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ANÁLISE TOXICOLÓGICA: PREPARAÇÃO DE AMOSTRA; TÉCNICASANALÍTICAS. ANÁLISE LABORATORIAL
EUGENIA GALLARDO
UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
Salvo algumas excepções, a análise toxicológica não pode ser efectuada directamente sobre a amostra, devendo esta sofrer um tratamento prévio: EXTRACÇÃO
O primeiro passo de uma análise toxicológica, e também o mais importante e crítico, é então a separação e isolamento das substâncias de interesse do resto dos constituintes da matriz, como por exemplo proteínas e ácidos gordos (no caso de f. biológicos), compostos estes que dificultam a análise
Deve ainda ter-se em conta que as substâncias tóxicas podem ou não estar ligadas a alguns constituintes da amostra, como por exemplo as proteínas, pelo que pode ser necessária a sua remoção
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
As amostras serão tanto mais fáceis de analisar quanto maior for a sua fluidez
Para conseguir romper as ligações e aumentar a fluidez das amostras é necessário submetê-las a diversos processos
Ultra-sons
Temperatura
Hidrólise
Ácidos
Modificação do pH
Metanol
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
EXTRACÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO
Neste tipo de extracção, os tóxicos são retirados da matriz por intermédio de solventes orgânicos para os quais têm mais afinidade que para os componentes da amostra
Vão então formar-se duas fases imiscíveis (as amostras são geralmente aquosas):
Fase aquosa (componentes da amostra não extraídos)
Fase orgânica (tóxicos solubilizados no solvente orgânico)
As substâncias tóxicas ficam numa forma que torna a sua análise muito mais fácil
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
SeparaçãoAdição
solventes
orgânicos
Agitação
Centrifugação +das fases
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
Vantagens
Amplamente utilizada
Gasto excessivo de solventes orgânicos
Inconvenientes
São simultaneamente extraídos muitos interferentes
Aplicável a todos os tipos de amostra
Fácil execução
Formação de emulsões, dificultando a separação
Difícil de automatizar
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
EXTRACÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO
Técnica alternativa à extracção líquido-líquido desenvolvida a meados dos anos 70
As substâncias de interesse são selectivamente adsorvidas num suporte sólido de constituição variável, sendo depois eluídas por acção de um solvente apropriado
É possível trabalhar em fase normal, fase reversa e intercâmbio iónico
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
Activação da coluna mediante adição de
solventes
Amostra
Lavagem
Secagem
Eluição dos extractos
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
Vantagens
Amplamente utilizada
Pouco eficiente para algumas substâncias
Inconvenientes
São simultaneamente extraídos alguns interferentes
Menor gasto de solventes orgânicos
Fácil execução
Não aplicável a todos os tipos de amostra (sólidos)
Automatizável
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
MICROEXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA
Técnica desenvolvida no início dos anos 90
As substâncias de interesse são selectivamente adsorvidas num suporte sólido de pequenas dimensões e de constituição variável, sendo depois directamente injectadas no sistema cromatográfico
Permite trabalhar nos modos de imersão directa e headspace
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
Vantagens
Elevada selectividade
Inconvenientes
Baixo rendimento de extracção, requerendo optimização morosa dos procedimentos
Nenhum gasto de solventes orgânicos
Fácil execução
Rapidez
Não aplicável a todos os tipos de substância
Microextraction By Packed Sorbent (MEPS)
Miniaturized technique for the treatment of the samples
SPE
1-6 mL
250 -100 µL
ADVANTAGES:
� Coupling on-line chromatographic systems without modifying the extraction device;
� Reduction of time required to prepare and inject samples;
� Fully automates the process of extraction, concentration and injection;
� Reduce the amount of sample required;
� Reduction of volumes of buffers and solvents significantly (mL> uL);
� Re-useable of solid support
• STEP1: Cycling of sample through the
MEPS BIN to transfer the compounds of
interest into the MEPS sorbent
•
• STEP2: Cycling the wash fluid through the
MEPS BIN to to remove non-specific binding
compounds
•STEP3: Drawing the elution solvent
through the MEPS BIN and desorbtion of
the compounds of interest
• STEP4: Injection to the sample into GC or
LC system
• STEP 5: Place 50 µL of solvent and 50µL of
washing solution to prepare the sorbent
for the next sample
Sequence of MEPS Extraction and Elution
INJECTIONSAMPLING
(1-N times)
WASHING ELUTION
SOLVENT
STEP
1
STEP
2
STEP
3
STEP
4
INJECTION
Outras técnicas Micro
SPDE
Polymer
coating
Microsyringe
Packed
sorbent
Stir
bar
Polymer coating
Magnetic
rod
Capillary
segment
SorbentFused
silica
capillary
Microsyringe
Solvent drop
Magnetic stir
Sample
Microsyringe
Solvent drop
Magnetic stir
Sample
Solvent layer
Microsyringe
Solvent drop
Magnetic stir
Sample
Headspace
Direct immersion Headspace Three-phases
MÉTODOS DE ANÁLISE
Ferramenta cada vez mais necessária nos laboratórios forenses
Destinam-se a efectuar triagens, permitindo a restrição da análise toxicológica a certos grupos particulares de substâncias (opiáceos, benzodiazepinas, canabinóides, etc. em águas ou f. biológicos)
IMUNOENSAIOS
A amostra não necessita de ser extraída previamente, podendo ser directamente analisada pelo equipamento
MÉTODOS DE ANÁLISE
IMUNOENSAIOS
Anticorpo Droga marcada
Droga livre
Complexo inactivo
Substracto
Produtos (sinal óptico)
marcador
MÉTODOS DE ANÁLISE
Esta técnica usa um anticorpo para a(s) droga(s) a ensaiar e uma versão marcada (enzimaticamente, radioisótopo, fluoróforo, etc.) da droga
O anticorpo é colocado em contacto com uma quantidade fixa da droga marcada e com amostra a analisar
IMUNOENSAIOS
Se a droga pretendida estiver presente na amostra vai competir com a droga marcada pelos locais activos do anticorpo
Quanto maior for a concentração da droga de interesse na amostra, menor será a fracção marcada que se encontra ligada ao anticorpo ou maior será a quantidade de droga marcada livre, podendo este decréscimo ser medido
IMUNOENSAIOSMÉTODOS DE ANÁLISE
Vantagens
Elevada sensibilidade
Inconvenientes
Não identificam a substância por isolado, mas sim grupos de substâncias
Rapidez
Menor número possível falsos negativos
Carecem de confirmação das substâncias por outros métodos mais selectivos
IMUNOENSAIOSMÉTODOS DE ANÁLISE
Baixo custo por análise
Reacções cruzadas
MÉTODOS DE ANÁLISE
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Baseiam-se na separação dos constituintes de uma mistura com base nas suas características físico-químicas
Os componentes são separados consoante a sua afinidade para um suporte (fase estacionária) e para uma fase móvel
Cromatografia Líquida – Fase móvel líquida
Cromatografia Gasosa – Fase móvel gasosa
MÉTODOS DE ANÁLISE
CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA
A fase estacionária consiste numa camada de sílica gel depositada sobre uma placa de vidro
Os constituintes da amostra são arrastados ao longo da fase estacionária por acção da fase móvel, avançando mais ou menos consoante a sua afinidade preferencial para uma ou outra das fases
A distância percorrida pelos componentes relativamente àfrente do solvente (Rf) é mais ou menos constante para cada substância ou grupo de substâncias, se as constituições das duas fases se mantiverem
F. ESTACIONARIA(polar)
Superficie plana = suporte
CROMATOGRAFÍA EM CAMADA FINA
AMOSTRA
FRENTE de avance do solvente
FLUXOpropiciado pela
CAPILARIDADE
FASE MÓVIL(apolar)
CÁMARACROMATOGRÁFICA
distancia avanzada pela moléculaRf=
distancia avanzada pelo frente
Rf é característico para cada substância para umacomposição de FM e para um determinado tipo
de superfície
hidrofóbica
hidrofílica
MÉTODOS DE ANÁLISE
CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA
Após a eluição as manchas relativas a cada um dos componentes são postas em evidência por acção de reveladores
Pode ter-se uma ideia acerca da(s) substância(s) presente(s) na amostra através do Rf e da cor obtida após a revelação
Vantagens
Permite purificar os extractos
Inconvenientes
Técnica pouco sensível e pouco selectiva
Pode ajudar na orientação da análise toxicológica
É sempre necessária a confirmação por outras técnicas mais selectivas
Morosa
MÉTODOS DE ANÁLISE
CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA
MÉTODOS DE ANÁLISE
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Os componentes da amostra percorrem a coluna dissolvidos na fase móvel, resultando a sua velocidade de eluição das diferentes interacções que mantêm com as duas fases do sistema cromatográfico
A fase estacionária consiste numa coluna de enchimento variável, consoante o tipo de interacção pretendida
A mais difundida é sem dúvida a HPLC
Devido à sua distinta interacção entre as duas fases, os componentes da amostra são retidos com intensidade variável, eluindo separados da coluna
O tempo que medeia a injecção da amostra e a saída dos componentes da mistura é chamado de tempo de retenção (RT), sendo constante para cada componente, se obtido nas mesmas condições (temperatura, fase móvel, etc.)
É uma cromatografia em coluna à qual se aplica uma pressão elevada, que permite acelerar o processo de separação
MÉTODOS DE ANÁLISE
HPLC
O modo mais comum de trabalho é a chamada fase reversa:
MÉTODOS DE ANÁLISE
HPLC
Fase estacionária de natureza apolar
Fase móvel de natureza polar combinada com solventes orgânicos, como o metanol ou o acetonitrilo
AU
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
0.050
0.060
0.070
0.080
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00
6.4
82
8.8
33
9.8
12
16.6
38
28.6
08
Os componentes detectados são representados num gráfico (tempo vs absorvância)
MÉTODOS DE ANÁLISE
HPLC
INJECTORCOLUNAS
DETECTORES
UV PDA MS
MÉTODOS DE ANÁLISE
HPLC
O tempo de retenção das substâncias num determinado sistema é um dado importante para a sua identificação, mas não o único
MÉTODOS DE ANÁLISE
HPLC
Por exemplo, quando se utiliza um detector de UV/VIS não é possível a identificação inequívoca das substâncias presentes, sendo necessário o recurso a outras técnicas analíticas complementares
Já com os detectores PDA e MS é possível obter um espectro da substância, o que permite a sua correcta identificação
Espectro ultravioleta do Diazepam (PDA) Espectro de massa do Diazepam (MS)
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 3400
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
22000
24000
m/z-->
Abundance
Scan 912 (7.515 min): DIAZEP.D256
283
221
16528 11077 241
51 151 20512591191
341327
MÉTODOS DE ANÁLISE
HPLC
Permite separar os componentes de uma amostra sem que seja necessário volatilizá-la, o que permite a sua aplicação a substâncias termolábeis
MÉTODOS DE ANÁLISE
HPLC
Gasto excessivo de solventes orgânicos (fase móvel) e a pouca sensibilidade de alguns dos detectores normalmente utilizados (UV), pelo menos se comparada com a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC/MS)
Vantagem
Inconveniente
MÉTODOS DE ANÁLISE
HPLC
CROMATOGRAFIA GASOSA
MÉTODOS DE ANÁLISE
A fase móvel é constituída por um gás inerte (normalmente o He), habitualmente chamado gás de arraste
A fase estacionária consiste numa coluna de enchimento variável, consoante o tipo de interacção pretendida
Os constituintes da amostra são separados de acordo com o seu ponto de ebulição e a sua afinidade para a coluna
Chama-se cromatografia gasosa porque os compostos são volatilizados previamente à análise
CROMATOGRAFIA GASOSA
MÉTODOS DE ANÁLISE
7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Time-->
Abundance
TIC: FIBRA2.D 7.69
10.73
Estricnina
Papaverina
Os componentes detectados são representados num gráfico (tempo vs abundância)
CROMATOGRAFIA GASOSA
MÉTODOS DE ANÁLISE
A cromatografia gasosa pode ser acoplada a vários tipos de detectores, como o detector de ionização de chama, o detector de azoto e fósforo e o detector de massa
Detector de massa é possível identificar inequivocamente as substâncias que saem da coluna
O espectro de massa é considerado a impressão digitaldo composto
A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa é parte integrante de muitos métodos de confirmação
Evolução da Espectrometria de massa
1966
Musson and Field – CI
1975
W. Paul and H.S. Steinwell - 1ªGC-MS Ion Trap
1981
1ª fonte de ionização - FAB
1982
1º GC triple quadrupolo
1987
CE-MS
MALDI
1974
Arpino and col. 1º LC-MS
ICP-MS
2002
J. Fenn - ESI
Mc Lafferty – 1º GC-MS
1957
J.J. Thompson1º MS
1897 200-
APCI, TOF, LC-MS(MS), UPLC-
MS (MS), 2D-ITMS, Nano LC,
…
Espectrometria de massa e Toxicologia
� Determinação estrutural e funcional de qualquer tipo de molécula
� Aumento de sensibilidade
� Diminuição dos limites de detecção
� Possibilidade de utilizar padrões internos deuterados
� Identificação inequívoca de um analito - fingerprint
Espectrometria de massa e Toxicologia
� Amostras alternativas
� Diminuição do volume de amostra
� Rapidez e confirmação de outras metodologias de analise (Elisa)
� Aumento do numero de tóxicos a detectar
� Detecção de quantidades baixas de tóxicos
Cromatografia gasosaDetector de ionização de chama (FID)
Mais utilizado, robusto, fácil utilização
Chama de ar/hidrogénio
Ionização dos compostos pela chama
Detecção - Monitorizar a corrente que se produz
A recolha dos iões e e- é conseguida pela aplicação de uma diferença de potencial entre o isqueiro e um eléctrodo
Corrente resultante (10 -12 A) medida com picoamperímetro
O nº de iões produzido é quase proporcional ao de átomos de C reduzidos pela chama
O detector é sensível a esses átomos que entram por unidade de tempo
Amostrador automático
Injector
Forno
Coluna
Detector
Sistema de controlo de gases
Programação de Tª
GCCromatografia gasosa
Cromatografia gasosa
Reservatório de gás de arraste
Regulador de
fluxo
Câmara de
injecção
Coluna Detector
Sistema de
dados
Registo
Forno Termostato
Amostra
Diagrama de um cromatógrafo de gases
OVEN
Temp 206 206
Initial temp 100
Initial time 1.00
Perfect fit
HP Hewlett
Packa rd
5973
Ma ss Selective Detector
5973
Mass Selective Detector
StopPre
run Start
8.85 8.90 8.95 9.00 9.05 9.10 9.15 9.200
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
Time-->
Abundance
Ion 87.00 (86.70 to 87.70): ESTABILIDAD CORTO PLAZO SANGRE.DIon 87.00 (86.70 to 87.70): BLANCO SANGRE.D
Cromatografia gasosa
15,76Azinfos metilo
14,47Etião
12,68Quinalfos
12,65Clorfenvinfos
11,80Paratião
11,79Clorpirifos
11,10Paraoxão
9,97Diazinão
9,05Dimetoato
Tempos de retenção(minutos)
Analito
Espectrometria de massa e Toxicologia
GC HP 6890– MS HP 5973 (Agilent Technologies)
Column J&W Ultra 2 (12 m × 0,25 µm × 0,25 mm d.i.)
Chromatographic conditions: 100ºC; 10ºC/min; 24ºC/min to 270ºC
Injector temperature 240ºC splitless; He 1mL/min
SPME CW/DVB 65 µm
7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.000
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
60000
Time-->
Abundance
TIC: patronclfv.D
12.41
12.65
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 3200
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
m/z-->
Abundance
Scan 1060 (12.645 min): patronclfv.D267
323
81
109295
170
206193123
14522465 157
7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.000
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
Time-->
Abundance
TIC: patronquin.D 12.68
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 3000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
m/z-->
Abundance
Scan 1065 (12.676 min): patronquin.D146
157
118129
97
298
173241 27019365
2257651 253
Quinalfos
Clorfenvinfos
Espectrometria de massa e Toxicologia
AU
- 0 , 0 0 2
0 , 0 0 0
0 , 0 0 2
0 , 0 0 4
0 , 0 0 6
0 , 0 0 8
0 , 0 1 0
0 , 0 1 2
0 , 0 1 4
0 , 0 1 6
0 , 0 1 8
0 , 0 2 0
0 , 0 2 2
0 , 0 2 4
0 , 0 2 6
M i n u t e s
0 , 0 0 5 , 0 0 1 0 , 0 0 1 5 , 0 0 2 0 , 0 0 2 5 , 0 0 3 0 , 0 0 3 5 , 0 0 4 0 , 0 0
W 2 9 9 6 a t 2 3 0 , 0 0 - P D A 2 1 0 . 0 t o 4 0 0 . 0 n m a t 1 . 2 n m
HPLC/PDA– Mod. 600, Waters Column: Xterra®MS C18 (150x 4.6 mmi.d., 5 µm) – WatersMobile phase: ACN:phosphate buffer 0.25 M (40:60, v/v)Flow rate: 0.6 mL/minInjection volume: 20µLλ detector: 230 nm
SPE – antidepressant
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
nm
250,00 300,00 350,00
271,3 314,3340,6366,7
386,0
AU
0,000
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
nm
250,00 300,00 350,00
238,1
289,2313,1 358,1
369,1
Nortriptilina Maprotilina
m/z 264[M + H]+ para a nortriptilina
m/z 278 [M + H]+ para a maprotilina
LC – ESI +/MS, Agilent 1100 seriesColumn: Inertsil C-8 (2.0 mm × 150 mm, 5 µm)Mobile phase: methanol–10 mM ammonium acetate (pH 5.0)–acetonitrile (70:20:10, v/v/v).Flow rate: 0.10 mL/min at 35ºCInjection volume: 20µLscan mode over the mass range m/z 60–500, 50 V SPE – antidepressant
Espectrometria de massa e Toxicologia
APLICAÇÕES
Cromatografia gasosa
Indústria petroquímica
Análises de águas e alimentos
Análises de tintas e fibras na indústria de lanifícios
Análises clínicas e forenses
Análises de drogas e adulterantes
Indústria farmacêutica
Análises de plásticos, análises ambientais, etc…
Análises de aromas e perfumes
Cromatografia gasosa
VANTAGENS DA CROMATOGRAFIA
GASOSA
LIMITAÇÕES DA CROMATOGRAFIA
GASOSA
Eficiente, permite alta resolução Amostra deve ser volátil ou estar volatilizada
Precisa de amostras muito pequenas (mL ou µL)
Não aplicável a amostras termolábeis
Elevada sensibilidade, detecta ppm e ppb Necessidade de derivatização de alguns compostos
Permite ensaios quali- e quantitativos Amostras complexas sujas precisam de uma extracção prévia, semelhante LC
Elevada velocidade análise Nos casos de um detector simples, para a confirmação de compostos deve utilizar-se outro detector (MS)
Boa exactidão Precisa de treino e experiência
Fácil de utilizar
LC
GC e LC são duas técnicas complementares, que não se substituem entre si e necessárias em qualquer laboratório
ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO MOLECULAR
MÉTODOS DE ANÁLISE
Baseia-se na capacidade dos compostos de interesse, ou um seu derivado, absorverem radiação, normalmente na zona do visível
Após o seu isolamento (extracção) da matriz, os tóxicos (em solução) são colocados em células especiais, sobre as quais irá incidir o feixe de radiação
Através da análise de soluções padrão da substância em causa é possível a sua identificação e quantificação
ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO MOLECULAR
MÉTODOS DE ANÁLISE
Esta técnica tem como principal inconveniente a sua baixa sensibilidade, sendo também pouco específica (pode haver substâncias que absorvam radiação no mesmo comprimento de onda dos tóxicos)
É principalmente usada na determinação do herbicida paraquato, monóxido de carbono e cianetos
ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO MOLECULAR
MÉTODOS DE ANÁLISE
ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÓMICA
MÉTODOS DE ANÁLISE
Normalmente utilizada para a determinação de metais e metalóides
Baseia-se na capacidade dos compostos, quando no estado elementar, absorverem radiação de comprimento de onda característico
Esta radiação é emitida por lâmpadas que contêm o elemento a determinar na sua constituição. Assim, o comprimento de onda da radiação emitida seráespecífico do elemento que se quer determinar na amostra
ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÓMICA
MÉTODOS DE ANÁLISE
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS BIOANALÍTICOS
http://www.ich.org/LOB/media/MEDIA417.pdf
VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND METHODOLOGY Q2(R1)
INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION
Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation
http://www.fda.gov/CDER/GUIDANCE/
U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES FOOD AND DRUG ADMINISTRATION
� Linear regression for calibration lines revisited: weighting schemes for
bioanalytical methods. A.M. Almeida, M.M. Castel-Branco, A.C. Falcão. J.
Chromatogr. B, (2002), 774 215–222
� Systematic Comparison of Bias and Precision Data Obtained with Multiple-
Point and One-Point Calibration in Six Validated Multianalyte Assays for
Quantification of Drugs in Human Plasma. Frank T. Peters and Hans H. Maurer.
Anal. Chem. (2007), 79, 4967-4976
� Bioanalytical Method Validation—A Revisit with a Decade of Progress. Vinod P.
Shah, Kamal K. Midha,John W. A. Findlay, Howard M. Hill, James D. Hulse, Iain
J. McGilveray,Gordon McKay, Krys J. Miller, Rabindra N. Patnaik, Mark L.
Powell,Alfred Tonelli, C. T. Viswanathan, and Avraham Yacobi. Pharmaceutical
Research, (2000),17, 12
� Rational experimental design for validation bioanalytical methods - Illustration
using an assay method for total captopril in plasma. J. Wieling, G. Hendriks,
W.J. Tamminga, J. Hempenius, C.K. Mensink,B. Oosterhuis, J.H.G. Jonkman.
J.Chromatogr. A, (1996), 730 381-394
PADRÕES
The method development and establishment phase defines thechemical assay. The fundamental parameters for a bioanalyticalmethod validation are accuracy, precision, selectivity, sensitivity, reproducibility, and stability. Measurements for each analyte in thebiological matrix should be validated. In addition, the stability of theanalyte in spiked samples should be determined.
Typical method development and establishment for a bioanalyticalmethod include determination of (1) selectivity, (2) accuracy, precision, recovery, (3) calibration curve, and (4) stability of analytein spiked samples.
PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
SELECTIVIDADE
LINEARIDADE
•Cocaine (303.4) - Serum - [0.05-0.3] - [0.25-5; L 1-20]
COC COC/COC-d30,05 0,007
0,1 0,014
0,25 0,028
0,5 0,07
1 0,14
2,5 0,315
5 0,7
7,5 1,1
10 1,4
12,5 1,75
15 2,1
17,5 2,45
20 2,8
y = 0,1404x - 0,002
R2 = 0,9997
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 5 10 15 20 25
CURVA DE CALIBRAÇÃO
LLOQ
CURVA DE CALIBRAÇÃO
EXACTIDÃO
PRECISÃO
COC COCd3 COC/COCd30,05 3737 533307 0,0070
0,1 10575 543853 0,0194
0,5 33705 494533 0,0682
1 59888 556390 0,1076
5 285492 580953 0,4914
10 636544 616605 1,0323
15 1059669 659511 1,6067
20 1583464 801348 1,9760
y = 0,1012x + 0,0104
R2 = 0,9976
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25
CURVA DE CALIBRAÇÃO
VALOR BIAS0,05 0,007007 -0,033525 -167,05%
0,1 0,019445 0,089373 -10,63%
0,5 0,068155 0,570704 14,14%
1 0,107637 0,960837 -3,92%
5 0,49142 4,753163 -4,94%
10 1,032337 10,09819 0,98%
15 1,60675 15,77421 5,16%
20 1,976 19,42293 -2,89%
y = 0,1012x + 0,0104
R2 = 0,9976
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25
CURVA DE CALIBRAÇÃO
1/x0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Médias D.P. C.V.0,05 0,007 0,008 0,010 0,007 0,008 0,008 0,001278 15,72%
0,1 0,019 0,014 0,019 0,015 0,012 0,016 0,00343 21,77%
0,5 0,068 0,058 0,055 0,052 0,044 0,056 0,008697 15,65%
1 0,108 0,112 0,116 0,114 0,099 0,110 0,006787 6,18%
5 0,491 0,538 0,558 0,549 0,522 0,532 0,026294 4,95%
10 1,032 1,160 1,119 1,139 1,173 1,125 0,055509 4,94%
15 1,607 1,708 1,667 1,720 1,633 1,667 0,048052 2,88%
20 1,976 2,389 2,296 2,223 2,252 2,227 0,153937 6,91%
m 0,1012 0,1177 0,1133 0,1124 0,1123 0,1114 0,006128 5,50%
b 0,0104 -0,0119 -0,0014 0,0017 -0,0072 -0,0017 0,008534 -504,98%
R 0,9988 0,9995 0,9998 0,9998 0,9994 0,9994 0,000412 0,04%
R2 0,9976 0,9989 0,9996 0,9996 0,9987 0,9989 0,000824 0,08%
CURVA DE CALIBRAÇÃO
RECUPERAÇÃO
ESTABILIDADE
ESTABILIDADE
ESTABILIDADE
ESTABILIDADE
ESTABILIDADE
ESTABILIDADE
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Pode haver algumas dificuldades na interpretação de resultados normalmente relacionadas com:
IDENTIFICAÇÃO DO TÓXICO
Diversos factores podem dificultar ou mesmo impossibilitar a identificação positiva de uma substância (estado de conservação da amostra, baixas quantidades de tóxico, etc.)
Muitas vezes tal identificação é feita indirectamente, através da pesquisa dos metabolitos dos tóxicos em causa
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
O facto de não ser detectado um tóxico não exclui a possibilidade de intoxicação
Em alguns casos, o facto de não ser detectado o agente tóxico pode ser tão ou mais importante que a sua detecção
É importante o estabelecimento de valores cutoff
Análise Toxicológica
Resultado Negativo
� A substância pesquisada não está presente na amostra analisada
� A substância pesquisada está presente mas abaixo da capacidade de detecção do método
� A substância presente na amostra não foi pesquisada
Análise Toxicológica
Resultado Positivo
� A substância detectada está presente na amostra analisada
� O resultado obtido cumpre os critérios de positividade analítica
Análise Toxicológica
� Objectivo da análise
� Informação disponível
Interpretação dos resultados
� Metodologia analítica usada
� Tipo de amostra