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Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología
Proyecto de Investigación
Bioelectroquímica de Biopelículas y su Influencia en Materiales Metálicos
Para obtener el Título de Ingeniero Biotecnólogo
Presenta: Dalinda Ramírez Espinosa
Director de Tesina: Xóchitl Domínguez Benetton.
Asesor Interno: M. en C. Gloria López Jiménez
México
2007
I
Índice de Contenido
RESUMEN ................................................................................................................................................ VII
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................................... VIII
PARTE I ............................................................................................................................................... XIV
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ XIV
I. 1 INTRODUCCIÓN Y PERSPECTIVAS DEL TRABAJO............................................................................................. 1 I. 2 MARCO TEÓRICO ...................................................................................................................................... 4 I.2.1 BIOPELÍCULAS ........................................................................................................................................ 4
I.2.1.1 Formación de una Biopelícula....................................................................................................... 5 I.2.1.2 Estructura y Arquitectura de una Biopelícula .................................................................................. 6 I.2.1.3 Importancia General de las Biopelículas ...................................................................................... 10
I.2.1.3.1 Importancia de las biopelículas en la Industria Petrolera ................................................................... 11 I.2.2 FUNDAMENTOS GENERALES DE LA BIOCORROSIÓN ..................................................................................... 13
I.2.2.1 Técnicas Electroquímicas para el Estudio de la Biocorrosión ........................................................ 16 I.2.2 .1.1 Potencial de Circuito Abierto .......................................................................................................... 19 I.2.2 .1.2 Espectroscopía por Impedancia Electroquímica .............................................................................. 20
PARTE II ................................................................................................................................................. 26
ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN .................................................................................................. 26
II.1 HIPÓTESIS ............................................................................................................................................. 27 II. 2 ALCANCES Y JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO .............................................................................................. 28 II. 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 30 II. 4 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ................................................................................................................... 31 II.5 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................................ 32 II.5.1 PROCEDIMIENTOS MICROBIOLÓGICOS ..................................................................................................... 33
II.5.1.1 Obtención de Muestras ............................................................................................................ 33 II.5.1.2 Medios de Cultivo e Inóculos .................................................................................................... 33 II.5.1.3 Aislamiento de Bacterias Anaerobias ........................................................................................ 35 II.5.1.4 Caracterización en Microcopio Óptico ........................................................................................ 37
II.5.1.4.1 Determinación de la Pureza de Cultivos .......................................................................................... 37 II.5.1.4.2 Determinación de la Morfología Microscópica .................................................................................. 37
II.5.1.5 Caracterización Macroscópica ................................................................................................... 38 II.5.1.5.1 Formación de biopelículas gas-electrolito ........................................................................................ 38 II.5.1.5.2 Pruebas de Adhesión .................................................................................................................... 38 II.5.1.5.2.1 Análisis superficial ...................................................................................................................... 40
II.5.1.6 Caracterización Cinética a partir de cultivos con sustratos específicos .......................................... 40 II.5.1.6.1 Cultivos con sustratos específicos .................................................................................................. 40 II.5.1.6.2 Cinéticas de Producción de CO2 y Degradación de Compuestos BTX ............................................... 41
II.5.1.7 Caracterización Bioquímica ....................................................................................................... 42 II.5.2 PROCEDIMIENTOS ELECTROQUÍMICOS ..................................................................................................... 44
II.5.2.1 Celdas Electroquímicas ............................................................................................................ 45 II.5.2.2 Potencial de Circuito Abierto ...................................................................................................... 45
II
II.5.2.3 Impedancia .............................................................................................................................. 46 II.5.2.4 Circuitos equivalentes ............................................................................................................... 46
PARTE III. .............................................................................................................................................. 47
RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 47
III. 1 BIOCOMPLEJIDAD Y ESTRATEGIAS MULTICELULARES MICROBIANAS EN GASOLINODUCTOS ............................... 48 III.1.1 RESULTADOS DE LOS CULTIVOS SEMILLA ................................................................................................ 49
III.1.1.1. Cultivos semilla en medio de enriquecimiento ENR .................................................................... 49 III.1.1.2. Cultivos semilla en medio MIN con sustratos específicos ........................................................... 49
III.1.2 RESULTADOS DE LOS AISLAMIENTOS MEDIANTE TUBO RODADO ................................................................. 50 III.1.2.1 RESULTADOS CON MICROORGANISMOS PUROS .................................................................................... 50
III.1.2.2 Resumen de Microorganismos Puros ........................................................................................ 64 III.1.3 FORMACIÓN DE BIOPELÍCULA EN CULTIVOS MICROBIANOS .......................................................................... 67 III.1.4 CINÉTICAS DE PRODUCCIÓN DE CO2 Y DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS BTX ................................................ 69 II.1.5 RESULTADOS DE PRUEBAS DE ADHESIÓN CON CULTIVOS MIXTOS ARTIFICIALES ........................................... 71 II.1.6 ESTRATEGIAS MULTICELULARES ............................................................................................................. 75 III.2.1 RESULTADOS EXPERIMENTALES DE IMPEDANCIA ...................................................................................... 77 III.2.2 ANÁLISIS CON CIRCUITOS EQUIVALENTES ............................................................................................... 80
PARTE IV. .............................................................................................................................................. 87
CONCLUSIÓN GENERALES ............................................................................................................... 87
IV. CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 88
PARTE V. ............................................................................................................................................... 90
REFERENCIAS ...................................................................................................................................... 90
V. REFERENCIAS .......................................................................................................................................... 91
III
Índice de Tablas
Tabla 1. Características de algunas técnicas electroquímicas para la detección de corrosión y efecto de
biopelículas en materiales metálicos. ...................................................................................................... 17
Tabla 2. Datos proporcionados por la tinción de Gram. .......................................................................... 37
Tabla 3. Matriz experimental para los cultivos sustrato-específicos. ..................................................... 41
Tabla 4. Matriz Experimental de los cultivos utilizados para realizar las cinéticas microbianas. ........... 41
Tabla 5. Pruebas bioquímicas que integran la tira API20A .................................................................... 43
Tabla 6. Crecimiento microbiano en fuentes específicas de carbono. ..................................................... 50
Tabla 7. Resultados de la caracterización de la cepa 63-P1. ................................................................... 51
Tabla 8. Resultados de la caracterización de la cepa 64-2 P1 ................................................................. 51
Tabla 9. Resultados de la caracterización de la cepa 64-1 P2 ................................................................ 52
Tabla 10. Resultados de la caracterización de la cepa 68-1 .................................................................... 52
Tabla 11. Resultados de la caracterización de la cepa 68-2 ................................................................... 53
Tabla 12. Resultados de la caracterización de la cepa 69-1 .................................................................... 53
Tabla 13. Resultados de la caracterización de la cepa 71-2 ................................................................... 54
Tabla 14. Resultados de la caracterización de la cepa 74 -2 .................................................................. 54
Tabla 15. Resultados de la caracterización de la cepa 78-1 .................................................................... 55
Tabla 16. Resultados de la caracterización de la cepa 80-1 .................................................................... 55
Tabla 17. Resultados de la caracterización de la cepa 80-2 .................................................................... 56
Tabla 18. Resultados de la caracterización de la cepa 82-1 .................................................................... 56
Tabla 19. Resultados de la caracterización de la cepa 86-2 ................................................................... 57
Tabla 20. Resultados de la caracterización de la cepa 87-1 .................................................................... 57
Tabla 21. Resultados de la caracterización de la cepa 88-2 .................................................................... 58
Tabla 22. Resultados de la caracterización de la cepa 89-P2 .................................................................. 58
Tabla 23. Resultados de la caracterización de la cepa 93-1 ................................................................... 59
Tabla 24. Resultados de la caracterización de la cepa 94-2 .................................................................... 59
Tabla 25. Resultados de la caracterización de la cepa 135 ...................................................................... 60
Tabla 26. Resultados de la caracterización de la cepa 137 ..................................................................... 60
Tabla 27. Resultados de la caracterización de la cepa SEB10. ............................................................... 61
Tabla 28. Resultados de la caracterización de la cepa SEB5. ................................................................. 61
Tabla 29. Resultados de la caracterización de la cepa SEB9. ................................................................. 62
Tabla 30. Resultados de la caracterización de la cepa SEB6. ................................................................. 62
Tabla 31. Resultados de la caracterización de la cepa SEB1 .................................................................. 63
Tabla 32. Resultados de morfología macroscópica y microscópica ........................................................ 64
IV
Tabla 33. Pruebas de adhesión realizadas a cultivos posiblemente puros. .............................................. 66
Tabla 34. Cepas con los mismos resultados en las pruebas bioquímicas y morfología microscópica. ... 66
Tabla 35. Resultados de los microorganismos aislados de muestras de gasolinoductos. ........................ 67
Tabla 36. Crecimiento con sustratos específicos, crecimiento planctónico o en biopelícula. ................. 68
Tabla 37. Nombres completo de los cultivos mixtos , y nombre designado para reportar los datos. ...... 71
Tabla 38. Resultados de las pruebas de adhesión a cultivos mixtos de microorganismos aerobios y
anaerobios. ............................................................................................................................................... 72
Tabla 39. Tabla comparativa de los distintos valores arrojados por el programa Zview en el ajuste de
datos experimentales para diferentes tiempos, para el sistema abiótico. ................................................. 83
Tabla 40. Tabla comparativa de los distintos valores arrojados por el programa Zview en el ajuste de
datos experimentales para diferentes tiempos, en el sistema biótico. ...................................................... 83
V
Índice de Figuras
Figura 1. Esquema de teórico de la formación de una biopelícula sobre una superficie inerte. ................ 6
Figura 2. Representación de la arquitectura heterogénea de una biopelícula ............................................ 8
Figura 3. Representación de la estructura teórica de una biopelícula. ....................................................... 9
Figura 4. Infraestructura de la industria petrolera sobre la que pueden crecer las biopelículas. ............. 12
Figura 5. Los sistemas de distribución (ductos) como bioreactores ........................................................ 13
Figura 6. Modelo teórico de consorcios de bacterias que influyen en la corrosión ................................. 15
Figura 7. Esquema de una biopelícula en el cual los diferentes tipos de microorganismos presentes
inducen un proceso de corrosión localizada]. .......................................................................................... 16
Figura 8. Representación teórica de una celda electroquímica en donde existe la presencia de una
biopelícula. .............................................................................................................................................. 18
Figura 9. Variaciones de OCP dependientes del tiempo influenciadas por Desulfovibrio capillatus y D.
gabonensis en cultivo mixto en agua de mar artificial. ........................................................................... 20
Figura 10. Gráfica que representa una señal sinusoidal a partir de la cual se obtiene la impedancia ..... 20
Figura 11. Esquemas de los tres diagramas que se obtienen en las mediciones de impedancia para una
celda electroquímica ................................................................................................................................ 23
Figura 12. Estrategia experimental del proyecto. ................................................................................... 31
Figura 13. Preparación de medio de cultivo anaerobio. .......................................................................... 34
Figura 14. Técnica de tubo rodado donde se observan los pasos de la misma ........................................ 35
Figura 15. Esquema general de cómo se aísla una colonia tomada de un tubo rodado y se deposita en un
frasco serológico ...................................................................................................................................... 36
Figura 16. a) Acero al carbón SAE5 1018. b) Cupones cortados. ........................................................... 39
Figura 17. Representación gráfica de la tira de reactivos API20A.......................................................... 42
Figura 18. Ilustración de conexiones entre la celda y el equipo de medición ......................................... 44
Figura 19. a) Equipo de medición (potenciostato y FRA) y b) celda electroquímica. ............................ 45
Figura 20. Fotografía de biopelículas creciendo en la interfaz líquido-gas, se observa una capa mucoide
creciendo entre el medio de cultivo, y la atmósfera de nitrógeno. .......................................................... 65
Figura 21. Tinciones de Gram de diferentes muestras de biopelículas anaerobias obtenidas de los
aislamientos realizados en el laboratorio con la técnica de tubo rodado. ................................................ 67
Figura 22. Cinética de degradación de compuestos BTX de de cultivos tomados directamente de las 13
muestras resembradas en medio MIN con sustratos específicos. ............................................................ 70
Figura 23. Cinéticas de producción de CO2 de cultivos tomados directamente de las 13 muestras
resembradas en medio MIN con sustratos específicos. ........................................................................... 70
VI
Figura 24. a) Medio aerobio, consorcio de microorganismos aerobios y anaerobios creciendo en medio
con lactato. b) Medio aerobio, consorcio de microorganismos aerobios y anaerobios creciendo en
medio con compuestos BTX. .................................................................................................................. 72
Figura 25. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental. Testigo; Cupón de Acero al carbón sin
microorganismos. .................................................................................................................................... 73
Figura 26. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental. Muestras DGC11, 400x y DGC17, 2500x
respectivamente; Cupón de Acero al carbón SAE 1018 con microorganismos. ..................................... 74
Figura 27. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental de muestras de cultivos mixtos de bacterias
aerobias y anaerobias. .............................................................................................................................. 74
Figura 28. Posibles estrategias multicelulares en gasolinoductos. .......................................................... 75
Figura 29. Diagrama complejo de los datos experimentales para el sistema abiótico............................. 77
Figura 30. Diagrama complejo obtenido de las mediciones realizadas al sistema biótico. .................... 78
Figura 31. Diagrama de Bode que muestra el ángulo de fase obtenido de los datos experimentales de un
sistema abiótico(a) y un sistema biótico (b). ........................................................................................... 80
Figura 32. Circuitos equivalentes utilizados para el ajuste de datos de impedancia, a) sistema abiótico,
b) sistema con biopelícula. ...................................................................................................................... 82
Figura 33. Diagrama complejo con ajuste de datos de un sistema abiótico ............................................ 85
Figura 34. Diagrama complejo, datos experimentales con ajustes de datos para el sistema abiótico. ... 86
VII
Resumen
El presente trabajo comprende un estudio de biopelículas microbianas que crecen sobre
materiales metálicos, particularmente sobre acero al carbón, por ser el material más utilizado en la
infraestructura de la Industria Petrolera.
Uno de los objetivos principales fue aislar y caracterizar parte de la flora microbiana anaerobia
presente en ductos que transportan gasolina, así como estudiar su influencia bio-electroquímica sobre
acero al carbón SAE 1018, especialmente cuando ocurre la formación de biopelículas. La
determinación de algunas estrategias multicelulares a través de las cuales esta flora anaerobia influye
en la corrosión cuando está en contacto con bacterias degradadoras de benceno, tolueno, xileno,
pentano, MTBE y TBA, fue otro de los objetivos centrales de este trabajo.
Para cumplir dichos objetivos se realizó el aislamiento de algunas bacterias capaces de crecer
en condiciones anaerobias utilizando distintos aceptores de electrones y cultivos sustrato-específicos.
Posteriormente se realizó la caracterización macroscópica, microscópica, bioquímica y cinética de
algunos de los cultivos obtenidos, y se finalizó con la caracterización electroquímica, utilizando la
técnica de Espectroscopía por Impedancia Electroquímica.
Los resultados obtenidos con el monitoreo electroquímico se aproximaron utilizando un análisis
con circuitos eléctricos equivalentes, para simular el efecto de la influencia microbiana en la corrosión
del acero, con el fin de estudiar el comportamiento de la impedancia en el sistema experimental
electrodo-interfaz biológica-electrolito. Además de la Espectroscopia por Impedancia Electroquímica
se utilizó el método electroquímico de medición del Potencial de Circuito Abierto, para complementar
la caracterización del sistema tanto en presencia como en ausencia de biopelículas.
Los resultados que se obtuvieron con este estudio comprenden los aislamientos y de la
caracterización de flora microbiana anaerobia, desde las perspectivas macroscópica, microscópica y
bioquímica, así como la caracterización macroscópica y cinética de cultivos mixtos artificiales, la
caracterización electroquímica con EIS, y los datos obtenidos a partir de un modelo con circuitos
eléctricos equivalentes para la simulación de los resultados de impedancia, todo esto se realizó para
determina el rol de algunas de las biopelículas microbianas estudiadas en la corrosión del acero al
carbón y su relación con las estrategias multicelulares y la biocomplejidad.
VIII
Agradecimientos Formación académica:
La UPIBI ha sido la recta final de una etapa de mi vida que está por concluir, y estoy orgullosa de salir de una escuela que si bien no es extremadamente difícil, tampoco es fácil, requiere básicamente dedicación, trabajo, TIEMPO… La manera en que uno tome las cosas a lo largo de su vida, en todos los ámbitos es cuestión de perspectivas, yo no puedo decir cuál es el nivel académico exacto de la UPIBI; uno lo va construyendo generación tras generación al llevar sus estudios ya sea de manera mediocre o sacando el mayor provecho de cada cosa. Vivimos en país donde en donde la mayoría hace el mínimo esfuerzo, y donde nadie se cree la idea de que las nuevas generaciones somos el futuro y el presente del país, del mundo, y cada quién lo va creando día a día con su manera de vivir, cada quién decide el grado de mediocridad o de productividad que le da a su vida. A las personas que laboran en la UPIBI, de ustedes depende al igual que del alumno el crecimiento del nivel académico y porqué no, del mismo país. Yo aprendí mucho en esta escuela, de los buenos y los malos ejemplos, y agradezco de manera general a todos los profesores que creen en ella, que la quieren y que trabajan por transmitir esa motivación ese buen ejemplo. El nivel de la escuela, depende en gran medida de sus alumnos, pero ustedes son los que nos impulsan y motivan a fijarnos metas. A quienes realmente dan su esfuerzo y dedicación a tener una vida productiva, y transmitir esas ganas a los estudiantes, es a quienes doy gracias. Proyecto Terminal Yo no pensé poder aprender tanto de mí en una materia externa, pero así fue, mi Proyecto Terminal es el primero (espero), de muchos proyectos que deseo realizar con el mismo o más cariño con que realicé éste, y espero siempre contar con una persona que me impulse a buscar lo mejor de mí, que le interese no solo publicar y sacar estudiantes, sino cambiar el entorno de las cosas, que busque no solo las soluciones del problema, sino la manera de integrarlo a la vida diaria, porque si no es así, la investigación se convierte en otra manera lucrativa de vivir y pierde su verdadero significado. Agradezco sinceramente a la persona que me ayudó a formarme esta idea, por el apoyo, la dedicación y paciencia de mi directora de Tesina Xóchitl Domínguez Benetton, de quien he aprendido mucho, y la cual me hizo ver nuevas perspectivas en mi vida académica, y me ha ayudado de manera directa e indirecta a definir más mi rumbo y el tipo de persona que quiero llegar a ser. Por ser además de mi directora de tesina una persona a la cual estimo, admiro y respeto profundamente, por su ejemplo, su esfuerzo y el tiempo dedicado a mis trabajos y a mi formación.
Mil gracias.
A mi asesora interna la Maestra en Ciencias, Gloria López Jiménez, por respetar mis ideas y mi trabajo, por su tiempo dedicado, por su apoyo y sus sugerencias que siempre me fueron de utilidad, por su comprensión y paciencia.
Muchas gracias. A mi evaluadora Maria Elena Rosas, por su apoyo, amabilidad, y esa sonrisa que siempre ha mostrado hacia mí y hacia todos mis compañeros.
Gracias.
IX
A mi familia
A la cual amo profundamente, y que es el núcleo y la columna que me sostiene; gracias, porque todos los sentimientos más nobles los aprendí a su lado.
A mi madre, por se mi mamá y mi amiga, por respetar mis ideas, por apoyarme siempre y en todo
momento, por todas las cosas que nos has dado y enseñado, por nunca dejarnos solas y por tener el
valor de continuar siempre cuando las cosas se ponían más difíciles, por ese gran valor tuyo mamá,
de mirar siempre adelante y querernos como nos quieres, espero de alguna forma regresarte con
creces ese cariño y esfuerzo, espero que te sientas tan orgullosa de mi como yo me siento de ti.
Te amo.
A mis tías; Por ese apoyo incondicional que me brindan, por los cuidados, por los regaños, por todo el tiempo
invertido en mi, por las palabras de aliento, por los abrazos, por ayudarme a crecer en TODOS los
momentos de mi vida, por aguantarme y adaptar de cierto modo su mundo a nosotras, por ese gran
ejemplo de superación que siempre me han inspirado, y por ser para mi y mi hermana uno de los
pilares de nuestra vida, nuestras segundas madres.
Gracias por su enorme cariño, yo he aprendido mucho de ustedes, y sin su presencia la vida
hubiera sido y sería muy diferente.
Muchas gracias por siempre estar ahí al pie del cañón.
A mi hermana, por ser mi mejor amiga, mi confidente y cómplice desde pequeñas, por ser también
un ejemplo y fuente de inspiración para esta carrera, por aguantarme, por regalarme las tardes de
ocio más agradables, y por apoyarme aunque no este de acuerdo siempre con lo que hago, eres la
mejor hermana que pude haber tenido, te quiero.
Gracias por ser siempre constante en mi vida.
A mi familia en general, abuelos maternos y paternos a los cuales adoro, y que siempre logran
hacerme sentir bien, a ambas familias en general les agradezco porque de manera indirecta me
impulsan a crecer, y me dan ánimos, una gran disculpa por desaparecerme parcialmente estos
cuatro años, pero siempre los tengo presentes, y siempre consiguen que una gran sonrisa se forme
en mi rostro, espero se sientan orgullosos de mi.
A Hugo Enrique, que ha sido y será una persona de suma importancia en mi vida, a la cual
quiero y agradezco de manera particular por su apoyo durante la carrera, y en la vida
personal, por que de el obtuve muchas cosas buenas, y crecí a lo largo de este tiempo, por todo
ese apoyo incondicional que nunca voy a olvidar, gracias.
X
A todos mis amigos, a los cuales no alcanzo a nombrar, por falta de espacio, y de palabras, los
quiero mucho, y son para mi el lugar donde me envanezco, porque todos ustedes siempre me
dan palabras de aliento, y yo se, que en muchas ocasiones no son objetivos, pero sus palabras
me llenan de nuevas fuerzas, me ayudan a crecer y me hacen una mejor persona.
Por enseñarme el valor de un texto viejo y gastado de “lo esencial es invisible a los ojos”,
porque cada uno me hace muy feliz al recordarle, y tengo un mundo entero de cosas que me
ligan a ustedes.
A toda la gente que ha creído en mi a lo largo del tiempo, que conoce la infinidad de defectos que tengo, y que sigue apoyándome, a la gente que hace posible que yo quiera ser siempre una mejor persona, a esa que me impulsa con su cariño y ejemplo a superarme día con día. A todas las personas que quiero, a mi familia, a mis amigos, profesores, a toda esa gente que aunque lejos siempre la siento cerca, y de la cual siempre he obtenido una palabra de aliento cuando me encuentro triste. Yo no tengo palabras para decirles lo especial e importante que me hacen sentir. Es tanta y a la vez tan poca la gente que hace que mi vida gire, y que mi indiferencia se convierta en un enorme cariño, y que saque a flote lo mejor de mi, a todos sus abrazos, y sus platicas, y su infinita paciencia para conmigo, a toda la colección de momentos que me han regalado y me regalan. A todos ustedes es a quienes en gran mediada, les debo no solo terminar una etapa más de mi vida escolar, sino ser la persona que soy. A toda esa gente que crece conmigo muy junta o a distancia. Simplemente GRACIAS.
XI
Lista de Símbolos y Abreviaturas EIS Por sus siglas en inglés (Electrochemical Impedance Spectroscopy), Espectroscopía por
Impedancia Electroquímica.
OCP Por sus siglas en inglés (Open Circuit Potential), Potencial de Circuito
SPE Sustancias Poliméricas Extracelulares
BTX Compuestos BTX; Por sus siglas (Benceno, Tolueno y Xileno)
TBA Por sus siglas en ingles, Tertiary-Butyl Alcohol
MTBE Por sus siglas en ingles (Methyl tert-butyl ether)
GSE Por sus siglas en ingles (Gaseous Secondary Electrón), Detector de Electrones Secundarios.
EDS Por sus siglas en ingles (Energy Dispersion Spectroscopy), Espectroscopía por Dispersión de
Energía.
ENA Por sus siglas en ingles (Electrochemical Noise Analysis), Análisis por Ruido Electroquímico.
ESEM Por sus siglas en ingles (Environmental Scanning Electron Microscope), Microscopia
Electrónica de Barrido Ambiental.
MIN Abreviatura de Medio Mínimo; Medio de cultivo con poca concentración de nutrientes.
ENR Abreviatura de Medio Enriquecido; Medio de cultivo con alta concentración de nutrientes.
Z Impedancia.
ω Frecuencia.
φ Ángulo de Fase.
I Corriente.
E Potencial.
RP Por sus siglas en ingles (Redox Potential), Potencial Redox.
TE Por sus siglas en ingles (Tafel Extrapolation), Extrapolación de Tafel.
XII
Léxico técnico
Abiótico: Componentes o factores del medio ambiente que carecen de vida pero que
condicionan la existencia de seres vivos en un determinado entorno, por
ejemplo: fuentes de carbono, minerales, sales
Biocomplejidad: Se refiere al las interacciones complejas del comportamiento biológico, social,
químico y fisiológico de los organismos vivos en su ambiente. El término y el
campo de la investigación son relativamente nuevos y abarcan otros dominios
como biodiversidad, ecología etc.
Biótico: Término para denominar todo lo viviente.
Biopelícula: Conglomerado de microorganismos que posee gran heterogeneidad y que se
forma con capas de células microbianas (aunque también pueden asociarse
organismos mayores) y productos celulares, que son capaces de adherirse a una
superficie sólida, o bien a una interfaz.
Celda electroquímica: Dispositivo aislado en donde se llevan a cabo reacciones de óxido-reducción,
en interacción con un material electroactivo, y que pueden ser medidas por
medio de los componentes presentes en el dispositivo.
Corrosión localizada: Proceso en el cual las áreas anódicas (de oxidación) y las catódicas (de
reducción) están separadas unas de otras dando lugar a la disolución del metal
en un área restringida.
Electrolito: Sustancia que al disolverse en agua, da lugar a la formación de iones.
Microorganismos sésiles: Microorganismos que crecen sobre superficies o se asocian a interfases a las
que pueden adherirse por medio de las sustancias poliméricas celulares (matriz
extracelular, glicocálix) o bien mediante la utilización de flagelos o pili, entre
otros mecanismos.
Microorganismos planctónicos: Microorganismos de vida libre, que viven dispersos en un ambiente, en
el que no se han adherido a una superficie o interfaz.
XIII
Millardo: Un millardo es el número natural equivale a 109 (1 000 000 000) cuyo nombre
usual es mil millones.
Mineralización: Proceso en el cual compuestos orgánicos son oxidados hasta compuestos
inorgánicos, por medio de reacciones metabólicas de microorganismos, por
ejemplo: la conversión del benceno hasta CO2 y H2O es un proceso de
mineralización.
Pasivación: Término utilizado en corrosión para definir la protección de un dispositivo en
estado sólido. Sucede cuando crece una capa de oxido (u otro producto de
corrosión) en la superficie de una superficie electroactiva o semiconductora
para proveer estabilidad eléctrica al sistema y se refleja en un cambio de
potencial a un valor mucho más positivo que aquél del material en su estado
activo.
1
I. 1 Introducción y Perspectivas del Trabajo
La organización característica de las comunidades microbianas ocurre en forma de biopelículas,
tanto en los ambientes naturales como en aquellos establecidos por el hombre, debido a que la mayoría de
las superficies o interfases pueden proporcionar grandes ventajas para la vida microbiana que las vuelven
un hábitat potencialmente colonizable, como son: una alta concentración de nutrientes, protección contra
el esfuerzo de corte, protección contra compuestos antimicrobianos, posibilidades para el intercambio de
material genético, entre otros factores.
Las biopelículas han demostrado utilidad para diversas aplicaciones, por ejemplo, en el
tratamiento de aguas residuales o efluentes, en procesos industriales de biotransformación para la
producción de metabolitos secundarios, en sistemas para producción de energía y en la bioremediación de
contaminantes [GERARD H. MARKX y col., 1990], entre otras aplicaciones. Sin embargo, también es
conocido que las biopelículas frecuentemente causan o influyen en serios problemas, como el
bioensuciamiento, el biodeterioro, la biocorrosión, la contaminación de procesos o implantes médicos, las
enfermedades infecciosas, que generalmente se asocian a grandes pérdidas humanas, ambientales y
económicas [DOMÍNGUEZ B. X., 2007].
Dentro de los problemas más relevantes, en cuestión de pérdidas económicas, se encuentra la
biocorrosión, en la que las biopelículas influyen en los procesos de degradación metálica que resultan en
la disolución de los metales, lo cuál repercute en una gran variedad de industrias, como la del papel, la
naval, la petrolera, la geotérmica, en las cuales el mantenimiento de las instalaciones, a consecuencia de la
corrosión, es un egreso económico significativo. Tan solo en los Estados Unidos de Norte América
(EUA) los costos relacionados con la corrosión metálica se estimaron para el año 2001 en 276 millardos
de dólares por año [CC TECHNOLOGIES y col., 2001], lo cual equivale aproximadamente al 3.2% del
Producto Interno Bruto (PIB, PPA) de ese país en ese año [DOMÍNGUEZ B. X, 2007].
Una de las industrias más susceptibles a la corrosión es la industria petrolera, debido a que gran
parte de su infraestructura se encuentra expuesta al ambiente, y muchas veces en contacto con agua no
estéril que permite la proliferación de microorganismos. Se ha estimado que en esta industria algunas de
las pérdidas relacionadas con la presencia microbiana pueden llegar a representar entre 10 % y 50 % del
daño total por corrosión, lo cuál para el caso de EUA se traduce en pérdidas de 27.6 millardos a 138
millardos de dólares por año.
2
En México no se tienen estadísticos reportados al respecto, sin embargo, se estima que las
pérdidas económicas relacionadas con la corrosión se aproximan al 5% del PIB (PPA) [DOMÍNGUEZ B.
X, 2007], el cuál para el año 2006 correspondió a 1072 millardos de dólares [CENTRAL INTLLIGENCE
AGENCY, 2007] y por consecuencia, la biocorrosión podría haber representado aproximadamente de
5.36 millardos a 26.8 millardos de dólares tan sólo para ese año en nuestro país [DOMÍNGUEZ B. X.,
2007].
La biocorrosión originada por el bioensuciamiento en la industria petrolera se produce en los
procesos de extracción, procesamiento, distribución, almacenamiento y transporte [SANDERS P.J. y col.,
2005], tanto de productos crudos como refinados. En dichas operaciones de la industria del petróleo los
problemas originados por la actividad de microorganismos son particularmente difíciles de diagnosticar,
evaluar y controlar. Por ello, resulta necesario estudiar y desarrollar nuevos métodos y herramientas para
obtener información de los fenómenos relacionados con estas estructuras biológicas que tienen influencia
en la corrosión.
La caracterización de las comunidades microbianas nativas de esta industria (y otras) y la
determinación de sus posibles interacciones y complejidad, asociadas al ambiente al que se encuentran
expuestas (biocomplejidad), son importantes para incrementar el conocimiento de las especies
microbianas involucradas en los problemas de corrosión, con el fin de obtener información que permita
desarrollar nuevas estrategias para su detección, monitoreo y control. Esto es de especial importancia en
aquellos sistemas de la industria petrolera para los que se carece de dicha información o que ésta es
mínima, por ejemplo, los poliductos (que transportan diesel, gasolina y otros productos), las torres de
enfriamiento y los tanques de almacenamiento de productos terminados, entre otros.
Por otra parte, el seguimiento en tiempo real de la influencia de biopelículas en materiales
metálicos es uno de los puntos críticos que se necesitan abatir para poder obtener información acerca de la
influencia microbiana en los sistemas industriales, para lo cuál las técnicas electroquímicas proporcionan
una alternativa, cuyo uso se ha incrementado debido a la los resultados y análisis que permiten obtener,
debido a la naturaleza electroquímica de estos sistemas [THOMAS R. J. y col. 2002; DOMÍNGUEZ B.
X, 2007]. La Espectroscopía por Impedancia Electroquímica (EIS) ha sido utilizada previamente en
estudios de biocorrosión [MANSFELD F. y col., 1990; MANSFELD F. y col., 1991; MONFORT N,
2001; DUBIEL M., y col., 2002], entre otras investigaciones, ya que permite calcular información
fenomenológica y mecanística de los eventos involucrados en estos procesos (reacciones en fase
homogénea, difusión, adsorción) [CHEN G. y col., 1997; DOMÍNGUEZ B. X, 2007].
3
A pesar de ello, la mayoría de los estudios de biopelículas que se han realizado al presente con EIS son
analizados mediante la aproximación de su comportamiento con circuitos eléctricos equivalentes
[RIVERO-HUDEC M. A., 2004; ÖRNEK D., 2002B; ZUO R. y col., 2004], sin considerar la distribución
de corriente y potencial que ocurre a lo largo del sistema, sino considerando contribuciones globales, que
usualmente ofrecen un análisis poco sustancial a cerca del comportamiento de estas estructuras biológicas
y las reacciones electroquímicas que suceden asociadas a las mismas [DOMÍNGUEZ B. y col., 2007].
Un análisis más profundo utilizando este tipo de aproximación requiere realizar muchos cálculos y
conocimientos avanzados de electroquímica.
Como consecuencia de los aspectos mencionados anteriormente, es que se realizó este trabajo de
investigación, el cuál se presenta en este documento dividido en dos partes: 1) el aislamiento y
caracterización de parte de la flora microbiana anaerobia presente en ductos que transportan gasolina—lo
cual no se ha encontrado reportado en documentos de dominio público o científico hasta el momento—
desde los puntos de vista macroscópico microscópico, bioquímico y cinético, cuyos resultados y discusión
se presentan en la sección III.1 de este documento, a partir de lo cuál se determina parte de la potencial
biocomplejidad y algunas de las estrategias multicelulares a través de las cuales la flora microbiana
anaerobia proveniente de estos sistemas puede influir en la corrosión, cuando está en contacto con
bacterias degradadoras de benceno, tolueno, xileno, pentano, MTBE y TBA; y 2) la caracterización
electroquímica, utilizando las técnicas de potencial de circuito abierto y de espectroscopía por impedancia
electroquímica, cuyos resultados se analizan a través de el uso de circuitos eléctricos equivalentes para
determinar la influencia de algunas de las biopelículas estudiadas en la corrosión del acero al carbón,
cuyos resultados y discusión de presentan en la sección III.2 de este documento.
4
I. 2 Marco Teórico
I.2.1 Biopelículas
El crecimiento microbiano asociado a superficies o interfases es el estilo de vida predominante de
estos seres vivos: aproximadamente el 95% de los microorganismos lo realizan en condiciones naturales
y son capaces de formar una biopelícula, siempre y cuando haya presente al menos una mínima
concentración de agua que contenga los nutrientes necesarios, asociada al medio en el que se encuentran
[EVANS L. V., 2000].
Una biopelícula se puede definir como un conglomerado de naturaleza biológica que posee gran
heterogeneidad y que se forma con capas de células microbianas (aunque también pueden asociarse
organismos mayores) y productos celulares, que son capaces de adherirse a una superficie sólida (viva o
inerte), o bien a una interfaz (líquido-sólido, líquido-gas). Estas estructuras biológicas se forman a partir
de microorganismos sésiles que producen una matriz (glicocálix) de sustancias poliméricas extracelulares
(SPE), la cuál les brinda posibilidades de adhesión, soporte y protección ante las diferentes formas de
estrés a las que los microorganismos pueden estar expuestos [DAVEY M. E. y col., 2000; COSTERRON
J. W., 1999; WATNICK P., y col., 2000; CENTER FOR BIOFILM ENGINEERING., 2006;
PICIOREANU C., 1999; DOMÍNGUEZ B. X, 2007].
Los microorganismos contenidos en una biopelícula pueden pertenecer a una misma o diversas
especies distribuidas en su estructura, siendo la matriz de SPE lo que mantiene la cohesión y las
posibilidades de interacción entre ellos [HARRISON J.J., y col., 2005].
El crecimiento en una biopelícula provee grandes ventajas en comparación con el crecimiento
planctónico (de vida libre), la proximidad física de distintas células favorece las interacciones
sinérgicas—especialmente cuando se forman consorcios microbianos complejos—cuyas células se
distribuyen naturalmente de acuerdo con sus requerimientos de crecimiento (aerobias estrictas, aerobias
facultativas, anaerobias estrictas, acidófilas, oligotróficas).
5
Como consecuencia, dentro de las biopelículas se pueden originar distintas condiciones y
gradientes, por ejemplo: zonas de aireación diferencial, zonas de acidificación diferencial, zonas de
concentración de iones que favorecen el establecimiento de estas complejas comunidades simbióticas
[HARRISON. J. J., y col., 2005; DOMÍNGUEZ B. X., 2004].
La incorporación de un microorganismo a una biopelícula le provee de grandes ventajas, como
son: la posibilidad de transferencia horizontal de material genético entre su misma y otras especies, la
utilización conjunta de subproductos metabólicos, una mayor tolerancia a compuestos antimicrobianos,
protección ante los cambios del microambiente y una defensa frente al sistema inmunitario o
depredadores, según sea el caso, lo cuál depende del ambiente en el que se forme la biopelícula
[HARRISON. J. J., y col., 2005].
I.2.1.1 Formación de una Biopelícula
La formación de una biopelícula comienza con la acumulación de nutrientes en una superficie (o
una interfaz) debido a la porosidad del material, a las interacciones electrostáticas, a fenómenos de
adsorción y a factores electroquímicos, que propician que haya un aumento en la concentración de
nutrientes [DOMÍNGUEZ BENETTON, 2007; DOMÍNGUEZ B. X, 2007]. Posteriormente ocurre la
adsorción reversible de algunas células planctónicas a la superficie pre-acondicionada; en un principio las
células se adsorben débilmente, posteriormente se forman pequeñas colonias que, si no son rápidamente
removidas, comienzan un proceso de adhesión irreversible a la superficie [VIDELA H. A. 1996].
Los primeros microorganismos que se establecen en una biopelícula, formando colonias, facilitan
la llegada de otras células al generar más sitios a los cuales éstas pueden adherirse, aumentando así la
producción de las SPE que mantendrán a la biopelícula unida [PRAKASH B. y col., 2003].
Cuando la biopelícula ha alcanzado un estado maduro y una determinada concentración de
microorganismos ocurre el desprendimiento de algunas células o conglomerados celulares—proceso
principalmente activado por moléculas de señalización (fenómeno de percepción de quórum o quorum
sensing); dichas células migran para repetir el proceso y formar nuevas biopelículas o asociarse a otras ya
establecidas, de las cuales incrementan su complejidad, la Figura 1 ilustra el proceso de la formación de
una biopelícula [CENTER FOR BIOFILM ENGINEERING, 2005].
6
Figura 1. Esquema de teórico de la formación de una biopelícula sobre una superficie inerte
[HARRISON J. J. y col., 2005].
Una vez que la biopelícula alcanza un estado maduro puede tener diferentes propiedades
heterogéneamente distribuidas, las estructuras que llegan a formar son muy diversas, y éstas dependen en
gran medida de los factores ambientales a los que la biopelícula se encentre expuesta.
I.2.1.2 Estructura y Arquitectura de una Biopelícula
Durante los procesos de formación y maduración de las biopelículas éstas se tornan únicas, tanto
en estructura como en arquitectura, aunque pueden hacerse algunas consideraciones universales para
describirlas. Factores abióticos, tales como el pH, la temperatura, la concentración de nutrientes, la
viscosidad del medio, la concentración de oxigeno, determinan el tipo de distribución que la biopelícula
adoptará.
Las biopelículas no son monocapas continuas de microorganismos, sino microcolonias que crecen
distribuidas heterogéneamente; como consecuencia, dentro de la biopelícula pueden ocurrir diferentes
interacciones entre microorganismos, ubicándose cada uno en las condiciones que resultan óptimas para
su crecimiento.
Así, en la estructura madura de una biopelícula están contenidas las colonias desarrolladas de
bacterias embebidas en SPE, que pueden encontrarse separadas por vacíos intersticiales o canales que se
7
forman en presencia de un fluido (estático o en movimiento) al que la biopelícula esta expuesto (Figura
2), estos canales favorecen el transporte de nutrientes, oxígeno, e incluso agentes antimicrobianos,
principalmente por difusión [DONLAN M. R. y col., 2002].
Esta forma de crecimiento resulta en heterogeneidades desde diferentes perspectivas, desde su
arquitectura, que puede resultar en tapices (tapetes microbianos), agregados, promontorios o incluso
microcolonias de mayor complejidad que generan formaciones con aspecto de tallos o setas, dependiendo
del entorno, hasta heterogeneidades de los siguientes tipos [PICIOREANU C., 1999]:
o Heterogeneidad geométrica: espesor de la biopelícula, su rugosidad superficial,
su porosidad, la cobertura superficial del sustrato
o Heterogeneidad química: diversidad de los solutos químicos (nutrientes,
productos metabólicos, inhibidores), gradientes de oxigeno y pH, diversidad de reacciones
(aerobias/anaerobias), gradientes iónicos
o Heterogeneidad biológica: diversidad de especies microbianas y su distribución
espacial, densidad celular, diferencias es la actividad celular (fase de crecimiento,
producción de SPE, células muertas), diversidad metabólica (metanogénesis, sulfato-
reducción, nitrato-reducción)
o Heterogeneidad física: densidad, permeabilidad, viscoelasticidad, fuerza,
difusividad, presencia de sólidos abióticos, propiedades de las SPE, propiedades magnéticas
y eléctricas del sustrato
o Heterogeneidad electroquímica: Diferencias de potencial, distribución de ánodos
y cátodos, propiedades conductivas, condiciones de potencial y de pH, distribución de cargas,
distribución de sitios activos, zonas electroactivas, estructuras metalúrgicas heterogéneas,
localización de defectos [DOMIGUEZ B. X., 2007].
Todos estos tipos de heterogeneidades son consecuencia de los procesos característicos de
adhesión que presentan las biopelículas.
8
Figura 2. Representación de la arquitectura heterogénea de una biopelícula [Reproducido de:
EHP, 1998].
Por otra parte, la matriz de SPE de una biopelícula puede ser considerada similar a un hidrogel—
un polímero complejo hidratado—cuyo contenido acuoso supera en gran medida su propio peso seco
[HARRISON J. J., 2005]. Estas características confieren a la biopelícula fluidez y elasticidad
(propiedades viscoelásticas) suficientes para que ésta soporte los cambios en el esfuerzo de corte cuando
se encuentra expuesta a un fluido circundante en movimiento.
Así, en la estructura y arquitectura heterogéneas de las biopelículas están contenidas las células,
que ocupan entre 5% y 25% del espacio total, y el glicocálix, formado por polímeros, ADN y proteínas,
que ocupa entre 50% y 90% [HARRISON. J. J., y col., 2005; DONLAN M. R. y col., 2002]. Además de
los componentes celulares y la matriz polimérica, las biopelículas también están compuestas de materia
adsorbida y absorbida, solutos orgánicos, iones metálicos y partículas inorgánicas [DILLON C. P., 1982,
DOMÍNGUEZ B. X., 2007], entre otros (Figura 3).
Las SPE y las células están generalmente dotadas de carga negativa [HARRISON J. J. y col.,
2005; PAPAVINASAM S., 2007] (Figura 3), lo cuál favorece el atrapamiento de partículas que sirven
como alimento a las células, además de arcilla y otros minerales. La materia atrapada genera nichos
microscópicos con microentornos distintos.
9
Figura 3. Representación de la estructura teórica de una biopelícula [Modificado de: HARRISON
J. J. y col., 2005].
Los microorganismos que son afines o manifiestan sus propias necesidades individuales se
agrupan en estas microzonas que les proporcionan las condiciones que más los favorecen, formando así
un consorcio microbiano diversificado [CENTER FOR BIOFILM ENGINEERING (2006), MONTANA
STATE UNIVERSITY].
Adicionalmente, la estructura y arquitectura de las biopelículas permiten que se lleve a cabo un
mecanismo de comunicación intracelular, conocido como quorum sensing (QS), ó fenómeno de
percepción de quórum, el cual consiste en la producción de moléculas señalizadoras por las células
[WATERS M. C. y col., 2005]. Este mecanismo es uno de los aspectos más importantes, y sin embargo
aún altamente enigmáticos, de las comunidades de bacterias que viven en estas estructuras biológicas.
El QS provee a los microorganismos en una biopelícula de un sistema de comunicación mediante
señales bioquímicas (llamados autoinductores o feromonas), utilizando moléculas como las N-acyl
homoserin lactonas (AHL); existen evidencias de que algunas de estas señales producidas por las células
y transmitidas a otras membranas extracelulares pueden ser interpretadas no sólo por los miembros de la
misma especie, sino también por otros géneros microbianos [ BASSLER B. L. , 2006; UNQSR, 2006].
La función principal de este mecanismo de señalización es regular el crecimiento de la población a través
de la detección de la concentración celular crítica dentro de la biopelícula [CENTER FOR BIOFILM
ENGINEERING (2006), MONTANA STATE UNIVERSITY; MILLER M. B. y col., 2001].
10
I.2.1.3 Importancia General de las Biopelículas
Las biopelículas son capaces de crecer en una gran diversidad de condiciones, incluyendo lugares
altamente inhóspitos; pueden crecer en ríos, sobre la superficie de los dientes, en algunas estructuras de
plantas, en el tracto digestivo de algunos animales, en tejidos humanos, en lentes de contacto, en torres de
enfriamiento, en los cascos de los barcos, en implantes médicos, en instalaciones de la industria
alimenticia, en ductos y tuberías [CENTER FOR BIOFILM ENGINEERING (2006), MONTANA
STATE UNIVERSITY].
La capa viscosa que recubre las rocas de un río o de un arroyo corresponde a una biopelícula, la
quilla de acero de un barco en alta mar se recubre con biopelículas que incrementan la resistencia al
movimiento del buque y afectan, por tanto, su velocidad. Algunas biopelículas, formadas por especies de
Archaea, línea ancestral de procariotas (organismos carentes de núcleo), sobreviven incluso en
ambientes extremos como los manantiales termales y fumarolas volcánicas submarinas [HARRISON J. J.
y col., 2005]. Otras biopelículas causan estragos en la industria petrolera, al promover la corrosión de los
metales y reducir el tiempo de vida de los ductos y tanques de almacenamiento [VIDELA H. A. 1996;
DOMÍNGUEZ B. X., y col., 2007]. En su amplia capacidad para desarrollarse casi en cualquier
ambiente radica su importancia, principalmente, debido a que en muchos casos este crecimiento tiene
repercusiones económicas.
Las biopelículas causan arriba del 80% de las infecciones microbianas que afectan a la salud
humana en EUA, el costo asociado con el tratamiento de estas infecciones es de más de un millardo de
dólares por año. Asimismo, las biopelículas contribuyen a las infecciones en implantes médicos, tales
como catéteres, las cuáles en EUA han ocasionado hasta 10,000 muertes por año y representan un costo
de más de 11 millardos de dólares anuales en hospitales [FINE D., 2005]. El 20% de los catéteres que
han sido implantados (en vías urinarias), en más de 5 millones de pacientes en Estados EUA, han
adquirido infecciones por biopelículas, lo cuál ha resultado en costos de 1.6 millardos de dólares por año
[DOMÍNGUEZ B. X., 2007]. Además, alrededor de 70,000 personas en el mundo han sido
diagnosticadas con fibrosis quística, enfermedad causada por biopelículas de Pseudomonas aeruginosa
[MBEC BIOPRODUCTS, 2006]; tan solo en esta enfermedad anualmente se gastan de 5 a 7 millardos de
dólares en cuidados médicos [DOMÍNGUEZ B. X., 2007].
11
Una de las industrias más susceptibles a la corrosión es la industria petrolera, debido a que gran
parte de su infraestructura se encuentra expuesta al ambiente, y muchas veces en contacto con agua no
estéril que permite la proliferación de microorganismos. Tan solo en los EUA los costos relacionados con
la corrosión metálica se estimaron para el año 2001 en 276 millardos de dólares por año [CC
TECHNOLOGIES, NACE INTERNATIONAL, 2001], lo cual equivale aproximadamente al 3.2% del
Producto Interno Bruto (PIB, PPA) de ese país en ese año [DOMÍNGUEZ B. X, 2007]. Se ha estimado
que en esta industria algunas de las pérdidas relacionadas con dicha presencia microbiana pueden llegar a
representar entre un 10 % y 50 % del daño total por corrosión, lo cuál para el caso de EUA se traduce en
pérdidas de 27.6 millardos a 138 millardos de dólares por año. En México no se tienen datos estadísticos
reportados al respecto, sin embargo, se estima que las pérdidas económicas relacionadas con la corrosión
se aproximan al 5% del PIB (PPA) [DOMÍNGUEZ B. X, 2007], el cuál para el año 2006 correspondió a
1072 millardos de dólares [THE WORLD FACTBOOK., 2007] y por consecuencia, la biocorrosión
podría haber representado aproximadamente de 5.36 millardos a 26.8 millardos de dólares tan sólo para
ese año en nuestro país [DOMÍNGUEZ B. X, 2007]. También en EUA, en la industria de refinación de
petróleo, se estima que las pérdidas causadas por bioensuciamiento han excedido los 1.4 millardos de
dólares anuales [KNUDSEN J. G, 1981; DOMÍNGUEZ B. X., 2007].
La formación de biopelículas en intercambiadores de calor ha causado perdidas económicas de
millones de dólares anuales a nivel mundial, debido a que el bioensuciamiento limita la transferencia de
calor en estos sistemas [PHILIP-CHANDY R. y col., 2000], en los que es necesario remover las
biopelículas por medio de agentes químicos o mecánicos.
En general, los gastos ocasionados por el crecimiento de biopelículas en industrias, ciudades y
hospitales son aproximadamente de 500 millardos de dólares anuales sólo en EUA, debido a daños en los
equipo, a la contaminación de productos, a las pérdidas de energía y a las infecciones médicas
[DOMÍNGUEZ B. X., 2007].
I.2.1.3.1 Importancia de las biopelículas en la Industria Petrolera
Como se ha mencionado anteriormente en este documento, entre los contextos susceptibles a la
formación de biopelículas se encuentran algunos ambientes industriales, como los procesos de tratamiento
de aguas, la industria de manufactura del papel y la industria petrolera, entre otras. En la industria del
petróleo, las biopelículas pueden estar implicadas en una gran diversidad de procesos, desde la extracción
del crudo, hasta los tanques de almacenamiento de producto terminado [PADILLA V. A. A., 2002;
12
DOMINGEZ B. X., 2005], donde pueden producir ácido sulfhídrico (que tiene efectos en la corrosión de
los metales), producir importantes masas de SPE que pueden llegar a obstruir el paso de fluidos en
tuberías, canales de circulación, o filtros, (proceso conocido como bioensuciamiento), y pérdidas en la
transferencia de calor en intercambiadores, entre otros problemas [VIDELA H. A., 1995].
La industria petrolera cuenta con una amplia infraestructura en donde pueden crecer las
biopelículas [PADILLA V. A. A., 2002]. En la Figura 4 se pueden apreciar algunas de las estructuras de
esta industria que son potenciales de ser invadidas por biopelículas, las cuáles son, principalmente,
estructuras que están en contacto con agua no estéril o con fluidos que tienen un porcentaje de agua no
estéril asociado.
Figura 4. Infraestructura de la industria petrolera sobre la que pueden crecer las biopelículas.
[PADILLA V. A. A., 2002; DOMINGUEZ B. X., 2005; Reproducido de: DOMIGUEZ B. X., 2007]
En México, la industria petrolera cuenta con más de 50,000 km de ductos (más de 12,000 tan sólo
en la industria de refinación) [PEMEX, 2006], de los cuales se ha reportado que aproximadamente el 68
% son considerados de alto riesgo—en términos de corrosión—debido a sus condiciones de operación y
mantenimiento [IMP, 2004].
13
En el caso de ductos que transportan gasolina (gasolinoductos) puede ocurrir que por cada gramo
de gasolina que es transportada pueda haber 0.01 o más, e incluso hasta un 1% de agua (en algunos casos
puede estar presente en mayor o menor cantidad) [DOMÍNGUEZ B. X. y col., 2007]; estas
concentraciones pueden ser suficientes para que el desarrollo de microorganismos se lleve a cabo,
incluyendo a aquellos capaces de formar biopelículas [DOMÍNGUEZ B. X. y col., 2007].
En los gasolinoductos la actividad de las biopelículas puede potencialmente ocasionar
bioensuciamiento y biocorrosión—uno de los principales daños en los que influyen—tanto dentro como
fuera de los ductos y en el equipo asociado o utilizado en los mismos [CENTER FOR BIOFILM
ENGINEERING, MONTANA STATE UNIVERSITY., 2006; DOMÍNGUEZ B. X, 2007; DOMÍNGUEZ
BENETON X. y col., 2007 ], ya que en dichos sistemas los microorganismos podrían encontrar los
nutrientes y condiciones abióticas que hacen a estos sistemas funcionar como grandes bioreactores que
favorecen el establecimiento de las complejas comunidades simbióticas, como ocurre en otros sistemas de
distribución (Figura 5).
Figura 5. Los sistemas de distribución (ductos) como bioreactores [CENTER FOR BIOFILM
ENGINEERING., 2006].
I.2.2 Fundamentos Generales de la Biocorrosión
La forma en que una biopelícula se desarrolla depende de los factores presentes en el ambiente en
el que crece y de los microorganismos que la conforman. En la industria petrolera, por ejemplo, ocurre la
interacción entre la biopelícula y el sustrato metálico sobre el que crece—con nutrientes adsorbidos a la
superficie—por lo que se crea un nuevo ambiente físico-químico con influencia biológica en donde
existen tres fases: un metal, una biopelícula incorporada con productos de corrosión y un electrolito. El
14
proceso de biocorrosión ocurrirá siempre y cuando se encuentren presentes estos tres elementos
[DOMÍNGUEZ B. X, 2007].
La biocorrosión se refiere al proceso de degradación metálica en el que la actividad microbiana es
un factor con influencia significativa en el proceso de disolución. Dentro de los procesos de biocorrosión
ocurren diferentes reacciones electroquímicas, de las cuales las más importantes (cuando el material
metálico es acero) son la oxidación del hierro (Fe) y la reducción del agua (H2O), ya que son las
reacciones limitantes del proceso de corrosión [STOECKER II J. G., 2001], como se muestra a
continuación:
Reacción de oxidación:
−++↔ eFeFe 22
Evolución del hidrógeno:
222 HeH ↔+ −+
Reacción de reducción:
En medio alcalino:
−− +→+ OHHeOH 222 22
En medio ácido:
OHeHO 22 244 →++ −+
En medio neutro:
−−→++ OHeOHO 222 22
Sin embargo, bajo la presencia de una biopelícula, existen además otros procesos que pueden
controlar directa o indirectamente el proceso de corrosión, ya que cuando ésta crece sobre una superficie
metálica es capaz de generar un metabolismo cooperativo integral (Figura 5) que contribuye al
establecimiento de diferencias de potencial favorables para la ocurrencia y mantenimiento de los procesos
electroquímicos implicados en la biocorrosión [CHARACKLIS W. G. y col., 1983; DOMÍNGUEZ
BENETTON X y col., 2005,], además de afectar en los procesos difusionales [DOMÍNGUEZ B. y col.,
2007; DOMÍNGUEZ B. y col 2005].
15
Figura 6. Modelo teórico de consorcios de bacterias que influyen en la corrosión [Elaboración personal a
partir de: STOECKER II J.G., 2001; CHOUDHARY S.G., 1998].
Debido a la gran complejidad de las biopelículas, mencionada anteriormente, se establecen zonas
de gran heterogeneidad estructural sobre la superficie del metal, que desde el punto de vista de la
corrosión favorecen la separación de cátodos y ánodos—sobre los últimos es que se favorece la formación
de las colonias microbianas—incrementando los procesos de corrosión localizada. Cuando existe una
colonización bacteriana no uniforme, como ocurre en presencia de una biopelícula, se pueden formar
zonas en las que se crean gradientes de concentración de oxigeno, entre otros, generando diferencias de
potencial y por consecuencia de corrientes de corrosión, lo cual conduce a la disolución del metal; esto
también puede ocurrir cuando existen consorcios en los que se ven involucrados productos de corrosión
tales como el ácido sulfhídrico producido por las BSR (Bacterias Sulfato Reductoras), las cuales suelen
incrementar las posibilidades de que ocurran fenómenos de corrosión localizada como se observa en la
Figura 6 [MONFORT M. N., 2001].
Para la biocorrosión, generalmente se utilizan productos antimicrobianos, usualmente en ductos,
torres de enfriamiento, u otras estructuras de la industria petrolera, con el fin de eliminar la fuente de
biocorrosión; sin embargo, estor productos no logran desaparecer por completo la carga microbiana, ya
que la presencia del exopolímero afecta la difusión de estos compuestos, que en condiciones de
laboratorio regularmente se prueban solamente con microorganismos planctónicos, cuando en una
biopelícula sólo solo acabarían con microorganismos en algunas regiones más susceptibles, por su
posición en la biopelícula, por el retardo en la difusión del compuesto y por su degradación [RODNEY
M. D., 2002].
16
Figura 7. Esquema de una biopelícula en el cual los diferentes tipos de microorganismos presentes
inducen un proceso de corrosión localizada (BSR: Bacteria Sulfato Reductoras, NR: Bacterias Nitrato
Reductoras, TSR: Bacterias Tiosulfato Reductoras, FeR: Bacterias Reductoras de Hierro) [DOMÍNGUEZ
B. X., 2003].
I.2.2.1 Técnicas Electroquímicas para el Estudio de la Biocorrosión
El seguimiento en tiempo real de la influencia de biopelículas es uno de los aspectos más
importantes dentro de este proyecto. Las técnicas electroquímicas existentes proporcionan una alternativa
para la medición de la influencia en la corrosión de los sistemas con biopelículas presentes (Tabla 1).
Por medio de estas técnicas se pueden estudiar sistemas donde exista la interacción electrodo-
interfaz-electrolito, incluyendo aquellos sistemas donde existe una biopelícula presente, la cual puede
convertirse en un factor que acelera o retarda las reacciones de corrosión (dependiendo de la naturaleza de
la biopelícula que se forme). Cuando los microorganismos influyen en la corrosión, se considera la
adición de un factor más en una celda electroquímica, en la cuál la biopelícula tiene una incidencia directa
en los procesos que en ella se llevan a cabo—que pueden ser estudiados mediante las técnicas
electroquímicas enlistadas anteriormente—debido a que las biopelículas modifican la velocidad y la
naturaleza de las reacciones electroquímicas que controlan la corrosión.
17
Tabla 1. Características de algunas técnicas electroquímicas para la detección de corrosión y efecto de
biopelículas en materiales metálicos [Reproducido de: DOMÍNGUEZ B. X, 2007].
Técnica Principios de Medición y Ventajas Desventajas
Potencial de
Equilibrio
(Eeq)
o
Potencial de Circuito
abierto
(OCP)
Mide el potencial en el cual no hay corriente inducida (la diferencia de potencial contra un electrodo de referencia). Es fácil de medir. Útil para obtener algunos parámetros termodinámicos.
Interpretación difícil para biocorrosión, debido a la complejidad de los procesos involucrados. Posible sobre-interpretación de los resultados si no se realiza en conjunción con otras técnicas y análisis electroquímicos.
Potencial Redox
(RP)
Mediciones (en Voltios) de la afinidad de una sustancia por los electrones (electronegatividad) comparada con hidrógeno (el cual se fija en 0). Útil en combinación con mediciones de OCP y Rp .
Limitada para seguir cambios por biocorrosión.
Extrapolación de Tafel
(TE)
La corriente se fija y el potencial resultante es medido (o viceversa), puede ser utilizada para determinar el Ecorr y la Icorr, el potencial libre de corrosión, y la corriente de corrosión. Interpretación fácil de los resultados.
Existe incertidumbres para identificar las regiones de Tafel. Es una técnica intrusiva.
Resistencia a la
Polarización
(Rp)
Un potencial (típicamente 10-20 mV) es aplicado y la corriente ("líneal") resultante es medida. La resistencia a la polarización es el cociente del potencial aplicado y de la respuesta de corriente resultante. Esta “resistencia” es inversamente proporcional a la velocidad de corrosión uniforme. Útil para obtener información en casos de corrosión uniforme.
Desventajas en electrolitos resistivos, altas velocidades de corrosión o corrosión localizada.
Espectroscopía por Impedancia
Electroquímica (EIS)
Análisis de la respuesta en frecuencia de un potencial de corriente alterna (CA) aplicado a una celda electroquímica, midiendo la corriente de respuesta a través de ésta. Se requiere de un electrodo en estado estacionario desde el punto de vista de la corrosión y la biopelícula.
Difícil interpretación de datos. Pobres resultados para estudiar un proceso localizado aislado, como el seguimiento de una picadura.
Análisis de Ruido Electroquímico
(ENA)
Mide las fluctuaciones de corriente y potencial. Requiere análisis estadístico para la correcta interpretación de los resultados.
Es muy sensible a cualquier perturbación externa.
Técnica del Bi-
electrodo
Permite obtener una cartografía de la densidad de corriente debida a corrosión localizada.
Sus aplicaciones son limitadas al laboratorio.
18
En la Figura 8 se presenta un ejemplo de una celda electroquímica que hace a su vez la función de
bioreactor para el crecimiento microbiano en forma de biopelícula; los componentes de este sistema son:
a) un electrodo de trabajo, que consiste en el material de estudio sobre el que crece la biopelícula, b) un
contra electrodo o electrodo auxiliar, cuya función es permitir la conexión eléctrica al electrolito con el
fin de poder aplicar una corriente al electrodo de trabajo (dado que el proceso que ocurre sobre este
electrodo no es de importancia, suele emplearse un material inerte para evitar su disolución), c) un
electrodo de referencia, el cuál tiene un potencial de equilibrio estable y conocido y es utilizado para
medir el potencial contra otros electrodos, d) un electrolito, que se refiere a una sustancia que conduce la
corriente eléctrica, en la que se observa que las soluciones que lo componen se transforman químicamente
a consecuencia de ello, y e) la biopelícula, que afecta los procesos físicos, químicos y electroquímicos
que ocurren en el sistema [GABRIELLI C., 1998].
Figura 8. Representación teórica de una celda electroquímica en donde existe la presencia de una
biopelícula.
Los resultados obtenidos con técnicas electroquímicas en los últimos años, en casos donde se ven
implicados microorganismos, involucran principalmente estudios de potencial de corrosión, potencial a
circuito abierto (OCP), potencial redox, resistencia a la polarización (Rp), espectroscopía por impedancia
electroquímica y análisis de ruido electroquímico (ENA) [MANSFELD F. y col., 1990]; no obstante, los
conceptos electroquímicos utilizados para el análisis de los resultados obtenidos deben ser adaptados de
acuerdo con las características de la superficie acondicionada bióticamente. En las secciones siguientes
se explicarán los principios de dos de estas técnicas electroquímicas, OCP y EIS, debido a que son las
técnicas utilizadas en este trabajo.
19
I.2.2 .1.1 Potencial de Circuito Abierto
El potencial de circuito abierto (OCP) se mide mediante la diferencia de potencial entre el metal
de estudio (electrodo de trabajo) y un electrodo de referencia (electrodo estándar de calomel SCE,
electrodo estándar de hidrógeno SHE) inmersos en un electrolito (Figura 8).
La magnitud y el sentido del potencial medido dependen de la naturaleza del sustrato metálico,
de la composición química del electrolito, de la temperatura, de características hidrodinámicas del
sistema, de la naturaleza de los microorganismos presentes y del resto de los componentes o parámetros
que puedan incidir en el sistema [DOMÍNGUEZ B. X, 2007; ROSAS C. O., 2003].
Las mediciones de OCP pueden obtenerse experimentalmente mediante la utilización de un
circuito potenciométrico, un vólmetro de alta impedancia o un potenciostato. Esta técnica tiene como
ventaja la simplicidad para aplicarla, su utilización puede hacerse fuera del laboratorio y permite la
diferenciación entre un fenómeno de pasivación y un proceso de corrosión localizada.
Una de las desventajas de realizar mediciones de OCP es la posible sobre-interpretación de los
resultados, debido a que la técnica no proporciona información mecanística, por lo que se recomienda
utilizar técnicas alternativas en conjunto con esta para determinar la influencia catódica y anódica en un
proceso electroquímico (ya que en las mediciones de OCP las monitorean en conjunto) o bien un
mecanismo de corrosión [DOMÍNGUEZ B. X, 2007].
Esta técnica se ha utilizado para monitorear la influencia de la corrosión por metabolitos sobre el
acero y la influencia de biocidas [KERESZTES Z. y col., 1998], la influencia de la corrosión por BSR
[BOOTH G. H., 19997], la influencia de biopelículas sobre aceros inoxidables en agua de mar [DEXTER
S. C., 1995] y la influencia de biopelículas de BSR sobre la corrosión del acero al carbón en agua de mar
artificial (Figura 9) [DOMÍNGUEZ B. y col., 2005], entre otros estudios.
20
Figura 9. Variaciones de OCP dependientes del tiempo influenciadas por Desulfovibrio capillatus y D.
gabonensis en cultivo mixto en agua de mar artificial [DOMÍNGUEZ y col., 2005].
I.2.2 .1.2 Espectroscopía por Impedancia Electroquímica
La impedancia de un sistema está definida por la relación entre la corriente y el voltaje (función
de transferencia), físicamente la impedancia es el análogo de una resistencia en corriente alterna. En
sistemas donde se estudia la corrosión y el efecto de biopelículas, habitualmente se utilizan pruebas
potenciostáticas, es decir a la entrada se aplica un barrido de potencial a diferentes frecuencias y como
respuesta se obtienen valores de corriente, para cada una de estas frecuencias.
Figura 10. Gráfica que representa una señal sinusoidal a partir de la cual se obtiene la impedancia, que es
la relación entre una señal de entrada (voltaje, E) y una señal de salida (corriente, I), las cuales están
desfasadas (por una ángulo de fase, φ).
21
La medición de la función de transferencia a diferentes frecuencias constituye un espectro de
impedancia, el cuál se obtiene experimentalmente al aplicar una mínima polarización alterna a la celda
electroquímica manteniendo un estado pseudo-estacionario, con el objeto de medir la respuesta cinética,
mecanística, de fenómenos de trasporte y de distribución de los fenómenos electroquímicos que ocurren
en un sistema [GAGRIELLI C., 1998; DOMÍNGUEZ B. X, 2007]. Esta técnica está basada en el análisis
de la respuesta en frecuencia del sistema electroquímico a una variación sinusoidal superpuesta a un
potencial continuo (Figura 8) o una corriente directa. A la entrada del sistema, para el caso de pruebas
potenciostáticas, se impone una perturbación sinusoidal en potencia E(t) de baja amplitud E0 (por
ejemplo, 10 miliVoltios), sobre el electrodo de trabajo, en un dominio de frecuencias (ω) entre los 10
mHz y 100MHz:
)sin()( 0 tEtE ω= (1)
ó
)(0)( ϕω +
=tj
eEwE (2)
La respuesta obtenida para cada frecuencia es una corriente sinusoidal I(t) de fase φ y de amplitud I0:
)sin()( 0 ϕω += tItI (3)
ó
)(0)( ϕωω +
=tj
eII (4)
Donde ω representa la pulsación (igual a 2πf, siendo f la frecuencia en Hz) y j el número
imaginario 1− . Las ecuaciones (2) y (4) son el equivalentes a (1) y (3), respectivamente, pero se
escriben en la forma de números complejos para simplificar los cálculos o dependiendo del análisis
requerido.
A partir de las ecuaciones anteriores, se construye la función de transferencia de la impedancia,
definida como la relación de la señal de entrada con respecto a la señal de salida, Z = E/I, que una vez
simplificada y separada en sus partes real (ReZ) e imaginaria (ImZ), puede representarse de la siguiente
forma:
)(Im)(Re)( ωωω ZjZZ += (5)
22
Al aplicar la señal sinusoidal de entrada (E) y obtener la señal sinusoidal de salida (I), éstas están
desfasadas por un ángulo de fase ϕ (Figura 10), debido a que la interfaz entre el metal y electrolito retarda
la señal de salida con respecto a la de entrada. Matemáticamente, el ángulo de fase se representa por la
relación:
Re
Imtan 1
Z
Z−=ϕ (7)
Y el módulo de la impedancia por:
( ) ( )22 ImRe ZZZ += (8)
A partir de estas ecuaciones, se obtienen 3 diagramas (Figura 11), que son los comúnmente
utilizados para el análisis de la respuesta en frecuencia de sistemas electroquímicos.
El Diagrama de Nyquist (Figura 11 a) se refiere a la gráfica de la parte real de la impedancia
contra el negativo de la parte imaginaria y describe la relación entre los diferentes componentes que están
presentes en el sistema electroquímico, ya que estos pueden tener un comportamiento análogo a uno
resistivo, cuya magnitud aumenta sobre el eje real de la impedancia, mientras que aquellos elementos que
tienen un comportamiento análogo a uno capacitivo se manifiestan en la componente imaginaria.
El diagrama del módulo de la impedancia (Figura 11b izquierda) permite identificar las
constantes de tiempo debidas al sistema de estudio. Esta variable representa la magnitud del vector
conformado por las partes real e imaginaria, conjuntas en una sola función, como un valor absoluto de la
variable compleja, como se muestra en la Figura 11a.
En el diagrama de ángulo de fase (Figura 9b, derecha) se puede observar el desfasamiento entre la
señal de entrada y la señal de salida. Físicamente, una forma de interpretar las variaciones del ángulo de
fase, se logra al comprender el hecho de que la energía aplicada al sistema debe ser almacenada
(analógicamente a un termino capacitivo) o disipada (términos resistivos). Si el sistema de estudio es
análogo a únicamente un capacitor la corriente se adelanta del potencial por π/2 radianes; es decir, la
diferencia potencial es de 90°; sin embargo, si el sistema de estudio es análogo a únicamente un resistor,
el ángulo de la fase es 0°.
23
Los sistemas biológicos verdaderos, a una frecuencia dada, se comportan como los resistores y
capacitores en serie o en paralelo, de modo que el ángulo de fase puede tomar valores entre 0° y 90°
[DAVEY C. L. y col., 1995].
(a)
(b)
Figura 11. Esquemas de los tres diagramas que se obtienen en las mediciones de impedancia para una
celda electroquímica. a) Diagrama de Nyquist o diagrama complejo y
b) Diagramas de Bode referentes al módulo de la Impedancia (izquierda) y al ángulo de fase (derecha)
[Reproducido de: DOMIGUEZ B. X., 2007].
El intervalo de frecuencias (105 a 10-4 Hz), que la técnica proporciona, ayuda a identificar los
elementos de la celda cuando la corriente se desfasa del voltaje; por ejemplo en altas frecuencias se puede
medir la resistencia de la solución, mientras que a bajas frecuencias se pueden identificar efectos
difusionales o fenómenos de adsorción y desorción interfacial [GABRIELLIC C., 1998; PADILLA V. A.
A., 2002; X., 2004].
24
Una particularidad de EIS es su capacidad para utilizarse en medios semiconductores o
conductores, donde las técnicas electroquímicas de corriente directa son limitadas debido a la caída
ohmica del medio, además de que la variable independiente se encuentra en el dominio del tiempo y no se
establece la velocidad de barrido, que es diferente para cada sistema (pinturas orgánicas, películas de
óxidos metálicos, inhibidores, biopelículas etc.) [GRAGRIELLIC., 1998; SCULLY J. R. y col., 1993].
Muchas de las películas biológicas que se adsorben sobre superficies metálicas expuestas a
medios acuosos son conductoras de electrones, por lo que el análisis de su formación e influencia
mediante EIS es potencialmente útil para determinar algunas de sus propiedades, como pueden ser su
espesor y su influencia en la corrosión, considerando que estas películas modifican la interfaz
electroquímica metal- electrolito [GRAGRIELLI C., 1998; DOMÍNGUEZ B. X, 2007].
Una desventaja de esta técnica es que se requiere de instrumentación compleja y costosa. Así
mismo se requiere tener un buen conocimiento electroquímico para poder realizar la interpretación de los
resultados. Comúnmente, se realiza una modelación o interpretación de los resultados mediante el uso de
circuitos eléctricos equivalentes, que son difíciles de interpretar para sistemas en los que se estudian
biopelículas, debido a que son entidades dinámicas y al metabolismo microbiano, lo cual puede resultar
en una respuesta con fluctuaciones en periodos cortos y ataque localizado, que por medio de este análisis
no puede ser descrito [DOMÍNGUEZ B. X, 2007].
Los circuitos equivalentes simples son útiles para reproducir en forma global la respuesta de un
sistema electroquímico analizado con EIS; sin embargo, presentan algunos inconvenientes para la
interpretación y análisis cuando se trata de sistemas con gran heterogeneidad, además de proveer
información limitada.
Entre las desventajas del uso de los circuitos equivalentes, es que existe un número infinito de
combinaciones de elementos pasivos que pueden reproducir el mismo comportamiento, esta problemática
puede resolverse seleccionando aquel arreglo que permita una explicación física acorde con el sistema de
estudio [MACDONALD D. D., 1991; GALVAN M. R., 2004; DOMÍNGUEZ B. X, 2007].
No obstante, los circuitos equivalentes simples no describen la distribución de corriente o
potencial en forma discretizada para cualquier sistema, lo cual es de especial importancia para el estudio
de sistemas porosos, fallas locales, sistemas macroscópicos e interfases con gran heterogeneidad
estructural como las biopelículas [MACDONALD D. D. y col., 1994; CASTANEDA H., 2001;
25
URQUIDI-MACDONALD M. y col. (1999); WARAKSA C. C. y col., 2003; DOMÍNGUEZ B. X, 2007;
DOMINGUEZ B. X., y col, 2007, DOMIGUEZ B. X., 2007].
El análisis de impedancia puede también interpretarse o modelarse mediante otros métodos
análogos a elementos eléctricos, como los modelos determinísticos de líneas de transmisión, modelos
mecanísticos de funciones de transferencia, modelos semiempíricos, modelos determinísticos modernos,
modelos estadísticos y modelos estocásticos [MACDONALD D. D., 1991; DOMÍNGUEZ B. X, 2007],
entre otros.
27
II.1 Hipótesis En los sistemas de distribución de gasolina (gasolinoductos ) existen microorganismos que son capaces de
formar biopelículas complejas sobre el acero al carbón, debido a que en la gasolina existen compuestos
que estos seres vivos pueden utilizar como fuentes de carbono y energía. Estas comunidades microbianas
son altamente diversas, heterogéneas y pueden originar problemas como el bioesuciamiento y la
biocorrosión mediante complejas estrategias multicelulares.
28
II. 2 Alcances y justificación del proyecto
La caracterización de la flora microbiana anaerobia formadora de biopelículas asociada a
gasolinoductos tiene gran relevancia debido no solo a la influencia que esta puede tener en los procesos
de corrosión, como ya se ha descrito ampliamente en anteriores capítulos, sino también potencialmente en
procesos de bioremediación, ya que en estos sistemas la flora microbiana puede potencialmente crecer en
y degradar algunos de los compuestos presentes en la gasolina (BTX, TBA, y MTBE), los cuales son
nocivos para la salud humana, animal, vegetal y ambiental.
La caracterización bioquímica, y cinética de la flora microbiana anaerobia, materia de este
trabajo, puede aportar nuevos conocimientos sobre las interacciones de consorcios formados en ambientes
indocumentados, donde puedan degradar compuestos recalcitrantes para convertirlos a compuestos
orgánicos más simples o a CO2 mediante un proceso de mineralización, que además de afectar a los
procesos de corrosión cuando se encuentran en el interior de sistemas como los gasolinoductos, los hace
potencialmente aplicables a procesos de bioremediación de sitios contaminados con gasolina debido a la
adaptación sobrellevada por estas comunidades microbianas. Parámetros obtenidos de la caracterización
microbiana, bioquímica y cinética, como son la velocidad de degradación de los compuestos presentes en
el sistema, la capacidad de adherirse a superficies (y sus consecuencias), y las interacciones involucradas
en el desarrollo de biopelículas, pueden ser de gran utilidad para dar seguimiento a los procesos de
corrosión en los que influyen y a su control cuando se aplican productos antimicrobianos. Con los datos
presentados previamente en este documento queda clara la importancia y el impacto que tiene el estudio
de las biopelículas provenientes de la industria petrolera, y específicamente provenientes de
gasolinoductos.
Con base en lo anterior se realizó un estudio de las poblaciones microbianas de gasolinoductos
que tiene como principales alcances determinar parte de la diversidad microbiana, y su posible influencia
sobre la corrosión de dichos sistemas. Debido a que en la literatura pública y científica no se han
encontrado datos reportados sobre el crecimiento de biopelículas en gasolinoductos, por tal motivo se
llevaron a cabo aislamientos de muestras tomadas de material de arrastre de estos sistemas, y se realizó la
caracterización macroscópica y microscópica de parte de la flora microbiana anaerobia, así como su
caracterización cinética y bioquímica, y el monitoreo de la influencia electroquímica que la biopelículas
ejercen en los procesos de corrosión.
29
Esto permite aportar una contribución científica a la biotecnología ambiental que, al carecer de
esta información, se ve limitada en las medidas que puede tomar con respecto a estos problemas o a
potenciales aplicaciones de estos microorganismos. Por otra parte, en la mayoría de los estudios de
biopelículas en los que el análisis de EIS se realiza mediante circuitos eléctricos equivalentes, se ha
proporcionado una descripción poco sustancial a cerca de la influencia de estas estructuras biológicas y de
las reacciones electroquímicas asociadas a las mismas. En este trabajo se presenta un análisis sustancial
con circuitos eléctricos equivalentes, con el fin de de ampliar el conocimiento al respecto. Asimismo, no
ha sido extensivo el uso de líneas de transmisión para el análisis de EIS, por lo que en este trabajo se
desarrolla un modelo unidimensional al respecto, con el fin de permitir un análisis comparativo con los
resultados obtenidos al utilizar circuitos equivalentes.
Los resultados de este trabajo aportan conocimiento relevante para el estudio de comunidades
microbianas en biopelículas mediante la EIS. Se provee información que puede servir como apoyo en el
desarrollo de métodos para la detección temprana de biopelículas, que permitieran aplicar planes de
prevención y contención apropiados en aquellos sistemas en los que existan riesgos de afectación por
bioensuciamiento, biodeterioro o biocorrosión.
La investigación se presenta en dos etapas, cuyas actividades serán descritas posteriormente en
este documento. La etapa I comprendió el cultivo, aislamiento, y caracterización microbiológica, desde
las perspectivas macroscópica, microscópica, bioquímica y cinética, de flora microbiana anaerobia. Para
ello, se utilizaron 13 muestras que fueron tomadas de material de arrastre de gasolinoductos y
resembradas en medio enriquecido, en el cuál crecieron los microorganismos a partir de los cuáles se
realizó el aislamiento anaerobio. Con los microorganismos aislados, se realizaron cultivos sustrato-
específicos con diferentes compuestos (benceno, tolueno, xileno, pentano, TBA, MTBE, lactato y
acetato), pruebas para la formación de biopelículas en la interfaz líquido-gas y pruebas de adhesión en la
interfaz sólido-líquido, cinéticas de degradación de benceno, tolueno y xileno y producción de CO2 (para
determinar el grado de mineralización con cultivos mixtos) y una caracterización bioquímica. Los
resultados obtenidos en la etapa I permiten determinar parte de la posible biocomplejidad microbiana,
además de algunas estrategias multicelulares en la formación de biopelículas en ambientes con gasolina.
Posteriormente, en la etapa II se llevó a cabo la caracterización electroquímica de sistemas abióticos y
bióticos, por medio de las técnicas de EIS y OCP. A partir de los datos obtenidos con estas mediciones se
realizó un análisis con circuitos eléctricos equivalentes. Con los datos obtenidos en esta etapa se realizó
un análisis de la influencia microbiana de algunas de las biopelículas obtenidas en la corrosión del acero
al carbón.
30
II. 3 Objetivos
Generales:
• Aislar y caracterizar flora microbiana anaerobia de gasolinoductos, desde las perspectivas
macroscópica, microscópica, bioquímica y cinética.
• Estudiar la influencia bio-electroquímica de microorganismos anaerobios formadores de
biopelículas, sobre acero al carbón, utilizando la Espectroscopía por Impedancia Electroquímica.
• Determinar algunas estrategias multicelulares en la formación de biopelículas en ambientes con
gasolina.
Particulares:
• Aislar microorganismos anaerobios formadores de biopelículas crecidas a partir de muestras de
gasolinoductos.
• Realizar la caracterización microscópica, macroscópica (formación de biopelículas) y bioquímica
de parte de la flora microbiana anaerobia aislada.
• Realizar cultivos y cinéticas sustrato-específicas para determinar la utilización de compuestos
BTX, MTBE, TBA y pentano, por las bacterias anaerobias.
• Monitorear el la influencia de las biopelículas anaerobias aisladas y en consorcios utilizando la
espectroscopía por impedancia electroquímica y la medición del potencial a circuito abierto.
• Realizar el análisis de impedancia con circuitos para describir el la influencia electroquímica de
las biopelículas sobre acero al carbón.
31
II. 4 Estrategia Experimental
La estrategia experimental utilizada en este trabajo se muestra en la Figura 12, en donde de se
presenta un esquema con las actividades que se llevaron a cabo durante del proyecto de investigación. En
resumen, se realizó el aislamiento y la caracterización microscópica, macroscópica, cinética, bioquímica
y electroquímica de bacterias anaerobias formadoras de biopelículas a partir de muestras tomadas de
gasolinoductos, toda la metodología se llevó a cabo por duplicado, y se presentan como resultado el
promedio o unificación de las mismas.
Figura 12. Estrategia experimental del proyecto.
La estrategia experimental se presenta en dos etapas, cuyas actividades serán descritas
posteriormente. La etapa I comprendió el cultivo, aislamiento, y caracterización microbiológica, desde las
perspectivas macroscópica, microscópica, bioquímica y cinética, de flora microbiana anaerobia.
ETAPA I
ETAPA II
32
Para ello, se utilizaron 13 muestras que fueron tomadas de material de arrastre de gasolinoductos
y resembradas en medio enriquecido, en el cuál crecieron los microorganismos a partir de los cuáles se
realizó el aislamiento anaerobio.
Con los microorganismos aislados, se realizaron cultivos sustrato-específicos con diferentes
compuestos (benceno, tolueno, xileno, pentano, TBA, MTBE, lactato y acetato), pruebas para la
formación de biopelículas en la interfaz líquido-gas y pruebas de adhesión en la interfaz sólido-líquido,
cinéticas de degradación de benceno, tolueno y xileno y producción de CO2 (para determinar el grado de
mineralización con cultivos mixtos) y una caracterización bioquímica.
Los resultados obtenidos en la etapa I permiten determinar parte de la posible biocomplejidad
microbiana, además de algunas estrategias multicelulares en la formación de biopelículas en ambientes
con gasolina.
Posteriormente, en la etapa II se llevó a cabo la caracterización electroquímica de sistemas
abióticos (medio de cultivo estéril) y bióticos (cultivos microbianos diversos), por medio de las técnicas
de EIS y OCP. A partir de los datos obtenidos con el monitoreo electroquímico se realizó un análisis con
circuitos eléctricos equivalentes para el análisis de impedancia. Con los datos obtenidos en esta etapa se
realizó un análisis de la influencia microbiana de algunas de las biopelículas obtenidas en la corrosión del
acero al carbón.
La experimentación de este trabajo se realizó principalmente en los Laboratorios de
Microbiología, Bioreactores, Biotecnología General, Biocatálisis y Electroquímica del Instituto Mexicano
del Petróleo, entre otras instalaciones del mismo. Para el estudio de biocomplejidad se colaboró con la M.
en C. Verónica Nava Ramírez y con el Estudiante de Ing. Biotecnológica Cristian Mata Rodríguez
(UPIBI), quienes realizaron estudios con la contraparte aerobia de este trabajo, de los cuáles no se
presentan los métodos experimentales ni los resultados específicos obtenidos de dicha contraparte.
II.5 Materiales y Métodos
Los procedimientos utilizados para cada una de las etapas expuestas en esta estrategia
experimental (Figura 12), se encuentran descritos en las siguientes secciones.
33
II.5.1 Procedimientos Microbiológicos
En esta sección se describirán aquellas técnicas que fueron utilizadas para aislar microorganismos
anaerobios a partir de muestras de gasolinoductos, realizar cultivos sustrato-específicos y cinéticas de
degradación de algunos de estos compuestos, realizar la caracterización microscópica y macroscópica
(formación de biopelículas y pruebas de adhesión) y realizar la caracterización bioquímica de parte de la
flora microbiana anaerobia aislada.
II.5.1.1 Obtención de Muestras
Para la elaboración de este trabajo, se obtuvieron 13 muestras distintas provenientes de ductos de
distribución de gasolina obtenidas a partir de los sedimentos y gasolina presentes en material de arrastre
extraído de los gasolinoductos mediante un diablo instrumentado. Las muestras fueron colocadas en
recipientes estériles y mantenidas en refrigeración a 4° C, hasta su uso. El origen de las muestras no se
hace explícito en este documento, debido a políticas de confidencialidad del donante.
II.5.1.2 Medios de Cultivo e Inóculos
Se utilizaron dos tipos de medio de cultivo con diferentes propósitos, que comprenden
principalmente el cultivo y aislamientos de microorganismos en un medio con suficientes nutrientes
(medio ENR), y la realización de pruebas de degradación de compuestos recalcitrantes de la gasolina
(medio MIN), entre otros compuestos. Dichos propósitos se especificaran en las secciones subsiguientes
del documento.
Medio ENR:
Medio basal enriquecido para los diferentes microorganismos anaerobios presentes en las
muestras obtenidas, cuya composición (por litro de agua destilada) es la siguiente: NH4Cl (1 g), K2HPO4
(0.3 g), KH2PO4 (0.3 g), MgCl2, 6H2O (0.2 g), NaCl (2 g), CaCl2, 2 H2O (0.1 g), extracto de levadura
Difco (1 g), triptona-peptona Difco (1 g), solución de oligoelmentos de Balch (10 mL), cisteína-HCl (0.4
g), NaHCO3 (0.02 g) y resazurina al 0.1% (1 mL), pH 7.2.
34
Para la preparación de este medio se añadieron los reactivos del medio en un matraz después de
ser pesados correctamente. Se añadió el agua destilada y se agitó hasta homogeneizar. Se ajustó el pH
del medio con NaOH 1M. El matraz se marcó a la altura del medio y se añadió un volumen extra de
aproximadamente 10% del volumen total. Se homogeneizó el medio. Se cubrió la boca del matraz que
contiene el medio con papel aluminio con un orificio de aproximadamente el diámetro de la manguera del
N2 con la que posteriormente se realizó un cambio de atmósfera. Se calentó cuidando que no se
derramara. El calentamiento del medio cesó al alcanzarse el nivel que tenia el medio antes de agregar el
10% extra de agua (la coloración del medio se tornó de rosa o azul al color del medio antes de agregar la
resazurina). Inmediatamente se hizo fluir una corriente de N2 puro dentro del medio, haciéndolo
burbujear hasta que bajó la temperatura. Se envasó el medio en porciones de 25 m bajo ambiente de N2
puro en frascos tipo Hungate o serológicos.
Figura 13. Preparación de medio de cultivo anaerobio. Una vez envasado el medio (en frascos tipo Hungate o serológicos) se introdujo a través del tapón
de goma una aguja conectada al gas por el cual se cambió la atmósfera (99.95% N2); una vez que el gas
fluía al recipiente se colocó otra aguja por la que éste pudiera fluir al exterior, evitando que se incremente
demasiado la presión en el frasco. Después de 30 s o 1 min se retiró la aguja con la que se introducía el
gas, la otra se retiró cuando la salida de gas había cesado. Posterior al cambio de atmósfera se esterilizó
el medio de cultivo a 15lb / 121 °C / 15 min. [DOMÍNGUEZ B. X., 2003].
Medio MIN:
El medio mínimo se utilizó, para el cultivo de microorganismos anaerobios degradadores de
compuestos específicos como: benceno, tolueno, xileno, MTBE, TBA, pentano, lactato y acetato, algunos
de ellos forman parte de la formulación de la gasolina. La composición de este medio (por litro de agua
destilada) es la siguiente: NH4Cl (0.75 g), K2HPO4 (1 g), KH2PO4 (2 g), CaCl2 (0.018 g), MgSO4 (0.5 g),
NaHCO3 (0.02 g), cisteína-HCl (0.4 g), resazurina al 0.1% (1 mL) y solución de elementos traza de Fortin
y Deshusses (1 mL).
35
El medio de cultivo se preparó en forma anaerobia (como se especifica en la preparación de
medio enriquecido). Los compuestos CaCl2 y MgSO4, se prepararon por separado en 125 mL cada uno y
se añadieron una vez que el medio estaba caliente para evitar la precipitación de los compuestos.
Posteriormente se expuso a flujo de nitrógeno, se vació en frascos serológicos y se esterilizó.
Posteriormente se adicionó 2µL de fuentes de sustrato específicas (benceno, tolueno, xileno, MTBE,
TBA, o pentano), o bien la cantidad necesaria para alcanzar una concentración de 20 mM de lactato o
acetato (a partir de soluciones estériles), por frasco con 20 mL de medio, según fuera la fuente de carbono
a utilizar para cada caso. Para añadir las fuentes de carbono (compuestos de la gasolina) al medio estéril,
se utilizó una jeringa de vidrio de 20 µL, la cual se enfrió previamente para evitar que los compuestos se
volatilizaran todo esto se realizó en una campana de flujo laminar.
Ambos medios fueron utilizados para realizar cultivos semilla a partir de las muestras de
gasolinoductos. En ambos casos se inocularon 2 mL de muestra en 20 mL de medio de cultivo sin fuente
de carbono y se incubaron a una temperatura de 30° C durante 48 horas.
II.5.1.3 Aislamiento de Bacterias Anaerobias
Se utilizaron tubos de ensaye de 16x150 en los cuales se añadió 0.05g de agar noble y 4.5 mL de
medio de cultivo líquido ENR (para este caso); los tubos se taparon con tapón de goma (butírica o
neopreno), y se esterilizaron por autoclave.
Figura 14. Técnica de tubo rodado donde se observan los pasos de la misma; a) Tubos con medio de
cultivo enriquecido y agar a 50° C. b) Inoculación de microorganismos en el tubo. c) Tubo inoculado en
girador mecánico. d) Tubo inoculado en girador mecánico, mientras este gira un hielo se pone en las
paredes del tubo para que el medio gelifique. d) Aspecto de un tubo rodado después del procedimiento
36
Posteriormente los tubos se incubaron a 50 ° C para prevenir la solidificación del medio de agar,
hasta el momento de su uso. Se inoculó 0.5 mL de la muestra, y se puso en un girador mecánico (especial
para la técnica de tubo rodado), se colocó hielo alrededor del tubo para que el agar gelificase formando
una película sobre de las paredes internas del tubo, donde posteriormente crecieron las colonias
embebidas en el agar, misma que fueron aisladas.
Las colonias de microorganismos embebidas en el agar fueron separadas en nuevos frascos
serológicos para favorecer la producción de biomasa de aquellas colonias probablemente puras. Para
favorecer esta biomasa se trabajó con cultivos tipo Hungate dentro de la cámara de anaerobiosis.
Se tomó el tubo donde había crecimiento de colonias aisladas y con pipetas Pasteur se tomaron las
colonias con la ayuda de una perilla de succión, posteriormente se depositaron en un frasco serológico.
Se incubaron a 30° C y se realizó tinción de Gram para observar si el cultivo estaba puro [HUNGATE, R.
E., 1950].
Figura 15. Esquema general de cómo se aísla una colonia tomada de un tubo rodado y se deposita en un
frasco serológico; a) Cámara de anaerobiosis. b) Fotografía de cómo se toma una colonia aislada de un
tubo rodado. c) La colonia tomada se deposita en un frasco serológico. d) Crecimiento de biopelícula de
una muestra aislada por este método, después de un periodo de incubación.
37
II.5.1.4 Caracterización en Microcopio Óptico
Se realizó la caracterización microscópica óptica, utilizando un microscopio Nikon E800, para
determinar la pureza de los cultivos sometidos a aislamiento y determinar la morfología microscópica de
bacterias puras aisladas. Las observaciones se realizaron utilizando el objetivo de inmersión en aceite
(100x).
II.5.1.4.1 Determinación de la Pureza de Cultivos
A los cultivos obtenidos después del aislamiento se les realizaron tinciones de Gram y
posteriormente se observaron al microscopio. Aquellas muestras que presentaron diversidad morfológica
y variación de Gram se sometieron a un segundo o tercer proceso de aislamiento por tubo rodado.
Los cultivos aparentemente puros, se resembraron por triplicado y secuencialmente en tiempo,
para verificar su mantenimiento en la morfología y ausencia de contaminación; a todos estos cultivos se
les realizaron también tinciones de Gram, comparando la ausencia de variación en las mismas, algunas de
aquellas bacterias que no variaron en la tinción de Gram y en la morfología se seleccionaron para realizar
pruebas de crecimiento de biopelículas, pruebas de adhesión y pruebas bioquímicas.
II.5.1.4.2 Determinación de la Morfología Microscópica
A los cultivos puros se les realizaron dos tipos de tinciones; la tinción de Gram y la tinción de
esporas. La tinción de Gram proporcionó datos a cerca de su morfología, como se expresa en la Tabla 2,
en tanto que la tinción de esporas, realizada con verde de malaquita, permitió saber si los cultivos puros
eran capaces de producirlas.
Tabla 2. Datos proporcionados por la tinción de Gram.
Tinción de Gram
Coloración Gram +, Gram - Morfología
Bacilos, cocos, diplococos, estreptococos, cocobacilos, fusiformes. Bacilos Rectos, o Curvos
Tamaño de los microorganismos. Presencia de polímeros asociados a las bacterias.
38
II.5.1.5 Caracterización Macroscópica
Se llevó a cabo el seguimiento visual de la formación de biopelículas en dos tipos de sistemas;
aquellas crecidas en la interfaz gas-electrolito (atmósfera de hidrógeno-medio de cultivo), y aquellas
crecidas en la interfaz sólido-líquido (pruebas de adhesión). Aquellas crecidas en la interfaz gas-
electrolito se derivan de la tendencia natural de las bacterias en un medio líquido a formar biopelícula en
un ambiente carente de movimiento, en tanto que las crecidas en la interfaz sólido líquido son
consecuencia de las interacciones que estas presentan en presencia de Acero al carbón SAE 1018, ambos
sistemas son descritos en los puntos posteriores.
II.5.1.5.1 Formación de biopelículas gas-electrolito
Por una parte, los cultivos de microorganismos en frascos serológicos, fueron observados
periódicamente, estos se llevaron a cabo en condiciones estacionarias (sin agitación o movimiento) y en
poca cantidad de medio de cultivo ENR o MIN (15 mL). Se observó periódicamente el desarrollo o
ausencia de biopelícula, y se llevó un control de los cultivos que fueron capaces de desarrollar formación
de biopelícula, cuya presencia se evidenció al observar una capa parecida a una mucosidad creciendo en
la interfaz gas-electrolito (entre la atmósfera y el medio de cultivo) o en algunos casos adherida al vidrio
por medio de una capa viscosa (transparente o colorida, de aspecto mucoide o sedimentaria).
II.5.1.5.2 Pruebas de Adhesión
Para el análisis de las biopelículas en la interfaz sólido-líquido se utilizaron muestras metálicas
rectangulares de acero al carbón SAE 1018 (composición: C 0.15-0.20 %, Mn 0.60 - 0.90 %, P 0.030 %,
S 0.035, acero de medio contenido de carbono para uso estructural) denominadas en este trabajo como
cupones de acero al carbón (Figura 16b), de 1 cm x 0.5 cm x 0.2 cm. esterilizadas bajo luz ultravioleta
(UV), durante 30 minutos (15 minutos por lado), las cuáles fueron introducidas en los frascos serológicos,
con medio MIN, medio ENR, o ENR suplementado con sustratos BTX o MTBE, dentro de una campana
de flujo laminar para evitar la contaminación del mismo. Esta introducción fue realizada rápidamente para
evitar la penetración de una cantidad de oxígeno considerable, cerciorando que el indicador de óxido-
reducción presente en el medio no tomara una coloración rosada para garantizar condiciones suficientes
de anaerobiosis para el crecimiento bacteriano.
39
a)
Figura 16. a) Acero al carbón SAE5 1018. b) Cupones cortados.
Se llevaron a cabo dos pruebas diferentes de adhesión: a) con las colonias aisladas y b) con
cultivos mixtos formados artificialmente, en algunos casos también se realizaron cultivos mixtos
artificiales con las bacterias derivadas de la colaboración con la contraparte aerobia de este trabajo. En
las listas siguientes se desglosan los sistemas de estudio, en los que se determinó cualitativamente el
crecimiento microbiano y la formación de biopelículas.
Los cultivos puros que se sembraron con muestras de acero al carbón se presentan a continuación,
en los que se determinó cualitativamente el crecimiento microbiano y la formación de biopelículas.
• 64-1 P2 • 92-1 • 89-P2 • 94-2 • 86-2 • 92-3 • 64-2 P1 • 87-1 • 96-2 • 63-P1 • 78-1 • 93-1 • 82-1 • 66 P2 • 92-2
Los cultivos mixtos formados artificialmente en los cuales se llevaron a cabo las pruebas de
adhesión se presentan en la siguiente lista:
� Cultivo Mixto Aerobio-Anaerobio con Lactato, inóculo para consorcio de BTX,
� Cultivo Mixto de BTX sin sustrato, Anaerobios BTX + Anaerobios Lactato .
� Cultivo Mixto de BTX + sustrato, AnaerobioBTX+ Anaerobio Lactato,
� Cultivo Mixto Aerobio-Anaerobio Lactato Imp. gas.
� Cultivo Mixto de BTX sin sustrato Anaerobio BTX+ Anaerobio Lactato.
� Cultivo Mixto Aerobio-Anaerobio Lactato 18 de Sep. consorcio.
� Cultivo Mixto de BTX medio Aerobio + Anaerobio BTX.
� Cultivo Mixto de lactato M3,1,1, M1,2,1, M13,21.
� M3,1,1, Lactato, CMR, 15/09/06.
� M1,2,1 Lactato, 15/09/06 CMR.
� Cultivo Mixto de BTX Muchas M, M3,1,2 O-X, M3T’.
b)
40
En estas pruebas se evaluó el grado de bioensuciamiento por turbidez y formación de biopelícula,
después de dos semanas de crecimiento en estos sistmas a 30° C, y de estas mismas muestras se tomaron
algunos de los cupones presentes en los cultivos y se realizó un análisis superficial.
II.5.1.5.2.1 Análisis superficial
Para el análisis superficial del acero al carbón SAE 1018, expuesto al sistema con biopelículas y
al medio de cultivo estéril sin inocular, respectivamente, se utilizaron la microscopia electrónica de
barrido ambiental (ESEM) y análisis químico por espectroscopía por dispersión de energía (EDS).
Después de dos semanas de exposición al medio de cultivo estéril o al medio con los cultivos
puros o cultivos mixtos microbianos, las muestras metálicas fueron extraídas con pinzas metálicas
estériles y puestas inmediatamente en el microscopio, sin recibir ningún otro tipo de tratamiento. Se
utilizó un detector de electrones secundarios (GSE) en el modo ambiental (bajo vacío), con un spot de 5.0,
Acc V de 30.0 kV y a una presión de 3.6 Torr.
II.5.1.6 Caracterización Cinética a partir de cultivos con sustratos
específicos
Se realizaron algunas cinéticas microbianas para determinar la posibilidad de mineralización, que
se refiere a la degradación de algunos compuestos de la gasolina (compuestos BTX) hasta compuestos
orgánicos (CO2). Las cinéticas realizadas se llevaron a cabo a partir de cultivos con sustratos específicos,
estos cultivos son descritos a continuación.
II.5.1.6.1 Cultivos con sustratos específicos
Se preparó una serie de 104 frascos serológicos con medio MIN adicionado una de las siguientes
fuentes de carbono específicas: benceno, tolueno, xileno (BTX), MTBE (MTBE; por sus siglas en inglés
methyl tert-butyl ether), TBA (TBA; por sus siglas en inglés tert-butyl alcohol), lactato, acetato o
pentano, que se inocularon con 3 ml de los cultivos semilla en medio MIN, de cada muestra de
gasolinoductos. La matriz experimental de los 104 cultivos realizados se muestra a continuación en la
Tabla 3.
41
Tabla 3. Matriz experimental para los cultivos sustrato-específicos.
Compuestos M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13
Benceno � � � � � � � � � � � � � Tolueno � � � � � � � � � � � � � Xileno � � � � � � � � � � � � � TBA � � � � � � � � � � � � �
MTBE � � � � � � � � � � � � � Pentano � � � � � � � � � � � � � Lactato � � � � � � � � � � � � � Acetato � � � � � � � � � � � � �
Posterior a su crecimiento a 30° C, se seleccionaron aquellos cultivos cuyo crecimiento
microbiano tuvo mayor cantidad de biomasa. A partir de estos, se realizaron las cinéticas para cuantificar
la degradación de benceno, tolueno y xileno, y la producción de CO2. Los cultivos seleccionados se
muestran en la tabla 4 (todos se hicieron por duplicado).
Tabla 4. Matriz Experimental de los cultivos utilizados para realizar las cinéticas microbianas.
Muestras Benceno Tolueno Xileno Pentano
M1 � � M6 � � M7 � M8 � M9 � M10 �
La selección cuantitativa se basó en la concentración de biomasa de las muestras, la cual fue
determinada por el método de cuantificación de proteína.
II.5.1.6.2 Cinéticas de Producción de CO2 y Degradación de Compuestos
BTX
El seguimiento de las cinéticas de degradación de compuestos BTX se llevó a cabo en un
cromatógrafo de gases marca Agilent. 0.1 ml de la fase gaseosa fueron inyectados al equipo, en el cual se
mide la disminución en el área del pico estándar de cada compuesto. Mientras que la producción de CO2
fue cuantificada por análisis del espacio libre usando un cromatógrafo de gases Gow Mac, con un detector
de ionización de flama, en el cual se sensan los incrementos del área del pico, y se interpolan con los
valores de una curva tipo pre-estandarizada de concentraciones conocidas de CO2.
42
II.5.1.7 Caracterización Bioquímica
Para la caracterización bioquímica se utilizó la tira de reactivos API 20 A para la identificación de
bacterias anaerobias. Cada tira reactiva consiste en una serie de 20 pruebas de identificación bioquímica,
como se muestra en la Figura 17. De manera general, se inocularon viales con medio de cultivo (que la
tira de reactivos API 20A proporciona), hasta alcanzar una concentración de 3 a 4 McFarland, y se
inocularon los pozos de la galería con pipetas Pasteur estériles, evitando la formación de burbujas, para el
prueba GEL (ver Tabla 5), se llenó el tubo y la cúpula, y para el la prueba de IND se llenó la cúpula con
aceite de parafina. Previo a esto la base de la tira se llenó con 5 mL de agua destilada, para mantener
hidratada la muestra al momento de la incubación (24-48horas, a 34 o 38 C).
El revelado de las pruebas bioquímicas se llevó a cabo con púrpura de bromocresol para todos los
microtubos que contenían carbohidratos (GLU, MAN, LAC, SAC, MAL, SAL, XYL, ARA, GLY, CEL,
MNE, MLZ, RAF, SOR, RHA, TRE). Una coloración amarilla o verde-amarillenta indicó una reacción
positiva, para la prueba IND, se agregó una gota de xileno, se mezcló y esperó de 2-3 minutos., y se
agregó una gota del reactivo EHR. Un color rojo indica una reacción positiva, y en la prueba CAT, la
producción de catalasa se hace evidente después de exponer la galería al aire libre durante 30 minutos y
agregar dos gotas de H2O2 al 3% en un pozo positivo. La aparición de burbujas indica una reacción
positiva.
Figura 17. Representación gráfica de la tira de reactivos API20A, la cual comprende 20 pruebas
bioquímicas en la tira, y cuatro pruebas externas.
Para la lectura de estas pruebas se utilizó la base de datos APIWeb de Biomerieux y el Manual
Bergey de Bacteriología. Las pruebas realizadas se muestran en la Tabla 5, así como sus reacciones
básicas, componentes activos, y una manera sencilla de la interpretación de resultados. Los resultados de
las pruebas bioquímicas se presentan en la sección III.1.2.1.
43
Tabla 5. Pruebas bioquímicas que integran la tira API20A
Prueba
Componentes
Activos
Reacciones
Enzimáticas
Resultados
Negativo Positivo
IND L-triptofano Formación de Indol Amarillo Rojo
URE Urea Ureasa Amarillo Rojo
GLU D-Glucosa Acidificación (Glucosa) Púrpura Verde
MAN D-Manitol Acidificación (Manitol) Púrpura Verde
LAC D-Lactosa Acidificación (Lactosa) Púrpura Verde
SAC D-Sacarosa Acidificación (Sacarosa) Púrpura Verde
MAL D-Maltosa Acidificación (Maltosa) Púrpura Verde
XYL D-Xilosa Acidificación (Xilosa) Púrpura Verde
ARA L-Arabinosa Acidificación (Arabinosa) Púrpura Verde
GEL Gelatina Hidrólisis (Proteasa) (Gelatina) Sin difusión Difusión
ESC Esculina Hidrólisis (ß-glucosidasa) (Esculina) Amarillo Marrón-Negro
GLY Glicerol Acidificación (Glicerol) Púrpura Verde
CEL D-Celobiosa Acidificación (Celobiosa) Púrpura Verde
MNE D-Manosa Acidificación (Manosa) Púrpura Verde
MLZ D-Melicitosa Acidificación (Melicitosa) Púrpura Verde
RAF D-Rafinosa Acidificación (Rafinosa) Púrpura Verde
SOR D-Sorbitol Acidificación (Sorbitol) Púrpura Verde
RHA L-Rhamnosa Acidificación (Rhamnosa) Púrpura Verde
TRE D-Trehalosa Acidificación (Trehalosa) Púrpura Verde
CAT H2O2 Catalasa Presencia de
Burbujas
Ausencia de
Burbujas
SPOR ---- Esporas Ausencia Presencia
GRAM ---- Coloración de Gram Rosa Violeta
COCC ---- Morfología Bacilo Coco
44
II.5.2 Procedimientos Electroquímicos
Las mediciones electroquímicas se llevaron a cabo utilizando dos equipos: un potenciostato y un
analizador de frecuencias Solartron conectados a una computadora, la cual tiene los siguientes programas
computacionales: a) CorrWare, en el que se determina la matriz de experimentos electroquímicos a
realizar en forma consecutiva, b) CorrView, que permite visualizar las mediciones de OCP, y c) Zview
que permite presentar en forma gráfica y analizar con circuitos equivalentes las mediciones que se
realizan del monitoreo de impedancia electroquímica. Para la colección de datos electroquímicos se
utilizó el sistema que se muestra en la Figura 18.
Figura 18. Ilustración de conexiones entre la celda y el equipo de medición [Modificado de:
DOMINGUEZ BENETTON, 2007].
Se verificó el buen funcionamiento del equipo calibrado utilizando una dummy cell, que consiste
en un circuito capacitivo y resistivo del cual se conocen los valores que deben de registrarse dentro del
programa ZView.
45
En un sistema similar al mostrado en la Figura 13, se conectó la celda electroquímica eligiendo en
el programa CorrWare los tipos de mediciones a realizar (en este caso OCP y EIS), y se asignaron los
valores de los parámetros de trabajo, de acuerdo con lo que se presenta en las secciones siguientes. En la
Figura 19 se presenta una fotografía del equipo de medición y la celda electroquímica utilizados.
Figura 19. a) Equipo de medición (potenciostato y FRA) y b) celda electroquímica.
II.5.2.1 Celdas Electroquímicas
La celda electroquímica utilizada para la experimentación es una celda de dos electrodos (Figura
19a). La celda consiste en un compartimiento de vidrio en el cual están inmersos los electrodos, cuyas
caras de exposición están completamente cubiertas por electrolito al realizar las mediciones. El electrodo
de trabajo, consiste en una pieza circular de acero al carbón SAE 1018 con 28.27 cm2 de superficie
expuesta, y el contraelectrodo consiste en una pieza circular de platino/oro (95%/5%) con 28.27 cm2 de
superficie expuesta.
II.5.2.2 Potencial de Circuito Abierto
Las mediciones de OCP se llevaron a cabo como una secuencia de experimentos en función del
tiempo, por duplicado, tanto para un sistema en condiciones abióticas (medio de cultivo estéril) como
para diversos cultivos microbianos (Tabla 6), cada medición se llevó a cabo por duplicado. El tiempo de
adquisición para las mediciones de OCP fue de 1 punto/segundo en periodos aleatorios de 20 minutos,
distribuidos durante el tiempo total de experimentación para cada celda de estudio que se seleccionaron
para el análisis (1249 horas).
46
II.5.2.3 Impedancia
Las mediciones de impedancia se llevaron a cabo como una secuencia de experimentos en
función del tiempo, para el sistema abiótico y diferentes sistemas bióticos, por duplicado. Se utilizó un
potenciostato acoplado con un analizador de la respuesta en frecuencia (FRA) Solartron. Las mediciones
de EIS se realizaron alrededor de los valores de OCP; la amplitud de la onda sinusoidal utilizada fue de
10 mV, el intervalo de frecuencias de 10 kHz a 10 mHz, con 5 puntos por década logarítmica.
Para efectos de análisis de resultados se trabajó con solo dos sistemas; el sistema abiótico, el cual
contenía medio de cultivo ENR estéril, y el medio biótico el cual contenía medio de cultivo MEFALTA
LO Q CONTENIA EL SISTEMA 17 SAND.
II.5.2.4 Circuitos equivalentes
El ajuste de datos se llevó a cabo utilizando el programa Zview en donde los datos fueron
ajustados a dos circuitos equivalentes, los cuales se mostrarán posteriormente en la sección de resultados.
Para el sistema abiótico se realizó un ajuste de datos con un circuito equivalente que consta de dos
resistencias; R1, R2, y un CPE (Constant Phase Element), denominado como elemento de fase constante.
En tanto que en el sistema biótico, se ajustó con otro sistema que comprende de 3 resistencias y 2
elementos de fase constante.
Después del ajuste de datos se llevó a cabo un análisis de sensibilidad, por medio de
ssimulaciones mediante las cuales se buscó observar los cambios en los resultados obtenidos con base en
variaciones de sus principales parámetros los de los circuitos equivalentes para cada tiempo, con el fin de
complementar el análisis de resultados al observar dichas variaciones al graficarpara y evaluar el efecto
de cada parámetro sobre el resultado original
48
III. Resultados
En la primera sección, llamada “Biocomplejidad y Estrategias Multicelulares Microbianas en
Gasolinoductos” se presentan los resultados, análisis y discusión derivados de la caracterización
microbiológica, la cual comprende los resultados de los aislamientos a partir de las muestras del material
de arrastre de gasolinoductos, su caracterización bioquímica, macro y microscópica, además de los
resultados cinéticos y de adhesión con los diversos cultivos mixtos artificiales.
La segunda sección, llamada “Bioelectroquímica de Biopelículas”, presenta los resultados,
análisis y discusión derivados de la caracterización electroquímica con OCP y EIS, en ella se describen
los datos obtenidos a partir de un modelo con circuitos eléctricos equivalentes para la simulación de los
resultados de impedancia; al final de esta sección se determina el rol de algunas de las biopelículas
microbianas estudiadas en la corrosión del acero al carbón y su relación con las estrategias multicelulares
y la biocomplejidad determinadas en la sección de “Biocomplejidad y Estrategias Multicelulares
Microbianas en Gasolinoductos”.
III. 1 Biocomplejidad y Estrategias Multicelulares
Microbianas en Gasolinoductos
Dentro de esta sección se describirán los resultados obtenidos de los aislamientos y de la
caracterización de flora microbiana anaerobia, desde las perspectivas macroscópica, microscópica y
bioquímica, así como la caracterización macroscópica y cinética de cultivos mixtos artificiales. La
caracterización microscópica para los microorganismos aislados comprende los resultados del uso de
microscopía óptica para la observación de la morfología microbiana, su de tinción Gram y esporas. La
caracterización macroscópica se presenta separada para los cultivos puros y los cultivos mixtos
artificiales, la cual consistió en la determinación cualitativa de la formación de biopelículas en dos tipos
de interfases: a) líquido-gas (medio de cultivo con una fase gaseosa de nitrógeno) y b) adhesión sólido-
líquido (acero al carbón con medio de cultivo). Para las prueba de adhesión sólido-líquido se presenta un
análisis superficial por ESEM y EDS.
49
La caracterización bioquímica se presenta para los microorganismos aislados, y la caracterización
cinética de degradación de compuestos BTX y producción de CO2 para los cultivos mixtos provenientes
de los cultivos con sustratos específicos.
III.1.1 Resultados de los Cultivos Semilla
A continuación se muestran los resultados obtenidos al realizar cultivos directamente de las
muestras de gasolinoductos, a partir de los cuales se desarrolló el resto de la experimentación para esta
tesis.
III.1.1.1. Cultivos semilla en medio de enriquecimiento ENR
Previo al trabajo de esta tesis se habían realizado cultivos, a partir de las muestras de
gasolinoductos, con el medio de cultivo ENR utilizando diferentes aceptores de electrones, a partir de los
cuáles se seleccionaron para el trabajo posterior y el aislamiento aquellos cultivos que presentaron mayor
crecimiento (determinado por la turbidez), provenientes de las muestras identificadas como M1, M3, M5,
M7, M8, M9 y M11, las cuales provienen de 7 de los 13 de los diferentes gasolinoductos. De los cultivos
restantes, que no se trabajaron para esta tesis, no se conoce la diversidad biológica ni el resto de los
parámetros presentados en este trabajo. Para los cultivos sustrato-específicos si se trabajó con las 13
muestras, debido a que se tenía un menor número de resultados con crecimiento que en el medio ENR.
En secciones posteriores se mostrarán los resultados de aquellos microorganismos aislados a partir de
estos cultivos.
III.1.1.2. Cultivos semilla en medio MIN con sustratos específicos
104 cultivos se llevaron a cabo utilizando diferentes sustratos (benceno, tolueno, xileno, TBA,
MTBE, pentano, lactato y acetato), para las 13 muestras con 8 sustratos. Dichos cultivos se pasaron a una
segunda resiembra para garantizar la ausencia de restos de gasolina que los microorganismos pudieran
estar utilizando para su crecimiento y que sólo tuvieran el sustrato específico adicionado como única
fuente de carbono y energía. Los resultados de este crecimiento se muestran en la Tabla 7, en donde se
observa que en sólo 33 no hubo crecimiento, mientras que en 71 cultivos los microorganismos fueron
capaces de utilizar los sustratos específicos como única fuente de carbono y energía.
50
Tabla 6. Crecimiento microbiano en fuentes específicas de carbono.
Compuestos M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12
Benceno + + + + + + + ----- + + ----- +
Tolueno + + + + + ----- ----- ----- + + + +
Xileno + ----- + + + + + + ----- + + +
TBA + + + + + + + ----- + + + +
MTBE + + + + + ----- + ----- + + + +
Pentano + ----- + + + ----- + ----- ----- + + +
Lactato + + + ----- ----- ----- + + ----- ----- ----- -----
Acetato + + + + ----- ----- + + ----- + ----- +
A partir de los dos tipos de cultivos positivos presentados en las secciones II.1.1.1 y II.1.1.2 es
que se realizaron los aislamientos y el resto de los estudios para esta tesis.
III.1.2 Resultados de los Aislamientos Mediante Tubo Rodado
A los cultivos semilla que se obtuvieron (presentados en la sección II.1.1) se les realizó la técnica
de tubo rodado, a partir de lo cuál se aislaron algunas de las colonias obtenidas hasta comprobar su
purificación después de revisar la morfología microscópica constante en 3 subcultivos.
De los cultivos semilla con medio ENR se obtuvieron 142 cultivos con la técnica de tubo rodado,
a partir de los cuáles se aislaron y caracterizaron (por los métodos mencionados previamente) 21
bacterias; mientras que de los cultivos con medio MIN y sustratos específicos se tomaron 8 cultivos por
duplicado (de los que presentaron mayor concentración de biomasa de la Tabla 7, esto se evaluó por el
método de cuantificación de proteína) que se sometieron a la técnica de tubo rodado, a partir de los cuáles
se aislaron y caracterizaron 7 bacterias. En las secciones subsiguientes se presentan los resultados de la
caracterización de dichas bacterias aisladas.
III.1.2.1 Resultados con Microorganismos Puros
En las siguientes tablas se presentan los resultados obtenidos con los microorganismos puros
obtenidos a partir de gasolinoductos. Se presenta su caracterización microscópica (Gram + ó -,
morfología microscópica, presencia de polímero asociado), macroscópica (formación de biopelícula) y
bioquímica, en donde �, indica una prueba positiva, y � una negativa.
51
Tabla 7. Resultados de la caracterización de la cepa 63-P1 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 2M8, 10-4 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 1µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
pp negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� �� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� �� � � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + - - Donde N/A: No aplica y L-G: Líquido Gas,
Tabla 8. Resultados de la caracterización de la cepa 64-2 P1 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 4M3 10-4 D1,2 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.5 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
pp negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� � N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� �� �� � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas → IN
D
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - - - -
52
Tabla 9. Resultados de la caracterización de la cepa 64-1 P2 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 4M3 10-4 D1,2 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.3 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� �� �� � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → + - + + - - + - + + - + + + + + + + + + - + - -
Tabla 10. Resultados de la caracterización de la cepa 68-1 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 3 M1D210-1 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Cocos, 1 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A* N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
N/R+ N/R N/R N/R N/R N/R
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas → IN
D
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - - + + * N/A: No aplica, +N/R: No reportado.
53
Tabla 11. Resultados de la caracterización de la cepa 68-2 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 3M1 10-1 D1,2 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Cocos, 1µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A � N/A �
Formación de biopelícula líquido-sólido →
N/R N/R N/R N/R N/R N/R
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + - - - - + + + + + + + + - + + +
Tabla 12. Resultados de la caracterización de la cepa 69-1 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 3M1 10-2 D1,2 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.5 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� � N/A � N/A �
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� �� �� � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + - -
54
Tabla 13. Resultados de la caracterización de la cepa 71-2 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 3M8 D210-4 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Cocos, 0.1 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� � N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� �� �� � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas → IN
D
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + +
Tabla 14. Resultados de la caracterización de la cepa 74 -2 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 3M1 10-2 D1,2 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.5 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� � N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
N/R N/R N/R N/R N/R N/R
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
U
RE
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + - -
55
Tabla 15. Resultados de la caracterización de la cepa 78-1 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 1M1 10-4 D1, 2 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Cocos, 0.2 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� � N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� � � � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + +
Tabla 16. Resultados de la caracterización de la cepa 80-1 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 1M710-3 D1, 2 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 1 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
N/R N/R N/R N/R N/R N/R
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + - -
56
Tabla 17. Resultados de la caracterización de la cepa 80-2 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 1M710-3 D1, 2 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 1 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
N/R N/R N/R N/R N/R N/R
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas → IN
D
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -
Tabla 18. Resultados de la caracterización de la cepa 82-1 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 1M8 D2 10-3 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 1.5 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
�� ��� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� �� � �� �� �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas → IN
D
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + -
57
Tabla 19. Resultados de la caracterización de la cepa 86-2 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 1M7 D2 10-4 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, .0.3 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
�� � � � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas → IN
D
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
G
RA
M
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - - - -
Tabla 20. Resultados de la caracterización de la cepa 87-1 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 4M1 D 10-1 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Cocos, 0.2 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� � � � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas → IN
D
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -
58
Tabla 21. Resultados de la caracterización de la cepa 88-2 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 1M710-3 D1, 2 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.5 µm Presencia de Polímero → N/R
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
N/R N/R N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
N/R N/R N/R N/R N/R N/R
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + - + - -
Tabla 22. Resultados de la caracterización de la cepa 89-P2 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 6M3D110-4 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Cocos, 0.1 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� � N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� � �� � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas → IN
D
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → + - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - - - +
59
Tabla 23. Resultados de la caracterización de la cepa 93-1 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 8M8 10-4 Rep en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.7 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
�� ��� ��� � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + - - + - - - - - - - - - + + -
Tabla 24. Resultados de la caracterización de la cepa 94-2 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 3M3 D2 10-4 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Cocos, 0.1 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� � N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
� �� �� � � �
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + - - - - - - - - + + + + + + + + - + - +
60
Tabla 25. Resultados de la caracterización de la cepa 135 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 4M1 D 10-1 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Cocos, 0.2 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
N/R N/R N/R N/R N/R N/R
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + +
Tabla 26. Resultados de la caracterización de la cepa 137 aislada a partir de los cultivos semilla de la
muestra 4M1 D 10-1 en medio ENR.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Cocos, 0.1 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Formación de biopelícula líquido-sólido →
N/R N/R N/R N/R N/R N/R
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas → IN
D
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + +
61
Tabla 27. Resultados de la caracterización de la cepa SEB10 aislada a partir de los cultivos con sustratos
específicos, muestra PM1 10-4 1 en medio MIN con pentano como sustrato específico.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.5 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -
Tabla 28. Resultados de la caracterización de la cepa SEB5 aislada a partir de los cultivos con sustratos
específicos, muestra TBAM3 10-51 en medio MIN con TBA como sustrato específico.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.5 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + + - + + + + + + + + - - -
62
Tabla 29. Resultados de la caracterización de la cepa SEB9 aislada a partir de los cultivos con sustratos
específicos, muestra PM1 10-3 2en medio MIN con pentano como sustrato específico.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.3 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Positiva Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
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C
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Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + - -
Tabla 30. Resultados de la caracterización de la cepa SEB6 a partir de los cultivos con sustratos
específicos, muestra TBAM3 10-52en medio MIN con TBA como sustrato específico.
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.3 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -
63
Tabla 31. Resultados de la caracterización de la cepa SEB1 a partir de los cultivos con sustratos
específicos, muestra TBAM3 10-3 en medio MIN con TBA como sustrato específico
Caracterización Microscópica ↓
Morfología y tamaño → Bacilos, 0.3 µm Presencia de Polímero → �
Tinción de Gram → Negativa Formación de esporas → �
Caracterización Macroscópica ↓
Tipo de biopelícula ↓ Adherencia a la interfaz de
estudio Turbidez
Producción de
precipitado negro
Bioensuciamiento
Vidrio Metal Interfaz
L-G
Formación de biopelícula líquido-gas →
� ��� N/A N/A N/A N/A
Caracterización bioquímica ↓
Pruebas →
IND
UR
E
GL
U
MA
N
LA
C
SA
C
MA
L
SA
L
XY
L
AR
A
GE
L
ES
C
GL
Y
CE
L
MN
E
ML
Z
RA
F
SO
R
RH
A
TR
E
CA
T
SP
OR
GR
AM
CO
CC
Resultados → - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + -
64
III.1.2.2 Resumen de Microorganismos Puros
En general en la caracterización microscópica se encontró gran diversidad de microorganismos
aislados, se observa que gran parte de los cultivos puros provienen de la muestra M1, y que el 46.4% de
las estructuras observadas son bacilos gram -, seguidos de bacilos y cocos gram + los cuales representan
un 21.4%, y 25% respectivamente, y solo el 7.2% presentan morfología de cocos gram -. La gran mayoría
forma esporas, sobre todo aquellas que se fueron aisladas a partir de cultivos con sustratos específicos.
Tabla 32. Resultados de morfología macroscópica y microscópica.
Nombre Origen de la Muestra
Cocos o Bacilos
Gram Tamaño (µµµµm)
Esporas Biopelícula L-G
Medio
63 P1 2M8, 10-4 Bacilos - 1 + + ENR
64-2 P1 4M3 10-4 D1,2 Bacilos - 0.5 - N/R ENR
64-1 P2 4M3 10-4 D1,2 Bacilos - 0.3 + N/R ENR
68-1 3 M1D210-1 Cocos + 1 - + ENR
68-2 3M1 10-1 D1,2 Cocos + 1 + + ENR
69-1 3M1 10-2 D1,2 Bacilos - 0.5 + + ENR
69-2 3M1 10-2 D1,2 Bacilos + 0.5 - + ENR
71-2 3M8 D210-4 Cocos + 0.1 + + ENR
74-2 3M1 10-2 D1,2 Bacilos - 0.5 + - ENR
78-1 1M1 10-4 D1, 2 Cocos + 0.2 + - ENR
80-1 1M710-3 D1, 2 Bacilos - 1 + + ENR
80-2 1M710-3 D1, 2 Bacilos + 1 + + ENR
82-1 1M8 D2 10-3 Bacilos + 1.5 + + ENR
86-2 1M7 D2 10-4 Bacilos - 0.3 - + ENR
87-1 4M1 D 10-1 Cocos + 0.2 - - ENR
88-2 1M710-3 D1, 2 Bacilos - 0.5 + N/R ENR
89P2 6M3D110-4 Cocos - 0.1 + - ENR
93-1 8M8 10-4 Rep Bacilos + 0.7 + + ENR
94-2 3M3 D2 10-4 Cocos - 0.1 + + ENR 135 4M1 D 10-1 Cocos + 0.2 + - ENR
137 4M1 D 10 Cocos + 0.1 + - ENR
SEB10 PM1 10-4 1 Bacilos - 0.5 + - MIN
SEB8 PM1 10-3 1 Bacilos + 0.5 + + MIN
SEB5 TBAM3 10-51 Bacilos - 0.5 + - MIN
SEB9 PM1 10-3 2 Bacilos - 0.3 + + MIN
SEB1 TBAM3 10-3 Bacilos - 0.3 + - MIN
SEB2 TBAM3 10-41 Bacilos + 0.5 + - MIN SE19-2 BM8C 10-21 Bacilos - N/R + + MIN
SE19-1 BM8C 10-22 Bacilos + N/R + - MIN
SE22-1 TM6C 10-11 Cocos - N/R N/R - MIN
SEB6 TBAM3 10-52 Bacilos - 0.3 + + MIN
65
La diversidad biológica encontrada y descrita a partir de la microscopía óptica, así como la
presencia de biopelícula y el medio en el cual crecieron las bacterias se resume en la Tabla 33, en donde
de manera general se muestran las morfología de las bacterias entre otras de sus características. Las
bacterias a las cuales se les ha denominado como SEB provienen de los aislamientos realizados a los
cultivos con sustratos específicos, en tanto que las primeras 21 bacterias descritas en la tabla anterior
corresponden a los aislamientos en medio ENR, en la misma tabla se observa el origen de la bacteria
aislada a partir de alguna de las 13 muestras tomadas de gasolinoductos (M”X”), en donde se indica el
número del subcultivo y la dilución (D).
En los resultados obtenidos a partir de la caracterización macroscópica se encontró que el 60 % de
los microorganismos puros fueron capaces de desarrollar biopelícula en la interfaz gas electrolito, lo cual
se evidenció como una capa viscosa creciendo entre el medio de cultivo y la atmósfera de nitrógeno
existente en el frasco serológico, en la Figura 20 se alcanza a apreciar la formación de una biopelícula
creciendo en la interfaz líquido gas.
Figura 20. Fotografía de biopelículas creciendo en la interfaz líquido-gas, se observa una capa mucoide
creciendo entre el medio de cultivo, y la atmósfera de nitrógeno.
En tanto que, en los cultivos puros a los cuales se les realizó pruebas de adhesión con acero al
carbón, se encontró que el 93% de los microorganismos anaerobios desarrollaron una biopelícula con
mucosidad densa adherida al cupón de acero al carbón, la placa metálica se vio cubierta de precipitado de
productos de corrosión de Fe, adquiriendo, en la mayoría de los casos, un color negro, el 53% de los
cultivos presentaron precipitación estos productos, y muchos de estos fueron capaces de incluso adherir el
cupón al vidrio.
Las pruebas de adhesión solo fueron realizadas para algunos de los microorganismos puros
aislados a partir de los subcultivos en medio enriquecido, y no así para los microorganismos aislados de
cultivos con sustratos específicos.
66
Los microorganismos aislados a los cuales se les realizaron las pruebas de adhesión y sus
resultados se muestran de manera más explícita en la Tabla 34, cabe destacar que la mayoría de estas no
presentaba aspecto de bioensuciamiento masivo.
Tabla 33. Pruebas de adhesión realizadas a cultivos posiblemente puros.
Muestra Adherencia Turbidez Producción de Fe
(color negro) Biopelícula
Vidrio Biofouling 63-P1 + +++ + + ~
64-1 P2 + ++ ++ + ~ 64-2 P1 ++ ++ +++ +++ M
66P2 ++ +++ +++ +++ ~ 78-1 + + + - ~ 82-1 + + + + ~ 86-2 ++ + + - ~ 87-1 + + + - ~
89-P2 ++ ++ ++ - ~ 92-1 +++ +++++ +++++ + M 92-2 +++ +++ +++ + ~ 92-3 ++ ++++ ++++ +++ ~ 93-1 +++ +++ ++++ +++ M 94-2 + ++ + + ~ 96-2 +++ +++ +++ +++ +
M y “~” se refieren a la apariencia de bioensuciamiento en el medio y no así en toda la placa, y a la débil apariencia de
bioensuciamiento, respectivamente. Biofouling, se refiere a bioensuciamiento.
En la caracterización bioquímica, la mayoría de los cultivos presentaron resultados
completamente distintos, de los 28 aislados, 4 de ellos están repetidos y los resultados se presentan en la
Tabla 34.
Tabla 34. Cepas con los mismos resultados en las pruebas bioquímicas y morfología microscópica.
Cepas con los mismos resultados Pruebas Bioquímicas Morfología Microscópica 68-1, 87-1 � � 74-2, 80-1 � � 78-1, 135 � �
72-1, 137 � �
Estos resultados nos hablan de una gran diversidad microbiana en el sistema de estudio, ya que se
aislaron tan solo 28 bacterias de los 142 cultivos, y solo 4 de estas están posiblemente repetidas, dando un
total de 24 bacterias con diferentes resultados. De acuerdo con la literatura, solo el 1% de los
microorganismos son cultivables en el laboratorio, por lo que se estima que toda esta diversidad es menor
al 1% de la que potencialmente existe en los gasolinoductos. La interpretación de los resultados para
67
definir la identificación microbiana no se presenta en este trabajo, debido a que no es parte de los
objetivos del mismo.
III.1.3 Formación de Biopelícula en cultivos microbianos
Por otro lado, en los resultados de los aislamientos realizados en la primera etapa, de los 142
cultivos mixtos obtenidos, más del 44% presentó formación de biopelícula (Tabla 35). Se observó la
morfología colonial de la biopelícula, generalmente crecida en la interfase gas-electrolito.
La flora microbiana presente en gasolinoductos resultó ser muy vasta, y con una gran capacidad
de formar biopelícula, en las micrografías de la Figura 21 es posible observar microorganismos
distribuidos en forma heterogénea en el exopolímero.
Figura 21. Tinciones de Gram de diferentes muestras de biopelículas anaerobias obtenidas de los
aislamientos realizados en el laboratorio con la técnica de tubo rodado.
La siguiente tabla muestra los resultados del crecimiento microbiano obtenido a partir de los
aislamientos realizados de las 13 muestras de sedimentos de gasolinoductos, por la técnica de tubo
rodado, se observa que solo 7 de las 13 muestras mostraron crecimiento en medio ENR, lo cual contrasta
con los cultivos en sustratos específicos.
Tabla 35. Resultados de los microorganismos aislados de muestras de gasolinoductos.
Crecimiento M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13
Biopelícula 5 - 18 - 2 - 14 20 4 - - - -
Crecimiento s/B 12 - 27 - 7 - 15 8 8 - 2 - -
• Las Muestras (M) para las cuáles no se realizó el aislamiento, se representan con un signo -.
68
La muestra con mayor proporción de biopelículas formadas en la interfaz gas electrolito fue M8,
aunque el crecimiento de los microorganismos presentes en esta muestra disminuyó notablemente al
cambiar el medio de cultivo.
En las pruebas con sustratos específicos se observó crecimiento microbiano capaz de formar
dichas estructuras, se encontró que, como se observa en la Tabla 36, de los 104 cultivos sembrados, 58
cultivos presentaron crecimiento planctónico, 13 cultivos evidenciaron la presencia de biopelículas
creciendo en la interfase gas- electrolito y 33 cultivos no presentaron crecimiento.
Dentro de la misma tabla se aprecia un gran número de muestras capaces de crecer en sustratos
específicos, y solo la muestra 13 no presentó crecimiento en estos sistemas y es por ello que no se
muestra en la Tabla 36.
Tabla 36. Crecimiento con sustratos específicos, crecimiento planctónico o en biopelícula.
Compuestos M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12
Benceno C/P1 C/P C/P C/P Biofilm C/P C/P ----- C/P C/P ----- C/P
Tolueno Biofilm2 C/P C/P C/P C/P ----- ----- ----- Biofilm C/P C/P C/P
Xileno C/P -----3 C/P Biofilm Biofilm C/P C/P C/P ----- C/P C/P C/P
TBA Biofilm C/P Biofilm Biofilm C/P Biofilm C/P ----- C/P C/P ----- C/P
MTBE C/P C/P C/P Biofilm Biofilm ----- C/P ----- C/P C/P C/P C/P
Pentano C/P ----- C/P C/P C/P ----- C/P ----- ----- C/P C/P C/P
Lactato C/P C/P C/P ----- ----- ----- C/P C/P ----- ----- ----- -----
Acetato Biofilm C/P Biofilm C/P ----- ----- C/P C/P ----- C/P ----- C/P 1Crecimiento Planctónico 2 Biopelícula 3 Sin Crecimiento
El hecho de que en sustratos específicos se haya generado un vasto crecimiento sugiere que las
bacterias presentes en estos gasolinoductos son capaces de degradar algunos de los compuestos
recalcitrantes de la gasolina, y que están mejor adaptadas al crecimiento dentro de un sistema con estas
fuentes de carbono, que a un medio con nutrientes más convencionales para cultivo de bacterias. Para
comprobar dicha hipótesis se llevaron a cabo cinéticas de degradación de compuestos BTX, los resultados
de las mismas son presentados en la siguiente sección.
69
III.1.4 Cinéticas de producción de CO2 y degradación de compuestos BTX
A continuación se presentan los resultados de las cinéticas de degradación de compuestos BTX, y
producción de CO2, que se realizaron para observar si las bacterias presentes en los sistemas de estudio
eran capaces de degradar compuestos BTX, estas se realizaron con los microorganismos presentes en
algunos de los cultivos con sustratos específicos.
Como ya se ha mencionado, los cultivos se hicieron por duplicado, para los datos obtenidos de los
cromatógrafos se obtuvieron las desviaciones estándar y en cada caso estas fueron menores a 5. La
duración de las cinéticas fue 48 días, las cinéticas indicaron una velocidad de crecimiento muy lenta, lo
cual es normal, como se sabe las velocidades de crecimiento de microorganismos anaerobios suelen ser
menores que los sistemas que involucran microorganismos aerobios, además del tipo de sustrato en el
estos crecieron.
Se observó claramente la disminución de los picos de estos compuestos a través del tiempo, la
concentración inicial de los compuestos se encuentra en función de la concentración inicial de biomasa
presente en el cultivo, así pues se observa que para el caso de las muestras con benceno como única
fuente de carbono, la concentración disminuye de 77 ppm a 30 ppm para el caso de la muestra BM8,
mientras que en BM9 la concentración disminuye de 71 ppm a 28 ppm. Para el caso de las muestras con
tolueno y xileno como única fuente de carbono las concentraciones disminuyen, en promedio, de 40 ppm
a 5 ppm, y de 19.45 ppm a 3.5 ppm, respectivamente. En la Figura 22, se observa la clara tendencia de
disminución en la concentración de dichos compuestos, lo cual nos indica que el sustrato (compuestos
BTX) esta siendo consumido por los microorganismos presentes.
Para el caso de las cinéticas realizadas para evidenciar la presencia de CO2, se observó un
incremento en la concentración de este compuesto con respecto al tiempo. En la figura 23 se aprecia la
tendencia de la cinética, esta muestra un incremento desde 9 mg de CO2 hasta 18 mg, como es el caso del
cultivo BM9. A su vez, dentro de la gráfica se observan variaciones en la concentración de CO2 lo cual
indica que la cinética no sigue el comportamiento cinético de Monod, esto puede deberse a que el cultivo
contiene más de un género microbiano, y es de esperarse que la cinética tenga variaciones en su
comportamiento, ya que dentro de un cultivo mixto se pueden dar interacciones complejas en las cuales
los productos de algunos microorganismos sean consumidos por otros, tal podría ser el caso del CO2, así
como la posibilidad de que no se esté llevando a cabo una completa mineralización de los compuestos
70
utilizados como sustratos y en su lugar se estén obteniendo intermediarios solubles, como el lactato o
catecoles.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 100 200 300 400 500 600 700
Tiempo (hrs)
ppm
BT
X
BM8
BM9
TM7
TM6
XM6
XM11
Figura 22. Cinética de degradación de compuestos BTX de de cultivos tomados directamente de las 13
muestras resembradas en medio MIN con sustratos específicos.
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0 100 200 300 400 500 600 700
tiempo (hrs)
mg
CO
2
BM8BM9TM7TM6XM6XM11PM1PM10
Figura 23. Cinéticas de producción de CO2 de cultivos tomados directamente de las 13 muestras
resembradas en medio MIN con sustratos específicos.
71
El ajuste de estos datos a un modelo cinético no se presenta en este documento debido a que no forma
parte de los objetivos de esta investigación.
II.1.5 Resultados de Pruebas de adhesión con Cultivos Mixtos Artificiales
En las pruebas con cultivos mixtos aerobios y anaerobios artificiales se encontró una morfología
macroscópica de las biopelículas diferente de la encontrada con los cultivos de microorganismos puros; se
observó que en un medio aerobio con compuestos BTX como fuente principal de carbono los
microorganismos son capaces de crecer, pero el bioensuciamiento disminuye y no se forma una
biopelícula tan invasiva como en el medio aerobio con lactato como fuente de carbono. Cuando se tiene
medio anaerobio la turbidez aumenta y se tiene un precipitado negro bastante evidente, pero la formación
de biopelícula que ensucia la superficie metálica no es tanta como en los medios aerobios con lactato.
Los nombres asignados a cada consorcio para reportar los resultados se muestran previamente en
la Tabla 37, mientras que en la Tabla 38 se describen los resultados de las pruebas de adhesión aplicadas
a cultivos mixtos.
Tabla 37. Nombre completo de los cultivos mixtos, y nombre designado para reportar los datos.
Nombre original del Cultivo Mixto Nombre Asignado
Cultivo Mixto; Aerobio-Anaerobio Lactato 18 de Sep. consorcio Cultivo Mixto 1
Cultivo Mixto de BTX sin sustrato, Anaerobios BTX + Anaerobios Lactato Cultivo Mixto 2
Cultivo Mixto de BTX + sustrato, AnaerobioBTX+ Anaerobio Lactato Cultivo Mixto 3
Cultivo Mixto; Aerobio-Anaerobio Lactato Imp. gas Cultivo Mixto 4
Cultivo Mixto de BTX sin sustrato Anaerobio BTX+ Anaerobio Lactato Cultivo Mixto 5
Cultivo Mixto; Aerobio-Anaerobio con Lactato, inóculo para consorcio de BTX Cultivo Mixto 6
Cultivo Mixto; de BTX medio Aerobio + Anaerobio BTX Cultivo Mixto 7
Cultivo Mixto de lactato M3,1,1, M1,2,1, M13,21 Cultivo Mixto 8
M3,1,1, Lactato, CMR, 15/09/06 Cultivo Mixto 9
M1,2,1 Lactato, 15/09/06 CMR Cultivo Mixto 10
Cultivo Mixto de BTX, M, M3,1,2 O-X, M3T’ Cultivo Mixto 11
72
Tabla 38. Resultados de las pruebas de adhesión a cultivos mixtos de microorganismos aerobios y
anaerobios.
Consorcio Medio Bacterias Adherencia Turbidez Producción de Fe (color negro)
Biopelícula
Cultivo Mixto 1 ENR A/An ++ ++++ +++ Pasiva
Cultivo Mixto 2 MIN+BTX+lact A/An ++ ++++ +++ Pasiva
Cultivo Mixto 3 MIN+BTX+lact A/An + ++++ +++ Pasiva
Cultivo Mixto 4 MIN+BTX+lact A/An ++ ++++ +++ Pasiva
Cultivo Mixto 5 MIN+BTX A/AN BTEX + ++++ +++ Pasiva
Cultivo Mixto 6 ENR A/An +++ ++++ +++ Pasiva
Cultivo Mixto 7 MIN+BTX A/ BTEX, +++++(vidrio) ++++ NO Biofouling
Cultivo Mixto 8 ENR Aerobios - +++ + ++ Pasiva
Cultivo Mixto 9 MIN+ BTX Aerobio puro ++++ ++++ +++ Biofouling
Cultivo Mixto 10 MIN+BTX Aerobio puro +++++(placa) + ++++ Biofouling
Cultivo Mixto 11 MIN+BTX Aerobios de BTEX
+++++(vidrio) + NO Pasiva
La principal observación en este sistema es la coloración de la biopelícula, en medio mínimo con
compuestos BTX sin lactato es blanca-amarillenta mientras que con medio de cultivo de enriquecimiento
con lactato como fuente de carbono da una coloración negra, lo cual podría atribuirse a la diferencia entre
una biopelícula protectora y una biopelícula corrosiva.
En la Figura 24 es posible observar la diferencia entre un consorcio de bacterias aerobias y
anaerobias creciendo en un medio con lactato (Figura 24a), y un consorcio de la misma naturaleza, pero
creciendo en medio MIN con compuestos BTX (Figura 24b) A algunos de estos cultivos mixtos se
les realizó la un análisis superficial por medio de
.
Figura 24. a) Medio aerobio, consorcio de microorganismos aerobios y anaerobios creciendo en medio
con lactato. b) Medio aerobio, consorcio de microorganismos aerobios y anaerobios creciendo en medio
con compuestos BTX.
a) b)
73
A algunos de estos cultivos mixtos se les realizó la un análisis superficial por medio de
Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental (ESEM, por sus siglas en inglés). Así, se muestran
algunas de las microscopías electrónicas que se tomaron de los cultivos a los cuales se les realizaron
pruebas de adhesión. Se observa que para este caso del cupón testigo (esto es: un cupón de acero al
carbón SAE 1018, con medio de enriquecimiento con lactato pero sin la presencia microbiana), los
productos tienen una distribución poco ordenada en una película fina y poco adherente, no se observa una
distribución homogénea ni que cubre todas la superficie.
Dados los resultados del análisis elemental con EDS (no presentados), se observa que algunos de
los elementos que componen los productos de corrosión son en su mayoría carbono, oxigeno, silicio, y
una gran concentración de fosfatos, cloro y calcio.
En los cupones que se inocularon con microorganismos (Figura 26), sobre una superficie invadida
por lo que podría ser exopolímero producido por microorganismos, lo cual sugiere el crecimiento de una
biopelícula sobre la superficie del cupón; se observa una gran diferencia entre las micrografías
presentadas debido a que los sistemas con bacterias presentan zonas de composición y estructura muy
diversas.
En los cultivos mixtos de bacterias aerobias y anaerobias creciendo en medio mínimo (Figura 27)
se observa la formación de productos de corrosión. Llama la atención la manera en la que los productos
de corrosión se distribuyen sobre la superficie del cupón, por la geometría que estos presentan
Figura 25. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental. Testigo; Cupón de Acero al carbón sin microorganismos.
. A la izquierda se ven productos de corrosión cúbicos que según los datos obtenidos por la
microscopía están formados principalmente de carbono, cloruro de sodio, silicio y azufre (diagramas no
presentados). En el centro se observan estructuras esféricas que bien podrían ser estructuras formadas
74
por productos de corrosión asociados a conglomerados de biopelícula. De acuerdo con las microscopías
ópticas se observaron microorganismos muy pequeños (de 0.1 a 0.5 micras) creciendo embebidos en la
biopelícula y la biopelícula podría estar acoplándose esa forma geométrica, el tamaño también podría
explicar las dificultades para observar los perfiles de los microorganismos.
Figura 26. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental. Muestras DGC11, 400x y DGC17, 2500x respectivamente; Cupón de Acero al carbón SAE 1018 con microorganismos.
Por último, a la derecha, en la misma muestra, diferente micrografía (Figura 27), se observan
protuberancias sobre la superficie, se cree que esta también podría ser biopelícula que crece en forma de
heterogénea, y que los conglomerados de productos en la estructura que se observan son exopolímero
producido en la biopelícula.
Figura 27. Microscopía Electrónica de Barrido Ambiental de muestras de cultivos mixtos de
bacterias aerobias y anaerobias. A la izquierda formación de sales, productos de corrosión y biopelícula
en medio enriquecido con lactato 400x. Centro, formación de sales y biopelícula en medio mínimo con
compuestos BTX como única fuente de carbono muestra BTXMA02, 1250x, y derecha; misma muestra,
micrografía BTXMA06, 1000x respectivamente; Cupón de Acero al carbón SAE 1018 con posible
biopelícula.
75
II.1.6 Estrategias Multicelulares
Con base en los resultados de las cinéticas, se sabe que los microorganismos son capaces de
degradar compuestos BTX, siendo capaces de mineralizarlos, y crecer en presencia de MTBE, TBA o
pentano como única fuente de carbono. Se llevó a cabo una revisión bibliográfica de las rutas de
degradación de estos compuestos, con el fin de determinar algunas de las posibles interacciones que
podrían existir en el sistema de estudio [BIOCATALISIS/BIODEGRADATION DATABASE, 2007].
Según lo anterior, los compuestos recalcitrantes que forman parte de la composición de la
gasolina son degradados a compuestos orgánicos tales como acetil-CoA, acetaldehído, piruvato, L-lactato,
y formiato, además de ser posible la mineralización de estos compuestos hasta CO2 y H2O. Cabe
mencionar que la mayoría de estos rutas metabólicas están descritas para un número limitado de bacterias,
y es posible que las interacciones en nuestro sistema de estudio sean diferentes, pero básicamente se
proponen algunas estrategias multicelulares con base en la formación de una biopelícula en donde los
tipos microbianas potenciales de crecer bajo las condiciones de estudio son capaces de interaccionar
simbióticamente, tomando en cuenta las rutas metabólicas publicadas en la literatura.
Figura 28. Posibles estrategias multicelulares en gasolinoductos.
Previo a este trabajo se había evidenciado la presencia de bacterias sulfato reductoras, nitrato
reductoras, fermentativas, reductoras de Fe, metanogénicas, productoras de ácidos orgánicos, y
productoras de acetato en las muestras de gasolinoductos; con base en esto, se proponen distintas
76
interacciones en el sistema, en la Figura 28 se observan algunos de los productos de estas interacciones,
de los cuáles algunos favorecen el aceleramiento del proceso de corrosión, como son, la liberación del N2,
de NH3, la producción de acetato y otros ácidos orgánicos, el CO2, y la producción de H2S que tiene una
gran influencia en corrosión localizada. Es posible que dentro de los gasolinoductos existan consorcios
de bacterias capaces de seguir un comportamiento cercano a la estrategia expuesta en la Figura 28.
Además de las interacciones metabólicas, la formación de la sustancias poliméricas extracelulares que dan
cuerpo a la biopelícula podrían albergar una amplia gama de compuestos que den lugar a otras secuencias
metabólicas y que permitan a las bacterias ser protegidas contra el esfuerzo de corte, así como crear
gradientes de concentración, de oxígeno y de acidificación diferencial.
En estudios posteriores, sería de gran interés analizar las rutas metabólicas y las enzimas
presentes dentro de la degradación de cada compuesto, ya que es un sistema que no se ha estudiado a
fondo, especialmente para el caso de microorganismos anaerobios.
77
III.2 Bioelectroquímica de Biopelículas
En esta sección se presentan los resultados de la caracterización electroquímica con OCP y EIS,
de un sistema abiótico y de un sistema biótico, así como el análisis de los datos por medio de circuitos
eléctricos equivalentes y un modelo computacional sencillo.
III.2.1 Resultados Experimentales de Impedancia
Se obtuvieron más de 1000 mediciones de impedancia y OCP a lo largo del monitoreo, sin
embargo para efectos de simplicidad, solo se muestra en esta parte el análisis de dos de los sistemas de
estudios, el primero consta de un sistema abiótico con medio ENR, mientras que el otro consta de medio
ENR con algunas de las bacterias presentes en los cultivos mixtos de las pruebas de adhesión. Los
resultados de OCP no se presentan explícitos en este documento, sin embargo todos los valores de
impedancia que se muestran fueron medidos con respecto a este valor.
-140000
-120000
-100000
-80000
-60000
-40000
-20000
0
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000
Z' (Ohm)
Z "
(Ohm
)
t = 0 h
t = 4 h
t = 12.5 h
t = 51 h
t = 75 h
t = 83 h
t = 234 h
Figura 29. Diagrama complejo de los datos experimentales para el sistema abiótico (izquierda), obtenido
de las mediciones a una celda con medio de cultivo enriquecido estéril, y su correspondiente acercamiento
a altas frecuencias (derecha).
78
En los datos experimentales graficados (Figura 28, 29 y 30) se aprecian las diferencias entre el
comportamiento electroquímico del sistema abiótico y el sistema biótico. En el diagrama complejo
(Nyquist) del sistema sin bacterias (Figura 28) se observa que hay tanto un aumento en la impedancia real
como en la imaginaria con respecto al tiempo en el que el electrodo metálico está expuesto al electrolito
(medio de cultivo ENR). La interfaz electroquímica provoca una gran resistencia al paso de corriente lo
cuál se observa en las grandes magnitudes obtenidas, especialmente para la impedancia imaginaria, lo
cuál es un indicativo de que la interfase se está formando por productos de corrosión tanto orgánicos
como inorgánicos del hierro, es altamente resistiva. Este comportamiento es característico de la
formación de una capa pasiva. El incremento de las magnitudes de la parte real de impedancia indica que
la velocidad del proceso de disolución (activación) decrece a través del tiempo, esto podría ser debido al
crecimiento de la capa que se forma con los productos de corrosión que impide la reacción directa del
metal con los componentes del medio de cultivo o que las especies electroactivas se agotan
-40000
-35000
-30000
-25000
-20000
-15000
-10000
-5000
0
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000
Z'(Ohms)
Z ''
(Ohm
s)
t = 0 h
t = 23 h
t = 94 h
t = 202 h
t = 218 h
t = 470.5 h
t = 488.5 h
t = 1149 h
t = 1242 h
Figura 30. Diagrama complejo obtenido de las mediciones realizadas al sistema biótico.
Para el caso del sistema biótico se observa que las magnitudes de la impedancia real y la
imaginaria en principio comienzan a aumentar con respecto al tiempo, hasta llegar a un punto en donde la
tendencia cambia y las magnitudes comienzan a decrecer.
79
Es posible que en un principio la reacción de corrosión se viera controlada por un proceso de
pasivación al igual que en el sistema abiótico, principalmente debido al lento crecimiento que presentan
en su mayoría de las ocasiones los microorganismos anaerobios que no supera la influenza de las
reacciones termodinámicas que se llevan a cabo, hasta llegar a un punto en el cual las bacterias establecen
una biopelícula que induce limitaciones por procesos de transferencia de masa, es decir de difusión a
través de la interfaz, a partir de este punto el fenómeno de activación que se observa en el sistema abiótico
ya no es el factor limitante en los procesos electroquímicos de corrosión que ocurren en la interfaz. Las
fluctuaciones en el comportamiento de este sistema
En la figura 29 en el diagrama complejo las magnitudes de ambos ejes con respecto al tiempo
disminuyen a partir de las 218 h de experimentación y posteriormente fluctúan en comportamiento,
especialmente para la impedancia real, la cual sugiere la formación de una biopelícula que alcanza un
estado de crecimiento máximo y posteriormente se desprende una parte haciendo que la interfaz se vuelva
más conductiva, y a su vez el decremento en el diámetro de los semicírculos en los tiempos más largos es
un indicativo de que la velocidad de corrosión para el sistema biótico aumenta.
En los diagramas de Bode que muestran el ángulo de fase (Figura 30), se muestra que en el
sistema biótico (Figura 30b), en comparación con el sistema con medio estéril (Figura 30a), conforme
transcurre el tiempo se observa que a bajas frecuencias el comportamiento simétrico de este diagrama se
ve alterado lo cuál puede interpretarse como la formación de una película con distribución heterogénea en
la interfaz, lo cuál puede deberse a una distribución heterogénea de la biopelícula sobre el metal y a los
productos de corrosión heterogéneamente distribuidos en ella, podría ser que la presencia del exopolímero
provoque que la interfase sea más conductiva.
Asimismo se observa que en el sistema abiótico las variaciones del ángulo de fase varían en
forma creciente en su valor máximo de 70 a 80 grados, mientras que para el sistema biótico varían de 65 a
80, pero además s recorren los valores máximos hacia frecuencias más bajas, con respecto al tiempo, lo
cuál puede deberse a que la presencia de la biopelícula induce la limitación de las reacciones
electroquímicas por procesos de transporte distintos a los de la interfaz abiótica, como se relacionó
previamente a la difusión. El cambio en la amplitud de los picos que con respecto al tiempo ocurren
abarcando más frecuencias en presencia de la biopelícula son un indicativo de que en presencia de la
biopelícula ocurre una secuencia de reacciones electroquímicas y procesos a diferentes velocidades que
tienen una influencia más continua en el acero al carbón que las que ocurren en el sistema abiótico.
80
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
1.00E-02 1.00E-01 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05
Frecuencia (Hz)
Áng
ulo
de
Fas
e (º
)
t = 0 h
t = 4 h
t = 12.5 h
t = 51 h
t = 75 h
t = 83 h
t = 234 h
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
1.00E-02 1.00E-01 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05Frecuencia (Hz)
Áng
ulo
de F
ase
(°)
t = 0 h
t = 23 h
t = 94 ht = 202 h
t = 218 ht = 470.5 h
t = 488.5 ht = 1149 h
t = 1242 h
Figura 31. Diagrama de Bode que muestra el ángulo de fase obtenido de los datos experimentales de un
sistema abiótico(a) y un sistema biótico (b).
III.2.2 Análisis con Circuitos Equivalentes
Los circuitos equivalentes son una combinación de elementos eléctricos tales como: resistores,
capacitares, inductores y elementos de fase constante, entre otros, los cuales pueden dar una respuesta
correspondiente a la del sistema electroquímico para todo el intervalo de frecuencias. Los circuitos
equivalentes o ajuste de datos a circuitos equivalentes es un paso para analizar los datos obtenidos con
EIS. Los valores de los componentes de los circuitos son usados para proveer información a cerca de la
velocidad de corrosión o los mecanismos de corrosión. Un ejemplo simple es cuando usas la resistencia a
la polarización (Rp) para estimar la velocidad de corrosión (icorr).
a)
b)
81
Los ajustes de los datos se realizan al sobreponer los datos experimentales con el comportamiento
de un circuito equivalente dado y hay muchas combinaciones de elementos que pueden dar el mismo
comportamiento en el espectro de impedancia, y la decisión a cerca del circuito más apropiado, debe
relacionarse con el y/o los procesos de corrosión que se están llevando a cabo en el sistema de estudio
[COTTIS y col., 1999].
Para hacer más fácil el uso de circuitos equivalentes para ajustar o modelar datos, al elegir un
circuito se debe hacer con elementos que tengan significado físico y lógico en el sistema. El circuito RC
equivalente más simple, contiene una resistencia del electrolito, una capacitancia de la doble capa, y una
resistencia a la transferencia de carga, que constituyen la impedancia de Faraday y están asociados a los
procesos que ocurren en la interfaz formada sobre el electrodo.
La impedancia de Faraday está hecha de combinaciones paralelas de impedancia de las reacciones
catódicas y anódicas. Para estimar la respuesta que puede estar ocurriendo se puede relacionar esta
impedancia con los diferentes procesos que controlan un proceso [COTTIS y col., 1999].
Hay muchos fenómenos que controlan un proceso de corrosión, uno de ellos es la impedancia de
difusión, que pude modelarse entre otras formas con la Impedancia de Warburg o con los elementos de
fase constante (CPE). La difusión en muchos casos es lo que controla el proceso de corrosión, siendo el
tiempo que tarda una partícula o carga en ser difundida del medio a la superficie del metal, y no así la
reacción de oxido-reducción que sucede al momento de hacer contacto con la superficie, conocida como
activación. Existen otros tipos de fenómenos en corrosión capaces de controlar un proceso, la pasivación
de un sistema, por ejemplo, se puede interpretar como la protección de un dispositivo en estado sólido,
sucede cuando crece una capa de oxido en la superficie de un semiconductor para proveer estabilidad
eléctrica al sistema, debido a que en cierto modo funciona como un aislante que protege al sistema de de
algunas reacciones químicas en el ambiente, lo cual reduce la velocidad de corrosión en un sistema [
COTTIS y col., 1999].
De esta manera, para poder llevar a cabo un ajuste de datos, es necesario tener conocimiento de
los diferentes fenómenos que controlan un proceso de corrosión, que activan o retardan la velocidad de
las reacciones en el sistema de estudio.
Los resultados experimentales de esta investigación se analizaron utilizando un ajuste con
circuitos eléctricos equivalentes. Para el sistema abiótico se realizó un ajuste de datos con el circuito
82
equivalente de la Figura 28a, el cual consta de dos resistencias: R1, la cual esta asociada a la resistencia
del electrolito (RE), y R2, la cual se relaciona con la resistencia a la transferencia de carga (RTQ), y un
CPE (Constant Phase Element), denominado elemento de fase constante, el cual es directamente
proporcional a la capacitancia de la doble capa (Qdc). Se ajustó con este circuito equivalente debido a que
en un sistema abiótico se tienen 3 principales componentes, esto es el electrolito, el metal, y la velocidad
de reacción entre ambos componentes que van a determinar la velocidad de corrosión de nuestro sistema.
En tanto que el sistema biótico (Figura 28b), se ajustó con un circuito equivalente de 3 resistencias y 2
elementos de fase constante: R1, asociada a la resistencia del electrolito (RE), R2, la cual esta asociada a
la resistencia de la biopelícula (RB), y R3, esta asociado a la transferencia de carga (RTC), en tanto que
CPE1 esta asociado a la capacitancia de la biopelícula (QB), CPE2 se asocia a la capacitancia de película
de corrosión (QPC).
Figura 32. Circuitos equivalentes utilizados para el ajuste de datos de impedancia, a) sistema abiótico, b) sistema con biopelícula.
La representación matemática de la impedancia del CPE está definida por la ecuación (9).
nCPEQj
Z⋅⋅
=ω
1
(9)
En donde ω es igual a la frecuencia, j es el número imaginario 1− , Q es la magnitud del CPE,
proporcional a la capacitancia, y n es un parámetro numérico entre 1 y 0. Cuando n se acerca al valor de
1 el CPE se comporta como un capacitor, y esto refleja la distribución homogénea de algunas propiedades
del sistema, y cuando n tiende a 0 algunas propiedades del sistema están heterogéneamente dispersas
[DEVOS O. y col., 2006].
Los resultados de los parámetros obtenidos con dicho ajuste son mostrados en las tablas 39 y 40,
para cada elemento del circuito equivalente correspondiente.
83
Tabla 39. Tabla comparativa de los distintos valores arrojados por el programa Zview en el ajuste de
datos experimentales para diferentes tiempos, para el sistema abiótico.
Tiempo RE QDC n RTC 0 h 29.1 0.000277 0.87109 13835 4 h 30.92 0.000281 0.82746 2.05E+05
12.5 h 31.23 0.000257 0.84495 2.81E+05 51 h 31.57 0.000241 0.86519 1.54E+05 75 h 33.12 0.000244 0.86276 1.89E+05 83 h 34.72 0.000231 0.87756 2.09E+05
234 h 31.48 0.000235 0.88043 4.92E+05
Para el sistema abiótico se observa que la resistencia del electrolito (RE) aumenta de 29.1 a 31.48
con respecto al tiempo, esto puede deberse a un aumento en la resistividad del electrolito.
La formación de una capa pasiva de productos de corrosión, como ya se ha descrito
anteriormente, se ve reflejada en las magnitudes de QDC, que disminuyen de 0.000277 a 0.000235, y de la
RTC que aumenta de 1.3 E4 a 4.92 E5. El valor de n se incrementa de 0.871 a 0.880, lo cuál indica que la
película pasiva se distribuye homogéneamente con respecto al tiempo, siendo ésta la que controla el
proceso de corrosión por activación. El aumento en los valores de la resistencia a la transferencia de
carga es un indicativo cualitativo de que la velocidad de corrosión disminuye con respecto al tiempo para
este sistema.
Tabla 40. Tabla comparativa de los distintos valores arrojados por el programa Zview en el ajuste de
datos experimentales para diferentes tiempos, en el sistema biótico.
Tiempo RE QB nB RB QPC n PC RTC 0 h 23.73 0.00026319 0.75258 24100 ------- ------- -------
23 h 31.38 0.00012209 0.51205 5.54E-08 8.14E-05 0.84672 1.45E+05 94 h 28.92 0.00028752 0.77706 1.846 6.97E-05 0.77351 74697
202 h 26.97 0.00044386 0.85146 3.03E-05 8.13E-05 0.86828 139250 218 h 28.95 0.00089212 0.75217 4.866 0.0003552 0.87538 136330
470.5 h 28.42 0.00051069 0.80791 32815 2.53E-05 0.88821 33619 488.5 h 29.53 0.00047889 0.83153 5129 6.96E-05 0.69412 53035 1149 h 25.7 0.00011939 0.77597 11.42 0.00015564 0.95696 85260 1242 h 26.97 6.63E-05 0.6227 7.254 0.00020224 0.95374 1.42E+05
Para el sistema con bacterias el tiempo 0 se ajustó con el mismo circuito equivalente que el
sistema abiótico, debido a que en este tiempo aun no hay crecimiento de microorganismos. Se observa
que la resistencia del electrolito varía con respecto al tiempo, de 23.73 a 26.97 ohms, mientras que el
parámetro asociado a la capacitancia de la biopelícula (QB), que es proporcional a la acumulación de
cargas, varia con respecto al tiempo, las magnitudes en principio suben y posteriormente decrecen, esto
84
puede asociarse a la presencia de una biopelícula inestable, o bien, que el consorcio pasa por diferentes
etapas con lo cual experimenta más de un fenómeno de control de las reacciones de corrosión, es decir, el
incremento de los valores puede asociarse a un fenómeno de activación, que al paso del tiempo es
controlado por difusión, lo cual explicaría la disminución de valores y el comportamiento de los
parámetros mostrados en la Tabla 40, que tienden a incrementarse y decrecer. En el parámetro nB, es
proporcional a la distribución de biopelícula en la interfaz, se observa que este parámetro fluctúa con
valores entre 0.51 a 0.85, pero no existe una tendencia definida de los mismos, comportamiento que
puede deberse a la formación de la película, al bloqueo de sus espacios libres con productos de corrosión
y al aleatorio desprendimiento de porciones de la misma, reactivando así la superficie metálica expuesta
al electrolito en sitios localizados.
La resistencia de la biopelícula disminuye con respecto al tiempo, esto quiere decir que la
conductividad entre el medio y la biopelícula va aumentando, lo cual puede favorecer los procesos de
corrosión, en tanto que la capacitancia de la película de corrosión (QPC) finalmente aumenta, al igual que
nPC, de manera general, esto se correlaciona con una distribución más homogénea de la película de
productos de corrosión. Por lo que refiere a RTC, se observa que disminuye con respecto al tiempo, las
magnitudes mostradas para ambos casos (sistema abiótico y biótico) son más grandes para el premier
sistema, lo cual nos habla de una disminución en la resistencia a la transferencia de carga para el sistema
biótico, y se traduce de manera cualitativa, en un incremento de velocidad de corrosión con respecto al
sistema abiótico.
En la Figura 33 se observa la gráfica del diagrama complejo para un sistema abiótico, donde se
muestra la calidad de los ajustes con respecto a los datos experimentales para tres de los tiempos de
experimentación, así como la simulación que se les realizó por medio del ajuste con circuitos equivalentes
para los tiempos 0 h, 4 h, 83 h.
Con los parámetros obtenidos del ajuste de los datos se llevó a cabo un análisis de sensibilidad, en
el cual se varió cada parámetro en cinco diferentes magnitudes del orden de 10-1, 10-2, y 101 y 102, para
cada parámetro, esto ayudó a identificar qué parámetros son los que tienen mayor influencia en la
impedancia del sistema de estudio. Con base en el análisis de sensibilidad se encontró que aquellos
parámetros que tuvieron mayor influencia en el sistema de estudio fue, para el sistema abiótico, la
resistencia a la transferencia de carga. Como se pudo apreciar en la Figura 31a, en el diagrama de Bode
del ángulo de fase, las variaciones se dan a bajas frecuencias, estas van aumentando con respecto al
tiempo, el análisis de sensibilidad se observó un desfasamiento similar al aumentar las dimensiones del la
85
resistencia a la transferencia de carga, que es lo mismo que ocurrió en el sistema con RTC (Tabla 39), en
donde se observa un incremento de esta magnitud con respecto al tiempo, esto se interpreta como una
disminución en la velocidad de corrosión con respecto al tiempo. Cabe mencionar que no es una
evaluación cuantitativa, sino cualitativa, partiendo del principio en que la resistencia a la transferencia de
carga es inversamente proporcional a la velocidad de corrosión.
-120000
-110000
-100000
-90000
-80000
-70000
-60000
-50000
-40000
-30000
-20000
-10000
0
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 110000 120000
Z' (Ohms)
Z "
(Ohm
s)
t = 0 h
Simulación t = 0 h
t = 12.5 h
Simulación t = 12.5 h
t = 83 h
Simulación t = 83 h
Figura 33. Diagrama complejo con ajuste de datos de un sistema abiótico
En la figura 34 se alcanza observa el ajuste de parámetros con respecto de los datos
experimentales, para este caso, no se muestran todos los tiempos, solo aquellos en los cuales se puede
observar la tendencia que estos muestran con respecto al tiempo.
Para el caso del sistema abiótico la mayor contribución de los cambios en el sistema se centra en
3 de parámetros; la acumulación de cargas de la biopelícula (QB), la capacitancia de la película de
corrosión (QPC), y la resistencia a la transferencia de carga (RTC).
86
-70000
-63000
-56000
-49000
-42000
-35000
-28000
-21000
-14000
-7000
0
0 7000 14000 21000 28000 35000 42000 49000 56000 63000 70000
Z ' (Ohms)
Z "
(O
hm
s)
t = 0 h
t = 94 h
t = 202 h
t = 470.5 h
t = 1242 h
Simulación t = 0 h
Simulación t = 94 h
Simulación t = 202 h
Simulación t = 470.5 h
Simulación t =1242 h
Figura 34. Diagrama complejo, datos experimentales con ajustes de datos para el sistema
biótico.
Para el primer caso, se observa (Figura 31) que a bajas frecuencias el diagrama presenta grandes
variaciones, dicho comportamiento también se pudo observar en el análisis de sensibilidad al disminuir
los valores de QB, lo cual quiere decir que la acumulación de cargas en la biopelícula va disminuyendo,
esto puede asociarse a que los procesos de corrosión están sucediendo de manera más rápida, y que la
formación de biopelícula incrementa la transferencia de carga en el sistema. En el caso de QPC, se
observó un comportamiento similar al aumentar los valores de este parámetro, quiere decir que el la
acumulación de cargas en la película de corrosión es uno de los parámetros que controlan los procesos
que se desarrollan en nuestro sistema. Por último, la RTC; las variaciones en este parámetro son similares
a las del sistema de estudio, para este caso solo se observa que la velocidad de transferencia de carga varía
con respecto al tiempo, y se puede asociar a los diferentes procesos que se pueden estar llevando a cabo
en el sistema.
88
IV. Conclusiones
� Los resultados obtenidos en el aislamiento que se llevaron a cabo en medio de cultivo ENR y MIN
con sustratos específicos sugieren una gran diversidad microbiana presente en los gasolinoductos,
considerando que solo el 1 % de la flora microbiana nativa es cultivable en laboratorio (misma que no
ha sido ampliamente estudiada). Más del 44% de estos microorganismos son capaces de formar
biopelículas, las cuales tienen influencia en corrosión y son capaces de degradar algunos compuestos
recalcitrantes de la gasolina (pentano, BTX, TBA y MTBE).
� Se obtuvieron cultivos de microorganismos que son capaces de crecer utilizando compuestos de la
gasolina, que además son capaces de producir CO2. Los microorganismos anaerobios, a partir de una
estimación cualitativa de las cinéticas, muestran una baja velocidad de crecimiento y consumo de
sustrato para los compuestos recalcitrantes benceno, tolueno y xileno. Sin embargo, a pesar de que
ocurre la mineralización completa de los sustratos utilizados, no todo el sustrato que se degradó sigue
este proceso. Para estimar con mayor detalle la producción de CO2 es necesario hacer pruebas de
respiración endógena.
� Las biopelículas de cultivos mixtos microbianos estrictamente anaerobios capaces de crecer en medio
anaerobio presentan menor producción de polímero en comparación con las biopelículas mixtas que
crecen en consorcio con bacterias aerobias.
� La flora microbiana anaerobia presenta una gran capacidad de adherencia a sobre acero al carbón
SAE 1018, y gran producción de productos de corrosión en forma de precipitado negro lo cual sugiere
la formación de biopelículas con influencia corrosiva.
� En presencia de compuestos BTX, con medio aerobio, el crecimiento microbiano se observa menos
invasivo que en medio con lactato, y la coloración cambia de negro a un tono blanco-amarillento, lo
cual sugiere la formación de biopelículas compactas protectoras de la corrosión.
� En el sistema con biopelículas, los productos en la interfase metal-electrolito tienden a agregarse en
estructuras más ordenadas en zonas localizadas, y no a distribuirse en toda la interfase como ocurre
con el sistema abiótico.
89
� La caracterización de los microorganismos encontrados en el material de arrastre de gasolinoductos,
es de gran importancia debido a que es un tipo de sistema que no se había caracterizado
anteriormente, además centra su importancia en aquellos microorganismos que son capaces de formar
biopelícula, los cuales tienden a acelerar el proceso de corrosión con influencia microbiológica.
� Se observó que existe la posibilidad que ocurra una red compleja de interacciones dentro de las
biopelículas, potenciales de ser formadas en gasolinoductos, en donde los metabolitos y productos
presentes permiten el establecimiento de comunidades microbianas altamente complejas y
simbióticas.
� Comparativamente desde el punto de vista electroquímico, en un sistema abiótico se observa que la
velocidad de corrosión es menor que en presencia de las biopelículas anaerobias que crecen con
lactato como principal fuente de carbono. En el caso del sistema abiótico existe un control por
procesos de activación, mientras que en el sistema con biopelículas el control de la corrosión esta
dado por procesos de transporte de masa (difusionales) que promueve la presencia de estas
estructuras biológicas.
� Se validó la hipótesis de este trabajo, al aislar y caracterizar una gran cantidad de microorganismos
provenientes de gasolinoductos, cuya diversidad y heterogeneidad permiten el establecimiento de
Biopelículas complejas con influencia en la corrosión.
91
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