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Vall d'Hebron Barcelona Hospital Campus 1 Sempre, el pacient primer
Adoración Blanco Álvarez
16 de noviembre de 2017
La Biología Molecular en el Diagnóstico de las Hemoglobinopatías.
Indicaciones y validación de resultados
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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α y β talasemia HbE HbS
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Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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TIPO DE MUTACIÓN POSIBLE CONSECUENCIA (EJEMPLO)
Mutación puntual Variante sinónima
Variante missense (Hb S, Hb C,.)
Aparición codón stop (Hb McKess Rocks)
Desaparición codón stop (Hb Constant Spring)
Duplicación o deleción de uno
o más genes Pérdida de expresión del gen (α-talasemia)
Pérdida de la expresión de los genes β y δ pero incremento de
la función del gen Gγ (Persistencia de Hb F)
Entrecruzamiento desigual
durante la meiosis
produciendo genes de fusión
Fusión α2α1 (-α3.7 talasemia)
Fusión δβ (Hb Lepore)
Mutaciones indel (frameshift) Alteración en la pauta de lectura ( β-talasemia)
Translocaciones
cromosómicas Triplicación de un gen α
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TÉCNICAS MOLECULARES
Estudio de afinidad por el oxígeno
Estudio de estabilidad molecular
Pruebas de solubilidad
Cuantificación de las fracciones HbA2 y HbF
Electroforesis de Hemoglobinas
HEMOGRAMA
Diagnóstico en el Laboratorio Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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Discrepancia genotipo-fenotipo
Hemoglobinopatías compuestas
Diagnóstico en α-talasemia
Consejo genético
Estudio prenatal
Cuándo realizar estudio molecular en las Hemoglobinopatías Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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• Síndromes drepanocíticos, Hb inestables, Hb de alta afinidad, Hb M
Hemoglobinopatías estructurales
• α-talasemia, β-talasemia
Talasemias
• HB E, HB Lepore, HB Constant-Spring
Variantes de la hemoglobina talasémicas
Persistencia hereditaria de la Hb fetal
Qué estudiar en las Hemoglobinopatías Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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• Mutaciones conocidas y recurrentes PCR
• Grandes deleciones o adiciones conocidas o no MLPA
• Mutación desconocida Secuenciación
Cómo estudiar las
Hemoglobinopatías Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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Hemoglobina S: Qué, Cómo y Cuándo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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Piel F et al. 2017
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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Cribado neonatal
Consejo genético
Discrepancia fenotipo-genotipo
Estudio prenatal
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CASO1
Solicitan estudio familia de un padre y dos hijos con sospecha de α-talasemia.
El padre (35 a) no presenta anemia y VCM 81. Hb F y Hb A2 normal.
Ambos hermanos (6 a y 3 a) presentaban anemia (Hb 12,8 y 12,6) y microcitosis
(VCM 69 y VCM 68). El estudio del metabolismo era normal.
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Harteveld an Higgs Orphanet Journal of rare diseases 2010, 5:13
Mutaciones delecionales de α-talasemia
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TRANS
CIS
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Hidropesia fetal por Hb Bart
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SOUTHERN BLOT POLYMERASE CHAIN REACTION
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Deleción 3,7 Kb de α-tal
GAP-PCR
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PCR e hibridación inversa
• Obtención del ADN
• Amplificación PCR utilizando cebadores marcados con biotina
• Hibridación en tiras contienen sondas alelo-específicas
• Revelación utilizando estreptavidina-fosfatas-alcalina y sustrato de color
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Triplicación alfa
Deleción 3,7Kb
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CASO1
PADRE: Triplicación α
HIJOS: No presentan alteraciones
Solicitan estudio familia de un padre y dos hijos con sospecha de α-talasemia.
Todos presentan microcitosis sin alteraciones en el metabolismo del hierro.
Sospecha de mutaciones puntuales
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• 69 mutaciones puntuales
• Formas no delecionales de alfa talasemia (αTα/αα)
• Afectan:
• secuencias de control de la expresión: CAJA CCAAT Y TATA
• Codón de iniciación y terminación
• Señales de splicing
• Señal de poliadenilacion
• Mutaciones sin sentido
• Modificacion del marco de lectura
• Secuencia de aminoácidos
Mutaciones no delecionales de α-talasemia
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Secuenciación Sanger Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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CASO1
PADRE: Triplicación α
HIJOS: No presentan alteraciones
Solicitan estudio familia de un padre y dos hijos con sospecha de α-talasemia.
Todos presentan microcitosis sin alteraciones en el metabolismo del hierro.
HEMOGLOBINA AGRINIO EN HETEROCIGOSIS
HbVar: Hemoglobina hiperinestable
Microcitosis
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CASO 2
Niña (propositus) de 7 años con Hb 10,7, VCM 64, HbF 7,3%, HbA2 2,7%.
Hermano 9 años con Hb 11.5, VCM 63, HbF 1.8%, HbA2 3.2%.
Madre portadora de α-talasemia, 3,7Kb con leve anemia y microcitosis
Padre no estudiado
SOSPECHA: Niña δβ-talasemia heredada del padre
Hermano α-talasemia heredada de la madre
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CASO 2 Niña (propositus) de 7 años con Hb 10,7, VCM 64, HbF 7,3%, HbA2 2,7%.
Hermano 9 años con Hb 11.5, VCM 63, HbF 1.8%, HbA2 3.2%.
Madre portadora de α-talasemia, 3,7Kb con leve anemia y microcitosis
Padre no estudiado
SOSPECHA: Niña δβ-talasemia heredada del padre
Hermano α-talasemia heredada de la madre
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CASO 2
Estudio α-talasemia: Madre deleción 3,7Kb heterocigosis
Padre normal
Niña normal
Hermano deleción 3,7Kb heterocigosis
Estudio βδ-talasemia: Madre deleción Spanish heterocigosis
Padre normal
Niña deleción Spanish heterocigosis
Hermano deleción Spanish heterocigosis
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Discrepancia genotipo-fenotipo
Hemoglobinopatías compuestas
Diagnóstico en α-talasemia
Consejo genético
Estudio prenatal
Cuándo realizar estudio molecular en las Hemoglobinopatías Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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Vall d'Hebron Barcelona Hospital Campus 34 Sempre, el pacient primer
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