Post on 18-Jan-2016
description
DNR IR RNR DNR IR RNR MOLEKULINĖ MOLEKULINĖ STRUKTŪRASTRUKTŪRA
ĮVADAS
Genetikos kursą pradėsime nuo molekulinės genetikos Molekulinė genetika tyrinėja DNR struktūrą ir funkcijas
molekulių lygmenyje Pastarųjų metų mokslo pasiekimai, tobulinant
tyrimo metodus ir kuriant naujas koncepcijas, labai išplėtė molekulinės genetikos žinias Šis progresas palietė ne tik molekulinę, tačiau ir
požymių perdavimo bei populiacijų genetikas Didžiaja dalimi genetikos žinios yra sukauptos
tiriant DNR ir RNR
2-2
Savo funkciją genetinė medžiaga atlieka tik tada, kai ji pasižymi tam tikromis savybėmis 1. Informacija: Ji privalo turėti informaciją, būtiną visam
organizmui sukurti 2. Paveldėjimu: Ji privalo būti perduodama iš tėvų
vaikams 3. Replikacija: Ji turi būti kopijuojama
Tada ji gali būti perduodama iš tėvų vaikams 4. Kintamumu: Ji privalo gebėti keistis
Toks kintamumas užtikrina plačiai stebima fenotpinę variaciją kiekvienos rūšies viduje
2-3
2.1 DNR KAIP GENETINĖ MEDŽIAGA
Daugelio genetikų, tarp jų ir Mendelio, duomenys atitiko šias keturias savybes Tačiau genetinės medžiagos cheminė prigimtis
negalėjo būti nustatyta vien tik kryžminant organizmus
Iš tikrųjų, DNR kaip genetinės medžiagos identifikavimas pareikalavo naujoviško požiūrio į eksperimentinę biologiją
2-4
2.1 DNR KAIP GENETINĖ MEDŽIAGA
Griffithas tyrė bakteriją (Diplococcus pneumoniae), kuri dabar vadinama Streptococcus pneumoniae
Yra aptinkami du S. pneumoniae kamienai S Smooth (lygus)
Sekretuoja polisacharidinę kapsulę Ši apsaugo bakteriją nuo gyvūnų imuninės sistemos
Auginamos ant kietos terpės suformuoja lygias kolonijas
R Rough (šiurkštus) Nesugeba sekretuoti kapsulės Kolonijų kraštai nelygūs
2-5
Fredericko Griffitho eksperimentai su Streptococcus pneumoniae
Be to, dviejų S kamienų kapsulės gali reikšmingai skirtis pagal savo cheminę sudėtį
2-6
Retos mutacijos gali paversti S kamienus R kamienais ir atvirkščiai
Tačiau mutacjos nekeičia kamienų tipų
2-7
1928 m. Griffithas atliko eksperimentus naudodamas du S. pneumoniae kamienus: IIIS tipo ir IIR tipo 1. Pelėms suleistos gyvos IIIS tipo bakterijos
Pelės žuvo IIIS tipo bakterijos buvo išskirtos iš pelių kraujo
2. Pelėms suleistos gyvos IIR tipo bakterijos Pelės išgyveno Iš pelių kraujo nebuvo išskirta gyvų bakterijų
3. Pelėms suleistos aukšta temperatūra užmuštos IIIS tipo bakterijos
Pelės išgyveno Iš pelių kraujo nebuvo išskirta gyvų bakterijų
4. Pelėms suleistos gyvos IIR tipo aukšta temperatūra užmuštos IIIS tipo bakterijos
Pelės žuvo IIIS tipo bakterijos buvo išskirtos iš pelių kraujo
2-8
2-9
Griffithas nusprendė, kad kažkokia medžiaga iš žuvusių IIIS tipo bakterijų transformavo IIR tipo bakterijas į IIIS tipą Jis pavadino šį procesą transformacija
Medžiaga, kuri tai padarė, buvo pavadinta transformuojančiąja priežastimi Griffithui nepavyko nustatyti, kokia tai medžiaga
Transformuojančiosios priežasties prigimtis buvo nustatyta gerokai vėliau, naudojant įvairius biocheminius metodus
Avery, MacLeod ir McCarty suprato, kad Griffitho tyrimų rezultatai gali būti panaudoti genetinei medžiagai nustatyti
Jie atliko savo eksperimentus penktame XX a. dešimtmetyje Tuo metu jau buvo žinoma, kad pagrindiniai ląstelių
makrokomponentai yra DNR, RNR, baltymai ir angliavandeniai
Iš IIIS tipo bakterijų jie paruošė ląstelių ekstraktus, turinčius kiekvieną iš šių makromolekulių Tiktai ekstraktai, turintys išgrynintą DNR, galėjo
transformuoti IIR tipo bakterijas į IIIS tipo bakterijas
Avery, MacLeod ir McCarty eksperimentai
2-10
2-11
Avery et al taip pat atliko ir kitą eksperimentą Jo reikėjo norint įrodyti, kad būtent DNR, o ne koks nors kitas
ekstrakto komponentas (RNR ar baltymas) yra genetinė medžiaga
1952 m. Alfred Hershey ir Marsha Chase pateikė papildomų įrodymų, kad genetinė medžiaga yra DNR
Hershey ir Chase eksperimentai su bakteriofagu T2
2-12
Jie tyrė bakteriofagą T2 Jo sandara yra palyginti
paprasta, nes jį sudaro tik dvi makromolekulės
DNR ir baltymai
Padaryti iš baltymo
Kapsidės viduje
2-13
Bakteriofago T2 gyvenimo ciklas
Hershey and Chase eksperimentų santrauka:
Naudojo radioizotopus, norėdami atskirti DNR nuo baltymų
32P specifiškai pažymi DNR 35S specifiškai pažymi baltymus
Radioaktyviai pažymėtais fagais buvo užkrečiamos neradioaktyvios Escherichia coli ląstelės
Po tam tikro laiko, reikalingo infekcijai įvykti, likusios fagų dalelės buvo pašalinamos
=> Fagų liekanos ir E. coli ląstelės buvo atskiriamos Radioaktyvumas buvo vertinamas scintiliaciniu skaitikliu
2-14
Hipotezė Tik fago genetinė medžiaga yra injekuojama į
bakterijas Radioaktyvi žymė turi parodyti, ar tai yra baltymas, ar
DNR
2-15
Rezultatai
2-16
Duomenų interpretacija
2-17
Šie rezultatai rodo, kad infekcijos metu fago DNR buvo injekuota į bakterijų citoplazmą
Tai yra tas rezultatas, kurio buvo galima tikėtis, jei būtent DNR yra genetinė medžiaga
Dauguma radioaktyvios sieros rasta
supernatanteTačiau tik maža dalis radioaktyvaus fosforo
2-18
1956 m. A. Gierer ir G. Schramm išskyrė RNR iš augalų viruso – tabako mozaikos viruso (TMV) Išvalyta RNR sukeldavo tas pačias pažaidas, kaip ir
intaktinis TMV Taigi, šių virusų genomą sudaro RNR
Dabar aptikta nemažai RNR virusų
Kai kuriuose virusuose genetinės medžiagos funkciją atlieka RNR
DNR ir RNR virusų pavyzdžiai
Virusas Šeimininkas
Nukleino rūgštis
Tabako mozaikos virusas
Tabakas RNR
Gripo virusas Žmogus RNR
HIV (ŽIV) Žmogus RNR
f2 E.coli RNR
Kalafiorų mozaikos virusas
Kalafiorai DNR
Herpes virusas Žmogus DNR
SV40 Primatai DNR
Epstein-Barr virusas Žmogus DNR
T2 E.coli DNR
2-19
DNR ir RNR yra stambios makromolekulės, susidarančios iš keleto lygmenų struktūrų
1. Nukleotidai sudaro pasikartojančius vienetus 2. Nukleotidai susijungia sudarydami grandinę 3. Dvi grandinės sąveikauja sudarydamos dvigubą
spiralę 4. Dviguba spiralė susisuka, susilanksto ir sąveikauja
su baltymais, sudarydama 3-D struktūras, formuojančias chromosomas
2.2 NUKLEINO RŪGŠČIŲ STRUKTŪRA
2-20
2-21
2-22
Nukleotidai yra pasikartojantys DNR ir RNR struktūriniai vienetai
Juos sudaro trys komponentai Fosfatinė grupė Pentozė (cukrus) Azotinė bazė
Nukleotidai
2-23
2-24
Nukleotidų, randamų (a) DNR ir (b) RNR, struktūra
A, G, C ar T
Šie atomai randami laisvuose nukleotiduose Tačiau jie yra pašalinami, kai nukleotidai jungiasi tarpusavyje,
sudarydami DNR ir RNR grandines
A, G, C ar U
Pasikartojantis dezoksiribonukleinorūgšties (DNR) elementas
Pasikartojantis ribonukleino rūgšties(RNR) elementas
2-25
Bazė + cukrus nukleozidas Pavyzdžiai
Adeninas + ribozė = adenozinas Adeninas + dezoksiribozė = dezoksiadenozinas
Bazė + cukrus + fosfatas(i) nukleotidas Pavyzdžiai
Adenozino monofosfatas (AMP) Adenozino difosfatas (ADP) Adenozino trifosfatas (ATP)
2-26
Bazė visada prisijungia čia
Fosfatai prisijungia čia
2-27
Nukleotidai kovalentiškai susijungia per fosfodiesterinę jungtį Fosfatas jungia vieno nukleotido 5’ anglies atomą su kito
nukleotido 3’ anglies atomu Tuo būdu grandinė turi kryptį
Iš 5’ į 3’
Fosforo rūgšties liekanos ir cukrūs sudaro nukleino rūgšties grandinės karkasą Bazės kyšo iš karkaso
2-28
2-29
1953 m. James Watson ir Francis Crick nustatė, kad DNR sudaro dviguba spiralė, kurioje nukleotidai sąveikauja tarpusavyje pagal tam tikras taisykles
Tačiau šio atradimo mokslinius pagrindus sukūrė kiti mokslininkai Linus Pauling Rosalind Franklin ir Maurice Wilkins Erwin Chargaff
DNR struktūra buvo išaiškinta remiantis keliais esminiais rezultatais
2-30
Penktajame XX a. dešimtmetyje jis nustatė, kad tam tikri baltymų regionai gali susilankstyti į antrinę struktūrą -spiralė
Linusas Paulingas
Šiai struktūrai išaiškinti, jis pagamino modeli, sudarytą iš rutuliukų ir lazdelių
2-31
Dirbo vienoje laboratorijoe su Mauricu Wilkinsu
Naudojo Rentgeno spindulių difrakciją drėgnų DNR siūlų struktūrai tirti
Rosalind Franklin
Difrakcinį vaizdą galima interpretuoti, naudojant matematinio
modeliavimo metodus. Tai gali suteikti informacijos apie tiriamos
molekulės struktūrą
2-32
Rentgeno difrakcijos metodais ji pasiekė gana didelės pažangos, tyrinėjant DNR struktūrą
Difrakciniai vaizdai atspindėjo kai kurias pagrindines DNR savybes
Spiralinė struktūra Daugiau nei viena grandinė 10 bazių porų tenka vienai pilnai
spiralės vijai
Rosalind Franklin
2-33
Chargaffas pirmasis panaudojo daugelį nukleino rūgščių išskyrimo iš gyvų ląstelių, išgryninimo ir matavimo biocheminių metodų
Tuo metu jau buvo žinoma, kad DNR sudaro keturios bazės: A, G, C ir T
Bazių sudėties analizė gali atskleisti svarbias DNR struktūros ypatybes
Erwino Chargaffo eksperimentai
2-34
2-35
Chargaffo tyrimų duomenys: bazių procentinis santykis skirtingų organizmų DNR
OrganizmasBazių %
Adeninas Timinas Guaninas Citozinas
Escherichia coli 26.0 23.9 24.9 25.2
Streptococcus pneumoniae 29.8 31.6 20.5 18.0
Mielės 31.7 32.6 18.3 17.4
Vėžlių eritrocitai 28.7 27.9 22.0 21.3
Lašišų spermatozoidai 29.7 29.1 20.8 20.4
Viščiukų eritrocitai 28.0 28.4 22.0 21.6
Žmogaus kepenų ląstelės 30.3 30.3 19.5 19.9
2-36
Rezultatų interpretavimas
2-37
Duomenys, pateikti lentelėje, sudaro tik nedidelę dalį visų rezultatų, gautų Chargaffo
Iš rezultatų akivaizdžiai matyti, kad Adenino procentas = timino procentui Citozino procentas = guanino procentui
Šis dėsningumas vadinamas Chargaffo taisykle Tai buvo vienas pagrindinių atspirties taškų, kuriuos
panaudojo Watsonas ir Crickas DNR struktūrai išaiškinti
2-38
Būdami susipažinę su visais šiais tyrimų rezultatais, Watsonas ir Crickas pasiryžo išsiaiškinti DNR struktūrą Jie bandė pagaminti DNR modelį iš rutuliukų ir lazdelių,
kuriam būtų būdingi visi žinomi eksperimentiniai DNR bruožai
Esminis klausimas buvo kaip dvi (ar daugiau) grandinių sąveikauja tarpusavyje Pirminė idėja buvo, kad grandinės sąveikauja per fosfato-
Mg++ sąsiuvas
Watsonas ir Crickas
2-39
Ši hipotezė, žinoma, buvo neteisinga!
2-40
Tada jie sukūrė modelį, kuriame Fosfodezoksiribozinis karkasas buvo išorėje Bazės buvo projektuojamos viena priešais kitą
Pradžioje jie manė, kad vandenilinės jungtys jungia identiškas bazes, esančias priešingose grandinėse t.y., A su A, T su T, C su C, and G su G
Tačiau modeliavimas parodė, kad ir šis modelis nėra teisingas
Watsonas ir Crickas
2-41
Tik tada jie suprato, kad vandenilinės jungtys susidaro tarp A ir T bei tarp C ir G Taigi, jie pagamino modelį, kuriame A sąveikavo su T, o G
– su C Šis modelis jau atitiko visus tuo metu žinomus duomenis apie DNR
struktūrą
Watsonas ir Crickas
Watsonas, Crickas ir Wilkinsas 1962 m. už DNR struktūros išaiškinimą gavo Nobelio premiją
Deja, Rosalind Franklin mirė 1958, o Nobelio premijos nėra skiriamos po mirties.
Watsonas ir Crickas
2-42
2-43
Pagrindinės struktūros ypatybės
Dviguba DNR spiralė
Dvi grandinės yra susivijusios apie centrinę ašį Vieną pilną apviją sudaro 10 bazių Abidvi grandinės yra antiparalelios
Vienos kryptis yra nuo 5’ į 3’, o kitos - nuo 3’ į 5’ Spiralė yra dešninė
Kai ji vijasi nuo jūsų, spiralė sukasi pagal laikrodžio rodyklę
2-44
Pagrindinės struktūros ypatybės
Dviguba DNR spiralė
DNR struktūra yra stabilizuojama
1. Tarp komplementarių bazių susidaro vandenilinės jungtys A jungiasi su T per dvi vandenilines jungtis C jungiasi su G per tris vandenilines jungtis
2. Bazių stekingas DNR struktūroje bazės yra orientuotos taip, kad jų plokščiosios dalys
“žiūri” viena į kitą. Esant tokiai orientacijai, tarp bazių susidaro stekingo jėgos, kurios papildomai stabilizuoja DNR struktūrą
2-45
Pagrindinės savybės
•Dvi DNR grandinės formuojadešninę dvigubą spiralę
•Bazės priešingose grandinėsejungiasi vandenilinėmis jungtimis pagal A/T ir G/Ctaisyklę
•DNR grandinės yra anti-paralelios pagal savo5’3’ kryptį
•Kiekvienos grandinės pilną 360° apviją sudaro 10 nukleotidų
2-46
Pagrindinės struktūros ypatybės
Dviguba DNR spiralė
Spiralės paviršiuje susiformuoja du asimetriški grioveliai
1. Didysis griovelis
2. Mažasis griovelis
Kai kurie baltymai gali jungtis prie šių griovelių Tuo būdu jie gali sąveikauti su tam tikromis nukleotidų sekomis
2-47
2-48
DNR dviguba spiralė gali sudaryti skirtingos konformacijos antrines struktūras
Dominuojanti forma, randama gyvose ląstelėse yra B-DNR
Esant tan tikroms in vitro sąlygoms, gali formuotis A-DNR ir Z-DNR dvigubos spiralės
DNR gali susiformuoti į kelių tipų dvigubas spirales
2-49
A-DNR Dešninė spiralė Vienoje vijoje 11 bp Susiformuoja esant žemai drėgmei Nėra aiškių įrodymų apie jos biologinę svarbą
Z-DNR Kairinė spiralė Vienoje vijoje 12 bp Formavimą skatina
Esant didelei druskų koncentracijai - GC-turtingos sekos Esant mažai druskų koncentracija – citozino metilinimas
Tokia konformacija gali būti svarbi transkripcijai ir rekombinacijai, bent jau mielių ląstelėse
9-50
Bazės pakrypusios
centrinės ašies
atžvilgiu
Bazės pakrypusios
centrinės ašies
atžvilgiu
Fosfofdezoksiribozinis karkasas išsidėstęs
zigzagiškai
Bazės santykinai statmenos centrinei
ašiai
2-51
XX a. Šeštojo dešimtmečio pabaigoje Alexander Rich et al atrado trigubą DNR Ji susiformavo in vitro naudojnant sintetinės DNR
fragmentus
Devintajame dešimtmetyje buvo nustatyta, kad natūrali dvigrandininė DNR gali jungtis su sintetine DNR grandine ir suformuoti trigubą DNR spiralę (tripleksą) Sintetinė DNR grandinė jungiasi prie natūralios DNR
didžiojo griovelio
DNR gali sudaryti trigubą spiralę
2-52
Tripleksinės DNR formavimasis priklauso nuo specifinių sekų
Bazių poravimosi taisyklės yra
Tripleksinė DNR gali dalyvauti keliuose svarbiuose procesuose
Replikacijoje, transkripcijoje, rekombinacijoje
Neseniai aptikti ląstelių baltymai, specifiškai atpažįstantys tripleksinę DNR
T jungiasi prie AT poros
natūralioje DNR
C jungiasi prie GC poros
natūralioje DNR
Kaspino modelis Bazių sekos pavyzdys
2-53
Tam, kad DNR tilptų ląstelėjė, ji turi būti efektyviai kompaktizuota per erdvines struktūras Tokios struktūros sukuriamos dalyvaujant baltymams,
galintiems jungtis prie DNR Plačiau apie tai bus kalbama sekančioje paskaitoje
Erdvinė DNR struktūra
2-54
DNR apsiveja apie histoninius
baltymus
2-55
Pirminė RNR grandinės struktūra yra labai panaši į DNR grandinės struktūrą
RNR grandinės paprastai būna nuo kelių šimtų iki kelių tūkstančių nukleotidų ilgio
RNR sintetinama naudojant DNR kaip matricą. Šios sintezės metu naudojama tik viena iš dviejų DNR grandinių
RNR struktūra
2-56
2-57
Nors RNR dažniausiai yra viengrandininė, RNE molekulėse gali formuotis dvigrandininiai regionai Šios antrinės struktūros susidaro dėl komplementarių bazių
poravimosi A su U ir C su G
Dėl to trumpuose RNR segmentuose susiformuoja dviguba spiralė
Tipiška RNR dviguba spiralė Yra dešninė Sudaro A formą, kurioje vienai vijai tenka 11-12 bp
Gali susidaryti skirtingų tipų RNR antrinės struktūros
2-58
Taip pat vadinama smeigtuko
galvute
Komplementarūs regionai
Nenkomplementarūs regionai
Palaikomi vandenilinių jungčių
Turi bazes, išsikišančias iš dvigrandininių regionų
Išsikišusi kilpa Vidinė kilpa Išsišakojusi kilpa arba mazgas Kamieninė kilpa
2-59
Daugelis veiksnių gali įtakoti RNR tretinę struktūrą Pavyzdžiui
Bazių poravimasis ir stekingas RNR molekulėje
Sąveikos su jonais, mažomis molekulėmis ir stambiais baltymais
Tretinė tRNRphe struktūra Tai transportinė RNR kuri perneša fenilalaniną
Molekulė turi viengrandininius ir
dvigrandininius regionus
Jie sąveikauja sudarydami šias 3-D
struktūras
Kaspino modelis