Post on 06-Dec-2021
i
IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*7 PADA SUBJEK UJI
NONPEROKOK SUKU TIONGHOA INDONESIA DENGAN METODE
POLYMERASE CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Marisa Hayuningsih
NIM : 168114021
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2020
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*7 PADA SUBJEK UJI
NONPEROKOK SUKU TIONGHOA INDONESIA DENGAN METODE
POLYMERASE CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Marisa Hayuningsih
NIM : 168114021
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2020
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Sebab Aku ini mengetahui rancangan-rancangan apa yang ada pada-Ku
mengenai kamu, demikianlah firman TUHAN, yaitu rancangan damai sejahtera
dan bukan rancangan kecelakaan, untuk memberikan kepadamu hari depan yang
penuh harapan”
(Yeremia 29 : 11)
Kupersembahkan karya ini kepada Tuhan Yesus Kristus,
keluarga yang telah memberikan kasih sayang, doa, dan dukungan,
dosen yang telah mendidik selama ini,
teman-teman yang selalu memberi dukungan dan semangat,
Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menjadi tempat untuk menimba
ilmu dan pengalaman.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas
berkat dan penyertaan-Nya, sehingga penelitian dan penyusunan skripsi dengan
judul “Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*7 pada Subjek Uji Nonperokok
Suku Tionghoa Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction” dapat
penulis selesaikan. Skripsi ini penulis susun untuk memenuhi salah satu syarat
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma. Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Dr. Christine
Patramurti Apt. dengan judul “Identifikasi Gen CYP2A6 Alel *4, *7, dan *9 pada
Subjek Uji Suku Tionghoa dan Ras Kulit Hitam Papua di Indonesia dengan
Metode Polymerase Chain Reaction”.
Penulis sadar bahwa proses penyusunan skripsi ini tidak lepas dari
dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini
penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada :
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma.
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma sekaligus dosen pembimbing yang telah
bermurah hati meluangkan waktu untuk membimbing dan memberi masukan
serta arahan kepada penulis.
3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc. selaku Kepala Laboratorium Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan izin untuk
penggunaan segala fasilitas laboratorium selama penelitian, sekaligus dosen
penguji yang telah memberi kritik dan saran yang sangat membangun dalam
penelitian ini.
4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji yang telah
memberi kritik dan saran yang sangat membangun dalam penelitian ini.
5. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang
telah memberikan bimbingan selama ini.
6. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL ............................................................................................ i
HALAMAN JUDUL ............................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................. v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .................................................. vi
HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... vii
PRAKATA ........................................................................................................... viii
DAFTAR ISI ........................................................................................................... x
DAFTAR TABEL .................................................................................................. xi
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiii
ABSTRAK ........................................................................................................... xiv
ABSTRACK ........................................................................................................... xv
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
METODE PENELITIAN ........................................................................................ 2
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 6
KESIMPULAN ..................................................................................................... 13
SARAN ................................................................................................................. 14
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 15
LAMPIRAN .......................................................................................................... 16
BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 29
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR TABEL
Tabel I. Frekuensi alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7…………………………12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik
elektroforesis………………………………………………………………..……..8
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1…………………10
Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR alel gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*7
(perbedaan satu basa ditunjukkan oleh warna hijau dan kuning, primer
ditunjukkan oleh warna biru) …………………………………………..…..……11
Gambar 4. Elektroforegram produk PCR dari berbagai isolat DNA…………...12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian .......................................................... 17
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ......................... 18
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix .......................... 19
Lampiran 4. Product Datasheet of CYP2A6*7 Forward and Reverse Primer ... 20
Lampiran 5. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers ........................... 21
Lampiran 6. Karakteristik Sampel....................................................................... 22
Lampiran 7. Elektroforegram Produk PCR pada Kondisi Optimum .................. 23
Lampiran 8. Frekuensi Alel Gen CYP2A6*7 pada Suku Tionghoa ................... 24
Lampiran 9. Hasil Kuisioner ............................................................................... 25
Lampiran 10. Perhitungan Jumlah Sampel ......................................................... 28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
ABSTRAK
Sitokrom P450 2A6 atau CYP2A6 adalah gen pengkode enzim yang
memiliki peran dalam aktivasi senyawa nitrosamin, sehingga senyawa tersebut
dapat menjadi karsinogenik. Gen ini diketahui memiliki polimorfisme yang tinggi
di Asia. Adanya polimorfisme tersebut akan berpengaruh pada aktivitas enzim
CYP2A6 dalam mengaktivasi nitrosamin. CYP2A6*7 adalah salah satu variasi
yang terjadi akibat Single Nucleotide Polymorphism (SNP), yaitu substitusi
nukleotida tunggal T menjadi C pada urutan basa nukleotida 8454 yang
menyebabkan penurunan aktivitas enzim pengaktivasi nitrosamin. Variasi alel gen
ini ditemukan pada suku Tionghoa dengan frekuensi yang cukup tinggi, yaitu
6,98%. Pada penelitian ini dilakukan identifikasi alel gen CYP2A6*7 pada 30
subjek uji nonperokok suku Tionghoa Indonesia dengan metode Polymerase
Chain Reaction (PCR) dan analisis dengan elektroforesis. Hasil penelitian
menunjukkan tidak adanya alel CYP2A6*7 pada subjek uji nonperokok suku
Tionghoa Indonesia, sehingga tidak terjadi penurunan aktivitas enzim CYP2A6
hingga 35% dalam mengaktivasi nitrosamin.
Kata kunci : CYP2A6*7, PCR, Polimorfisme, Tionghoa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
ABSTRACT
Cytochrome P450 2A6 or CYP2A6 is an enzyme coding gene that
activates the nitrosamine compounds, so these compounds can be carcinogenic.
This gene is known to have high polymorphisms in Asia. The presence of
polymorphisms will affect the activity of the CYP2A6 enzyme in activating
nitrosamine. CYP2A6*7 is one of the variations that occur as a result of Single
Nucleotide Polymorphism (SNP), a single-nucleophile substitution of T to C in
8454 sequence which decreases the activity of nitrosamine activation by CYP2A6.
The variant of this gene is found in Chinese ethnic with a high frequency, which is
6.98%. This study identifies CYP2A6*7 gene allele in 30 Indonesian Chinese
ethnic non-smokers using Polymerase Chain Reaction (PCR) method and its
analysis using electrophoresis. The results showed there is no CYP2A6*7 allele in
Indonesian Chinese ethnic non-smokers, so there is no decrease up to 35% in the
activity of nitrosamine activation by CYP2A6.
Keywords : CYP2A6*7, PCR, Polymorphism, Chinese
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit penyebab kematian kedua di dunia dengan
angka kematian 9,6 juta pada tahun 2018 (WHO, 2018). World Health
Organization (WHO) melaporkan bahwa kanker paru merupakan salah satu dari
lima besar jenis kanker penyebab kematian di dunia, baik pada laki-laki maupun
perempuan. Menurut data GLOBOCAN (IARC) tahun 2012, kanker paru
merupakan penyebab utama kematian akibat kanker pada penduduk laki-laki
(30,0%) dan penyebab kematian akibat kanker kedua pada penduduk perempuan
(11,1%). Faktor risiko kematian akibat kanker paru yang paling dominan adalah
penggunaan tembakau, seperti kebiasaan merokok (Kementerian Kesehatan
Republik Indonesia, 2015).
Bahaya dari merokok tidak hanya mengancam jiwa perokok (perokok
aktif) saja, tetapi juga mengancam orang yang ada di sekitarnya (perokok pasif)
(Susana, 2003). Individu yang pernah menghirup asap rokok memiliki risiko
terkena kanker paru karena asap rokok mengandung senyawa yang berbahaya,
seperti nitrosamin (Hecht, 1998). Senyawa ini akan menjadi karsinogen apabila
telah diaktivasi oleh enzim sitokrom P450 2A6.
Sitokrom P450 2A6 atau CYP2A6 adalah salah satu enzim dari sub
famili gen sitokrom P450 yang memiliki peran penting dalam metabolisme
beberapa senyawa kimia (Patramurti et al., 2015). CYP2A6 juga mengaktivasi
beberapa senyawa prokarsinogen, seperti aflatoxin B1, butadiena, dan nitrosamin.
Enzim ini dapat mengalami polimorfisme yang akan berpengaruh pada ekspresi,
stabilitas, dan fungsi dari enzim (Hodgson, 2010). Penyebab terjadinya
polimorfisme ini bervariasi, seperti Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs),
delesi, duplikasi, konversi dan frameshift (Pharmvar, 2019). Hingga Februari
2012, terdapat sejumlah 38 variasi alel CYP2A6 dan beberapa di antaranya
mengalami SNPs (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).
CYP2A6*7 adalah salah satu variasi yang terjadi akibat SNP pada urutan
basa nukleotida 8454, yang menyebabkan penurunan aktivitas enzim pengaktivasi
nitrosamin. Hal ini terjadi karena substitusi satu basa nukleotida T menjadi C pada
urutan 8454 yang menyebabkan ekspresi dari gen tersebut menjadi tidak normal,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
sehingga aktivitas dari enzim yang dikode oleh gen tersebut juga terpengaruh.
Individu yang memiliki alel CYP2A6*7 dikategorikan sebagai kelompok
intermediate metabolizer, yang berarti aktivitas enzim pengaktivasi nitrosamin
mengalami penurunan hingga 35%. Hal ini menyebabkan nitrosamin menjadi
kurang karsinogenik dan tidak menyebabkan risiko kanker paru (Raunio and
Rahnasto-Rilla, 2012). Informasi terkini menunjukkan bahwa CYP2A6*7 adalah
salah satu polimorfisme CYP2A6 utama yang umum di Asia (Minematsu et al.,
2006). Frekuensi CYP2A6*7 pada perokok maupun nonperokok suku Tionghoa
cukup tinggi, yaitu sebesar 6,98% (Nurfadhlina et al., 2006). Penelitian ini telah
mengidentifikasi alel gen CYP2A6*7 pada subjek uji nonperokok suku Tionghoa
Indonesia dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu proses amplifikasi atau
penggandaan untaian basa-basa DNA yang dibatasi oleh pasangan primer
pengapitnya melalui teknik pengaturan suhu dan penggunaan enzim yang tahan
terhadap suhu tinggi (Matfutchah et al., 2014). Proses PCR merupakan proses
dengan siklus berulang, yang meliputi denaturasi rantai double helix (rantai
double helix DNA terurai menjadi dua untai cetakan DNA tunggal), annealing
(pengenalan primer ke pita DNA yang sesuai), dan ekstensi (proses polimerasi
untuk pembentukan untai DNA baru) oleh enzim Taq DNA polymerase.
METODOLOGI PENELITIAN
Alat
Alat yang digunakan adalah vacutainer K2 yang mengandung EDTA 5,4
mg, PCR tubes, spuit injeksi 3 mL, Thermal cycler (Perkin Elmer 2400), satu set
Elektroforesis (Biorad), UV Transilluminator (Fisher Scientific), timbangan
analitik dengan ketelitian 0,0001 g (Metler Toledo), dispossable gloves, centrifuge
(Fisher Scientific), elution tubes, collection tubes, kolom FABG, water bath, hot
plate (Ika Combinag-red), kamera mirrorless fujifilm XA3, blue tip, yellow tip,
white tip, ice box, mikropipet ukuran 10 L dan 1000 L (Socorex Swiss), gelas
beaker (Pyrex), Erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), dan pipet volume
(Pyrex).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel darah subjek uji nonperokok suku
Tionghoa Indonesia, primer forward (5’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA CAT-
3’) dan primer reverse (5’-AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’) (Minematsu et
al., 2006), Promega Go Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA polymerase,
dNTPs, MgCl2, dan reaction buffer), FavorPrepTM
Blood Genomic DNA
Extraction Mini Kit (berisi FABG buffer, W1 buffer, wash buffer, dan proteinase
K), agarose, Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer (10x), DNA Ladder 1 KB (0,25-10
kb), loading dye (berisi bromophenol blue, xylene cyanol FF, glycerol), etanol
70%, etanol absolut, aqua pro injection, nuclease free water, FluoroVueTM
Nucleic Acid Gel Stain, alkohol swab, dan es batu.
Kriteria Subjek Uji
Penelitian ini menggunakan subjek uji berjumlah 30 (tiga puluh) dengan
kriteria subjek uji yaitu tidak merokok, pernah terpapar asap rokok, dan suku
Tionghoa asli minimal third degree relatives (diketahui dari hasil wawancara).
Semua subjek uji bersedia menandatangani informed consent. Penelitian ini
mengecualikan subjek uji yang sedang mengonsumsi obat rutin, subjek uji dengan
penyakit yang mengharuskan untuk beristirahat total selama lebih dari 10
(sepuluh) hari dalam sebulan, penyakit hepar, dan penyakit lain yang disebabkan
oleh virus dan bakteri.
Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji
Pengambilan sampel darah dilakukan oleh tenaga kesehatan profesional,
dalam hal ini adalah perawat. Sampel darah diambil dari pembuluh vena subjek
uji menggunakan spuit injeksi 3 mL dan ditampung dalam vacutainer K2 yang
mengandung EDTA 5,4 mg. Darah yang diperoleh disimpan pada suhu 4 .
Isolasi DNA dari Sampel Darah
Isolasi DNA dari sampel darah dilakukan dengan menggunakan reagen
FavorPrepTM
Blood Genomic DNA Extraction Mini Kit. Sampel darah yang
digunakan sebanyak 200 µL, dipindahkan ke dalam elution tube 1,5 mL.
Sebanyak 20 µL Proteinase K dan 200 µL FABG buffer ditambahkan ke dalam
sampel (Proteinase K jangan dicampurkan ke dalam FABG buffer), lalu divortex
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
sebentar. Setelah itu, diinkubasi pada suhu 60°C selama 15 menit untuk
melisiskan sampel, setiap 3 menit divortex selama 30 detik. Sentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik. Ditambahkan 200 µL etanol absolut ke
dalam sampel, kemudian divortex selama 30 detik. Sentrifugasi kembali pada
kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik. Kolom FABG dipasangkan pada
collection tube, kemudian sampel pada elution tube dipindahkan ke dalam kolom
FABG dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 1 menit. Kolom FABG dilepas,
cairan pada collection tube dibuang, dan kolom FABG dipasangkan pada
collection tube baru. Kolom FABG segera dicuci dengan 500 µL W1 buffer,
disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit, lalu sisa cairan
dibuang. Kolom FABG kembali dicuci dengan 750 µL wash buffer, lalu
disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit dan sisa cairan
dibuang. Sentrifugasi selama 4 menit untuk mengeringkan kolom FABG. Kolom
FABG dipasangkan pada elution tube baru, kemudian ditambahkan 200 µL
elution buffer dan dibiarkan berdiri diam selama 3 menit. Setelah itu,
disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit untuk mengelusi DNA
dan fragmen DNA disimpan pada suhu -20°C.
Penyiapan Gel Agarosa 1%
Gel agarose 1% digunakan sebagai fase diam dalam elektroforesis untuk
analisis kualitatif isolat DNA. Pembuatan gel agarose 1% dilakukan dengan cara
melarutkan 0,25 g agarose dalam 1 x larutan TBE sebanyak 25 mL, lalu
dipanaskan pada hot plate hingga mendidih sambil diaduk dengan magnetic
stirrer hingga larut. Kemudian ditambah 2,5 µL larutan nucleic acid gel stain dan
diaduk hingga homogen. Larutan tersebut dituang ke dalam cetakan yang telah
diberi sisiran pada bagian tepi dan gel dibiarkan mengeras. Setelah mengeras,
sisiran dicabut hingga terbentuk sumur-sumur sebagai tempat dimasukkannya
sampel yang akan diidentifikasi.
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Analisis kualitatif isolat DNA dilakukan dengan metode elektroforesis.
Gel agarose ditempatkan dalam gel tray elektroforesis berisi buffer 1 x TBE
hingga permukaan gel terendam. Isolat DNA sebanyak 3,0 µL ditambah dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
2,0 µL aquabidest dan 1,0 µL loading dye, kemudian dicampur pada platelet.
Campuran tersebut diambil dengan mikropipet, lalu dimasukkan ke sumuran gel
agarose. Salah satu sumuran diisi dengan DNA ladder sebanyak 5,0 µL,
kemudian elektroforesis dijalankan pada tegangan 110 volt selama 45 menit. Hasil
elektroforesis diamati di bawah UV transilluminator dan didokumentasikan
dengan menggunakan kamera mirrorless fujifilm XA3. Panjang pita akan
diketahui dengan menarik garis lurus masing-masing pita DNA sampel dengan
pita DNA ladder.
Amplifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*7
Amplifikasi fragmen DNA alel gen sitokrom P450 2A6*7 dilakukan
dengan menggunakan primer forward: (3’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA
CAT-5’) dan primer reverse: (5’-AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’)
(Minematsu et al., 2006). Sebanyak 12,5 μL Promega Go Taq Green Master Mix,
1,25 μL forward primer, 1,25 μL reverse primer, 5,0 μL isolat DNA, dan 5,0 μL
nuclease free water dicampurkan hingga volume akhir 25,0 μL. Amplifikasi
dilakukan dengan mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR
yang digunakan yaitu initial denaturasi pada suhu 95˚C selama 5 menit;
dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 95˚C selama 20 detik; annealing pada
suhu 56,5˚C selama 30 detik dan ekstensi pada suhu 72˚C selama 30 detik. Siklus
amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali, lalu diakhiri dengan final
ekstensi pada suhu 72˚C selama 5 menit.
Analisis Produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis
Untuk melihat hasil produk PCR, dilakukan elektroforesis menggunakan
gel agarose 1,5 % sebagai fase diam. Gel agarose ditempatkan dalam gel tray
elektroforesis berisi buffer 1 x TBE hingga permukaan gel terendam. Produk PCR
sebanyak 5,0 μL dicampurkan dengan 1,0 μL loading dye, lalu diambil dengan
mikropipet dan dimasukkan ke sumuran gel agarose. Salah satu sumuran gel
agarose diisi dengan 3,0 μL DNA ladder, kemudian elektroforesis dijalankan
pada tegangan 110 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis dilihat dengan
menggunakan lampu UV transilluminator. DNA yang terekspresi
didokumentasikan dengan menggunakan kamera mirrorless fujifilm XA3.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Analisis Hasil
Hasil yang dianalisis adalah ada atau tidaknya dan frekuensi alel gen
sitokrom P450 2A6*7. Terbentuknya pita pada 439 bp menunjukkan tidak adanya
alel gen sitokrom P450 2A6*7. Adanya alel gen sitokrom P450 2A6*7
ditunjukkan dengan tidak terbentuknya produk. Frekuensi alel gen sitokrom P450
2A6*1 dan sitokrom P450 2A6*7 dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :
Frekuensi *1 =
100 %
Frekuensi *7 =
100 %
Frekuensi alel gen CYP2A6*1 didapatkan dari jumlah pita pada 439 bp
yang terbentuk dibagi dengan jumlah sampel yang digunakan (30 sampel),
kemudian dikalikan 100 %. Frekuensi alel gen CYP2A6*7 didapatkan dari jumlah
pita pada 439 bp yang tidak terbentuk dibagi dengan jumlah sampel yang
digunakan (30 sampel), kemudian dikalikan 100 %.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian polimorfisme CYP2A6 dilakukan empat tahapan utama,
yaitu pemilihan subjek uji, isolasi DNA dari sampel darah subjek uji, analisis
kualitatif isolat DNA, dan analisis produk PCR dengan teknik elektroforesis. Alel
CYP2A6*7 merupakan alel yang akan diidentifikasi pada penelitian ini.
Pemilihan alel CYP2A6*7 didasarkan pada terjadinya polimorfisme pada gen
CYP2A6 yang dapat mempengaruhi aktivasi senyawa nitrosamin dan risiko
terjadinya kanker paru.
Pemilihan Subjek Uji
Penelitian ini menggunakan subjek uji sebanyak 30 orang. Hal ini telah
sesuai dengan jumlah minimum subjek uji untuk penelitian polimorfisme genetik
(B-Rao, 2001). Subjek uji dipilih sesuai dengan kriteria inklusi yang telah
ditetapkan oleh peneliti. Subjek uji yang didapat berusia antara 17-25 tahun
dengan rata-rata usia subjek uji adalah 20 tahun, dengan 13 subjek uji laki-laki
dan 17 subjek uji perempuan. Keseluruhan subjek uji rata-rata pernah menghirup
asap rokok dengan frekuensi sedang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Isolasi DNA dari Sampel Darah
Isolasi DNA dari 30 sampel darah dilakukan dengan menggunakan
FavorPrepTM
Blood Genomic DNA Extraction Mini Kit. Isolasi DNA dilakukan
untuk memisahkan DNA dari bahan lain, seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Isolasi DNA harus menghasilkan DNA tanpa mengandung kontaminan seperti
protein maupun RNA (Surzycki, 2000). Sampel darah yang digunakan adalah
whole blood, yang mengandung sel darah putih (leukosit) dan komponen lainnya.
DNA terkandung dalam leukosit, sehingga dilakukan teknik sentrifugasi untuk
memisahkan leukosit dari komponen whole blood yang lain. Sampel darah
tersebut diisolasi dengan menggunakan Proteinase K dan FABG buffer untuk
melisiskan sel karena DNA terdapat pada nukleus. Penambahan buffer pada
isolasi DNA berfungsi untuk mencegah terjadinya degradasi DNA atau kerusakan
DNA akibat ion logam berat yang dapat mempengaruhi hasil deteksi
menggunakan gel pada elektroforesis. DNA yang telah dilisiskan diendapkan
dengan menggunakan etanol absolut, tujuannya adalah agar DNA yang telah lisis
tidak larut pada saat proses penghilangan kontaminan dengan W1 buffer dan wash
buffer. DNA yang telah dicuci kemudian dilarutkan dengan menggunakan elution
buffer, yang berfungsi untuk menjaga DNA yang dihasilkan agar tidak mengalami
kerusakan (Chacon-Cortes and Griffiths, 2014). Isolat DNA dapat disimpan pada
suhu -70 untuk penyimpanan dalam waktu yang lebih lama, yaitu 5 tahun atau
lebih, serta penggunaan suhu ini juga dapat menjaga untai DNA agar tidak
mengalami kerusakan pada saat penyimpanan (Surzycki, 2000). Isolat DNA yang
dihasilkan dapat dilihat kemurniannya secara kualitatif dengan menggunakan
elektroforesis.
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Hasil isolasi DNA diuji secara kualitatif dengan menggunakan
elektroforesis, tujuannya adalah untuk mengetahui kualitas DNA yang didapat.
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada
pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik
isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk,
ukuran, besar muatan, dan sifat kimia dari molekul. Pemisahan dilakukan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung
oleh makromolekul tersebut (Pratiwi, 2001). Hasil elektroforesis dapat dilihat
dengan menggunakan lampu UV transilluminator. Apabila pita yang dihasilkan
berukuran lebih dari 10.000 bp serta merupakan pita tunggal dan tebal,
menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan murni, tidak tercemar, dan tidak
terdegradasi. Namun apabila terjadi variasi bentuk pita seperti pita ganda,
menunjukkan bahwa isolat DNA yang digunakan sudah tercemar ataupun
terdegradasi menjadi fragmen yang lebih kecil, yaitu nukleotida penyusun DNA
atau penyusun nukleotida itu sendiri (karbohidrat, fosfat, dan basa nitrogen)
(Patramurti et al., 2015). Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa isolat DNA
menghasilkan pita tunggal dan tebal dengan ukuran lebih dari 10.000 bp, yang
berarti bahwa isolat DNA yang digunakan murni. Pita tunggal dan tebal dengan
ukuran lebih dari 10.000 bp tersebut menunjukkan bahwa DNA yang diisolasi
masih utuh (Gambar 1).
M 1 2 3 4 5
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik
elektroforesis
Keterangan :
M : DNA ladder 1 KB (0,25-10 kb) sebagai marker
1-5 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal
Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1%; fase gerak larutan 1 TBE;
kecepatan 110 V/cm selama 45 menit; volume injeksi 6
µL
Isolat
DNA 10.000 bp
Lubang
injek
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Amplifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*7
Identifikasi alel CYP2A6*7 pada penelitian ini dilakukan dengan
menggunakan metode PCR (Minematsu et al., 2006). Prosedur identifikasi alel
dari CYP2A6*7 pada penelitian ini mengadopsi dari penelitian yang telah
dilakukan oleh Gaurine dan Agnes tahun 2017. Kondisi tiap tahap PCR yang
digunakan yaitu initial denaturasi pada suhu 95˚C selama 5 menit; denaturasi pada
suhu 95˚C selama 20 detik; annealing pada suhu 56,5˚C selama 30 detik; dan
ekstensi pada suhu 72˚C selama 30 detik. Siklus amplifikasi tersebut dilakukan
sebanyak 35 kali, lalu diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72˚C selama 5
menit.
Proses penggandaan fragmen DNA pada proses PCR dimulai dengan
denaturasi atau pemutusan rantai DNA double helix menjadi rantai tunggal oleh
suhu tinggi. Rantai tunggal hasil denaturasi selanjutnya mengalami tahap
annealing, yaitu penempelan primer pada posisi forward dan reverse dengan
pengaturan suhu tertentu. Primer berfungsi sebagai penanda dan fragmen yang
memulai proses penggandaan DNA pada lokasi yang diinginkan.
Tahap kritis yang harus diperhatikan pada metode PCR adalah tahap
annealing. Berjalannya tahap ini ditentukan oleh suhu dan ketepatan primer. Suhu
pada tahap ini berpengaruh terhadap proses penempelan primer pada sekuen
DNA. Suhu yang tidak tepat menyebabkan primer tidak menempel pada sekuen
DNA target, sehingga proses penggandaan DNA tidak akan berjalan. Suhu
annealing ditentukan oleh komposisi primer yang digunakan, sehingga dalam
desain primer harus memperhatikan komposisinya agar bisa menempel pada
sekuen DNA target. Primer harus memenuhi syarat dalam hal jumlah maupun
komposisi karena primer harus cukup spesifik dan cukup sederhana agar bisa
menempel dan mengawali proses penggandaan sekuen DNA target. Primer juga
harus mengandung basa G/C dengan komposisi 40-60% dan jumlah basa pada
rentang 15-30. Urutan basa pada primer harus komplementer dengan sekuen DNA
target agar bisa menempel (Hans-Joachim et al., 2006). Primer yang digunakan
dalam penelitian ini yaitu primer forward (5’-CTC CCA GTC ACC TAA GGA
CAT-3’) dan primer reverse (5’-AAA ATG GGC ATG AAC GCC C-3’)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
(Minematsu et al., 2006). Pada penelitian ini digunakan primer dengan target alel
normal, yaitu CYP2A6*1 dengan menempel di daerah exon 9. Situs penempelan
primer pada fragmen DNA target ditunjukkan pada Gambar 2.
5’ 3’
CTCCCAGTCACCTAAGGACAT TTTTACCCGTACTTGCGGG
GAGGGTCAGTGGATTCCTGTA AAAATGGGCATGAACGCCC
5’ 3’
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen CYP2A6*1
Keterangan :
: Arah penempelan primer forward
: Arah penempelan primer reverse
Tahap terakhir adalah ekstensi, yaitu proses pemanjangan (pembentukan
rantai double helix oleh bantuan enzim DNA polymerase). Proses ini akan terus
terulang dari jumlah siklus yang diinginkan dan akan menghasilkan jumah DNA
sebanyak 10n (n adalah jumlah siklus) (Hans-Joachim et al., 2006). Ekstensi
dilakukan pada suhu 72 selama 30 detik dan final ekstensi pada suhu 72
selama 5 menit.
Produk PCR yang dihasilkan pada penelitian ini berupa fragmen DNA
dengan panjang 439 bp yang merupakan alel CYP2A6*1. Alel CYP2A6*7 pada
isolat DNA nonperokok suku Tionghoa tidak akan menghasilkan produk PCR
karena primer forward yang digunakan tidak menempel pada DNA target akibat
perbedaan satu basa nitrogen pada basa ke 21, yaitu pada tempat penempelan
primer forward (Gambar 3). Alel CYP2A6*7 muncul karena terjadi SNP, yaitu
perubahan 1 basa T (timin) menjadi C (sitosin) pada exon 9 yang menyebabkan
penurunan fungsi alel (Xu et al., 2002).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
A. CTCCCAGTCACCTAAGGACATTGACGTGTCCCCCAAACACGTGGGCTTT B. CTCCCAGTCACCTAAGGACACTGACGTGTCCCCCAAACACGTGGGCTTT
A. GCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGCGA B. GCCACGATCCCACGAAACTACACCATGAGCTTCCTGCCCCGCTGAGCGA
A. GGGCTGTGCCGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGG B. GGGCTGTGCCGGTGCAGGTCTGGTGGGCGGGGCCAGGGAAAGGGCAGGG
A. CCAAGACCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCAGCTAAGACTGGGGGCAGGATG B. CCAAGACCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCAGCTAAGACTGGGGGCAGGATG
A. GCGGAAAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGAAACAGAAGC B. GCGGAAAGGAAGGGGCGTGGTGGCTAGAGGGAAGAGAAGAAACAGAAGC
A. GGCTCAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGG B. GGCTCAGTTCACCTTGATAAGGTGCTTCCGAGCTGGGATGAGAGGAAGG
A. AAACCCTTACATTATGCTATGAAGAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATT B. AAACCCTTACATTATGCTATGAAGAGTAGTAATAATAGCAGCTCTTATT
A. TCCTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAAACCATTGCAGCT B. TCCTGAGCACGTACCCCCGTGTCACCTTTGTTCAAAAACCATTGCAGCT
A. CACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTT B. CACCTAATTGCCACAAACCTCTGCGAAGGGCGTTCATGCCCATTTT
Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR alel gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*7
(perbedaan satu basa ditunjukkan oleh warna hijau dan kuning, primer
ditunjukkan oleh warna biru)
Keterangan :
A : potongan urutan basa CYP2A6*1 menurut Gen Bank
B : urutan basa CYP2A6*7 menurut Minematsu et al. (2006)
Analisis Produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis
Produk PCR hasil amplifikasi isolat DNA nonperokok suku Tionghoa
dianalisis menggunakan elektroforesis dengan gel agarose 1,5% dan
didokumentasikan dengan kamera mirrorless fujifilm XA3. Produk PCR hasil
amplifikasi dalam penelitian ini ditunjukkan oleh pita dengan ukuran 439 bp,
yang berarti bahwa sampel DNA tersebut merupakan alel CYP2A6*1. Alel
CYP2A6*7 tidak ditemukan pada penelitian ini yang ditunjukkan oleh
terbentuknya pita 439 bp pada semua sampel (Gambar 4).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
M 1 2 3 4 5 6 7
Gambar 4. Elektroforegram produk PCR dari berbagai isolat DNA
Keterangan :
M : DNA ladder 1 KB (0,25-10 kb) sebagai marker
1-7 : Produk PCR dari berbagai isolat DNA yang
berbeda
Kondisi elektroforesia : Fase diam agarose 1,5%; fase gerak 1 TBE;
kecepatan 110 V/cm; volume injeksi 6 µL
Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa produk PCR yang dihasilkan
merupakan produk dari alel aktif CYP2A6*1 dan dari 30 sampel yang
diidentifikasi, tidak ada subjek uji yang memiliki alel CYP2A6*7 (Tabel I). Hasil
tersebut dapat diartikan bahwa sebanyak 30 sampel yang tidak memiliki alel
CYP2A6*7 tidak mengalami penurunan aktivitas enzim CYP2A6 dalam
mengaktivasi nitrosamin, sehingga risiko terjadinya kanker paru juga tidak
mengalami penurunan.
Tabel I. Frekuensi alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*7
Alel Jumlah Frekuensi
CYP2A6*1/ CYP2A6*1 30 100%
CYP2A6*1/CYP2A6*7 0 0%
Individu yang memiliki alel gen CYP2A6*7 dikategorikan dalam
kelompok intermediate metabolizer, yang berarti aktivitas enzim CYP2A6 dalam
10.000 bp
Produk PCR
dengan
panjang pita
439 bp
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
mengaktivasi senyawa nitrosamin mengalami penurunan hingga 35% (Raunio and
Rahnasto-Rilla, 2012). Penurunan aktivitas enzim ini terjadi karena adanya SNP,
yaitu penggantian satu basa T pada urutan 8454 menjadi C. Terjadinya
penggantian satu basa tersebut mempengaruhi ekspresi dari gen, sehingga
aktivitas dari enzim yang dikode oleh gen tersebut juga menjadi tidak normal.
Apabila aktivitas dari enzim pengaktivasi nitrosamin mengalami penurunan, maka
jumlah senyawa nitrosamin yang menjadi karsinogen juga menurun, sehingga
risiko terjadinya kanker paru juga akan menurun. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa semua subjek uji dalam penelitian ini tidak memiliki alel gen CYP2A6*7,
sehingga aktivitas enzim pengaktivasi nitrosamin tidak mengalami penurunan
seperti individu yang memiliki CYP2A6*7, dan risiko terjadinya paru tidak
menurun.
Enzim CYP2A6 juga berperan penting dalam metabolisme beberapa
senyawa, seperti nikotin, metoksifluran, halotan, asam valproat, disulfiram,
kumarin, dan tugafur (Hodgson, 2010). Pada individu yang memiliki alel gen
CYP2A6*7, aktivitas enzim dalam metabolisme beberapa senyawa tersebut akan
mengalami penurunan hingga 35% (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012), sehingga
jumlah senyawa yang termetabolisme juga mengalami penurunan. Oleh karena
itu, individual dose sangat penting untuk diperhatikan karena adanya
polimorfisme dan efek dari suatu senyawa yang ditimbulkan akibat adanya
polimorfisme pada setiap individu berbeda.
KESIMPULAN
Hasil identifikasi alel gen sitokrom P450 2A6*7 pada subjek uji
nonperokok suku Tionghoa Indonesia adalah tidak terdapat alel gen sitokrom
P450 2A6*7 dengan frekuensi 0%, sehingga tidak terjadi penurunan aktivitas
enzim P450 2A6 hingga 35% dalam mengaktivasi nitrosamin dan nitrosamin
menjadi kurang karsinogenik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
SARAN
Untuk penelitian selanjutnya, penulis menyarankan untuk dilakukan
identifikasi polimorfisme alel gen CYP2A6 pada alel non aktif yang berbeda,
yang diduga memiliki peran terhadap proses aktivasi nitrosamin pada populasi
nonperokok suku Tionghoa.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
DAFTAR PUSTAKA
B-Rao, C., 2001. Sample Size Considerations in Genetic Polymorphism Studies.
Human Heredity, 007(52), 191–200.
Chacon-Cortes, Griffiths, L.R., 2014. Methods for extracting genomic DNA from
whole blood samples : current perspectives. Journal of Biorepository for
Applied Medicine, 1–9.
Hans-Joachim, D., Annette, D., Doris, E., Stefanie, G.-J., Joe, K., 2006. PCR
Applications Manual 3rd edition. Roche, Germany.
Hecht, S.S., 1998. Biochemistry, Biology, and Carcinogenicity of Tobacco-
Specific N-Nitrosamines 11(6), 5–8.
Hodgson, E., 2010. Modern Toxicology, 4th ed. North Carolina State University,
Raleigh, North Carolina.
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2015. Situasi Penyakit Kanker.
Buletin Jendela Data dan Informasi Kesehatan,.
Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno,
H., Ishizaka, A., 2006. Limitation of cigarette consumption by CYP2A6*4,
*7 and *9 polymorphisms. European Respiratory Journal, 27(2), 289–292.
Nurfadhlina, M., Foong, K., Teh, L.K., Tan, S.C., 2006. CYP2A6 polymorphisms
in Malays , Chinese and Indians 36(August), 684–692.
Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., Martono, S., 2015. Polymorphism of
Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese
Indonesian Smoker and Non Smoker. Indonesian J. Pharm, 26(1), 11–19.
Pratiwi, R., 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana, XXVI(1), 25–31.
Raunio, H., Rahnasto-Rilla, M., 2012. CYP2A6: Genetics, structure, regulation,
and function. Drug Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73–88.
Surzycki, S., 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer, New York.
Susana, D., 2003. Penentuan Kadar Nikotin Pada Asap Rokok. Makara
Kesehatan, 7(2), 2–5.
Xu, C., Rao, Y.S., Hoffmann, E., Jones, J., Sellers, E.M., Tyndale, R.F., 2002. An
in Vivo Pilot Study Characterizing the New. Biochemical and Biophysical
Research Communications, 290(1), 318–324.
Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Lampiran 4. Product Datasheet of CYP2A6*7 Forward and Reverse Primer
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Lampiran 5. Product Information of DNA Ladder and Markers
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Lampiran 6. Karakteristik Sampel
Nomor sampel CYP2A6*7 Risiko terjadi kanker paru
1 Tidak ada Normal
2 Tidak ada Normal
3 Tidak ada Normal
4 Tidak ada Normal
5 Tidak ada Normal
6 Tidak ada Normal
7 Tidak ada Normal
8 Tidak ada Normal
9 Tidak ada Normal
10 Tidak ada Normal
11 Tidak ada Normal
12 Tidak ada Normal
13 Tidak ada Normal
14 Tidak ada Normal
15 Tidak ada Normal
16 Tidak ada Normal
17 Tidak ada Normal
18 Tidak ada Normal
19 Tidak ada Normal
20 Tidak ada Normal
21 Tidak ada Normal
22 Tidak ada Normal
23 Tidak ada Normal
24 Tidak ada Normal
25 Tidak ada Normal
26 Tidak ada Normal
27 Tidak ada Normal
28 Tidak ada Normal
29 Tidak ada Normal
30 Tidak ada Normal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Lampiran 7. Elektroforegram Produk PCR pada Kondisi Optimum
M 29 30
M 15 16 17 18 19 20 21 M 22 23 24 25 26 27 28
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 13 14 15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 8. Frekuensi Alel Gen CYP2A6 *7 pada Suku Tionghoa
Alel Jumlah Frekuensi
CYP2A6*1/ CYP2A6*1 30 100%
CYP2A6*1/ CYP2A6*7 0 0%
- Frekuensi *1/*1 =
100 %
=
100 %
= 100%
- Frekuensi *1/*7 =
100 %
=
100 %
= 0%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 9. Hasil Kuisioner
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Lampiran 10. Perhitungan Jumlah Sampel
Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal
pada penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001) adalah :
Nmin log (1 – )/2 log (1- fmin)
Keterangan :
Nmin : jumlah sampel minimal
: probabilitas alel utama
fmin : frekuensi alel minor
Pada penelitian ini, jenis alel yang akan diteliti adalah dua macam, yaitu
CYP2A6*1 dan CYP2A6*7 (minor). Maka, menurut B-Rao (2001), nilai dan
fmin untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah = 0,95 dan fmin = 0,05.
Jadi, jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian adalah :
Nmin log (1 – )/2 log (1- fmin)
log (1 – 0,95)/2 log (1- 0,05)
28,89
29 orang
Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 30 orang,
sehingga jumlah tersebut sudah memenuhi persyaratan sampel untuk penelitian
genetik polimorfisme.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
BIOGRAFI PENULIS
Skripsi dengan judul “Identifikasi Alel Gen Sitokrom
P450 2A6*7 pada Subjek Uji Nonperokok Suku
Tionghoa Indonesia dengan Metode Polymerase Chain
Reaction” ditulis oleh penulis dengan nama lengkap
Marisa Hayuningsih. Penulis lahir di Boyolali pada
tanggal 27 November 1996 dan merupakan anak
kandung keempat dari pasangan Jiyanto dan Sri Harjani.
Pendidikan formal yang telah ditempuh penulis yaitu TK
Pertiwi Trosobo (2001-2003), SD Negeri 1 Trosobo (2003-2009), SMP Negeri 1
Simo (2009-2012), dan SMA Negeri 1 Simo (2012-2015). Pada tahun 2016,
penulis melanjutkan pedidikan ke jenjang Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama perkuliahan, penulis aktif dalam
kegiatan UKF, yaitu Paduan Suara Fakultas (PSF) Veronika. Penulis merupakan
anggota PSF Veronika periode 2016/2017 hingga 2018/2019. Penulis pernah
mengikuti Pekan Olahraga dan Seni Farmasi Indonesia (PORSFI) 2017 kategori
vocal group dan berhasil meraih juara I. Penulis juga aktif dalam beberapa
kegiatan, yaitu Titrasi 2017 sebagai anggota Bandzen dan Pekan Seni Mahasiswa
Daerah (Peksimida) Yogyakarta 2018 Tangkai Lomba Vocal Group sebagai
sekretaris. Penulis menyelesaikan tugas akhir ini berdasarkan ketekunan dan
pengalaman bekerja keras selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma. Semoga skripsi ini berguna bagi pembaca.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI