Post on 31-Jul-2015
HEMOGLOBINAS –
ELETROFORESES E
OUTRAS METODOLOGIASPONTIFÍCIA UNIVERSIDADE
CATÓLICA DE GOIÁS
CBB-BIOMEDICINA
Prof.Luiz Murilo Martins de Araújo
PERFIL DAS HEMOGLOBINAS
MAIS COMUNS
% ADULTO % FETO
• Hb A - α2 β2 96 - 98 TRAÇOS
• Hb A2 - α2 Δ2 ATÉ 3.5-4.0 TRAÇOS
• Hb F - α2 TRAÇOS 99 2ץ
HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQÜENTES
• Hb S - α2 β2(6: GLU VAL)
• Hb C - α2 β2(6: GLU LIS)
• Hb DLos Angeles-Punjab - α2 β2(121: GLU GLN)
• Hb MBOSTON - α2(58:HIS TIR) β2 (Metahemoglobina)
• Hb H - β4
• Hb BARTS - 4ץ
HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQÜENTES
• Hb Lepore - Pareamento não homologo
entre os genes ץ e β (Híbrido ץ-β, sendo
a parte inicial, amino terminal semelhante
a gama e a terminal, carboxila,
semelhante a beta)
Hemoglobinas Instáveis:
Hb Torino - α2(43:PHE VAL) β2
Hb Koln - α2 β2(98:VAL MET)
OUTRAS HEMOGLOBINAS
ANORMAIS
• Hb E - α2 β2(26: GLU LYS)
• Hb J Baltimore - α2 β2(16: GLY ASP)
• Hb N Baltimore - α2 β2(95: LYS GLU)
• Hb O Arábica - α2 β2(121: GLU LYS)
• Hb Porto Alegre- α2 β2(9: SER CIS)
• Hb K Woolwich - α2 β2(132: LYS GLN)
OUTRAS HEMOGLOBINAS
INSTÁVEIS
• Hb Rio Claro - α2 β2(34: VAL MET)
• Hb Zurich - α2 β2(63: HIS ARG)
• Hb Santa Ana - α2 β2(88: LEU PRO)
• Hb Niteroi - α2 β2(42-44:PHE/GLU/SER 0)
• HB Koln - α2 β2(98: VAL MET)
• Hb Camperdown - α2 β2(104: ARG MET)
OUTRAS HEMOGLOBINAS
VARIANTES
• Hb G Philadelphia - α2 68: ASN LIS β2
• Hb I - α2 16: LYS GLU β2
• Hb J Oxford - α2 15: GLY ASP β2
• Hb J Rovigo - α2 53: ALA ASP β2
• Hb Constant Spring - α2 142: STOP GLN β2
OUTRAS HEMOGLOBINAS
INSTÁVEIS
• Hb Hasharon - α2 47: ASP HIS β2
• Hb Stanleyville II - α2 78: ASN LIS β2
• Hb G Pest - α2 74: ASP ASN β2
• Hb Kurosaki - α2 7 : LYS GLU β2
• Hb Westmead - α2 122: HIS GLN β2
• Hb Campinas - α2 26: ALA VAL β2
Prevalência de hemoglobinopatias em 238 amostras
coletadas para estudo eletroforético de hemoglobinas no
Laboratório lâmina-Rj, no ano de 2000.
• 61 FITAS(25,6%) APRESENTARAM HEMOGLOBINAS ANÔMALAS:
• Talassemia Alf a : 6/61 – 10%
• Talassemia Beta : 23/61 - 38 %
• Hemoglobinopatia AS: 22/61 – 36%
• Hemoglobinopatia AC: 3/61 – 5%
• Hemoglobinopatia AD: 1/61 – 1.5%
• Hemoglobinopatia SS: 1/61 - 1.5%
• Persistência Hereditária
de Hemoglobina Fetal: 5/61 - 8%
DOS TALASSÊMICOS:
• Talassemia Minor : 19/23 - 82%
• Talassemia Intermedia : 4/ 23 - 18%
ELETROFORESE
• É definido como sendo a migração de
espécies carregadas eletricamente, que
ocorre quando as mesmas são dissolvidas
ou suspensas em um eletrólito, através do
qual uma corrente elétrica é aplicada.
• Esta técnica de separação foi
desenvolvida pelo químico Arne Tiselius
para o estudo de proteínas em soro e por
este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel
em 1948.
SEQUÊNCIA BÁSICA DA
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS
EM pH alcalino
(-) (+)
• A2 G S K F A B H J I
C D
E DLos Angeles-Punjab
Lepore
A
R
T
s
O
R
L
E
Bu
PERFÍS ELETROFORÉTICOS
• A - A : NORMAL
• A - S : Traço Falciforme (Banda A e S)
• S - S : Anemia Falciforme (Banda S)
• S - C : Falciforme/ Hb C (Banda S e C)
• S - βTal : Micro-Drepanocitose (Banda
S e aumento de A2 e F)
• S - αTal : Banda S e Hb H
• A - C : Hetereozigoto para Hemoglobina C
• C - C : Homozigoto para Hemoglobina C
ALTERAÇÕES NA ESTRUTURA QUÍMICA DA
MOLÉCULA POR TROCA DE AMINOÁCIDOS
Hb A- pI 6.8
HbS - pI 6.85
HbG - pI 6.90
HbC - pI 6.95
Hb S: Glu (-) Val (o): pI 6.85
Hb G: Asn (o) Lis (+): pI 6.90
Hb C: Glu (-) Lis (+): pI 6.95
P.C.NAOUM, 2001
ELETROFORESE CAPILAR
• Técnica que foi introduzida em 1981, por
Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita
cada vez mais, como um importante
método analítico.
• Em sua forma mais simples é uma
aproximação da técnica original, descrita
por Tiselius, porém emprega-se um tubo
capilar, preenchido com um eletrólito,
conforme o próprio nome sugere.
• Pode ser usada na determinação de
hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas
hidro e lipossolúveis, aminoácidos, íons
inorgânicos, ácidos orgânicos, fármacos,
catecolaminas, substâncias quirais,
proteínas, peptídeos, etc.
Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz
Isabel Cristina Sales Fontes Jardim (Universidade Estadual de Campinas,
Instituto de Química),
http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm
• Uma característica é a sua capacidade
única para separar macromoléculas
carregadas eletricamente de interesse tanto
em indústrias de biotecnologia quanto em
pesquisas biológicas.
• No projeto Genoma Humano foi necessário
distinguir os diversos polinucleotídeos, com
massas molares, por volta de 200 a 500
Daltons (Dalton = u.m.a.) que diferiam entre
si por um único nucleotídeo.
• Somente a EC tem resolução suficiente
para este tipo de separação.
• Além disso, o DNA humano contém cerca
de 3 bilhões de nucleotídeos e as altas
velocidades de análises, obtidas pela EC,
permitiram que milhares de nucleotídeos
fossem seqüenciados em um único dia
• O funcionamento do equipamento
envolve a aplicação de alta voltagem,
tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de
diâmetro reduzido gerando correntes na
faixa de 10 a 100 mA.
• O uso do capilar apresenta várias
vantagens, particularmente com respeito
ao aquecimento Joule.
• A alta resistência elétrica do capilar
permite a aplicação de campos elétricos
altos pois gera um aquecimento mínimo.
• Além disso o formato de capilar propicia
uma dissipação eficiente do calor gerado.
• O uso de campos elétricos altos resulta
em tempo de análise curto, alta eficiência
e resolução.
• O capilar é preenchido com uma solução
tampão e suas extremidades são
mergulhadas em recipientes, que contém
a solução tampão, e onde é aplicado um
campo elétrico, que gera uma corrente no
interior do capilar.
• Os eletrodos são feitos de um material
inerte, tal como, platina, e são também
mergulhados na solução para fechar o
circuito.
• O capilar passa através de um detector,
usualmente um detector
espectrofotométrico de absorção no
UV/Vis
VANTAGENS
• Rapidez
• Versatilidade
• Baixo custo por análise
• Alto poder se separação (resolução)
• Consumo mínimo de amostras, reagentes
e solventes.
• Possibilidade de automação e detecção
on-line.
DESVANTAGENS
• Não é adequada para a determinação de
compostos voláteis, não-polares e de
massa molar baixa, os quais são melhores
determinados por cromatografia gasosa.
• Também não é muito adequada para a
análise de polímeros não iônicos de
massa molar alta
• Não é tão sensível quanto a cromatografia
líquida de alta performace
HPLC
Metodologia automatizada que a partir da cromatografia por
troca iônica permite separar e definir a porcentagem de
diferentes hemoglobinas de uma forma precisa e rápida.