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EXPLORATION DU METABOLISME CELLULAIRE PAR CYTOMETRIE EN FLUX ET EN IMAGES
Amira ZARROUK,1, 2 Anne VEJUX,1 Gérard LIZARD1
1 - Université de Bourgogne/Equipe Bio-peroxIL (EA 7270) / INSERM, Dijon, France
2 - Université de Monastir, Laboratoire de Biochimie- UR ‘Nutrition Humaine et Désordres Métaboliques’, Monastir, Tunisie
Université de Bourgogne
Vèmes Journées Nationales de Cytométrie en Flux (JNCF-2013)
للقيس الخلوي المتدفق خامسةالايام الوطنية ال
Faculté de Pharmacie de Monastir, TUNISIE : 7-9 Mars 2013 Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Métabolisme cellulaire : aspect biochimique
PubMed
20 février 2012
Metabolism + Cytometry
87 397 citations
• Metabolism + Cytometry + Lipids
7 741 citations
• Metabolism + Cytometry + Cholesterol
731 citations
• Metabolim + Cytometry + Carbohydrates
10 222 citations
• Metabolim + Cytometry +Glucose
1 494 citations
Chemistry is the logic of biological
phenomena – Reginald H Garett
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Le métabolisme regroupe l'ensemble des activités cellulaires qui se
déroulent de manière ininterrompue pour permettre à la cellule de
remplir des fonctions qui lui sont spécifiques.
C'est un processus complexe et ordonné comprenant plusieurs aspects
étroitement liés (métabolisme énergétique, lipidique, glucidique,
protéique, nucléique, oxydatif) qui fait intervenir des processus de
dégradation (catabolisme) et de synthèse organique (anabolisme).
Le métabolisme cellulaire est un mécanisme adaptatif sujet aux
pressions de l’environnement (syndrome métabolique).
Il existe de nombreuses pathologies (maladies génétiques) liées à des
troubles du métabolisme (diabète de type 1, leucodystrophies
peroxysomales, …).
Métabolisme cellulaire : aspect biochimique
Gérard Lizard, EA7270,
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Acides gras (C22 ≤ )
Métabolisme Lipidique Hépatique
Glycogène
Glucose (Insuline)
glucagon
Protéines
Acides
aminés
Acétyl-CoA
ABCD1
Acétyl-CoA (Cn-2) + Acétyl-CoA
peroxisome
Catalase
( + RH2)
½ O2 + H2O
R + 2 H2O
Acides gras à très longue chaîne ≥ C22 (alimentation, métabolisme)
CO2
Noyau (AGs, cholestérol,
oxystérols, …)
activation
et
répression
de gènes
D-PBE
D-PBE
PPARs, LXRs,
RXR, PXR…
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Université de Bourgogne / INSERM
Métabolisme Lipidique Cérébral
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM V. Leoni, C. Caccia : Biochimie 95 (2013) 595-612
Acyl-CoA
VLCFAs (FAs ≥ C22) Eicosanoïdes Acide dicarboxylique Intermédiaires des acides biliaires (DHCA, THCA)
+ CoA (Acyl-CoA synthase)
O2
H2O2
Catalase
(n-2) Acyl-CoA Acetyl-CoA
COT
Acétyl-Carnitine
Acide phytanique +
CoA (Acyl-CoA synthase)
β-oxydation
α-oxydation
Acide pristanique
C24:6, n-3 +
CoA (Acyl-CoA synthase)
C22:6, n-3 (DHA)
DHAP
DHAPAT
Acyl-DHAP
Alkyl-DHAP
synthase
Alkyl-DHAP
plasmalogènes
Réticulum endoplasmique
Oxydation mitochondriale ou élongation
Acyl-Carnitine
CAT
β-oxydation
Voies métaboliques affectées
dans la maladie d’Alzheimer et
Démences du type Alzheimer
Voies métaboliques
affectées
dans les leucodystrophies
peroxysomales
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Statut Peroxysomal et Physiopathologie des Leucodystrophies
(X-ALD, P-NALD)
Fonctions
du peroxysome Baes M & Aubourg P
Neuroscientist 2009; 15; 367
C24:0
C26:0
ABCD1
- X-ALD (X-Linked Adrenoleukodystrophy)
fréquente : 1:17 000
déficience en ABCD1
déficience en -oxydation peroxysomale
accumulation d’AGTLCs (C24:0; C26:0)
ACOX1
- P-NALD (Pseudo Neonatal ALD)
très rare
déficience en ACOX1
déficience en -oxydation peroxysomale
accumulation d’AGTLCs & déficience en DHA
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Gérard Lizard, EA7270,
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Implication du métabolisme lipidique, peroxysomal et mitochondrial
dans les maladies neurodégénératives
Peroxysome et AGTLCs
* leucodystrophies peroxysomales,
* Incidence de dysfonctions peroxysomales sur
- viabilité cellulaire,
- stress oxydant
- inflammation
- myélinisation
* Vieillissement / démences
Relations peroxysome – mitochondrie
Métabolisme du cholestérol et démences (maladie d’Alzheimer)
Métabolisme du cholestérol et démyélinisation
(leucodystrophies, sclérose en plaque)
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Outils et méthodes de cytométrie
pour l’étude du métabolisme peroxysomal, mitochondrial,
oxydatif et lipidique
Le peroxysome
• Organite cellulaire souvent rond
(0,1 à 1 µm de diamètre)
• Présent dans les cellules animales et
végétales à l’exception des érythrocytes
• Pas d’ADN
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Charactérisation in situ du peroxysome
Hépatocytes murins
0.5 µm
Oligodendrocytes murins 158N
0.5 µm
Oligodendrocytesmurins 158N: ABCD3
5 µm
- Microscopie électronique à transmission (activité catalase)
- Microscopie confocale (ABCD3, catalase)
12 µm
Cellules neuronales humaines SK-N-BE: catalase
Peroxisome: GFP or RFP–PTS1
- Fluorescent protein–based markers
for peroxisomes
- Cytométrie en flux
•ABCD1
•ABCD3
•Catalase
•ACOX1
•L-PBE
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Gérard Lizard, EA7270,
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Caractérisation de la biogénèse et du métabolisme peroxysomal
- Biogénèse peroxysomale
Microscopie électronique à transmission
Immunofluorescence (ABCD3; catalase)
Microscopie confocale
Reconstruction-3D
Analyse d’images (quantification)
PAGE / Western blotting
RT-qPCR
- Activitée peroxysomale
β-oxydation
activitée catalase
activitée ACOX1
taux de DHA
taux de C24:0 et C26:0; rapports: C24:0/C22:0; C26:0/C22:0
taux d’acide phytanic
Caractérisation in situ de la mitochondrie (MET)
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0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm
0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm
m
m
m
m
m m
m m
m m
m
m
m m
m
m m m
Control Vehicle C22:0 (10 µM) C24:0 (10 µM) C26:0 (10 µM)
Zarrouk A et al. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:623257. doi: 10.1155/2012/623257
Gérard Lizard, EA7270,
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Topographie mitochondriale et quantification
Control
Vehicle
5 µm
C22:0 – 5 µM
C24:0 – 5 µM
C26:0 – 5 µM
C22:0 – 10 µM C22:0 – 20 µM
C24:0 – 10 µM
C26:0 – 10 µM
C24:0 – 20 µM
C26:0 – 20 µM
C22:0 – 10 µM C24:0 – 10 µM C26:0 – 10 µM
Contrôle
Véhicule
VLCFAs
No
mb
re d
e c
ellu
les
Fluorescence Intensité de fluorescence (MitTracker Red)
Zarrouk A et al. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:623257. doi: 10.1155/2012/623257
MitoTracker Red
Potentiel Transmembranaire Mitochondrial (∆Ψm)
Coloration avec DiOC6(3) ou JC1
- DiOC6(3) (40 nM ; permet de détecter les cellules avec des mitochondries
dépolarisées ou hyperpolarisées)
- JC-1 (1 µg/mL ; permet la distinction des cellules vivantes (colorées en rouge)
et mortes ( avec des mitochondries dépolarisées et colorées en vert))
Controle Traité
Cellules
mortes
Cellules
mortes
Cellules
vivantes
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Fluorochromes adaptés à la détection
d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote
Espèces réactives de
l’oxygène et de l’azote Fluorochromes et réactifs
• Peroxyde d’hydrogène ; H2O2
•Radical hydroxyl ; HO·
• Acide hypochlorique ; HOCl
• Oxyde nitreux ; ·NO
• Peroxynitrite ; ONOO–
• Anion superoxyde; O2 ·–
CM-H2DCFDA ; AM-H2DCFDA ; Dihydrocalcéine AM;
Dihydrorhodamine 123 ; Dihydrorhodamine 6G ;
H2DCFDA ; Lucigénine ; Luminol
3'-(p-Aminophényl) fluorescéine) ; 3'-(p-Hydroxyphényl) fluorescéine)
CM-H2DCFDA ; AM-H2DCFDA ; Proxyl fluorescamine ; TEMPO-9-AC
Aminophényl fluorescéine ; Dihydrorhodamine 123 ; Luminol DAF-FM ; DAF-FM diacétate ; 2,3-Diaminonaphthalène ; Luminol
3'-(p-Aminophenyl) fluorescéine) ; 3'-(p-Hydroxyphényl) fluorescéine;
H2DCFDA; CM-H2DCFDA ; AM-H2DCFDA ; Coelenterazine;
Dihydrorhodamine 123 ; Dihydrorhodamine 6G ; Luminol
Coelentérazine ; Dihydroéthidium ; Lucigénine ; Luminol ; MTT;
NBT; Mitosox
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Mesure de la Production d’Anions Superoxydes (O2·– )
Mitochondriaux avec le Mitosox
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H2DCF-DA (2’, 7’dichlorofluorescin diacetate) : H2O2 ; HO· ; ONOO– …
λEx=492-495 nm
λEm=517-527 nm
H2DCF-DA
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Dihydroethidium (DHE) : Anion Superoxyde O2·–
DHE
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Dihydrorhodamine 123 : H2O2 ; HOCl ; ONOO–
HENDERSON LM, CHAPPELL JB Eur J Biochem 1993, 217 (3): 973 - 980
Gérard Lizard, EA7270,
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Détection de l’Oxyde Nitrique (·NO)
par la Diaminofluorescéine (DAF)
DAF-FM
diacétate4-amino-5-méthylamino-2',7'-difluorofluorescéine diacétate
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Interaction Métabolisme Peroxysomale et Métabolisme Oxydatif :
Rôle d’ACOX1
Gérard Lizard, EA7270,
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Effet de C24:0 et C26:0 sur la Production de Radicaux Oxygénés
Production de radicaux oxygénés (C24:0, 24 h)
0
20
40
60
80
100
Contrôle Alpha
cyclo
C24
5 µM
C24
10 µM
C24
20 µM
C24
40 µM
IMF
24 h
48 h H2-DCFDA
Production d’anions superoxydes (C26:0, 24 h)
O2.- (Dihydroéthidine)
0
100
200
300
400
500
Contrôle Alpha
cyclo
5 µM 10 µM 20 µM
% C
on
trô
le
Résultats : Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Extinction d’Acox1 par différents siRNAs
AR
Nm
, exp
ress
ion
rel
ativ
e
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Scr β-actine Acox1 1 Acox1 2 Acox1 3
Acox1 silencing
WT Scr SiRNA 1 2 3
Acox1 50 KDa
β actine
β actine
Acox1 21 KDa
Résultats : Kattan Z, Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
0
100
200
300
400
500
Contrôle Scramble Solvant C24:0
5 µM
C24:0
10 µM
C24:0
20 µM
C26:0
5 µM
C26:0
10 µM
C26:0
20 µM
Cellules non transfectées
Cellules transfectées Acox1
% C
on
trô
le * * * *
* * * #
#
*
Production d’anions superoxides (Dihydroéthidine)
Conséquence de l’Inactivation d’Acox1
sur la Production d’Anions Superoxides
Résultats : Kattan Z, Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
0
100
200
300
400
500
Control Scr Vehicle C24:0
5 µM
C24:0
10 µM
C24:0
20 µM
C26:0
5 µM
C26:0
10 µM
C26:0
20 µM
Cellules non transfectées
Cellules transfectées Acox1
% C
on
trô
le
* * * * * * *
#
#
*
Production de H2O2 (Dihydrorhodamine 123)
Effet de l’inactivation d’Acox1 sur la production de H2O2
Résultats : Kattan Z, Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Interaction Métabolisme Peroxysomale et Métabolisme Lipidique :
Rôle d’ABCD1
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Colorants Cibles Utilisation Applications
Noir Soudan Gouttelettes
lipidiques
Microscopie en
champs clair,
imagerie
Maladies
métaboliques et
dégénératives
Oil Red O Lipides neutres
Microscopie en
champs clair,
imagerie,
biochimie
Toxicologie,maladi
es métaboliques et
dégénératives
Colorants Dédiés à l’Analyse des Lipides
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Sondes Cibles Utilisation Applications
Nile Red Lipides polaires et
neutres
Microscopie, cytométrie
en flux, analyse spectrale
Phospholipidose,
stéatose
HCS LipidTOX Lipides neutres et
phospholipides
Microscopie, analyse
spectrale
Phospholipidose,
stéatose
Filipine Cholestérol non estérifié Microscopie, cytométrie
en flux Hypercholestérolémie
BODIPY Lipides neutres Microscopie, cytométrie
en flux
Métabolisme des
lipides, radeaux
lipidiques
Laurdan Phospholipides
Polarisation de
fluorescence,
microscopie confocale
multiphotonique
Fluidité membranaire,
radeaux lipidiques
Mérocyanine 540
Phospholipides
Microscopie, cytométrie
en flux
Externalisation des
phosphatidylsérines
Cis-parinaric acid
Acides gras insaturé
Microscopie,
cytométrie en flux Peroxydation lipidique
DPH Lipides de la membrane
plasmique
Polarisation de
fluorescence Fluidité membranaire
Fluorochromes Dédiés à l’Analyse des Lipides
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
10 µm 10 µm
Fibroblastes humains: sujet normal Fibroblastes humains: patient X-ALD
LipidTOX (Réf H34158; Invitrogen)
*Lipides neutres: fluorescence verte * Lipides polaires: fluorescence rouge
Contrairement au Nile Red, l’extinction de fluorescence est faible
Microscopie confocale possible dans de bonnes conditions
Seguin A, Baarine M, Lizard G – Inserm 866, Dijon, France
LipidTOX : Distinction Lipides Polaires et Lipides Neutres
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
HCS LipidTOX : phospholipidose et stéatose
Diminution des lipides polaires et modifications de la répartition spatiale des
lipides neutres et polaires (Résultats: Baarine M, Seguin A, Kahn E, Lizard G – Inserm 678 et 866, Paris-Dijon)
Fibroblastes humains normaux
Acide gras C24:0
10 µm 10 µm 10 µm 10 µm
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Oil Red-O : Quantification Intracellulaire des Lipides Neutres
Pham NA et al., J Inherit Metab Dis. 2005;28(6):991-1004
Gouttelettes lipidiques visibles en
vidéomicroscopie: granules sombres de
fort contraste de diamètre 0,3 à 0,6 µm
(flèche) et granules plus petits de faible
contraste (tête de flèche)
Fibroblastes vivants observés en contraste de phase
Mouvement des goutelettes lipidiques :
régions du cytoplasme contenant les
gouttelettes de fort contraste (flèche) avec
un mouvement oscillatoire, et les
gouttelettes de faible contraste (tête de
flèche) qui se déplacent à travers le
cytoplasme
5 µm
5 µm
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Conséquences de l’Inactivation d’Abcd1 et Acox1 sur le Métabolisme Lipidique
Baarine M et al. Neuroscience 213 (2012) : 1-18
Bodipy. 493/503; Réf D3922; Invitrogen
Résultats: Seguin A, Baarine M, Lizard G - Inserm 866, Dijon, France
Fibroblastes humains: sujet normal Fibroblastes humains: patient X-ALD
5 µm 5 µm
Bodipy : Analyse des Lipides Neutres
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM
Laurdan : Organisation des Bicouches Lipidiques
Laurdan LAURDAN, which is reported to be excited with the UV light (360 nm) and emits a blue fluorescence
(440 nm) in the ordered lipid phase and a green fluorescence (490 nm) in the disordered lipid phase
* Spectre de fluorescence sensible à la polarité et à la phase dans
laquelle se trouve la bicouche lipidique
* Fortement accroché dans le cœur hydrophobe de la bicouche
avec sa partie fluorescente localisée au niveau des glycérols et des
phospholipides
* Le laurdan est utilisé pour la détection des radeaux lipidiques
Cellules 158N
10 µm
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM Kahn E et al. Cytometry A 2011;79(4):293-305
Incidence du 7-Cétocholestérol sur la Désorganisation des Radeaux Lipidiques:
Micrsocopie Confocale et Analyse Spectrale
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM Kahn E et al. Cytometry A 2011;79(4):293-305
- Plusieurs approches de cytométrie (flux, image) permettent d’appréhender
le métabolisme grâce à différents fluorochromes et colorants
- Les méthodes de cytométrie (flux, image) sont appropriées pour aborder
différents aspects du métabolisme cellulaire et en particulier le métabolisme
lipidique
-L’identification des mécanismes moléculaires et des cibles nécessite des
approches complémentaires (chromatographie gazeuse, spectrométrie de
masse, western blotting, …)
CONCLUSIONS
Gérard Lizard, EA7270,
Université de Bourgogne / INSERM