
CAUSE POST -TESTICOLARI
EPIDIDIMARIE
PROSTATICHE
VESCICOLARI
EIACULATORIE
OLIGOSPERMIA MODERATA
> 5 MILIONI SPZ MP/ ml
Su Seme intero
In assenza di fattore femminile e/o disfunzione ovulatoria trattata
PCT - Positivo
PCT - Negativo
Trichomonas
Muco Cervicale
cristallizzazioni
atipica
Muco ostile
cristallizzazioni
terziarie e
quaternarie
Muco ideale
Assisted Reproductive TechnologyAssisted Reproductive Technology
Intrauterine Insemination (I.U.I)
Direct intraperitoneal insemination (D.I.P.I)
Fallopian tube sperm perfusion (F.S.P) or intrafallopian insemination (I.F.I)
Peritoneal oocyte sperm transfer (P.O.S.T)
In vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET)
Zygote intrafallopian transfer (Z.I.F.T),
Pro-nuclear stage tubal transfer (P.R.O.S.T),
Tubal embryo stage transfer (T.E.S.T),
Tubal embryo transfer (T.E.T), or embryo intrafallopian transfer (E.I.F.T)
Surgical embryo transfer (S.E.T) or transmyometrial embryo transfer (TM-ET)
Direct oocyte transfer (DOT)
Intravaginal culture (IVC)
In Vitro Fertilization Embryo Transfer (FIVET)
Intra cytoplasmic Sperm injection (ICSI)
In vitro oocyte maturation (IVM)
IMSI (Intracytoplasmic Morphologically selected Sperm injection)
pICSI (physiologycal Intracytoplasmic selected Sperm injection)
• IUI (Intra Uterine Insemination)
• GIFT (Gamete Intra Fallopian Transfer)
• IVF (In Vitro Fertilization)
• ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection)
Assisted Reproductive TechnologyAssisted Reproductive Technology
OLIGOSPERMIA SEVERA
≥ 2 MILIONI SPZ MP ≤ 5
≥ 4 % F.N.
Dopo Trattamento
≥ 4 % F.N.
Dopo Trattamento
6.7 →2.1% < 1 mil/ml spz
< 2 mil/ml spz
< 5 mil/ml spz12,8 →5.3%
Tecniche di preparazione del liquido seminale
Swim up da strato:
stratificazione di una aliquota di
terreno di coltura (0,3-0,5ml di
Ham’s f10) su 1 ml di liquido
seminale e incubazione per 45
minuti.
Swim up da pellet:
diluizione 1:2 di terreno di coltura-seme, miscelazione delle due frazioni e centrifugazione a 21 G per 10 minuti. Eliminazione del surnatante, aggiunta di terreno di coltura fino ad un volume max di 0,5 ml e incubazione per 45 minuti.
Tecniche di preparazione del liquido seminale
Gradiente di densità:
45 %
Incubazione inHAMS F10
90 %
seme
Pellet + lavaggio
Isolate 90% + semeCentrifugazione a 21 G
Tecniche di preparazione del liquido seminale
Le tecniche di preparazione del liquido seminale sono finalizzate al medesimo scopo: selezionare gli spermatozoi migliori per eseguire le inseminazioni.
L’efficienza di tali tecniche invece fa riferimento alla percentuale media massima di spermatozoi recuperati in seguito alla loro applicazione e dipende sia dalle caratteristiche del campione di partenza che dalla tecnica utilizzata.
È compito di un operatore esperto discriminare tra le tecniche la più appropriata atta a garantire la migliore qualità e quantità nemaspermica iniettabile
Seme pre-trattamento
AIH - Seme post trattamento
Main indications for insemination with husband’s/partner’s semen
Ejaculatory failure
Anatomical ( hypospadias )
Neurological (spinal cord injury )
Retrograde ejaculation (multiple sclerosis )
Psychological (impotence )
Cervical factor
Cervical mcus hostility , Poor cervical mucusu
Immunological
Male and female antisperm antibodies
Unexplained infertility
Gamete Intra-Fallopian Transfer(GIFT)
Un mix di ovociti e spermatozoi trattati vengono trasferiti nella tuba durante una laparoscopia
OLIGOSPERMIA SEVERA
≥ 0,5 MILIONI SPZ MP/ ml ≤ 1
≥ 4 % F.N.
Dopo Trattamento
Indications :Indications :
Tubal diseaseTubal disease
EndometriosisEndometriosis
Unexplained infertilityUnexplained infertility
Immunological infertilityImmunological infertility
Male factor Male factor
Fertilization In Vitro Embryo Transfer(FIVET)
FIVET - DEMO
FIV - piastra
OLIGOSPERMIA SEVERA
< 1 MILIONI SPZ MP Totali
≥ 4 % F.N.
Dopo Trattamento
Indications for intracytoplasmic sperm injection
Ejaculated sperm• Oligozoospermia• Asthenozoospermia• Teratozoospermia• Antisperm antibodies• Repeated fertilization failure after conventional IVF-ET• Ejaculatory disordes (retrograde ejaculation)
Epididymal spermCongenital bilateral absence of the vas deferens• Failed vasoepididymostomy• Failed vasovasostomy• Obstruction of both ejaculatory ducts
Testicular sperm• All indications for epididymal sperm• Failure of epididymal sperm recovery because of fibrosis• Azoospermia because of testicular failure
(maturation arrest, germ - cell aplasia )• Necrozoospermia
TE.S.A. - Testicular Sperm Aspiration
M.E.S.E. - Microsurgical Epididimal Sperm Aspiration
P.E.S.A. - Percutaneous Epididimal Sperm Aspiration
TE.S.E. - Testicular Sperm Extration
TE.S.E
Cattura spermatozoo
ICSI
PZD-SUZI-ICSI
I.M.S.II.M.S.I
Osservazione ad alto ingrandimento: 6.300 X/13.000X dei vacuoli nucleari degli spermatozoi
p.I.C.S.Ip.I.C.S.I
In natura poco prima dell’ovulazione le cellule del cumulo subiscono un’espansione dovuta alla secrezione di una matrice amorfa contenenti alti livelli di acido ialuronico,
un glicosamminoglicano non solforato con proprietà adesive
Gli spermatozoi maturi, con corretto assetto cromosomico e basse % di frammentazione esprimono recettori di legame all’acido ialuronico (HA)
pICSI
Biopsia PB
Valutazione Trattamento
(FIVET – ICSI)
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 0Day 0Recupero ovocitario
Preincubazione
Produzione seme
PreincubazionePreincubazionePreincubazione
Insemination mediumInsemination medium
No GlucosioNo GlucosioFosfatiFosfatiAA non essenzialiAA non essenzialiGlutamminaGlutammina
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 1Day 1
Osservazione avvenuta fecondazione 16-18 h dalla ICSI / FIVET
1 PN1 PN 2 PN2 PN 3 PN3 PN
EMBRIONE A 4 CELLULE
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 2Day 2
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 3Day 3
EMBRIONE A 8 CELLULE
Cleavage MediumCleavage Medium
GlucosioGlucosioAA essenzialiAA essenzialiAA non essenzialiAA non essenzialiPiruvato Piruvato vitaminevitamineEDTAEDTA
BLASTOCISTI
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 5Day 5--77
Embryo Transfer EcoguidatoEmbryo Transfer Ecoguidato
La tecnica del congelamento ha lo scopo di creare un gradiente di concentrazione che consente all’acqua di uscire dalla cellula e al
crioprotettore di entrare, anche se più lentamente.
I fattori che devono essere tenuti presenti sono:
• Contenuto intracellulare di acqua
• Permeabilità della membrana• Rapporto superficie/volume
della cellula
Gli ovociti hanno un basso rapporto superficie/volume e una quantitàrelativamente alta di acqua intracellulare, necessitano perciò di un raffreddamento più lento rispetto agli embrioni.
Curva di raffreddamento
-60-50-40
-30-20-10
0
102030
Tempo (min)
Tem
pera
tura
(°C
)
CrioconservazioneCrioconservazione
Embrioni 2pnEmbrioni 2pn--8C8C Ovociti MIIOvociti MIIDisidratazioneDisidratazione 1010’’ RT in 1,5 M PrOHRT in 1,5 M PrOH 1010’’ RT in 1,5 M PrOHRT in 1,5 M PrOH
Soluzione Congel.Soluzione Congel. 1,5 M PrOH + 0,1M Sacc.1,5 M PrOH + 0,1M Sacc. 1,5 M PrOH + 1,5 M PrOH + 0,3M0,3M SaccSacc
Curva Curva
CongelamentoCongelamentoRT to RT to ––77°°C a 2C a 2°°C/minC/min RT to RT to ––77°°C a 2C a 2°°C/minC/min
Stop per SeedingStop per Seeding ((--77°°C) per 8C) per 8’’ ((--77°°C) per 8C) per 8’’
Curva CongelamentoCurva Congelamento ((--77°°C) to (C) to (--3030°°C) a C) a
0,30,3°°C/minC/min((--77°°C) to (C) to (--3030°°C) a C) a
0,30,3°°C/minC/min
((--3030°°C) to (C) to (--8080°°C) a C) a
1010°°C/minC/min((--3030°°C) to (C) to (--8080°°C) a C) a
1010°°C/minC/min
Immersione in LNImmersione in LN22 Immersione in LNImmersione in LN22
Testart et al 1986Testart et al 1986
Protocollo di Congelamento lento
CrioconservazioneCrioconservazione
Embrioni 2pnEmbrioni 2pn--8C8C Ovociti MIIOvociti MIIIdratazioneIdratazione 1 M PrOH + 0,2M Sacc. 51 M PrOH + 0,2M Sacc. 5’’
RTRT1 M PrOH + 1 M PrOH + 0,3M0,3M Sacc. Sacc.
55’’RTRT
0,5 M PrOH + 0,2M Sacc. 0,5 M PrOH + 0,2M Sacc.
55’’RTRT0,5 M PrOH + 0,5 M PrOH + 0,3M0,3M Sacc Sacc
55’’RTRT
0,2M Sacc. 50,2M Sacc. 5’’ RTRT 0,3 M0,3 M Sacc. Sacc. 1010’’ RTRT
PBS 10PBS 10’’ RTRT PBS 10PBS 10’’ RTRT
Terreno di Terreno di
colturacolturaCleavageCleavage FertFert
Testart et al 1986Testart et al 1986
Protocollo di Scongelamento
Vitrificazione ovocitiVitrificazione ovociti
Disidratazione 2/3 minuti Sol ADisidratazione 2/3 minuti Sol BDisidratazione 2/3 minuti Sol C
Tuffo in N2 liquido
Crioconservazione SemeCrioconservazione Seme
2 volumi seme + 1 volume crioprotettore30 minuti a -20°C10 minuti sui vapori di N2 liquidoTuffo in N2 liquido
ComplicanzeComplicanze
Perforazione intestinalePerforazione di vasi
Eventi rari
Evento + frequente
Iperstimolazione ovarica severa – immagine R.M.
Iperstimolazione ovarica moderata
Iperstimolazione ovarica lieve (COH)
Follicolo cistico: 10 cm
ComplicanzeComplicanze
Prevenzione
Primaria: cercare di evitare la patologia
Identificazione di pazienti a rischio di OHSS : PCOS, giovane Identificazione di pazienti a rischio di OHSS : PCOS, giovane etetàà, basso peso, , basso peso,
precedenti OHSS, elevato precedenti OHSS, elevato numero di follicoli antrali;numero di follicoli antrali;
Iniziare la stimolazione con dosaggio basso di gonadotropineIniziare la stimolazione con dosaggio basso di gonadotropine
Monitoraggio ecografico e di E2 ravvicinato (numero follicMonitoraggio ecografico e di E2 ravvicinato (numero follicoli > 20/30 ed E2 > oli > 20/30 ed E2 >
2.500/6.000 pg/ml rappresenta un dato prognostico di OHSS)2.500/6.000 pg/ml rappresenta un dato prognostico di OHSS)
Prevenzione
Secondaria: prima della somministrazione di hCG
Sospensione del ciclo;Sospensione del ciclo;
Coasting: prolungamento dellCoasting: prolungamento dell’’intervallo tra lintervallo tra l’’ultima dose di ultima dose di FSH e la FSH e la
somministrazione di hCG (1somministrazione di hCG (1--4 gg)4 gg)
Induzione del picco endogeno di LH con GnRH agonista ad Induzione del picco endogeno di LH con GnRH agonista ad emivita piemivita piùù
breve (< 5 h) rispetto allbreve (< 5 h) rispetto all’’hCG (>24h) hCG (>24h) in prot. con antagonistain prot. con antagonista
Somministrazione di basse dosi di hCG (5000 U.I.)Somministrazione di basse dosi di hCG (5000 U.I.)
PrevenzioneSecondaria: dopo la somministrazione di hCG
Aspirazione di tutti i follicoli e asportazione di grosse quanAspirazione di tutti i follicoli e asportazione di grosse quantittitàà di di
cellule della granulosa;cellule della granulosa;
Crioconservazione degli embrioni: riduce lCrioconservazione degli embrioni: riduce l’’evenienza di forme evenienza di forme severe severe
della sindrome dopo impianto delldella sindrome dopo impianto dell’’embrione;embrione;
Trattamento
L’approccio terapeutico è empirico, basato soprattutto sul trattamento dei segni
e sintomi
Forme lievi e moderate:
Riposo assoluto;
Abbondante introduzioni di liquidi e soluzioni saline
TrattamentoForme severe: ematocrito > 45 %
Ospedalizzazione: emocromo, elettroliti, funzionali tà epatica e renale,
coagulazione, protidemia, albuminemia
Plasma expanders
Diuretici solo se si è ottenuta emodiluizione
Eparina
Dialisi
Eventuale paracentesi transvaginale/transaddominale
Cabergolina: internalizza i recettori del VEGF, da somministrare a
partire dal giorno dell’hCG
Trattamento
Soares, S. R. et al. Hum Reprod Update 2008 0:dmn008v1-13; doi: 10.1093/humupd/dmn008
Cabergolina e ↓ permeabilità vascolare in ratti iperstimolati