Post on 03-Jan-2016
description
Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires :
étude et recherche d’effecteurs
Thèse préparée au laboratoire du cytosqueletteThèse préparée au laboratoire du cytosquelette
INSERM U366 - CEA GrenobleINSERM U366 - CEA Grenoble
Sous la direction deSous la direction de
Didier Job et Odile ValironDidier Job et Odile Valiron
Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaireIntroduction : le cytosquelette microtubulaire
ObjectifsObjectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubulesdes microtubules
Caractérisation d’oligomères stimulant la Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubulesnucléation des microtubules
Recherche de nouveaux effecteurs de Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubulesl’assemblage des microtubules
Conclusions et perspectivesConclusions et perspectives
Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaireIntroduction : le cytosquelette microtubulaire
ObjectifsObjectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubulesdes microtubules
Caractérisation d’oligomères stimulant la Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubulesnucléation des microtubules
Recherche de nouveaux effecteurs de Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubulesl’assemblage des microtubules
Conclusions et perspectivesConclusions et perspectives
Le cytosquelette microtubulaire
InterphaseInterphase MitoseMitose
Structure des microtubules
Assemblage des microtubules
L’assemblage est réversible, nécessite de l’énergie, atteint un état stationnaire hors
d’équilibre
Eléments requis :Eléments requis :Concentration critique, température minimaleSource d’énergie: GTPSolution adéquate (tampon, magnésium)
Nucléation des microtubules
DIMERESDIMERES
OligomèresOligomères
FeuilletsFeuillets
MICROTUBULESMICROTUBULES
Elongation des microtubules
Addition de dimèresAddition de dimères Elongation de feuilletsElongation de feuillets
Instabilité dynamiqueInstabilité dynamique
Etat stationnaire
Consommation d’énergie à l’état stationnaireConsommation d’énergie à l’état stationnaire
Flux de sous-unités
200010
50
4000
30
0
Lo
ng
ueu
r (µ
m)
Temps (s)
TreadmillingTreadmilling
+-
Dynamique des microtubulesin vivo
Interphase Mitose
Une architecture dynamiqueUne architecture dynamique
Modifications du réseau au cours du cycle cellulaire
Renouvellement permanent des microtubules
Instabilité dynamique « tempérée »
Treadmilling
Contrôle de la stabilité des microtubules
Protéines stabilisant les microtubulesProtéines stabilisant les microtubulesMAP1, MAP2, Tau, E-MAP115, MAP 4
Lis1, DoublecortineXMAP230, XMAP215, TOGpSTOP
Intégrateurs du cytosqueletteIntégrateurs du cytosquelettePlakines, BPAG1 (microtubules, neurofilaments)MACF (microtubules, actine)
Protéines déstabilisantesProtéines déstabilisantesStathmine, SCG10XKCM1, Kar3pRev
Modulation du turnover des microtubules
Protéines liant l’extrémité Protéines liant l’extrémité plusplus des microtubules des microtubules
Bim1, EB1, EB2Bim1, EB1, EB2
Tip1pTip1p
Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaireIntroduction : le cytosquelette microtubulaire
ObjectifsObjectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubulesdes microtubules
Caractérisation d’oligomères stimulant la Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubulesnucléation des microtubules
Recherche de nouveaux effecteurs de Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubulesl’assemblage des microtubules
Conclusions et perspectivesConclusions et perspectives
Objectifs
Réévaluation des facteurs contrôlant la Réévaluation des facteurs contrôlant la dynamique des microtubulesdynamique des microtubules
Obtention et caractérisation d’oligomères Obtention et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des de tubuline stimulant la nucléation des microtubulesmicrotubules
Recherche de nouveaux effecteurs de la Recherche de nouveaux effecteurs de la dynamique des microtubulesdynamique des microtubules
Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire
Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubulesdes microtubules
Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
Conclusions et perspectives
Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules
Mise au point de dosages Mise au point de dosages
Mesure simultanée deMesure simultanée de
- concentration en tubuline-GTP
- « masse » de tubuline assemblée
- distribution de longueurs des
microtubules et longueur moyenne
[Tubuline-GTP](t)[Tubuline-GTP](t)
m(t)m(t)
l(t)l(t)
[MT](t)[MT](t)
Tubuline complexée au GTP sans excès de GTPTubuline complexée au GTP sans excès de GTPPas de système régénérateur du GTPPas de système régénérateur du GTP
la tubuline n’assemble qu’une seule fois
Réactions d’assemblages
•Vitesse et amplitude augmentent•Symétrie des courbes
•Désassemblage en dessous de la concentration critique
Nucléation des microtubules
Vitesse de formation de nouveaux microtubules :Vitesse de formation de nouveaux microtubules :• Indépendante de la concentration instantanée en Tubuline-GTP• Fortement dépendante de la concentration initiale en Tubuline-GTP• Exposant de nucléation : environ 6,2
Elongation des microtubules
Vitesse d’élongation indépendante de :Vitesse d’élongation indépendante de :- concentration instantanée de tubuline-GTP- concentration initiale en tubuline-GTP
Limitée par les propriétés intrinsèques des Limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules ?microtubules ?
Désassemblage des microtubules
Désassemblage par catastrophesDésassemblage par catastrophesIndépendant de la longueurIndépendant de la longueur
Des facteurs de catastrophesDes facteurs de catastrophes des oligomères ?
Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules
• Nucléation : un intermédiaire stable entre les Nucléation : un intermédiaire stable entre les dimères de tubuline et les microtubulesdimères de tubuline et les microtubules
Des oligomères de tubuline ?
• Elongation limitée par les propriétés intrinsèques Elongation limitée par les propriétés intrinsèques des microtubulesdes microtubules
Fermeture de feuillets
• Désassemblage limité par la fréquence de Désassemblage limité par la fréquence de catastrophecatastrophe
Des oligomères facteurs de catastrophes ?
Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire
Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
Conclusions et perspectives
Recherche d’oligomères de tubuline contrôlant la nucléation
des microtubules
Production d’assemblages de tubuline stabilisés par Production d’assemblages de tubuline stabilisés par pontage covalentpontage covalent
Protocole dérivé de méthodes de production « d’amorces » de microtubules : pontage modéréAssemblage de microtubules puis traitement modéré à l ’EGSCollecte des fragments de microtubules stabilisésFiltration éliminant les particules de plus de 100 nm
Caractérisation des solutions d’oligomères de tubuline
•Les solutions d’oligomères stimulent l’assemblage des microtubules sous la concentration critique•Absence de fragments de microtubules dans les solutions
- filtration 100 nm- observation en immunofluorescence
Caractérisation des solutions d’oligomères
• Uniquement des dimères (env. 8 nm) et des oligomères (env. 42 nm)• Des oligomères linéaires
Microscopie électroniqueMicroscopie électronique
Diffusion de lumièreDiffusion de lumière
Structure des oligomères
• Liaison de GTP par le dimère de tubulineLiaison de GTP par le dimère de tubuline échangeable sur la sous-unité
• Structures possibles des oligomèresStructures possibles des oligomères
Association longitudinale
Association latérale
Feuillet
Propriétés de liaison du GTP par les oligomères
Echange du GTP des oligomères contre du GTP radioactifEchange du GTP des oligomères contre du GTP radioactif
Des oligomères formés par association latérale de dimères
Affinité plus faibleAffinité plus faibleEchange plus lentEchange plus lent
contraintes liées au pontage ?
Mécanisme de nucléation des microtubules par les
oligomères
Tubuline assembléeTubuline assemblée Longueur moyenne des microtubulesLongueur moyenne des microtubules
Concentration en microtubulesConcentration en microtubules
Exposant de nucléation
Exposant de nucléation
Environ 4 oligomères sont nécessaires pour Environ 4 oligomères sont nécessaires pour former un nouveau microtubuleformer un nouveau microtubule
Caractérisation d’un intermédiaire de nucléation
• Des oligomères linéaires formés par association latérale de Des oligomères linéaires formés par association latérale de dimèresdimères
42 nm environ 10 dimères Taille + diffusion dynamique de la lumière 65% de tubuline sous forme oligomérique
• Exposant de nucléation : environ 4Exposant de nucléation : environ 44 oligomères se combinent pour former un microtubule formation d’un feuillet ?
• Les microtubules ne désassemblent pas spontanémentLes microtubules ne désassemblent pas spontanément Absence de facteurs de catastrophes ?
Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire
Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
Conclusions et perspectives
Stratégie de recherche de partenaires de la tubuline
Partenaires de la tubuline
Un nombre limité de partenairesUn nombre limité de partenaires
Des partenaires variables selon la nature des extraitsDes partenaires variables selon la nature des extraits
Protéines identifiées
MAPs et moteursMAPs et moteurs MAP2, KIF21A Protéines de la famille EBProtéines de la famille EB EB1, EB2 HSPsHSPs HSP70, HSP90 Enzymes du métabolismeEnzymes du métabolisme Citrate lyase
Efficacité de la méthode
Identification de protéines liées au cytosquelette Identification de protéines liées au cytosquelette microtubulairemicrotubulaire
Identification toujours en cours Utilisation d’extraits cellulaires humains (séquençage achevé)Grande diversité d’extraits cellulaires possibles
Purification de partenaires interférant avec Purification de partenaires interférant avec l ’assemblagel ’assemblage
Exposition des domaines de la tubuline impliqués dans l’assemblage
Possibilité de tests fonctionnels en sortie de colonnePossibilité de tests fonctionnels en sortie de colonne Identification d’effecteurs de la nucléation, de facteurs de catastrophes
Plan Introduction : le cytosquelette microtubulaire
Objectifs
Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
Conclusions et perspectives
Conclusions Facteurs contrôlant l’assemblage des microtubulesFacteurs contrôlant l’assemblage des microtubules
Nucléation en deux étapes (oligomères ?)Elongation limitée par les propriétés structurales des microtubulesDésassemblage limité par la fréquence de catastrophes
Facteurs de catastrophes = oligomères?
Stabilisation et caractérisation d’oligomères de tubuline Stabilisation et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubulesstimulant la nucléation des microtubules
Stabilisation de fragments de microtubules par pontage covalent modéréOligomères formés par association latérale d’environ 10 dimèresEnviron 4 oligomères nécessaires pour former un microtubule
Identification de partenaires de la tubulineIdentification de partenaires de la tubulineDes partenaires identifiés « qui font sens »Identifications en cours
Perspectives
Des outils pour étudier les effecteurs du Des outils pour étudier les effecteurs du cytosquelettecytosquelette
Mesure de l’activité sur la nucléation, l’élongation, le désassemblage Etude détaillée de la nucléation à partir des oligomères Recherche de facteurs de catastrophes Réalisation d’un « protéome » des partenaires de la tubuline
Transposition aux études cellulairesTransposition aux études cellulaires Effet des oligomères de nucléation dans les cellules