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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA LABORATORIO DE ESPECTROSCOPIA MOLECULAR
Determinación de nitrato y amonio en fertilizantes, utilizando la técnica de Análisis
por Inyección en Flujo acoplada a la Espectroscopía de Absorción Molecular
Ultravioleta/Visible en fase gaseosa
Trabajo Especial de Grado de Licenciatura
Br. Eliana R. Guillén C.
Tutora: Dra. Maribel Valero
Mérida - Venezuela Enero 2009
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R. Guillén C.
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RESUMEN
En el presente trabajo se validó un método para la determinación
secuencial de amonio y nitrato en fertilizantes mediante el uso de la técnica de
análisis por inyección en flujo acoplada a la espectroscopia de absorción
molecular ultravioleta-visible como sistema de detección (FIA-EAM). En el
sistema propuesto el contenido de amonio y nitrato en las diferentes muestras
se determinó mediante la conversión de los analitos a la forma de amoniaco. El
método consiste en la inyección en dos etapas de 100 µL de muestra en un
sistema en flujo. En la primera, el volumen de muestra inyectado; se mezcla
con una corriente de hidróxido de sodio 3 mol.L-1 y posteriormente en un
serpentín (R1), la mezcla previa entra en contacto con una corriente de
hidróxido de sodio que contiene una concentración de 13 mol.L-1. En este
punto, se produce cuantitativamente amoniaco a partir de amonio. La mezcla
gas-líquida, es arrastrada por una corriente de nitrógeno a un segundo
serpentín (R2) y luego a un separador de fases (SF), donde se produce la
separación definitiva de la fase gaseosa, para finalmente ser transportada a
una celda para gases que se encuentra alineada al camino óptico del
espectrofotómetro, el cual mide la absorbancia del compuesto en fase gaseosa
a 197 nm. De esta forma se obtiene la señal de amoniaco a partir de amonio en
la muestra. En la segunda etapa la muestra inyectada en la corriente del
hidróxido de sodio 3 mol.L-1 es dirigida mediante el uso de una válvula
selectora (VS) hacia una columna de 17 cm de longitud rellena de Zn/Cu, la
cual permite la conversión cuantitativa de nitrato a la forma de amonio. Este
último, se hace reaccionar con hidróxido de sodio 13 mol.L-1 como fue descrito
anteriormente para la formación cuantitativa de amoniaco. La señal obtenida en
esta etapa corresponde al amoniaco procedente del amonio y nitrato en la
muestra. La señal correspondiente al nitrato se obtiene por la diferencia de las
dos señales.
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El método propuesto presento características analíticas como: intervalo
dinámico, límite de detección y cuantificación, precisión y frecuencia de análisis
adecuadas para el análisis propuesto. Los estudios de recuperación y adición
de estándar indicaron que el método es exacto y se encuentra libre de
interferencias, con lo cual constituye una alternativa interesante y válida para la
determinación de la concentración de nitrato y amonio en fertilizantes
nitrogenados de origen inorgánico, que puede ser usada de forma rutinaria
para el control de calidad en las industrias del ramo.
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DEDICATORIA
Los vencedores son aquellos que creen en si mismos y depositan su
confianza en Dios, a quién hoy cuando estoy celebrando el logro de una de mis
anheladas metas; le dedico mi trabajo porque siempre ha estado conmigo;
dándome la fuerza necesaria para seguir adelante.
En memoria de todos los que hoy no están, porque Dios un día me los
quitó; se que donde él los tenga comparten conmigo este triunfo, primo del
alma Alfonso y Tía Francy les dedico mi logro.
A mis Padres, lo más hermoso que poseo, a quienes debo y agradezco
todo lo que me han dado, sin pedirme nada a cambio, solo teniendo por
recompensa el sentirse felices y dichosos de lograr mi bienestar y felicidad.
Todo lo que hasta ahora he logrado en mi vida, es gracias a la sabia educación
con la que me instruyen, porque representan para mi, el esfuerzo, sacrificio,
consuelo, enseñanza, consejo oportuno, rectitud y abnegación, este triunfo es
totalmente en honor a ustedes.
A mis hermanos Edgar y Ender y a las hermanas que la vida me regalo
Yelitza y Yucelis, quienes con cariño y comprensión son el bastón que me
ayuda a seguir en pie.
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AGRADECIMIENTO
Hoy se hace realidad una de mis metas, pero sabia que para alcanzarla
tendría que aprender a conocer virtudes como la paciencia, constancia,
sacrificio y dedicación. En este camino existieron momentos difíciles que me
llenaron de angustia, depresión y tristeza, queriéndome apartar de mi sueño,
pero gracias a Dios todopoderoso y a la Santísima Virgen que me iluminaron
siempre para poder vencer estos grandes obstáculos. Sé, que sin ayuda
probablemente no lo hubiese alcanzado, por lo cual considero que ha sido un
triunfo en conjunto y son muchas las personas especiales a las quiero
agradecer.
A Dios y a la Virgen, quienes me dieron fortaleza y me guiaron siempre
por el buen camino, dándome la mano para levantarme en cada uno de los
tropiezos y poder seguir adelante.
A mis Padres, a quienes les debo la vida, son los mejores padres del
mundo; gracias por su inmenso amor, sus esfuerzos, apoyo y por la confianza
que depositaron en mí. Gracias por sacarme adelante y regalarme la
oportunidad de lograr una de mis metas, la cual constituye la herencia más
valiosa que pudiera recibir para continuar superándome. Los Amo.
A mis hermanos y sobrinos, por ser mis amigos incondicionales, fuente
de inspiración, motivo de superación, con su apoyo, ayuda y cariño he logrado
este sueño hoy día. Dios los bendiga.
Gracias a la profesora Maribel Valero (Tutora), por creer en mí sin
conocerme y abrirme las puertas del Laboratorio de Espectroscopia Molecular
para que realizar mi trabajo especial de grado. Gracias por todo.
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Al profesor Ali Bahsas por ser una persona ejemplar, excelente profesor,
amigo y orientador. Prof. creo que esta demás recordarle que usted para mi es
como mi padre. Le doy gracias a Dios por haberlo puesto en mi camino, quiero
decirle que puede contar siempre conmigo. Gracias por sus consejos y
excelentes enseñanzas de vida y humildad. Por permitirme trabajar a su lado
durante todos estos años. En fin Prof. No tengo nunca como pagarle todo lo
que usted ha hecho por mí, bueno ya sabe que para mi seguirá siendo el Dios
de la Facultad de Ciencias. Lo quiero mucho.
A Pedro y Alvaro del Labarotario de Catálisis, a Edyleiba y Marlene del
Laboratorio de Espectroscopía Molecular, a Iris y Fanny Técnicos de los
Laboratorios de docencia, gracias por haber estado ahí cada vez que los
necesite ustedes me ayudaron siempre que se los pedí, muchachos mil gracias
en verdad. Dios se los pague.
A mis verdaderos amigos, si que han sido bastantes desde el Jardín de
Infancia hasta la Universidad, cada uno ocupa un espacio importante en mi
vida y un lugar especial en mi corazón, con ellos compartí buenos y malos
momentos y hoy en día llenan mi mente de gratos recuerdos, nunca los
olvidaré pues marcaron mi vida. Tengan siempre presente que todo lo que se
quiere en la vida se puede. Luchen por sus sueños.
A todos los integrantes del Laboratorio de Espectroscopia Molecular, por
permitirme trabajar con ellos durante todos estos meses que estuve
desarrollando mi trabajo, gracias por su amistad, asesoría y apoyo.
A mis amigos del Laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear (RMN),
por ese cariño y compartir tantos momentos gratos conmigo ustedes son parte
de mi familia pues convivía con ustedes a diario, ustedes fueron testigos fieles
más que cualquier otra persona de todo lo que he pasado para poder hacer
realidad este sueño, muchas gracias muchachos. Suerte.
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A la Ilustre Universidad de los Andes, mi casa de estudio, por brindarme
la oportunidad de formar parte de ella, orientándome con sus profesores,
quienes impartieron sus conocimientos para formarme como profesional.
A todas y cada una de esas personas que confiaron, creyeron en mí y se
atrevieron a apostar, sabiendo que sí lo lograría, hoy pueden decir que han
ganado, pues ya la espera ha terminado, a ustedes gracias por estar allí
formando parte de mi vida. Lo Logré.
Eliana Guillén
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ÍNDICE DE CONTENIDO Página ÍNDICE DE CONTENIDO i ÍNDICE DE FIGURAS iv ÍNDICE DE TABLAS vi RESUMEN vii INTRODUCCIÓN 1 CAPÍTULO I 4 EL PROBLEMA 1.1 Planteamiento del problema 4 1.2 Objetivos de la investigación 6 1.2.1 General 6 1.2.2 Específicos 6 CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO 7 2.1 Fundamento teórico 7
2.1.1 Historia del nitrato y del amonio 7
2.1.2 Naturaleza química del nitrato y del amonio 8 2.1.3 Importancia del nitrato y del amonio 10 2.1.4 Usos de las sales de nitrato y de amonio 12 2.1.5 Aspectos generales de los fertilizantes 14 2.2 Antecedentes 19
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2.3 Hipótesis 26 2.4 Plan de trabajo 27 CAPÍTULO III 29 MARCO METODOLÓGICO 29 3.1 Parte experimental 3.1.1 Instrumentación 29 3.1.2 Reactivos 30 3.1.3 Preparación de la columna reductora 30 3.1.4 Activación de la columna 31 3.1.5 Regeneración de la columna 31 3.1.6 Preparación de las muestras de fertilizantes 32 3.2 Metodología propuesta 33 3.2.1 Procedimiento general 33 3.3 Espectroscopía de absorción molecular en el Ultravioleta/Visible 36
3.4 Técnica de análisis en flujo y generación de fase gaseosa en línea 43
CAPÍTULO IV ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 51 4.1 Estudios preliminares 51 4.2 Optimización del acoplamiento de sistema FIA-GFG-EAM-UV-Vis para la determinación de amonio 54
4.2.1 Efecto de la concentración de hidróxido de sodio sobre la respuesta instrumental 54
4.2.2 Efecto de los caudales de la solución portadora y del hidróxido de sodio sobre la señal analítica 56
4.2.3 Efecto del diámetro y longitud de los serpentines (R1 y R2) sobre la señal analítica 57
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4.2.4 Efecto del flujo de nitrógeno sobre la señal analítica 57
4.2.5 Efecto del volumen de inyección sobre la señal analítica 58
4.3 Caracterización analítica del sistema FIA-GFG-EAM-UV-Vis para la determinación de amonio 59
4.4 Estudios de efectos de matriz para el ión amonio 60 4.5 Estudios de recuperación para el ión amonio 61 4.6 Determinación de nitrato 62 4.6.1 Efecto de la longitud de la columna reductora sobre la señal analítica 62
4.7 Caracterización analítica para la determinación de nitrato 63
4.8 Estudios de efectos de matriz para el ión nitrato 64 4.9 Estudios de recuperación para el ión nitrato 66 5. Análisis de muestras reales 66 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 68 BIBLIOGRAFÍA 70
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ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1.- Ciclo del nitrógeno 10
Fig. 2.- Diagrama esquemático de un sistema utilizado para la determinación de las tres formas de nitrógeno inorgánico 24
Fig. 3.- Representación esquemática del sistema AIF-GFG-EAM-UV-Visible 35
Fig. 4.- El proceso de la absorción molecular en el Ultravioleta-Visible 38
Fig. 5.- Diagrama de bloques de un instrumento básico para la Absorción Molecular en el Ultravioleta-Visible 40
Fig. 6.- Esquema básico sobre el sistema de análisis en flujo continuo 44
Fig. 7.- Esquema básico del sistema de análisis de inyección en flujo (FIA) 46
Fig. 8.- Representación esquemática del sistema FC-GFG-EAM-UV-Visible 52
Fig. 9.- Espectro de absorción molecular del amoniaco (NH3) obtenido por flujo continuo utilizando una solución de 11,111 x 10-2 mol NH4
+ L-1 53
Fig. 10.-
a) Efecto de la concentración de hidróxido de sodio por el canal portador (C1), b) Efecto de la concentración de hidróxido de sodio por el canal (C2) sobre la señal analítica de una solución de 1,389 x 10-2 mol.L-1
56
Fig. 11.- a) Efecto del flujo de hidróxido de sodio por el canal portador C1, b) Efecto del flujo de hidróxido de sodio por el canal C2 sobre la señal analítica de una solución de 1,389 x 10-2 mol.L-1
57
Fig. 12.- Efecto del flujo de nitrógeno, sobre la señal analítica de una solución de 1,389 x 10-2 mol.L-1 de amonio 58
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Fig. 13.- Efecto del volumen de inyección, sobre la señal analítica de una solución de 1,389 x 10-3 mol.L-1 de amonio 59
Fig. 14.- Estudios de adición de estándar para el ión amonio 61
Fig. 15.- Efecto de la longitud de la columna reductora, sobre la señal analítica de una solución de 4,03 x 10-3 mol.L-1 de nitrato
63
Fig.16.- Estudios de adición de estándar para el ión nitrato 65
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características de los fertilizantes más usados 18
Tabla 2. Características de los reactivos utilizados 30
Tabla 3. Muestras de fertilizantes nitrogenados sintéticos inorgánicos 32
Tabla 4. Condiciones experimentales de operación del sistema AIF-GFG-EAM-UV-Visibles 36
Tabla 5. Absorción por aniones inorgánicos 39
Tabla 6. Condiciones experimentales de operación del sistema FC-GFG-EAM-UV-Visible 52
Tabla 7. Caracterización analítica del sistema AIF-GFG-EAM-UV-Visible para el ión amonio 60
Tabla 8. Estudio de recuperación para el ión amonio 62
Tabla 9. Caracterización analítica del sistema AIF-GFG-EAM-UV-Visible para el ión nitrato 64
Tabla 10. Estudio de recuperación para el ión nitrato 66
Tabla 11. Contenido de amonio y nitrato en fertilizantes 67
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INTRODUCCIÓN
La producción agrícola depende en gran medida de que los suelos sean
capaces de desarrollar cultivos con un buen rendimiento y esa capacidad es
establecida por su fertilidad. El contenido de nutrientes de origen natural en los
suelos, generalmente no es suficiente para lograr una adecuada productividad
y así aumentar los rendimientos de las cosechas. Por esta razón, se emplean
los fertilizantes naturales y químicos (orgánicos e inorgánicos). El nutriente más
utilizado es el nitrógeno, ya que éste afecta directamente los rendimientos y la
calidad de los productos. Los fertilizantes nitrogenados contienen el nitrógeno
principalmente bajo la forma de nitrógeno inorgánico (nitrato y amonio) que es
la forma que puede ser absorbida por las plantas. Sin embargo, la capacidad
de absorción varía según el cultivo y las técnicas agrícolas, a fin de obtener
una máxima producción se aplica un exceso del producto al suelo, este exceso
puede perderse por lixiviación en forma de nitrato (NO3-), por volatilización en
forma de amoníaco (NH3), igualmente el amonio (NH4+), puede almacenarse en
las plantas, generando problemas serios de contaminación ambiental y
humana.[1−4]
En la actualidad, el uso del nitrato como fertilizante nitrogenado en la
agricultura intensiva desencadena problemas ambientales como: la
contaminación de las aguas, la degradación de la capa de ozono y problemas
sanitarios como: deficiencias en la oxigenación sanguínea en lactantes o la
acumulación de nitrosaminas, sustancia cancerigena en el estómago adulto.
Por esto, es necesario buscar un equilibrio entre la productividad agrícola y la
cosecha de calidad, manteniendo las condiciones ambientales.[5−8]
El ión nitrato y el amonio, pueden ser transformados, por diversos
mecanismos químicos y biológicos a nitrito y amoniaco respectivamente, cuyas
toxicidades están bien documentadas. [3,9−11]Debido a esto, en la literatura se
pueden encontrar una amplia variedad de propuestas analíticas para
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determinar los contenidos de nitrato y amonio en diversas matrices (biológicas,
ambientales, industriales, etc.) a fin de ser utilizadas en varios sectores con el
objeto de establecer controles o diagnósticos. [12−17]La mayoría de las
propuestas metodológicas para la determinación de amonio (amoniaco) y
nitrato (luego de la conversión a nitrito) se basan en el uso de la técnica
espectrofotométrica, utilizando las reacciones de Berthelot (reacción de lesser)
y reacción de Griess respectivamente.[14,18−21]
Por otra parte, la espectroscopía de absorción molecular en fase
gaseosa (EAMFG), ha sido utilizada para la determinación de aniones y
cationes, mediante la conversión del analito en una especie molecular volátil y
medida su máxima absorbancia en fase gaseosa. Por su parte, las técnicas en
flujo han permitido nuevos desarrollos en EAMFG, que se caracterizan por su
simplicidad, rapidez y seguridad, superando muchos de los inconvenientes
encontrados en otros métodos.[22]
Dada la importancia que tienen las especies nitrogenadas inorgánicas;
en los últimos años el Laboratorio de Espectroscopía Molecular ha abordado
este tema en diferentes matrices; con el fin de diseñar metodologías rápidas,
simples, sensibles, etc., que permitan la cuantificación de nitrato, amonio y/o
nitrito en muestras como aguas, suelos, alimentos, entre otros. Por estas
razones, es que surge la iniciativa de diseñar una metodología con
características analíticas adecuadas que permita la cuantificación del ión
amonio y nitrato en fertilizantes.
Con base a lo anteriormente descrito, el presente trabajo, tiene como
objetivo validar un método basado en el acoplamiento de la técnica en flujo,
generación de fase gaseosa y detección por espectroscopía de absorción
molecular ultravioleta-visible, para la determinación de nitrato y amonio en
fertilizantes.
El presente trabajo ha sido dividido en varios capítulos. El primero se
basa en el planteamiento del problema, en el cual se trata de enfocar las ideas
contextuales del problema y equivalentemente se hace referencia al por qué se
debe hacer dicho estudio; así como la limitación en tiempo y espacio del
mismo, planteándose también los objetivos general y específicos que pretende
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la investigación. En el segundo se enfoca el marco referencial, el cual consta
de un fundamento teórico sobre el tema planteado, incluyéndose antecedentes
y planteamiento de la hipótesis. En el tercero, se incluye la instrumentación y
reactivos utilizados, así como la metodología usada. Adicionalmente, se
abordan algunos aspectos relacionados con la técnica de Espectroscopía de
Absorción Molecular y las técnicas en flujo las cuales están involucradas en
esta propuesta, con el objeto de poder precisar los parámetros que se deben
optimizar. En el capítulo cuatro, se incluyen el análisis y discusión de los
resultados obtenidos sobre la metodología propuesta y finalmente se presentan
las conclusiones y recomendaciones del trabajo.
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CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1.1 Planteamiento del problema
En general la comercialización de fertilizantes en el mundo, ha tenido un
crecimiento sustancial desde que a principios del siglo XX Fritz Haber,
descubrió como acortar el ciclo del nitrógeno,[3,11] fijando químicamente el
elemento a altas temperaturas y presiones, creando así fertilizantes que podían
ser añadidos directamente al suelo para incrementar en forma significativa la
productividad agrícola. Sin embargo, el uso de estos productos, ha traído
algunas consecuencias negativas, ya que los mismos al ser utilizados en
exceso, incrementan el contenido de nitratos y amonio (que es el nitrógeno
asimilable para las plantas) en la solución de los suelos, sin tomar en cuenta el
aporte de estas especies, procedentes de las cantidades de nitrógeno
orgánico. El excedente de nitrato no es retenido en grandes cantidades por los
suelos y puede ser fácilmente lavado o lixiviado, y así estar presente en las
aguas potables, que al ser utilizadas por los seres vivos puede ejercer efectos
tóxicos, ya que es un potente metahemoglobinizante y tiene acción
vasodilatador, también al ingerir aguas contaminadas por nitratos, estos
pueden ser transformados en el organismo a la forma de nitrito. La toxicidad del
nitrito, esta principalmente relacionada con su participación directa en la
oxidación férrica de la hemoglobina (Hb) normal, a metahemoglobina (metHb);
la cual es incapaz de transportar el oxígeno a los tejidos. Esta especie, también
tiene una toxicidad indirecta, ya que reacciona con aminas o amidas para
producir compuestos N-nitroso, nitrosaminas y nitrosamidas, los cuales poseen
efectos cancerígenos y mutagénicos.[6−9,12,23]
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Las sales de amonio aplicadas, en la superficie de los suelos alcalinos
produce un gas que se escapa a la atmósfera como amoniaco,[3] siendo este un
compuesto tóxico, dependiendo de la dosis; para todo el reino animal. El
amonio también puede sufrir un proceso de oxidación biológica para
transformarse en nitratos, en este proceso, intervienen organismo autotróficos
(bacterias de los géneros Nitrosomas y Nitrobacter).[3]
Los fertilizantes nitrogenados, contienen concentraciones elevadas de
nitrato y amonio que varían entre (6 y 19) g/kg y como se planteo
anteriormente, son utilizados en exceso en los diferentes cultivos, con el objeto
de incrementar las cosechas. Cuando la disponibilidad del fertilizante en los
suelos es alta, las plantas son capaces de absorber niveles superiores a los de
la disponibilidad inmediata, haciendo que el exceso sea almacenado en los
tejidos más viejos de estas. Otra parte del fertilizante que queda en la solución
de los suelos, puede perderse por lixiviación en forma de nitrato (NO3-) y por
volatilización en forma de amoníaco (NH3),[3] lo que conlleva a un aumento
importante de estas especies en el medio ambiente con un alto riesgo de
incorporarse en la cadena alimentaría.
En Venezuela, existen regiones que son explotadas desde el punto de
vista agrícola. Sin embargo, los suelos de la región Andina en particular, suelen
ser los más apropiados para el desarrollo de una variedad de cultivos y dichos
productos son los de mayor consumo en el país. Estos al igual que en muchas
partes del mundo son tratados con una variedad de compuestos entre ellos
fertilizantes nitrogenados; ya que cuando se trata de producir grandes
cantidades de alimentos en menos tiempo y espacio, algunos nutrientes del
suelo suelen agotarse tras el cultivo año tras año en un mismo lugar,
ocasionando un mayor desgaste ecológico. A fin de evitar esto, los agricultores
de la región aseguran el rendimiento de sus cultivos adicionando fertilizantes
sin hacer un estudio previo de los requerimientos del suelo.
Por lo antes expuesto, es importante controlar los niveles de nitrato y
amonio que son adicionados a los diferentes tipos de suelos a través del uso
de fertilizantes nitrogenados a fin de evitar que un exceso de los mismos pueda
producir serios problemas de contaminación ambiental.
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En los últimos cinco años, el Laboratorio de Espectroscopia Molecular
viene trabajando en una línea de investigación que se refiere al desarrollo de
nuevos diseños metodológicos que incluye la automatización y/o actualización
de métodos clásicos para la determinación de nitrato y amonio en diversas
matrices con miras a la prestación de servicios de análisis químico y control de
calidad para empresas productoras del sector agrícola, y usuarios de análisis
de suelos y plantas, tanto a nivel nacional como del exterior.
En este orden de ideas, en el presente trabajo, se propone una metodología
para la determinación de estas especies en fertilizantes nitrogenados que son
utilizados para la producción agrícola en la región de los Andes Venezolanos.
1.2 Objetivos de la investigación
1.2.1 General
Validar una metodología que permita la determinación de nitrato y
amonio en fertilizantes que se comercializan en la región de los Andes
Venezolanos, basada en el acoplamiento de la técnica de Análisis por
Inyección en Flujo con Espectroscopia de Absorción Molecular ultravioleta-
visible, mediante la generación de una fase gaseosa en línea.
1.2.2 Específicos
1) Utilizar una o varias reacciones químicas para generar en línea
amoniaco a partir de soluciones de cloruro de amonio y nitrato de sodio.
2) Seleccionar parámetros instrumentales y espectroscópicos, como flujo
de los diversos canales, serpentines de reacción, longitud de onda, etc.
3) Seleccionar parámetros químicos, como concentración de reactivos.
4) Caracterizar analíticamente el sistema en términos de sensibilidad,
límite de detección, concentración máxima, concentración mínima, etc.
5) Validar el método mediante los estudios de interferencia y
recuperación.
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CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1 Fundamento teórico
2.1.1 Historia del nitrato y del amonio
El nitrógeno y sobre todo sus compuestos derivados; como el nitrato y el
amonio, son de gran interés para los seres humanos, debido a su importancia
en la atmósfera, en los procesos de la vida humana y en general de las plantas
y animales.[3]
El nitrato en si mismo es inocuo, pero puede ser transformado por
diversos mecanismos químicos y bioquímicos a la forma de nitrito, cuya
toxicidad esta ya verificada y afecta la salud de las personas.[6−9,11,12,14] Estos se
conocen al menos desde la edad media y son sales o esteres del ácido nítrico
(HNO3). Con la introducción de la pólvora los pequeños yacimientos naturales
de sales de nitrato ya no eran suficientes y se pasó a un proceso de fabricación
a partir de los excrementos humanos y de animales; estos se vertían sobre un
lecho alto y bien aireado de material orgánico como rastrojos, además se
añadían cantidades de cal. En estas condiciones se genera el nitrato de calcio,
este, por ser soluble en agua pudo ser extraído y obtenido tras la evaporación
del líquido.[23,24] La adición de carbonato potásico extraído de las cenizas de
madera, a una disolución del nitrato cálcico precipitaba el calcio en forma de su
carbonato (la cal) y el nitrato potásico se obtenía tras evaporación del
disolvente.[24]
En relación al ión amonio (del latín ammonium) puede formar sales
amónicas cuando se une con iones negativos, estos compuestos son obtenidos
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por reacciones del amoniaco con los ácidos: Los antiguos sacerdotes del siglo
(XII) conocían las sales amónicas producidas por la destilación del estiércol del
camello cerca del templo de Júpiter Amón en Libia de ahí su nombre, también
se atribuye a los egipcios su descubrimiento llamándolo amoniaco o sales
amoniacales, en memoria del dios del sol Ra Ammon.[25]
En Europa durante la edad media el amoniaco se obtenía calentando los
cueros y pezuñas de bueyes y se le llamaba espíritu de cuerno de ciervo. El
amoniaco también fue descubierto por los alquimistas quienes se encargaban
de estudiar su obtención y propiedades, siendo Priestley quien lo aisló por
primera vez y años más tarde Berthollet estableció su composición exacta.[25]
En el siglo XIX la principal fuente de amoniaco fue la destilación
de la hulla, era un derivado importante en la fabricación de los
combustibles gaseosos. Hoy la mayoría de sales de amonio y
nitrato se producen sintéticamente a partir del nitrógeno y del hidrógeno en el
proceso de Fritz Haber.[3,11,25]
2.1.2 Naturaleza química del nitrato y del amonio
El nitrato se forma en la naturaleza por la descomposición de los
compuestos nitrogenados como las proteínas, la urea, etc. En esta
descomposición se forma amoníaco o amonio, los cuales en presencia de
oxígeno son oxidados por microorganismos de tipo nitrobacter a ácido nítrico
que ataca cualquier base (generalmente carbonatos) que hay en el medio
formando el nitrato correspondiente. Otra vía de formación es a través de los
óxidos de nitrógeno, que se generan en las descargas eléctricas de las
tormentas a partir del nitrógeno y del oxígeno del aire, con el agua de la lluvia
de nuevo se forma ácido nítrico que ataca los carbonatos y otros minerales
básicos que se encuentran en el medio, para formar nitrato. Actualmente, se
forman también cantidades importantes de óxidos de nitrógeno en los procesos
de combustión a alta temperatura, estos se transforman por el mismo camino
en nitrato que ha sido descrito para los óxidos de nitrógeno formados
naturalmente.[3,11,23,24,25]
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El nitrato es una forma iónica combinada de nitrógeno y
oxígeno en condiciones aerobias y resulta de la oxidación
total de los compuestos del nitrógeno, el cual contiene un
átomo de nitrógeno (N) y tres átomos de oxígeno (O). El
nitrógeno en estado de oxidación (+V) se encuentra en el centro de un triángulo
formado por los tres oxígenos. La estructura es estabilizada por efectos
mesoméricos.[24] El símbolo químico del nitrato es NO3- y su peso molecular
igual a 62 g/mol. El ión nitrato es la base conjugada del ácido nítrico
(HNO3),[11] el ácido nítrico es un ácido fuerte el cual se disocia en agua
produciendo iones nitrato e iones hidroxonio (H3O+), el ión nitrato tiene una
hibridación sp2.[23,24] Es un ión estable, soluble en agua, muy móvil, no se
absorbe en arcilla o materia orgánica por sus condiciones aniónicas, y por lo
tanto, se puede lixiviar a través del suelo y ser transportado por el agua
subterránea. El origen del nitrato en aguas subterráneas es principalmente de
fertilizantes, sistemas sépticos y almacenamiento de estiércol u operaciones de
extensión, los fertilizantes nitrogenados no absorbidos por las plantas,
volatilizados o arrastrados por la corriente superficial terminan en las aguas
subterráneas en forma de nitrato. El nitrógeno procedente del estiércol o de los
abonos puede perderse de manera similar de los prados, corrales, o lugares de
almacenamiento. Los sistemas sépticos eliminan solamente la mitad del
nitrógeno de las aguas residuales, dejando que la otra mitad sea lavada hacia
las aguas subterráneas.[4,11]
En cuanto al ión amonio, se puede decir que es un catión
monovalente, formado a partir de la molécula amoniaco
(NH3), en la que el nitrógeno, que es el átomo central, cede el
par de electrones libres a un protón formando un enlace
dativo, dando así la molécula de amonio (NH4+) con un peso molecular igual a
18 g/mol y cuyo nitrógeno en dicha molécula presenta una hibridación sp3 y
trabaja con un estado de oxidación (-III).[25]
El ión amonio es un producto proveniente de la descomposición de
residuos orgánicos nitrogenados (proceso de amonificación) o de la fijación
biológica, debido a que dicho ión posee una carga positiva en su composición
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química, éste puede retenerse en las partículas de arcilla del suelo cuya carga
es negativa, por lo que es relativamente inmóvil en el suelo, como
consecuencia de ello y por lo general no se incorpora al agua
subterránea.[10,17,25]
Estos iones nombrados en líneas anteriores, se encuentran
naturalmente en el ambiente ya que los mismos forman parte del ciclo del
nitrógeno como se puede observar en la Figura 1. Las reservas de nitrógeno
elemental en la atmósfera son inagotables y se encuentran en equilibrio con las
demás formas fijadas; es decir, en la medida que este nitrógeno atmosférico es
convertido a formas fijadas, existe una continua reposición del nitrógeno
elemental por medio de procesos microbiológicos y químicos que suceden en
el suelo.[3,11,25]
Figura 1. Ciclo del Nitrógeno
2.1.3 Importancia de los iones nitrato y amonio
El nitrógeno en su estado elemental (N2), es un gas inerte, incoloro,
inodoro y constituye aproximadamente el 78 % de los gases que conforman la
atmósfera; sin embargo, este nitrógeno atmosférico no es aprovechable
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directamente por la mayoría de las plantas, estas principalmente lo absorben
por las raíces en forma de amonio (NH4+) y de nitrato (NO3
-), por lo que dichas
especies son de gran importancia para la agricultura ya que por medio de los
fertilizantes nitrogenados que las contienen, ayudan a los suelos a ser más
fértiles y productivos al servir como abonos para los mismos.[3,11]
Una cantidad pequeña de nitrógeno atmosférico puede ser fijada
abióticamente por procesos de ionización provocados por tormentas eléctricas,
mayor cantidad puede fijarse mediante radiaciones cósmicas y meteoritos.
Estos fenómenos proporcionan por instantes gran cantidad de energía, que
hacen reaccionar al nitrógeno con el agua, para formar amoniaco (NH3). Este
compuesto posteriormente es llevado al suelo por las lluvias.[3,11]
La fijación industrial de nitrógeno que lleva a la obtención de fertilizantes
nitrogenados, son cuantitativamente de gran importancia, desde el punto de
vista de la agricultura comercial. Esta es la fuente más importante de este
elemento como nutriente vegetal.[3,11]
Los nitratos son aprovechados por las plantas que los convierten de
nuevo en compuestos orgánicos nitrogenados, como los aminoácidos, por lo
tanto, son una parte esencial de los abonos, muchas plantas acumulan el
nitrato en sus partes verdes; si éstas se aprovechan como alimentos cocidos
existe el peligro de que los nitratos que contengan puedan ser reducidos por
otros organismos a nitritos una vez que estos alimentos sean ingeridos.
Adicionalmente, existen algunos vegetales como las espinacas
(procesadas o no) que tienen la particularidad de que al ser almacenadas bajo
condiciones que favorezca el crecimiento de microorganismos que permiten la
reducción del nitrato a la forma de nitrito; los cuales son tóxicos y a su vez
producen nitrosaminas que son cancerígenas.[3,24,26−31]
El amonio es un derivado muy importante del nitrógeno, igualmente se
utiliza en fertilizantes nitrogenados los cuales son aplicados al suelo sirviéndole
de abono al mismo. A través de él se obtienen otros compuestos del ciclo del
nitrógeno como por ejemplo el amoniaco, el cual se produce igualmente en la
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naturaleza por acción de bacterias de la putrefacción y de la formación de
amoniaco sobre la materia orgánica del suelo. Por este motivo, se percibe olor
a amoniaco en establos y corrales, donde esta acción tiene lugar.[10,11,32]
Las cantidades de amonio (NH4+) y nitrato (NO3
-), en la solución del
suelo están en función de las cantidades de fertilizantes comerciales
suministrados al mismo y de las cantidades de nitrógeno orgánico que se
pueden transformar a nitrógeno inorgánico, es decir, esta última depende del
equilibrio que afecte la relación entre la mineralización y la inmovilización del
nitrógeno del suelo; entendiéndose por mineralización la transformación del
nitrógeno orgánico a nitrógeno mineral (NH4+, NO3
-, NO2-). El proceso contrario
al ya descrito se denomina inmovilización.[3]
Se sabe desde hace mucho tiempo que el empleo de nitrato de amonio
aumenta la acidez del suelo. A no ser, que se de el caso, de un manejo
adecuado a los fertilizantes completos, estos siempre tendrán a desarrollar un
residuo ácido en los suelos, debido sobre todo a la influencia de algunos
materiales nitrogenados en especial de naturaleza amoniacal. El efecto
principal de los iones amonio (NH4+) se ejerce cuando estos son nitrados por la
oxidación, los compuestos amoniacales tienden a aumentar su acidez.[33]
Existen otros efectos importantes de los iones amonio de menor
extensión que disminuyen el pH del suelo, por ejemplo, cuando se añade al
suelo sulfato de amonio algunos de los iones amonios son absorbidos por la
materia coloidal, reemplazando cantidades equivalentes de otros cationes.[33]
2.1.4 Usos de las sales de nitrato y de amonio
El nitrato de potasio (KNO3) forma parte esencial de la pólvora negra. Se
aprovecha su poder oxidante para transformar el carbono y el azufre, también
presentes en la mezcla de sus óxidos; la energía liberada en el proceso hace
que se calienten los gases y se expandan de manera explosiva.[24] Εl nitrato
también forma parte esencial de muchas formulaciones de abonos, el nitrato
natural conocido también como nitrato de Chile, se explota desde hace mucho
tiempo en los salares del norte de ese país y constituía un importante producto
de exportación del mismo; hasta el desarrollo en Noruega y otros países del
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nitrato artificial (obteniendo el nitrógeno directamente del aire a través de
medios electroquímicos). El nitrato de amonio, aparte de ser un buen abono, se
descompone de forma explosiva a la hora de calentarlo y es responsable de un
gran número de accidentes, mezclado con petróleo es utilizado, como
explosivo en minería. En condiciones más controladas la descomposición del
nitrato de amonio se utiliza para generar el óxido de dinitrógeno, este se
aprovecha como anestésico y por ejemplo para espumar la nata batida
enlatada.[23,24,34] El nitrato de plata, es un precursor importante para los haluros
de plata utilizados como sales fotosensibles en fotografía, igualmente este tipo
de nitrato, es usado en la ciencia de la medicina para quemar la piel.[23,24]
Como intermedio, los nitratos están presentes en el proceso de
nitrificación/desnitrificación que se utilizan en las plantas depuradoras de aguas
residuales, se aprovecha el hecho que algunos microorganismos se pueden
reducir en condiciones anaeróbicas el nitrato directamente a nitrógeno
elemental; así se eliminan los compuestos de nitrógeno de las aguas donde
producirían problemas de eutrofización.[24,34] En un cuerpo de agua cerrado, por
ejemplo una laguna, el proceso de eutrofización, es decir puede terminar por
convertir al cuerpo de agua en tierra firme. Esto ocurre porque los nutrientes
que ingresan masivamente al sistema generan una gran biomasa,
generalmente efímera que al morir se acumulan sobre el fondo y no son
totalmente consumidos por organismos degradadores (especialmente
bacterias).[35]
Con respecto al amonio, las disoluciones de éste se emplean en usos
domésticos. A manera de ejemplo, eliminan la dureza temporal del agua y por
lo tanto son útiles en labores de lavado y limpieza con el ahorro consiguiente
de jabón.[25,32,34] Recientemente se ha ideado un método para descomponer el
amoniaco mediante un catalizador y producir una mezcla del 75 % de
hidrógeno y 25 % de nitrógeno, en volumen que pueda utilizarse en sopletes
oxhídricos para soldar metales raros y aceros especiales. Un tubo de amoniaco
líquido, proporciona así, más hidrógeno que el que pudiera comprimirse en el
mismo volumen. Para transporte y almacenaje resulta pues, una fuente
conveniente y compacta de hidrógeno.[34] El amoniaco líquido, es empleado en
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máquinas frigoríficas y en la fabricación de hielo, es decir, en la producción
industrial del frío cuando se comprime se licua y al expandirse se evapora y
absorbe el calor del medio, por lo que la temperatura disminuye.[3] Igualmente
se usan en la producción de explosivos y nailon, así como en la elaboración de
fertilizantes o abonos nitrogenados. El amoniaco, también se usa como
reductor sobre muchos óxidos cuando se hace pasar gas sobre ellos a altas
temperaturas.[32,34]
2.1.5 Aspectos generales de los fertilizantes
Definición: En general, los fertilizantes se refieren a productos que
aumentan la fertilidad de los suelos al proporcionar a las plantas las principales
sustancias o mezclas químicas naturales o sintéticas, utilizadas para
enriquecer el suelo y favorecer el crecimiento vegetal.[25,36]
Estado físico de los fertilizantes: El estado físico en que se presenta un
abono puede ser: sólido, líquido y gaseoso, este juega un papel importante en
las condiciones de utilización y la eficacia del abono ya que tanto la
homogeneidad de la distribución como su integración más o menos completa
en el suelo van a depender de dicha presentación.[36]
Los abonos sólidos son los de mayor uso y suelen presentarse en las
siguientes formas:
1) Abonos en polvo: Con grado de finura variable según el tipo de
fertilizante. Normalmente no son aconsejables, ya que su manejo resulta
molesto, entorpecen el funcionamiento de las máquinas y sufren pérdidas en la
manipulación. Sin embargo, esta forma puede ser apropiada cuando la
solubilidad en agua es escasa o nula y resulta idónea en los casos en los que
el abono se mezcla íntimamente con el suelo.[36]
2) Abonos granulados: Aquéllos en los que al menos el 90 % de las
partículas presentan un tamaño de (1-4) mm, esta presentación permite un
manejo más cómodo, un mejor funcionamiento de las abonadoras, una
dosificación más exacta y una distribución sobre el terreno más uniforme.[36]
3) Abonos cristalinos: Que facilitan la manipulación y distribución.[36]
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4) Abonos perlados: Se obtiene mediante el sistema de pulverización en
una torre de gran altura, transformándose en esferas de tamaño muy uniforme,
al solidificarse las gotas durante la caída.[36]
5) Abonos macrogranulados: Constituidos por grandes gránulos de (1-3)
cm de diámetro e incluso mayores, de liberación progresiva de los elementos
nutritivos.[36]
Dentro de los fertilizantes líquidos, los tipos más característicos son los
siguientes:
1) Suspensiones: Gracias a la utilización de arcillas dispersas en el agua
pueden mantenerse soluciones sobresaturadas de alguna sal (generalmente
cloruro potásico) para alcanzar concentraciones totales elevadas en forma
líquida. Para mantener las suspensiones se requiere una agitación
periódica.[36]
2) Soluciones con presión: Soluciones acuosas de nitrógeno en las que
participa como componente el amoníaco anhidro con concentración superior a
la que se mantiene en equilibrio con la presión atmosférica. Para su aplicación
se requieren equipos especiales que soporten la presión adecuada.[36]
3) Soluciones normales o claras sin presión: Soluciones acuosas que
contienen uno o varios elementos nutritivos disueltos en agua.[36]
Los abonos líquidos ofrecen las siguientes ventajas respecto a los
sólidos:
1) Su manejo es totalmente mecanizable.
2) Se alcanza un gran rendimiento en la aplicación.
3) Se consigue una gran uniformidad en la distribución sobre el
terreno.
Entre los abonos gaseosos únicamente se emplea el amoníaco anhidro,
que es un gas a la temperatura y presión normal. Para que pase ha estado
líquido y facilitar el almacenaje y el transporte se comprime y vuelve a
transformarse en gas cuando se inyecta en el suelo.[36]
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Propiedades químicas y físicas de los fertilizantes: Estás determinan
tanto su comportamiento en el suelo, como su manipulación y conservación;
entre las que se destacan:
1) Solubilidad: La solubilidad en agua o en determinados reactivos es
determinante sobre el contenido o riqueza de cada elemento nutritivo en un
fertilizante concreto.[36]
2) Reacción del fertilizante sobre el pH del suelo: Viene determinada por
el índice de acidez o basicidad del fertilizante, que se corresponde con la
cantidad de cal viva que es necesaria para equilibrar el incremento de acidez
del suelo (fertilizantes de reacción ácida) o producir un incremento de pH
equivalente (fertilizantes de reacción básica).[36]
3) Higroscopicidad: Capacidad de absorber agua de la atmósfera a partir
de un determinado grado de humedad de la misma. Esta absorción puede
provocar que una parte de las partículas se disuelvan con lo que se deshace la
estructura física del fertilizante. Generalmente, cuanto mayor es la solubilidad
del fertilizante en agua, mayor es su higroscopicidad.[36]
Los Abonos o fertilizantes pueden clasificarse en:
1) Fertilizantes orgánicos: Comprende aquellas sustancias derivadas de
productos vegetales o animales, que contienen cantidades variables de los
elementos nutritivos esenciales para las plantas, tales como: Estiércol vacuno,
Gallinazo, Estiércol de Chivo etc.[37]
2) Fertilizantes minerales o químicos: Son aquellos productos obtenidos
mediante procesos químicos, desarrollados a escala industrial, que tienen
cantidades mínimas de alguno de los elementos esenciales para las plantas.
En general son productos inorgánicos, si bien existen dentro de este grupo
algunos productos orgánicos obtenidos por síntesis (Urea). [37]
Los fertilizantes minerales o químicos, se dividen a su vez en fertilizantes
simples y fertilizantes compuestos, los primeros son aquellos que contienen
uno de los elementos mayores y los segundo son aquellos que contienen dos o
más de los elementos mayores. Entre los fertilizantes simples de uso común en
Venezuela se tiene la urea, sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de
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potasio, sulfato de potasio, roca fosfática, sulfato de potasio y magnesio, nitrato
de calcio, entre otros. Y entre los fertilizantes compuestos se destacan el
fosfato diamónico, nitrato de potasio, 12-24-12 CP, 15-15-15 SP,
12-12-17/2 SP, 14-14-14 (S) CP, 12-12-17/2 Zinc CP, etc. Estas fórmulas se
obtienen mediante dos procesos tales como mezcla física de fertilizantes
simples para producir fertilizantes compuestos, en donde se pueden separar
los componentes que integran la mezcla o combinarse mediante
procedimientos químicos especiales para producir fertilizantes compuestos
granulados. [37]
3) Fertilizantes portadores de micronutrientes: Los microelementos
requieren una especial atención y cuidado porque existen límites muy
estrechos entre el exceso y la deficiencia, ya que, solo se necesitan en
pequeñas cantidades. Si se aplican dosis excesivas puede tener efectos
perjudiciales par los cultivos. Se pueden preparar fertilizantes mixtos especiales
que junto con la fórmula de N, P y K contengan microelementos para aquellos
suelos y cultivos en que se sepa hay deficiencia. También se emplean en
aspersiones foliares y en tratamiento de las semillas. Por ejemplo se tiene el
sulfato ferroso, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato de magnesio, bórax,
molibdato sódico, etc. [37]
4) Otros: Nitrato cálcico y magnésico, nitrato de sodio, cianamida cálcica
nitrada, sulfonitrato de amonio o nitrosulfato amónico, sulfonitrato de magnesio
o nitrosulfato magnésico, abonado nitrogenado con magnesio,
crotonilidendiurea, isobutilidendiurea, urea formaldehído, dolomita, azufre
elemental, abono nitrogenado que contiene crotonoilidendiurea, abono
nitrogenado que contiene isobutilidendiurea, abono nitrogenado que contiene
urea formaldehído, sulfato amónico con inhibidor de la nitrificación
(diciandiamida), nitrosulfato amónico con inhibidor de la nitrificación
(diciandiamida), sulfato amónico-urea, etc.[36,37]
En la Tabla 1, se resumen algunas características de los fertilizantes
más utilizados en diversos sectores.
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Tabla 1. Características de los fertilizantes más usados
Fertilizante Riqueza % Reacción Solubilidad (g.l -1 a 20ºC)
Ácido fosfórico 75 % P2O5 - 52,0 Muy ácida Muy soluble Ácido nítrico 54 % N - 12,6 Muy ácida Muy soluble
Fosfato monoamónico
P2O5 - 61,0 N - 12
Ácida 380
Fosfato monopotásico
P2O5 - 53,0 K2O - 34,0
Básica 230
Nitrato amónico N - 33,5 Ácida 1970
Nitrato cálcico N - 15,5
CaO - 27,0 Básica 1260
Nitrato potásico K2O - 46,0 N - 13,0
Neutra 320
Sulfato amónico N - 21,0
SO3 - 60,0 Ácida 740
Sulfato magnésico SO3 - 32,5 MgO - 16,0
Ácida 360
Sulfato potásico K2O- 50,0 SO3 - 47,5
Ácida 120
Superfosfato simple P2O5 - 19,0 Ácida 20 Superfosfato triple P2O5 - 45,5 Ácida 40
Urea N- 45,0 Muy ácida 1060
Concentración de los fertilizantes: La riqueza de un abono suele
relacionarse con el contenido en elementos fertilizantes asimilables por las
plantas, para un determinado elemento, se expresa en tanto por ciento
fertilizantes de unidades.[36] En el caso de los fertilizantes simples, la riqueza
corresponde a la cantidad del único elemento nutritivo que contiene, expresada
en porcentaje. En los fertilizantes compuestos es necesario indicar la riqueza
de todos los elementos que entran a formar parte de su composición y en
particular de los tres elementos principales N, P y K. Para definir el fertilizante
compuesto basta indicar las tres cifras que corresponden a las riquezas de los
elementos precisamente en el orden N P K. Así un fertilizante 12-24-12
contiene 12 % de nitrógeno, 24 % de P2O5 y 12 % de K2O. Cuando este tiene,
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además otros elementos se debe indicar este en la fórmula, por ejemplo:
8-24-16-2 Mg-0,2 B, contiene además 2% de MgO y 0,2 % de Boro. En la
mayoría de los países del mundo, el contenido de cada uno de los elementos
que determinan la riqueza garantizada de cada producto, se expresa de la
siguiente forma:
- N, para todas las formas de
nitrógeno.
- K2O, para todas las formas de
potasio.
- P2O5, para todas las formas de
fósforo.
- CaO, para todas las formas de
calcio.
- MgO, para todas las formas de
magnesio.
- SO3, para todas las formas de
azufre.
- Cl, para todas las formas de cloro. - B, para todas las formas de boro.
2.2 Antecedentes
Debido a la importancia que tienen el nitrato y amonio en el desarrollo
del medio ambiente, sus determinaciones cuantitativas en una variedad de
matrices no es un tema reciente. Los métodos reportados en la literatura
pueden ser clasificados en dos grupos: métodos clásicos y métodos
instrumentales.
En relación a los métodos clásicos estas especies son determinadas
utilizando medidas volumétricas. En este sentido, el amonio se determina
mediante la transformación en amoniaco, utilizando una base fuerte y posterior
destilación. El amoniaco liberado se recoge y se valora utilizando el método de
Kjeldahl. También el nitrato se determina utilizando este método pero involucra
una etapa previa de reducción con una aleación de devarda (50 % de Cu, 45 %
de Al, 5% Zn) o la aleación de Arnd (60 % de Cu, 40 % de Mg), para la
conversión a ión amonio.
El método de Kjeldahl se ha utilizado desde hace más de 100 años para
la determinación de nitrógeno en una amplia gama de muestras de alimentos
tales como, bebidas, cereales, carnes y otros materiales biológicos para el
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cálculo de contenido de proteínas. También se utiliza para la determinación de
nitrógeno en aguas, suelos, fertilizantes y otras matrices.
El método se basa en:
1) La conversión de compuestos nitrogenados a bisulfato amónico por
adición de ácido sulfúrico concentrado en la digestión. Un ejemplo de los
cambios que ocurre es el siguiente:
2 CH3CH (NH2)-COOH + 14 H2SO4 → 2 NH4HSO4 + 16 H2O + 6 CO2 + 12 SO2
(alfa aminoácido)
2) La neutralización del ácido sulfúrico no combinado y del bisulfato
amónico y la alcalinización del medio para desalojar el amoniaco, con la adición
del hidróxido de sodio para la destilación:
H2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 H2O
NH4HSO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 H2O↑ + NH3↑
3) La destilación del amoniaco que al condensarse se combina con el
agua, formando hidróxido de amonio:
NH3 + H2O → NH4OH
4) La fijación del hidróxido de amonio por el ácido bórico, formando
borato de amonio:
2 NH4OH + H3BO3 → (NH4)2 HBO3 + 2 H2O
5) La titulación del borato de amonio con ácido clorhídrico en presencia
de un indicador con un intervalo de transición ácido, debido a la acidez que el
ión amonio presenta en el punto de equivalencia (por ejemplo 0,1 g de rojo de
metilo y 0,5 g de verde bromocresol, en 100 mL de alcohol etílico al 95 %). La
titulación termina cuando se observe un cambio de color de azul a ámbar:
(NH4)2 HBO3 + 2 HCl → 2 NH4Cl + H3BO3
Es un método oficial de análisis y descrito en múltiples normativas como
la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (siglas en inglés AOAC). La
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Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos US-EPA
(U.S. Environmental Protection Agency, EPA por sus siglas en inglés),
Organización Internacional para la Estandarización (International Organization
for Standardization, (siglas en inglés ISO), entre otras para la determinación de
nitrógeno en diversas matrices incluyendo fertilizantes.[17,38] Uno de los métodos
estándar utilizados en Venezuela para hacer la determinación del nitrógeno
nítrico y amoniacal en fertilizantes, esta descrito en la norma venezolana
COVENIN 1140-77.[39]
En cuanto a la determinación de nitrato y amonio utilizando métodos
instrumentales, la información encontrada en la literatura especializada, es muy
extensa y las diversas propuestas metodológicas se han aplicado para el
análisis en muestras de alimentos, agua, material biológico, suelos, entre otros.
Los métodos analíticos desarrollados para la determinación de estos analitos
juntos o por separado en una matriz determinada, involucran técnicas como
electroquímicas; amperometría, voltametría y potenciometría;[40−45]
espectroscópicos; ultravioleta-visible,[46,47] quimioluminiscencia y fluorescencia
molecular,[31,48−50] infrarroja[51,52] y técnicas acopladas como electroforesis
capilar con detección UV,[53] cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
con detección por fluorescencia, quimioluminiscencia[48] y cromatografía de
gases con detección por espectrometría de masa.[54]
Debido a la relativa inercia que tiene el nitrato, para su determinación
algunas de las propuestas metodológicas utilizan al ión nitrito o al óxido de
nitrógeno como intermediario. En este sentido, para la conversión del nitrato a
la forma de nitrito se han propuesto diversos agentes reductores, tales como
zinc,[55] cadmio amalgamado,[56] soluciones de hidracina en presencia de cobre
como catalizador,[57]cadmio coperizado,[58] fotoinduccción,[59] y para la
conversión a óxido de nitrógeno se han propuesto el uso de Ti (III), V (III),
Mo (VI) + Fe (II) y Cr (III).[12] En cuanto al amonio, el intermediario utilizado en
algunos trabajos incluye una reacción en medio alcalino entre el ión amonio y el
hipoclorito para la generación de una fase gaseosa compuesta principalmente
por dicloroamina que posteriormente es convertida a óxido de nitrógeno. [60]Otro
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Br. Eliana R Guillén C 22
intermediario es el amoníaco, que se forma a partir del ión amonio en
soluciones fuertemente alcalina.
De todas las técnicas mencionadas anteriormente, la mayoría de las
propuestas analíticas para determinar amonio y nitrato tienen su fundamento
en el uso de la espectroscopía de absorción molecular en el ultravioleta/visible
(EAM) y por lo general, se utiliza la reacción de Berthelot [15,21] y la reacción de
Griess [12,18−20] respectivamente.
En la reacción de Berthelot, el ión amonio se hace reaccionar con
hipoclorito y fenol o timol, en medio fuertemente alcalino y en algunos casos en
presencia de un catalizador, como nitroprusiato de sodio,[61] para formar el
indofenol o indotimol respectivamente que presentan un máximo de absorción
en la región del visible, entre (640 y 690) nm.[5,21,61]
La reacción de Griess se realiza en dos etapas (posterior a la reducción
del nitrato a la forma de nitrito) la primera, consiste en la diazotación de una
amina aromática primaria con el nitrito en medio ácido y la segunda
corresponde a una reacción de acoplamiento del diazocompuesto con un
compuesto fenólico o una amina aromática, para producir un compuesto
intensamente coloreado que tiene un máximo de absorción en la región del
visible. En el año 1961 Shinn V., propuso la utilización de la sulfanilamida
(SUL) como reactivo para la diazotación y el N-(1-naftil) etilenediamina (NED)
como reactivo de acoplamiento. Desde entonces, son muchos los métodos
desarrollados que utilizan esta reacción. De hecho, el método oficial para el
análisis de nitrito se fundamenta en su uso.[62] La cuantificación de las especies,
se lleva a cabo, midiendo inicialmente el contenido de nitrito en la muestra y
posterior a la reducción, se hace la determinación de nitrito total que
corresponde a la reducción de nitrato y del nitrito endógeno; y los niveles de
nitrato se determinan por diferencia de las dos señales.
Es importante mencionar que con el uso de (EAM) y la técnica
fluorescentes se han hecho desarrollos de métodos cinéticos catalíticos para la
determinación de nitratos vía reducción de nitrito, que ofrece una mejora en la
sensibilidad y por ende en los límites de detección necesarios cuando se
requieren determinaciones a niveles de trazas y ultratrazas.[19,63,64] En estas
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Br. Eliana R Guillén C 23
propuestas la etapa previa de reducción del nitrato, en la mayoría de los casos
es realizada utilizando una columna de cadmio-coperizado.[12,14,20,27,58] Las
condiciones de la reducción están ajustadas de manera que el nitrato sea
convertido a nitrito con una eficiencia elevada, sin que continúe el proceso de
reducción a otras especies.
En general, la etapa de reducción y la mezcla de los diferentes reactivos,
ha sido adaptada a las técnicas de análisis por inyección en flujo (Siglas en
inglés FIA), lo cual permite que el proceso de reducción y la formación de
productos se desarrollen en línea. Además, esta condición ha permitido la
determinación secuencial de nitrato y nitrito en aguas y alimentos.[65−68] De igual
manera, los métodos desarrollados para la determinación de amonio, tienen su
fundamento en el uso de la técnica (FIA) y en términos generales, con el uso
de esta técnica las diferentes propuestas han permitido solventar los problemas
clásicos encontrados con el uso de procedimientos manuales, que incluyen
tiempos de análisis muy elevados, procedimientos tediosos de realizar,
consumo importante de reactivos y muestras así como baja reproducibilidad.
A pesar que el nitrato y el amonio se presentan juntos en una variedad
de matrices, son pocos los trabajos encontrados en la literatura donde se
efectúe la determinación de ambos por espectrometría. En algunas propuestas
incluyen la determinación secuencial o simultánea de ambos analitos o de las
tres formas de nitrógeno inorgánico (NO3-, NO2
- y NH4+) y se fundamentan en el
uso de técnicas acopladas como (FIA) conjuntamente con (EAM).[61, 68] En la
Figura 2, se observa una representación esquemática de un sistema típico
(FIA-EAM).
Las metodologías propuestas incluyen una etapa de reducción y
oxidación del nitrato y amonio respectivamente, para su conversión a nitrito en
un sistema en línea.
El nitrito resultante es determinado mediante la formación del
azocompuesto que se origina a partir del uso de (SUL) y (NED), el cual es
detectado por (EAM). Para la reducción del ión nitrato, utilizan una columna de
cadmio coperizado mientras que el ión amonio es oxidado con hipoclorito de
sodio en presencia de bromuro de potasio y en medio fuertemente alcalino
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 24
(NaOH). La respuesta instrumental para las tres especies, se origina por la
inyección de un volumen de muestra en una configuración que permite que tres
fracciones de estas sean dirigidas a tres puntos de confluencia distintos antes
de pasar por el detector. Una primera fracción es dirigida directamente a un
serpentín de reacción (SR) donde se produce el azocompuesto, una segunda
fracción de muestra es dirigida hacia otro (SR) donde se mezcla con cloruro de
potasio y EDTA, posteriormente pasa a la columna reductora y finalmente se
forma el azocompuesto; la otra fracción de la muestra se lleva a un tercer (SR)
de reacción y se produce la oxidación del amonio. La señal que se obtiene son
tres picos separados en el tiempo, el primero corresponde a la cantidad de
nitrito, el segundo corresponde a la concentración de nitrito y nitrato y un último
pico corresponde a los niveles de nitrito y amonio en la muestra
respectivamente. La separación de los picos queda determinada por los
tiempos de residencia de las distintas fracciones de muestras en las
configuraciones propuestas.
Figura 2. Diagrama esquemático de un sistema utilizado para la determinación de las tres
formas de nitrógeno inorgánico
Otros métodos de análisis por (EAM) que se han desarrollado para
determinar nitrato y amonio, tienen su fundamento en la conversión de los
analitos que inicialmente están en solución en una especie gaseosa, las cuales
son arrastradas por un gas inerte hacia una celda de flujo alineada en el
camino óptico del espectrofotómetro. La generación de especies gaseosas y
detección por espectroscopía de absorción molecular (por sus siglas en inglés
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Br. Eliana R Guillén C 25
GPMAS) fue introducida por Syty y desarrollada por el laboratorio Crecer,[22]
para la determinación de aniones y cationes en solución. Los primeros trabajos
publicados para la determinación de amonio y nitrato por separado, utilizaron
un espectrofotómetro de absorción atómica. En estos trabajos, la fase gaseosa
generada es transportada a una celda ubicada en el espacio normalmente
ocupado por la llama del espectrofotómetro de absorción atómica. La señal de
absorbancia de los compuestos gaseosos se mide a la longitud de onda
seleccionada que generalmente corresponde al máximo de absorción de los
compuestos. Sin embargo, hoy día los desarrollos analíticos utilizan los
instrumentos de absorción molecular UV-Vis con sistemas de arreglos de
diodos o los espectrofotómetros convencionales conjuntamente con la técnica
(FIA), permitiendo que (GPMAS), sea más simple, confiable y rápida.
El acoplamiento (FIA-GPMAS), fue utilizado recientemente por algunos
autores[22] para la determinación de amonio en productos farmacéuticos y la
detección de amonio y nitrato en aguas fortalecidas con los analitos. En la
metodología propuesta, el amonio que inicialmente se encuentra presente en
una solución de la muestra y el producido a partir de la reducción del nitrato
mediante el uso de una columna de (Zn/Cu), reaccionan en un sistema en línea
con una solución que contiene hidróxido de sodio para formar amoniaco, el cual
finalmente es llevado a la celda de gases por un gas inerte y posteriormente se
mide la señal de absorbancia transitoria del amoniaco a una longitud de onda
de 194 nm. Para la cuantificación de las especies es necesario realizar dos
inyecciones de muestra. En una primera inyección, se determina el contenido
de amonio, mientras que en una segunda inyección, la muestra se dirige a un
sistema de reducción para la conversión de nitrato a amonio y posteriormente
reacciona con el hidróxido de sodio. La señal que se obtiene corresponde a la
contribución de nitrato y el amonio que inicialmente estaba en la muestra. El
contenido de nitrato se determina por diferencia de las dos señales obtenidas.
El amonio y nitrato también se han determinado utilizando la técnica FIA
con detección por quimioluminiscencia.[60,69−71] Aoki y colaboradores[60] proponen
la determinación sucesiva de las tres formas inorgánicas del nitrógeno,
tomando como base un desarrollo metodológico que en 1990[69] fue concebido
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para la determinación de nitrito en aguas. Estas propuestas consisten en la
reducción de nitrato y nitrito a óxido nítrico y este posteriormente es arrastrado
por una corriente de un gas al recipiente de reacción donde se combina con
ozono para producir una especie electrónicamente excitada que emite luz
cuando vuelve a su estado fundamental. Entre los sistemas reductores que se
han utilizado para la conversión del nitrito destacan iones ioduro en medio
ligeramente ácido y para el nitrato hierro (II) y molibdato (II) o titanio (III) en
condiciones fuertemente ácidas. Estas propuestas se diferencian en las
cantidades de ácidos que se utilizan, estrategias para la separación de las
fases involucrada (líquida-gas), incorporando en las configuraciones
propuestas membranas de poly tetrafluoretileno (PTFE) permeable al óxido de
nitrógeno (NO), diferentes gases de arrastre y diferentes condiciones de
acidez.
2.3 Hipótesis
Si se tiene en consideración las siguientes premisas:
1) La generación de especies gaseosas, constituye una herramienta muy
valiosa ya que el analito es separado de la matriz de la muestra antes
de la lectura de absorción, disminuyendo de manera importante posibles
interferencias químicas y espectrales.
2) El ión amonio puede ser convertido a amoniaco en medio fuertemente
básico.
3) Existen sustancias capaces de reducir al ión nitrato a amonio, como una
mezcla de Zn/Cu.
4) El amoniaco es una molécula que tiene una banda de absorción en la
región del ultravioleta cercano.
5) Los fertilizantes nitrogenados contienen altas concentraciones de nitrato
y amonio.
6) El nitrógeno es un gas que no absorbe en la región de absorción del
amoniaco.
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Por tanto, se podría poner a punto una metodología para la
determinación de nitrato y amonio, basada en el acoplamiento de la técnica
análisis por inyección en flujo, generación de una fase gaseosa (NH3) con la
espectroscopia de absorción molecular UV-Visible.
2.4 Plan de trabajo
Revisión bibliográfica sobre el tema.
Estudios preliminares:
- Adiestramiento en el uso y manejo de los equipos a utilizar.
- Estudio del comportamiento de absorción de los reactivos y el amoniaco.
Determinación de amonio:
Optimización de parámetros físicos y químicos asociados al sistema de
análisis por inyección en flujo para la determinación de amonio.
- Estudio de diversas configuraciones del sistema sobre la señal de
amoniaco.
- Efecto de la concentración de hidróxido de sodio sobre la respuesta
instrumental.
- Efecto de los caudales de la solución portadora y del hidróxido de sodio
sobre la señal analítica.
- Efecto de los diámetros y longitud de los serpentines (R1 y R2) en la señal
analítica.
- Efecto del flujo de nitrógeno sobre la señal analítica.
- Efecto del volumen de inyección sobre la señal analítica.
Caracterización analítica del sistema en la determinación de amonio.
Validación del método.
- Estudios de interferencia en la determinación de amonio.
- Estudios de recuperación en la determinación de amonio.
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Determinación de nitrato:
Optimización de parámetros físicos asociados al sistema de análisis por
inyección en flujo para la determinación de nitrato.
- Efecto del diámetro y longitud de la columna reductora sobre la señal
analítica.
Caracterización analítica del sistema en la determinación de nitrato.
Validación del método.
- Estudios de interferencias en la determinación de nitrato.
- Estudios de recuperación en la determinación de nitrato.
Análisis de las muestras reales de fertilizantes.
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CAPÍTULO III
MARCO METODOLÓGICO
3.1 Parte experimental
3.1.1 Instrumentación
Para la realización de este trabajo se utilizó la infraestructura disponible
en el Laboratorio de Espectroscopia Molecular. Una descripción general de la
instrumentación utilizada incluye:
Un espectrofotómetro de absorción molecular en el
ultravioleta / visible marca Perkin Elmer, modelo Lambda 20. Este instrumento
está equipado con dos fuentes de radiación (lámpara de hidrógeno y otra de
tungsteno); y un fotomultiplicador como dispositivo de detección.
Una celda para gases con geometría cilíndrica de 2 cm de diámetro y
10 cm de longitud, equipada con ventanas de cuarzo.
Una unidad de inyección marca Perkin Elmer, modelo FIAS 300 que
incorpora dos bombas peristáltica (P1 y P2) de ocho rodillos y cuatro canales
totalmente independientes, que utiliza tuberías de tygon para el transporte de
muestras y reactivos. Esta unidad incluye un automuestreador AS 91 con
capacidad para 150 muestras.
Un computador personal para el control del espectrofotómetro y la
unidad de inyección, a través de dos programas: Winlambda y PFIAS de
Perkin Elmer.
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3.1.2 Reactivos
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico, sus
características se reportan en la Tabla 2. Las soluciones utilizadas fueron
preparadas con agua de alta pureza de 18 Ω (ohms) cm-1 de resistividad,
suministrada por un sistema Milli-Q-TOC de Millipore.
Se prepararon por separado, soluciones patrón de amonio y nitrato de
(5,556 y 1,613) x 10-2 mol.L-1 a partir de cloruro de amonio y nitrato de sodio.
Los reactivos fueron previamente secados en una estufa durante dos horas a
una temperatura de 110 °C. Se pesaron 1,4921 g de NH4Cl y 0,6924 g de
NaNO3 los cuales fueron disueltos y llevados a un volumen final de 500 mL con
agua. Las soluciones estándar de trabajo se prepararon en balones de 100 mL
por dilución de un volumen apropiado de la solución patrón en agua destilada.
Se preparó una solución de sulfato de cobre 5 % (p/v) disolviendo
5,0029 g del reactivo en agua y llevado a un volumen final de 100 mL.
Se preparó una solución de ácido clorhídrico 5 mol.L-1, por dilución
adecuada del reactivo concentrado.
Se prepararon cinco soluciones de hidróxido de sodio con diferentes
concentraciones del reactivo (1.5, 3, 5, 10 y 13) mol.L-1.
Tabla 2. Características de los reactivos utilizados
Reactivo Pureza (% p/p) Casa comercial Hidróxido de sodio 99 Riedel-de Haën Cloruro de amonio 99,6 J.T. Baker
Nitrato de sodio 99 MERCK Sulfato de cobre 99,9 MERCK Ácido clorhídrico 37 Riedel-de Haën
Zinc granular Tamaño de las partículas
(0,8 a 2) mm 100 J.T. Baker
3.1.3 Preparación de la columna reductora
La columna de reducción de zinc “cuprificado” fue preparada siguiendo
un procedimiento descrito por Haghighi.[22]
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- Se corta un tubo de teflón de 17 cm de longitud por 2 mm de diámetro
interno.
- Se introducen partículas de zinc en el interior del tubo con tamaños menores
a 2 mm.
- Se tapan los extremos del tubo con fibra de vidrio.
- Se lava la columna rellena de zinc con agua por un minuto y posteriormente
con ácido clorhídrico 5 mol.L-1, luego se le hace pasar agua nuevamente por
dos minutos, utilizando un sistema de flujo continuo.
- Se hace pasar a través de la columna una solución de sulfato de cobre al
5 % (p/v), por un tiempo de un minuto o hasta que se observe la formación de
un precipitado de color negro. Aquí se da lugar a la formación de cobre
metálico tal y como se describe en la siguiente reacción:
ductorAgenteCuSOZnZnSOCu
VEZnCuZnCuVEeZnZnVECueCu
Re
1037,17518,023419,02
04
204
2
2002
20
02
+→+
−=°+→+
−=°+→
−=°→+
=+=+
++
−+
−+
Ec. (1)
- Finalmente se lava la columna con agua por dos minutos para remover el
exceso de cobre.
3.1.4 Activación de la columna
Se inyecta tres veces una solución de 4,03 x 10-3 mol NO3- L-1, luego se
limpia la columna con abundante agua y se hacen las inyecciones de las
soluciones de nitrato hasta obtener una señal reproducible.
3.1.5 Regeneración de la columna
La columna de reducción Zn/Cu fue regenerada lavando con abundante
agua y posteriormente con la solución de sulfato de cobre, como se indicó
anteriormente.
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3.1.6 Preparación de las muestras de fertilizantes
Las muestras de fertilizantes utilizadas en este trabajo fueron adquiridas
en expendidos de productos agrícolas de la ciudad de Mérida. Estas muestras
representan las diversas marcas de fertilizantes que se comercializan para la
producción del campo en la región Andina de Venezuela.
Con los valores de nitrógeno reportados en las etiquetas de los
productos, inicialmente se determinó el contenido de nitrato y amonio en cada
uno de los fertilizantes. Una vez que se calculan los porcentajes tanto de
amonio como de nitrato, se pesaron entre 0,10 y 0,25 gramos, para el caso del
amonio y entre 0,03 y 0,12 gramos, para el caso del nitrato aproximadamente,
para cada una de las muestras descritas en la Tabla 3, las muestra pesadas se
disolvieron en agua y se llevaron a un volumen final de 100 mL.
Todas las soluciones utilizadas fueron previamente desgasificadas
antes de ser introducidas en forma directa al sistema en flujo para su
correspondiente análisis.
Tabla 3. Muestras de fertilizantes nitrogenados sintéticos inorgánicos
Muestra Composición según el fabricante
1 13 % nitrógeno total
8 % nitrógeno amoniacal (NH4+- N)
5 % nitrógeno nítrico (NO3-- N)
2 33,5 % nitrógeno total
16,8 % nitrógeno amoniacal (NH4+- N)
16,7 % nitrógeno nítrico (NO3-- N)
3 26 % nitrógeno total
18,5 % nitrógeno amoniacal (NH4+- N)
7,5 % nitrógeno nítrico (NO3-- N)
4 13 % nitrógeno nítrico
Hecho en Israel (polvo)
5
13 % nitrógeno total 13 % nitrógeno nítrico (NO3
-- N) 46 % K2O
38 % K perlado
6 33,5 % nitrógeno total
16,8 % nitrógeno amoniacal (NH4+- N)
16,7 % nitrógeno nítrico (NO3-- N)
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3.2 Metodología propuesta
3.2.1 Procedimiento general
El sistema AIF-GFG-EAM-UV-Vis, propuesto en este trabajo involucra
varias etapas:
1) Establecimiento del background del sistema.
2) Introducción de la muestra.
3) Conversión del nitrato o amonio en amoniaco.
4) Transporte de la fase gaseosa a la celda para gases.
5) Registro de la señal analítica y procesamiento de datos.
La Figura 3, muestra el diagrama esquemático propuesto para la
realización de este trabajo. Consta de dos bombas peristálticas de cuatro
canales (P1 y P2) que propulsan los flujos correspondientes de la muestra (M)
y soluciones de hidróxido de sodio a diferentes concentraciones (C1 y C2) una
válvula de inyección (VI), una columna reductora (SR), dos serpentines de
reacción (R1 y R2), una entrada de nitrógeno con su respectivo regulador de
flujo, un separador de fases gas-líquido y una celda para gases alineada al
camino óptico del espectrofotómetro UV-Visible el cual funge como detector en
el sistema. El diseño incorpora una válvula manual selectora de canales (VS)
que permite la introducción de la muestra y reactivos por las rutas indicadas
como a o b en la Figura 3.
Al comienzo de cada sesión de trabajo se establece el background del
sistema colocando agua destilada por el canal de la muestra (M) y soluciones
de hidróxido de sodio por el canal (C1 y C2) a temperatura ambiente, como se
indica en la Figura 3, bajo las condiciones de trabajo que se especifican en la
Tabla 4. A continuación, se ponen en funcionamiento: Las bombas, el
espectrofotómetro, así como el sistema surtidor de nitrógeno. La bomba (P1)
permanece encendida durante todo el análisis, propulsando un flujo constante
de soluciones de hidróxido de sodio, mientras que la bomba (P2) se activa solo
para llenar el loop de la muestra. Bajo estas condiciones se introducen al
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sistema las diversas soluciones por las rutas a o b y se obtiene de esta manera
el background y el fiagrama correspondiente al blanco del sistema.
A continuación se coloca la muestra o soluciones estándar que
contienen amonio en el canal (M), se gira la válvula de inyección (VI) a la
posición de carga y a través de la válvula selectora (VS), se da paso a las
soluciones por la ruta a indicada en la Figura 3. En una primera instancia el
contenido de muestra en el loop se inserta en la corriente de (C1), el cual se
mezcla en línea con el hidróxido de sodio proveniente del canal (C2), en el
serpentín (R1). En este punto, se produce o tiene lugar la formación del
amoniaco a partir del cloruro de amonio, tal y como se describe en la siguiente
ecuación química:
NH4Cl (ac) + NaOH (ac) → NH3 (g) + NaCl (ac) + H2O (l) Ec. (2)
Posteriormente, en su camino hacia el detector, la mezcla gas-líquido es
transportada por una corriente de nitrógeno a un segundo serpentín (R2),
donde se produce la separación parcial de las dos fases y luego a un
separador gas-líquido para una separación definitiva. En esta etapa, la fase
líquida es conducida al drenaje y la fase gaseosa es transportada por el gas de
arrastre (N2) al interior de una celda para gases alineada al camino óptico del
espectrómetro UV-Visible y se obtiene la correspondiente señal analítica a una
longitud de onda de 197 nm.
La salida de la celda de gases se encuentra conectada a una trampa
que contiene una solución ácida con el fin de retener el amoniaco generado
mediante su conversión a ión amonio. Esta reacción puede ser descrita como:
NH3 (g) + HCl (ac) → NH4Cl (ac) Ec. (3)
A continuación, se cambia la válvula selectora (VS) para permitir el paso
de las muestras o estándares que contienen nitrato por la ruta b (Figura 3),
hacia una columna reductora (SR) que permite la conversión del nitrato a la
forma de amonio. En la columna se produce la reacción entre el nitrato y el
cobre depositado en la superficie de las partículas de zinc. Esta reacción puede
ser descrita como se muestra en la Ecuación 4.
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Posteriormente, el amonio procedente de la reducción del nitrato y el
amonio que originalmente se encuentra en la muestra, son mezclados como
fue descrito anteriormente con el hidróxido de sodio. La señal de absorbancia
del amoniaco que corresponde a la conversión del nitrato se determina por
diferencia de las dos señales obtenidas.
( )
24
032
20432
4104724
1087
+−+−
−+
−+−−
++→++
+→⋅
+→++
CuOHNHCuNOOHeCuCu
OHNHeNOOH
Ec. (4)
Antes de la introducción al sistema de una nueva muestra (estándar), se
recomienda realizar una etapa de limpieza. Para ello se lava varias veces el
loop de inyección con agua destilada por 30 segundos, mientras circula
hidróxido de sodio por los canales (C1 y C2). Posteriormente, se carga el loop
con agua y se hace una inyección al sistema. La verificación de la calidad del
blanco se puede realizar en cualquier momento, mediante la obtención del
fiagrama del blanco entre la medida de dos muestras o estándares, durante el
ciclo de limpieza.
El criterio de medida seleccionado en el presente trabajo para la señal
instrumental fue la lectura de absorbancia en el máximo de absorción de la
señal analítica a una longitud de onda de 197 nm.
Figura 3. Representación esquemática del sistema AIF-GFG-EAM-UV-Vis. M: muestra, C1: canal portador C2: canal de NaOH, P1 y P2: bombas peristáltica, VI: válvula de inyección, VS: válvula selectora, SR: sistema reductor, R1: serpentín de reacción, R2: serpentín de mezcla, RF: regulador de flujo, SF: separador de fases, CG: celda para gases, TG: trampa de gases.
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Tabla 4. Condiciones experimentales de operación del sistema AIF-GFG-EAM-UV-Vis
Parámetro Valor Seleccionado Concentración de hidróxido de
sodio (C1) 3 mol.L-1
Concentración de hidróxido de sodio (C2) 13 mol.L-1
Longitud del serpentín de reacción y de mezcla (R1 y R2) 40 cm
Diámetro interno del serpentín de reacción y de mezcla (R1 y R2) 0,5 mm
Revoluciones de la bomba (P1) 60 rpm Revoluciones de la bomba (P2) 120 rpm Flujo del hidróxido de sodio (C1) 1,4 mL.min-1
Flujo del hidróxido de sodio (C2) 0,8 mL.min-1
Flujo de muestra (M) 11,6 mL.min-1 Flujo de nitrógeno con una salida
en la bombona de 27 psi 56,7 mL.min-1
Loop de inyección 100 µL Longitud de la columna de Zn/Cu 17 cm
Longitud de onda 197 nm
3.3 Espectroscopía de Absorción Molecular en el Ultravioleta/Visible
La espectroscopía de absorción molecular en el ultravioleta y visible
involucra transiciones electrónicas desde el estado fundamental a un nivel
electrónico excitado, de los electrones externos o de valencia de una
molécula.[72]
La región del Ultravioleta abarca la región del espectro electromagnético
comprendida entre 10 y 350 nm. Sin embargo, desde el punto de vista
experimental es conveniente subdividirla en dos subregiones, a saber:
1) El Ultravioleta lejano o de vacío: Ocupa el intervalo comprendido entre
10 y 180 nm. Esta es una región muy difícil de trabajar desde el punto de vista
experimental, por la fuerte absorción que presentan muchos componentes
atmosféricos. Este hecho la descarta para su utilización en esta técnica
instrumental.[72]
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2) El ultravioleta convencional: Abarca el intervalo de longitudes de onda
comprendido entre los 180 y 350 nm. Desde el punto de vista practico, es la
región útil del ultravioleta.[72]
Por su parte, el visible corresponde a una región del espectro
electromagnético, en la cual el ojo humano es sensible, está confinado al
intervalo que va desde los 350 hasta los 780 nm. Sobre la base de lo expuesto,
la espectroscopía de absorción molecular en el ultravioleta visible se encuentra
en la zona espectral acotada entre 180 y los 780 nm.[72]
A temperatura ambiente, la mayoría de las moléculas se encuentran en
el estado electrónico fundamental y más aún, también lo están en el estado
vibracional basal. Bajo estas condiciones, la absorción de un cuanto de
energía, involucra la excitación de algún electrón externo desde E0 hasta algún
estado electrónico excitado (E1*, E2
*, etc.), en un proceso que se puede resumir
en la siguiente ecuación:
M0 + hυ1 M1* o M0 + hυ1 M2
* Ec.(5)
Dependiendo de la energía (υ) del fotón que proporcione la fuente de
excitación.
La molécula excitada M1* o M2
* es inestable, por lo que tiende a liberar el
exceso de energía con rapidez para retornar al estado fundamental. Este
proceso puede llevarse a cabo mediante diversos mecanismos, que son de
mucho interés para los fundamentos de la luminiscencia molecular. Sin
embargo, este paso no es relevante dentro del proceso de la absorción
molecular, razón por la cual no se entrará en detalle sobre la misma.[38,72,73]
La gran cantidad de estados vibracionales y rotacionales asociados a
cada estado electrónico es lo que justifica que las bandas de absorción
molecular sean muy ensanchadas tal y como se aprecia en la Figura 4.
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Estado Electrónico Excitado E*2υ=3
υ=2
υ=1
υ=0
υ=3
υ=1
υ=2
υ=0
υ=0
υ=1
υ=2
υ=3
E*1 Estado Electrónico Excitado
M0+h.υ2 M*2
Estado Electrónico Fundamental E0
ΔE0 2= h.υ2
ΔE0 1= h. υ1
M0+h.υ1 M*1
Figura 4. El proceso de la absorción molecular en el Ultravioleta-Visible
El primer punto que se plantea con real interés es establecer cuales son
los compuestos (orgánicos e inorgánicos) que presentan un comportamiento de
absorción.[72]
Todas las moléculas orgánicas absorben radiación ultravioleta y visible.
Sin embargo, desde el punto de vista práctico, solo algunas de ellas presentan
una absorción que se puede definir como “útil” en esta región.[72]
Las transiciones electrónicas de los electrones de valencia se resumen
en cuatro grandes grupos:
1) Transiciones σ σ* 2) Transiciones n σ* 3) Transiciones π π* 4) Transiciones n π*
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Los dos primeros grupos (σ σ* y n σ*) no presentan ninguna
utilidad ya que la energía involucrada en estas transiciones es grande
(λ < 200 nm) y los coeficientes de excitación molar suelen ser bajos.[38,72,73]
Desde el punto de vista analítico, tan solo los dos últimos tipos de
transiciones (π π* y n π*) tienen utilidad en la espectroscopía de
absorción molecular en el ultravioleta-visible.[38,72,73]
Existen diversos iones, compuestos y complejos inorgánicos que
muestran un interesante comportamiento de absorción.[72,73] Entre ellos se tiene:
1) Absorción por aniones inorgánicos. 2) Absorción por iones de los metales de transición. 3) Absorción por iones lantánidos y actínidos. 4) Absorción por transferencia de carga.
En cuanto a la absorción por aniones inorgánicos, se puede decir que
varios aniones inorgánicos presentan picos de absorción “naturales” en el
Ultravioleta, como consecuencia de transiciones del tipo n π*. A continuación
en la Tabla 5 se ilustran algunos ejemplos.
Tabla 5. Absorción por aniones inorgánicos
Anión Longitud de onda El nitrato (NO3
-) λ = 201 y 301 nm El nitrito (NO2
-) λ = 209,280 y 360 nm El carbonato (CO3
=) λ = 217 y 301 nm
La azida λ = 230 nm
La repuesta instrumental que se sigue en la Espectroscopía de
Absorción Molecular en el Ultravioleta-Visible es la Absorción (A), la cual se
rige por la ley de Beer-Lambert.[38,72,73]
A = Log P0 / P= Є (λ) * b * c Ec. (6)
En donde P0 y P representan la potencia de la radiación incidente y
transmitida respectivamente. Є (λ) es el coeficiente de extinción molar que
depende de la naturaleza de la especie absorbente de la primera transición
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electrónica involucrada de la longitud de onda. Los términos b y c corresponden
al paso óptico y a la concentración respectivamente.[72] Los componentes
básicos de un equipo de absorción molecular en el ultravioleta-visible son los
siguientes:
1) Fuente de Radiación 2) Selector de longitud de onda 3) Celda 4) Detector 5) Unidad de registro de la señal
La distribución de estos componentes se ilustra en el diagrama de
bloques que se presenta en la Figura 5.
P0 P
Figura 5. Diagrama de bloques de un instrumento básico para la Absorción Molecular en el
Ultravioleta-Visible
Fuente de radiación: Fuentes para la región espectral del Ultravioleta-Visible.
Selector de λ: Monocromador
Celdas: De plástico, vidrio y de cuarzo
Detector: Fotomultiplicador
Unidad de registro: Registrador, PC, etc.
La instrumentación comercial se divide a su vez en instrumentos de un
solo haz y equipos de doble haz.[38,72,73]
En cuanto a las aplicaciones de la espectroscopía de absorción
molecular se pueden agrupar en: Análisis Cualitativo y Análisis
Cuantitativo.[38,72,73]
En el análisis cualitativo, el espectro de absorción se caracteriza por
tener muy pocas bandas y ensanchadas, además de una estructura fina muy
Selector de λ Detector RCelda +
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Br. Eliana R Guillén C 41
pobre. Esto sugiere que la información que proporciona con fines de
identificación es bastante limitada. En ese sentido, son pocas las aplicaciones
de esta técnica instrumental dentro del análisis cualitativo.[72,73] A continuación
se indican algunas consideraciones al respecto:
1) Hay que tener cuidado con las zonas de transparencia y las bandas
de absorción del solvente.[72,73]
2) Los solventes (por su polaridad) pueden causar desplazamientos en
las bandas del cromóforo de interés (efecto batocrómico e hipsocrómico). Los
picos asociados a transiciones (n π*) se desplazan generalmente, hacia
longitudes de onda más cortas (un desplazamiento hacia el azul) a medida que
aumenta la polaridad del disolvente. Este efecto se conoce como efecto hipsocrómico. En los sistemas en que son posibles transiciones (π π*),
el estado excitado es más polar que el estado basal; como resultado de esto, la
transición (π π*), ocurrirá a mayores longitudes de onda en solventes
polares que en solventes no polares. Este desplazamiento hacia el rojo del
espectro visible, se conoce como efecto batocrómico.[72,73]
3) El espectro puede ser útil para la verificación de la presencia o
ausencia de grupos funcionales.[72,73]
4) Determinación de la presencia de impurezas en un solvente
particular.[72,73]
Siguiendo en este mismo orden de ideas, se puede decir, que en
contraste con lo planteado en líneas anteriores, son múltiples las aplicaciones
que presenta la espectroscopía de absorción molecular UV-Visible, en el
campo del análisis cuantitativo, dicho método ha recibido gran
aceptación,[39,72,73] debido entre otras, a las siguientes razones:
1) Amplio campo de aplicación: Como ya se ha mencionado, las técnicas
espectroscópicas UV-VIS., son ampliamente empleadas, ya que son muchas
las especies que son activas en el Visible, y muchas más las que con un
tratamiento adecuado son capaces de formar especies coloreadas. Lo mismo
puede decirse de la espectroscopía UV.[72,73]
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Br. Eliana R Guillén C 42
2) Selectividad adecuada: Aunque no es muy común si es posible tener
interferencias en UV-Visible. Cuando esto ocurre, es posible emplear los
métodos para análisis de multicomponentes. Otra alternativa es aislar el analito
de la interferencia, o separar la interferencia misma.[72,73]
3) Buena Exactitud y Precisión: En estas técnicas espectroscópicas, es
normal tener errores relativos del 1 al 3 %, por lo cual, se puede considerar que
se tendrán resultados analíticos con un mínimo de incertidumbre si se procede
en la forma correcta.[72,73]
4) Facilidad y Conveniencia: Aunque existen instrumentos altamente
sofisticados acoplados a computadoras y con sistemas ópticos y electrónicos
de alta precisión, es posible obtener resultados muy aceptables para análisis
de rutina con instrumentos o espectrofotómetros de los más sencillos en el
mercado, a un costo muy accesible.[72,73]
En algunos casos la espectroscopia UV puede ser fundamental para el
estudio de ciertos problemas específicos. Por ejemplo, en la industria de los
cosméticos, tintes, colorantes, pinturas y fertilizantes. El estudio de los grupos
auxocromos y de su influencia en el desplazamiento de ciertos compuestos
químicos hacia la región visible hacen de esta técnica una de las de mayor
interés en ésta área.[38,73]
Desde el punto de vista del estudio de estereoquímica y de grupos
funcionales en una molécula orgánica, la espectroscopía ultravioleta-visible
compite con otras técnicas, sin embargo, su aplicación en la cuantificación de
sustancias que absorben radiación ultravioleta-visible la hacen una técnica
insustituible.[38,73]
Existe un gran número de métodos, para determinar sustancias que no
tienen un número suficiente de grupos cromóforos para que la banda de
absorción esté dentro del espectro visible; por ejemplo, ácidos orgánicos,
alcoholes, fenoles, aldehídos, cetonas, etc. Muchos de este tipo de compuestos
muestran al menos una banda de absorción en el UV cercano y tomando como
dato su longitud de onda de máxima absorbancia, se pueden cuantificar en la
misma forma en que se determina compuestos en espectroscopía visible. Estas
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Br. Eliana R Guillén C 43
técnicas analíticas son de múltiples aplicaciones en bioquímica general y
bioquímica de alimentos, y esta es la razón de su importancia. En Química
Clínica también son muy utilizados los métodos de espectroscopía UV,
utilizando para ello equipos de análisis como los espectrofotómetros.[38,73]
3.4 Técnica de Análisis en Flujo y Generación de Fase Gaseosa en Línea
Los avances en química analítica actualmente se basan en tecnologías
complejas y en el uso de instrumentos sofisticados, cuyo precio de adquisición
y mantenimiento así como su difícil manejo las hacen inasequibles a una gran
parte de los científicos y de los laboratorios de control. Es por ello que se ha
tratado de desarrollar nuevas técnicas, surgiendo así el análisis por inyección
en flujo el cual constituye una reciente e importante innovación metodológica
en química analítica que se caracteriza por un fundamento simple, un utillaje
barato, un manejo sencillo y cómodo y una gran capacidad para lograr unos
resultados que son sorprendentes dadas sus características: rapidez, exactitud
y precisión. Su extremada versatilidad la distingue de la mayor parte de las
nuevas técnicas analíticas.[74]
Por una parte, puede adaptarse con sencillez a todo tipo de necesidades
sin cambios técnicamente complejos y por otra hay que resaltar lo fácil que es
para un investigador analítico intervenir directamente en su funcionamiento.
Lográndose una optimización del propio sistema técnico con el fin de controlar
las variables químicas. [38,72,73]
La denominación de esta nueva modalidad de métodos de análisis
continuo como “Análisis por Inyección en Flujo” fue propuesta en el primer
artículo publicado en 1975 por Ruzicka y Hansen. [75] La inclusión del termino
“inyección” en el nombre de la técnica responde más a un aspecto histórico que
actual,[74] ya que en los primeros sistemas de análisis por inyección en flujo
realizados en 1970 por Nagy, Free y Pungir, [76] describen el uso de una jeringa
hipodérmica para inyectar la muestra en un flujo de reactivo. El uso de válvulas
rotatorias que se ha dispuesto actualmente hace que se trate más de una
inserción que de inyección propiamente dicha. [74]
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Br. Eliana R Guillén C 44
Si se tiene en cuenta la definición de “análisis” expuesta recientemente
por Pardue como “conjunto de etapas que van desde la planificación de la
estrategia para abordar el problema analítico hasta el tratamiento e
interpretación de los resultados”,[74] no es del todo correcto la inclusión de este
vocablo en el nombre de la nueva metodología, ya que esta no abarca todas
las etapas que configuran un método analítico.
En general el análisis por inyección en flujo se puede definir como una
técnica analítica basada en la manipulación de microfluidos de muestras y
reactivos. En estos sistemas las muestras son introducidas a través de una
válvula de inyección y transportadas por los canales de flujo junto con los
reactivos hasta el detector. Los primeros sistemas de (FIA) se diseñaron
utilizando la espectroscopia de absorción molecular UV/VIS, como forma de
detección. Sin embargo, con el pasar del tiempo, su uso se expandió de forma
exponencial, incorporando prácticamente a todas las técnicas espectroscópicas
de detección (fluorescencia, quimioluminiscencia, infrarrojo, etc.) e incluso a
numerosas técnicas electroquímicas.[77]
Tal y como se ha indicado el (FIA) es una modalidad del análisis de flujo
continuo (CFA), esta última se refiere a métodos continuos segmentados y son
los clásicos descritos por vez primera, por Skeggs en 1957,[74] los cuales
corresponden aquellos procesos analíticos en los que la concentración del
analito es medida sin interrumpir un flujo de líquido o gas. En la Figura 6, se
observa un sistema primario de dicha técnica.
Figura 6. Esquema básico sobre el sistema de análisis en flujo continuo
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Br. Eliana R Guillén C 45
Las muestras se introducen de manera sucesiva y a intervalos regulares
de tiempo en un canal por el que fluye un líquido en el que se encuentra
disuelto el reactivo, o bien este es introducido posteriormente mediante canales
auxiliares que confluyen con el principal. Estas muestras son aspiradas
secuencialmente y entre ellas se sitúan burbujas de aire que (segmentan) el
flujo establecido, incluido un ciclo de lavado.[74]Dicho fluido pasa a través de
una cubeta de flujo que forma parte de un sistema de detección. Habitualmente
las burbujas de aire se eliminan antes de que lleguen al detector. El flujo de
salida se desprecia. La señal obtenida se recoge en un registrador y es de tipo
continuo. Cada muestra origina una señal transitoria en forma de curva, cuyas
características generalmente la altura máxima, se relacionan con el parámetro
determinado en cada muestra. La línea de base entre curvas corresponde al
tiempo en que no pasa ninguna muestra o de su producto de reacción por el
detector.[74]
La técnica (FIA) se trata en principio de un apartado de los métodos
automáticos de análisis, pero que presenta una diferencia importante en
relación con el conjunto de los mismos. Esta consiste en un diseño para el
análisis de muestras inyectadas manualmente que es la situación más
frecuente en (FIA). De ahí que sea normal hacer la distinción entre un método
(FIA) ordinario y un método automático (FIA). Esta concepción es una
característica importante de la nueva metodología que es inconcebible en los
métodos automáticos.[74]
Entre los rasgos esenciales del Análisis de Inyección en Flujo se
destacan los siguientes:
1) El flujo no esta segmentado por burbujas de aire, lo que constituye la
diferencia fundamental con los métodos clásicos de (CFA).[74]
2) La muestra líquida es inyectada o inserta directamente en el flujo en
lugar de ser aspirada en el mismo.[74]
3) Se realiza un transporte del trozo inyectado a través del sistema.
Puede también tener lugar un proceso físico-químico adicional al transporte
(reacción química, diálisis, extracción líquido-líquido etc.).[74]
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Br. Eliana R Guillén C 46
4) La dispersión o dilución parcial del analito en este transporte puede
ser perfectamente manipulada mediante un control de las características
geométricas e hidrodinámicas del sistema. Se produce una mezcla incompleta
pero reproducible, que da lugar a un gradiente de concentración variable con el
tiempo a lo largo del sistema.[74]
5) Un sistema de detección continua proporciona una señal transitoria,
que es convenientemente registrada.[74]
6) En el momento de la detección de la señal no se ha alcanzado el
equilibrio físico (que se supondría la homogenización de una porción de flujo) ni
el equilibrio químico (reacción completa). Por ello las técnicas (FIA) pueden
considerarse dentro de los métodos cinéticos de análisis y en su modalidad de
medida a tiempo fijo.[74]
7) El tiempo de operación debe ser muy reproducible pues las medidas
se realizan en condiciones de no estabilidad y por tanto pequeñas variaciones
del mismo pueden producir graves alteraciones de los resultados.[74]
En cuanto a los elementos esenciales de un montaje (FIA) teniendo en
cuenta una versión primaria del mismo como se observa en la Figura 7. Consta
de las siguientes partes:
Figura 7. Esquema básico del sistema de análisis de inyección en flujo (FIA)
1) Una unidad de propulsión, que establece un flujo de caudal lo más
constante posible de una disolución (o de varias) que lleva disuelto un reactivo
o hace de simple portador. Puede ser una bomba peristáltica, un sistema de
presión gaseosa, o bien la simple fuerza de la gravedad.[74]
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Br. Eliana R Guillén C 47
2) Un sistema de inyección, que permita insertar o introducir en el flujo
un volumen exactamente medido de la muestra con gran reproducibilidad de
operación y sin interrumpir el mismo.[74]
3) Una zona de tubo, que se llama comúnmente “reactor”, a veces
impropiamente y que es donde tiene lugar el transporte con o sin proceso
adicional. Puede ser un tubo recto, en forma de serpentín, relleno o no de
bolitas inertes, o bien tener una cámara de mezcla, un tubo relleno de material
inerte o activo químicamente (redox, cambio iónico, enzima inmovilizada,
etc.).[74]
4) Una celda de flujo incorporada a un instrumento de medida
(colorímetro, fotómetro, fluorímetro, potenciómetro, etc.), que traduce la señal
continúa a un registrador y un microprocesador. El flujo que sale del sistema se
desecha. A veces se pasa de nuevo por la bomba peristáltica para conseguir
mayor constancia en el caudal. Para que este esquema (FIA) observado en la
Figura 7, tenga categoría de automático, es preciso incorporar un sistema de
muestreo que consiste en un muestreador típico, un sistema de aspiración de
muestra (normalmente con el uso de la misma bomba peristáltica) y un sistema
de inyección controlado eléctricamente y que funcione coordinadamente con el
muestreador. Un microprocesador con una interfase activa permite con
facilidad programar esta operación.[74]
Una técnica muy selectiva que se ha utilizado bastante en análisis por
inyección en flujo es la difusión de gases desde una corriente portadora en la
que hay un analito gaseoso hasta una corriente aceptora que contiene un
reactivo que permite su determinación. Las separaciones tienen lugar en un
módulo especial. Sin embargo, en esta aplicación la membrana suele ser de un
material hidrofóbico microporoso, como Teflón o polipropileno.[78]
Es importante insistir que en los métodos (FIA) ningún tipo de
separación llega a ser completa, pero esto no tiene importancia, porque los
patrones y las muestras se tratan exactamente igual. Cómo ya se ha señalado
antes, en los instrumentos automáticos los intervalos de tiempo son tan
reproducibles que aunque se trabaje con separaciones incompletas, no hay
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 48
pérdida en la precisión y exactitud, como sucede en el caso de operaciones
manuales.[74]
La técnica de (FIA) provee un medio simple de automatizar una gran
cantidad de procedimientos analíticos por vía húmeda y algunas de sus
principales ventajas [78]reconocidas son:
1) Alta productividad de 60 a 200 muestras analizadas por hora.[79]
2) Bajo costo de operación y mantenimiento, el consumo de reactivos
químicos por muestra analizada esta en el orden de microgramos a uno o dos
miligramos (esto también representa baja contaminación ambiental). Así
mismo, el consumo de muestra es del orden de decenas a una centena de
microlitros.[79]
3) Una gran parte del mantenimiento del equipo (FIA) puede ser
realizado por el propio usuario.[79]
4) Es aplicable a las principales técnicas instrumentales de análisis
químico, tales como: Espectroscopía de absorción atómica, (ICP),
potenciometría, espectroscopia de absorción molecular, voltamperometría e
incluso (HPLC). En todos los casos la utilización de (FIA) incrementa la
productividad y reduce los costos de análisis de manera espectacular.[79]
5) La instrumentación necesaria puede ser ensamblada directamente a
partir de componentes relativamente poco costosos.[79]
En cuanto a los uso de (FIA), se puede decir que las técnicas de análisis
de inyección en flujo se han extendido ampliamente en el área de química
analítica en los últimos años. (FIA) permite realizar análisis rápidos, ya que la
muestra y el reactivo no deben ser mezclados homogéneamente y no se
necesita esperar mucho tiempo para que la reacción química ocurra, debido a
que la misma se desarrolla en sistemas en línea que permite hacer las
mediciones. (FIA) se puede utilizar para el análisis de un gran número de
muestras en un laboratorio de análisis; la eficacia y la eficiencia en el mismo,
puede ser aumentado mediante el uso de (FIA). Esto no es sólo porque los
análisis son automatizados, sino también porque la cantidad de reactivos
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 49
utilizados se verá considerablemente reducido en comparación con otras
técnicas.[80]
Los métodos fotométricos simples, están muy extendidos en el análisis
de agua y del medio ambiente, por lo tanto, no es sorprendente encontrar (FIA)
en los mismos, ya que esta técnica es utilizada ampliamente en este campo de
análisis, esta técnica (FIA) es acoplada en la práctica a detectores ópticos
como los espectrofotómetros UV/VIS o de Absorción Atómica, entre otros, para
la determinación de aniones y cationes y así desempeñar un papel importante.
Lo mismo se aplica a la industria agroquímica, donde grandes cantidades de
componentes inorgánicos deben ser analizados.[80]
Aunque hay una gran cantidad de publicaciones que describen el uso de
la (FIA) en análisis clínicos, en la práctica no es tan ampliamente utilizado. Esto
es sobre todo porque ya existe un uso generalizado del nivel de automatización
en este ámbito, aunque las técnicas son convenientes para (FIA).[80]
Un mayor uso de (FIA) se puede esperar en el análisis industrial en
general. Esta es usada para el análisis en el control de calidad y vigilancia en el
interior de las aguas residuales. Un uso importante de la técnica vendrá en la
vigilancia y el control de procesos. Las ventajas que se pueden ver aquí es que
ayuda al análisis de los datos disponibles de una manera rápida lo que significa
que puede hacer el análisis como un proceso, más o menos, se verifican los
datos de forma continua y se utilizará para controlar el proceso de inmediato.[80]
Para el análisis industrial, y de manera similar para el análisis de
productos farmacéuticos, existe un número cada vez mayor de los reglamentos
que significa una mayor necesidad de análisis continuo en el control de calidad
y control de procesos. Es por ello que en estas áreas, por sí solo, existe la
necesidad de una mayor automatización por lo que el uso de (FIA) es ideal.[80]
Análisis bioquímico y la biotecnología son otras áreas de crecimiento en
el uso de análisis por inyección en flujo. Debido a que esta área presenta una
alta tasa de crecimiento, una gran parte de análisis bioquímicos se realizan por
pruebas fotométricas simples. Estas pruebas son por lo general muy
adecuadas para la automatización de (FIA). Muchos de los compuestos, por
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 50
ejemplo, Fosfatos, nitratos y amonio, pueden ser fácilmente determinados
usando (FIA). Ya hay métodos preparados para el análisis bioquímico de las
moléculas más grandes. Como por ejemplo determinar la actividad enzimática
utilizando (FIA).Procesos de fermentación, incluso más que los procesos
químicos, requieren un complejo sistema de vigilancia para el control óptimo, a
menudo con muchos parámetros.
Los sistemas (FIA) son adecuados para optimizar el control de procesos
de fermentación con sus rápidos tiempos de respuesta y análisis de las tasas
altas. A menudo, en análisis bioquímicos, una matriz puede requerir una
considerable cantidad de muestras para analizar el sustrato que contiene. Sin
embargo utilizando técnicas (FIA) la preparación de la muestra puede ser
automatizada.[80]
Un problema importante en el análisis de los alimentos son muestras con
matrices complejas. Pero con la utilización de determinadas técnicas (FIA) (por
ejemplo, la difusión de gas, diálisis, etc.), estos problemas se pueden resolver
fácilmente.[80]
De manera muy general se puede decir que la técnica (FIA) es usada
con frecuencia en los últimos tiempos en diferentes áreas debido a las razones
antes expuestas, ya que con respecto a su aplicación, realmente no existen
límites. En principio, todos los procesos, todas las reacciones se pueden
desarrollar en línea: reacciones homogéneas, reacciones heterogéneas,
reacciones acido-base, de oxido-reducción, etc., procesos de extracción de
preconcentración, separación de fases, etc., la limitación esta en la imaginación
y en la disponibilidad de accesorios.[80]
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Br. Eliana R Guillén C 51
CAPÍTULO IV
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1 Estudios preliminares
Estudio del comportamiento de absorción de los reactivos y el amoniaco.
La formación de amoniaco a partir de soluciones de cloruro de amonio
puede llevarse a cabo en presencia hidróxido de sodio y a temperatura
ambiente, como fue descrito anteriormente a través de la Ecuación (1). En esta
reacción, es necesario utilizar una alta concentración de hidróxido de sodio
para garantizar la formación cuantitativa del amoniaco.
Con el objeto de conocer el comportamiento de absorción de los
reactivos involucrados, en la formación del amoniaco a partir de soluciones de
cloruro de amonio, las experiencias preliminares se llevaron a cabo utilizando
un sistema de flujo continuo (FC-GFG-EAM-UV-Vis) como el que se ilustra en
la Figura 8. Consiste básicamente en el ensamble descrito anteriormente
excepto que se elimina la válvula de inyección, la columna reductora y el canal
portador (C1). Las condiciones iniciales de operación de este sistema se
resumen en la Tabla 6 y las mismas fueron tomadas de la literatura.[22]
La obtención del espectro de absorción del amoniaco en un sistema
como el indicado en la Figura 8, implica el establecimiento del “background” del
sistema o señal de fondo (blanco). Para esto, se hace pasar agua por el canal
de la muestra (M) y una solución de hidróxido de sodio 13 mol.L-1 por el canal
(C2) previamente desgasificadas. A continuación, se ponen en funcionamiento
las bombas peristálticas (P1 y P2), el dispensador de nitrógeno y el
espectrofotómetro. En este sistema, ambas bombas permanecen encendidas
durante todo el análisis, propulsando un flujo constante de soluciones.
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 52
Seguidamente se da la orden instrumental para que el espectrofotómetro
realice una corrección de línea base con estas soluciones. Finalmente, se
reemplaza el agua por una solución de cloruro de amonio y se deja que esta
entre en contacto con el hidróxido de sodio en el serpentín (R1), donde se
produce la reacción para la formación del amoniaco. Posteriormente la mezcla
gas-líquida es dirigida mediante una corriente de nitrógeno a un segundo
serpentín (R2), el cual permite la separación parcial de la mezcla y de allí a un
separador de fases (SF), para que finalmente la fase gaseosa que contiene el
analito alcance la celda de gases. El tiempo requerido desde la introducción de
la muestra hasta emitir la orden instrumental para la adquisición del espectro,
fue estimado en unos 40 segundos.
Figura 8. Representación esquemática del sistema FC-GFG-EAM-UV-Vis. M: muestra, C2: canal de NaOH, P1 y P2: bombas peristáltica, R1: serpentín de reacción, R2: serpentín de mezcla, RF: regulador de flujo, SF: separador de fases, CG: celda para gases, TG: trampa de gases que contiene una solución de HCl.
Tabla 6. Condiciones experimentales de operación del sistema FC-GFG-EAM-UV-Vis
Parámetro Valor Seleccionado Concentración de amonio 1,389 x 10-2 mol.L-1
Concentración de hidróxido de sodio 13 mol.L-1 Velocidad de barrido 240 nm.min-1
Longitud del serpentín de reacción 40 cm Diámetro interno del serpentín de
reacción 0,5 mm
Revoluciones de la bomba (P1) 45 rpm Revoluciones de la bomba (P2) 60 rpm
Flujo del estándar de amonio (M) 1,1 mL.min-1
Flujo del hidróxido de sodio (C2) 0,8 mL.min-1
Flujo de Nitrógeno con una salida en la bombona de 27 psi 56,7 mL.min-1
Longitud de onda 197 nm
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Br. Eliana R Guillén C 53
La Figura 9 muestra el espectro de absorción del amoniaco obtenido a
partir de la reacción entre el cloruro de amonio y el hidróxido de sodio (a) y de
una solución de 13 mol.L-1 de hidróxido de sodio (b). El amoniaco presenta un
espectro de absorción en la región comprendida entre 190 y 225 nm
respectivamente, caracterizado por ocho bandas cuyos máximos se ubican en
194, 197, 201, 205, 208, 212, 216 y 221 nm respectivamente. Por su parte, el
hidróxido de sodio no genera absorción en esta región espectral con lo cual
muestra una absoluta transparencia en esta zona donde absorbe el analito.
Con el objeto de estudiar la reproducibilidad del sistema continuo en la
adquisición del espectro de absorción, se tomaron cinco espectros de una
misma solución que contenía 1,389 x 10-2 mol.L-1 de amonio. Los resultados
obtenidos mostraron que a una longitud de onda de 194 nm, la absorbancia
varía aún cuando los espectros fueron tomados bajo las mismas condiciones
experimentales. Los resultados obtenidos en estas experiencias y tomando en
cuenta que los niveles de amonio y nitrato son elevados en la matriz de
estudio, se seleccionó 197 nm como la longitud de onda analítica más
adecuada en términos de reproducibilidad y sensibilidad para ser utilizada en el
sistema AIF-GFG-EAM-UV-Vis.
190 195 200 205 210 215 220 225
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
nm
194 197
201
205
208
212
216221(b)
(a)
A
Figura 9. Espectro de absorción molecular del amoniaco (NH3) obtenido por flujo continuo utilizando una solución de 11,111 x 10-2 mol NH4
+ L-1
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Br. Eliana R Guillén C 54
4.2 Optimización del acoplamiento de sistema FIA-GFG-EAM-UV-Vis para la determinación de amonio
Inicialmente, se probaron diversas configuraciones que involucraban el
acoplamiento FIA-GFG-EAM-UV-Vis, con el objeto de obtener una señal
analítica, con tiempos de respuestas bajos, reproducible y con el menor
consumo de reactivo. En tal sentido, las mejores condiciones se obtuvieron con
el sistema propuesto en la Figura 3.
En esta sección de trabajo se optimizaron los diversos parámetros
experimentales del sistema FIA-GFG-EAM-UV-Vis, con el objeto de encontrar
las mejores condiciones de análisis para la determinación de nitrato y amonio.
En la configuración utilizada en este trabajo, el volumen de inyección de
muestra y la concentración de hidróxido de sodio son unos de los parámetros
instrumentales que se deben estudiar ya que influyen en la respuesta
instrumental. La generación de la especie gaseosa depende también de los
serpentines (R1 y R2). Es por ello la importancia de fijar los caudales de los
canales correspondientes al portador (C1) y al hidróxido de sodio (C2), así
como la longitud y diámetro interno de los serpentines.
Todos los parámetros fueron optimizados utilizando el método
univariado, es decir, variación de un parámetro a la vez. Sin embargo, tras
cada optimización se evaluó la validez de los parámetros previamente
seleccionados. Todas estas experiencias se llevaron a cabo utilizando una
solución de 1,389 x 10-2 mol NH4+ L-1 y utilizando la configuración propuesta en
la Figura 3 con la válvula selectora (VS) en una posición que permitiera el paso
del flujo de (C1) por la ruta a.
4.2.1 Efecto de la concentración de hidróxido de sodio sobre la respuesta
instrumental
Como se mencionó anteriormente la concentración de hidróxido de sodio
determina la cantidad de amoniaco que se forma en fase gaseosa, es por ello
que se realizó la variación de la concentración de este reactivo en los canales
(C1) y (C2) (Figura 3). Inicialmente se vario la concentración del reactivo que
fluye por el canal (C1) en un intervalo de concentración de 0 a 4 mol.L-1. Los
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Br. Eliana R Guillén C 55
resultados encontrados se presentan en la Figura 10a. En esta se observa que
la señal del amoniaco crece en forma importante con la concentración de
hidróxido de sodio hasta una concentración de 1,5 mol.L-1 a partir del cual no se
observa una variación apreciable de la señal en el resto del intervalo. La
ausencia de señal cuando la concentración de hidróxido de sodio es cero indica
que se requiere una etapa previa de contacto de la solución estándar o muestra
con el reactivo antes de llegar al serpentín (R1). Sobre la base de estos
resultados, se seleccionó la concentración de hidróxido de sodio 3 mol.L-1 por
encontrarse en la zona media donde se observa poca variación de la señal
analítica, se minimiza un consumo importante de reactivo si se compara con el
punto extremo de la gráfica y además este valor coincide con el reportado por
otros autores.[22]
Seguidamente, se evaluó el comportamiento de la señal analítica con la
concentración del mismo reactivo que fluye por el canal (C2) en el intervalo
comprendido entre 1,5 y 13 mol.L-1. A diferencia de los resultados anteriores en
la Figura 10b, se observa que a concentraciones por debajo 5 mol.L-1 el
instrumento no tiene la capacidad de detectar la producción de amoniaco. Sin
embargo, por encima de esta concentración la cantidad de amoniaco que se
genera es importante y crece continuamente en el resto del intervalo. Se
seleccionó una concentración de 13 mol.L-1 del reactivo para el resto del
trabajo, con el objeto de asegurar un exceso estequiométrico de hidróxido de
sodio para todas las muestras y soluciones del calibrado y además ganar
sensibilidad en la respuesta instrumental a fin de ampliar la aplicación del
método a otras matrices cuyos niveles de concentración del analito pudieran
estar muy por debajo de los valores reportados en los fertilizantes.
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Br. Eliana R Guillén C 56
Figura 10. a) Efecto de la concentración de hidróxido de sodio en el canal portador (C1), b)
Efecto de la concentración de hidróxido de sodio en el canal (C2) sobre la señal analítica de
una solución de 1,389 x 10-2 mol.L-1 de amonio
4.2.2 Efecto de los caudales de la solución portadora y del hidróxido de sodio
sobre la señal analítica
En la configuración del sistema propuesto, los caudales de las
soluciones de trabajo se controlan mediante la elección del tipo de tubería
(material del que esta hecho y su diámetro interno); así como por las
revoluciones por minutos con que trabajan las bombas. En este sentido, por
razones de disponibilidad, se utilizó tubería de tygon con diámetro interno de
0,762 mm y 0,504 mm para el canal (C1 y C2) respectivamente.
Adicionalmente, fue necesario el uso de una tercera bomba peristáltica para los
estudios de los caudales. El efecto de este parámetro en el canal (C1), sobre el
tiempo de análisis así como en la forma y altura del pico de absorción fue
estudiado en un intervalo entre 1,1 a 1,9 mL.min-1. La respuesta instrumental
observada de una solución de 1,389 x 10-2 mol.L-1 de amonio, con la variación
de este parámetro se muestra en la Figura 11a. En la misma se presenta dos
zonas. En la primera, la señal analítica muestra un ligero incremento con el
flujo hasta alcanzar un valor máximo, cuando el caudal es de 1,4 mL.min-1.
Finalmente, la señal disminuye para el resto del intervalo. Este último
comportamiento es lógico, ya que un aumento en el flujo disminuye el tiempo
de premezcla de la muestra y reactivo, antes de llegar al primer serpentín y
probablemente el tiempo de residencia en (R1); disminuyendo así la cantidad
de amoniaco que se forma. Por lo anterior, se seleccionó el flujo donde la señal
se hace máxima. Esto como un compromiso entre la sensibilidad y tiempo de
análisis.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 1 2 3 4 5[NaO H] mol L-1
A
00.2
0.40.6
0.81
0 1 2 3 4 50
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14[NaO H] mol L-1
A0
0.20.40.60.8
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 1314
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Br. Eliana R Guillén C 57
Posteriormente, se estudió el comportamiento de la señal analítica de
una solución de 1,389 x 10-2 mol.L-1 de amonio, variando el caudal de (C2)
entre 0,48 y 1,1 mL.min-1. El resultado de este estudio se presenta en la Figura
11b y el mismo muestra que no se observa una ganancia importante de
sensibilidad con el cambio de esta variable en el intervalo estudiado. Se
seleccionó el valor de 0,8 mL.min-1 estableciendo un compromiso entre el
consumo de reactivos y tiempos de análisis.
Figura 11. a) Efecto del flujo de hidróxido de sodio del canal portador (C1), b) Efecto del flujo de
hidróxido de sodio del canal (C2) sobre la señal analítica de una solución de
1,389 x 10-2 mol.L-1 de amonio
4.2.3 Efecto del diámetro y longitud de los serpentines (R1 y R2) sobre la señal
analítica
El tiempo de contacto entre el hidróxido de sodio y la muestra o
soluciones estándar, así como el tiempo para permitir la separación previa de la
mezcla gaseosa del seno de la solución antes de llegar al separador de fase,
están también determinados por el diámetro interno y longitud de los
serpentines (R1 y R2). Estos parámetros determinan la cantidad de amoniaco
que llega a la celda. En este sentido y sobre la base de resultados reportados
por algunos autores,[22] estos parámetros se fijaron en 40 cm de longitud por
0,5 mm de diámetro interno.
4.2.4 Efecto del flujo de nitrógeno sobre la señal analítica
La función principal del nitrógeno en la configuración propuesta es
transportar el amoniaco generado a la celda para gases y obtener una señal
reproducible con sensibilidad adecuada y en un tiempo relativamente corto.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
1 1.2 1.4 1.6 1.8 2Flujos del portador [NaO H] mL min-1
A
00.20.40.60.8
1
1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.4 0.6 0.8 1 1.2
Flujos de [NaO H] mL min-1
A
00.20.40.60.8
1
0.4 0.6 0.8 1 1.2
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 58
Con el objeto de estudiar el comportamiento de la señal de amoniaco
con la velocidad de entrada del gas nitrógeno, éste parámetro se varió entre
21,5 y 115 mL.min-1 fijando una presión de salida del cilindro en 27 psi. Los
resultados de este estudio se muestran en la Figura 12, donde se observa que
la señal comienza en un valor mínimo, se va incrementando hasta alcanzar un
valor máximo para un flujo de 55,6 mL de N2 min-1, y posteriormente disminuye
hasta llegar a un valor de cero cuando el flujo es de 115 mL N2 min-1. El
incremento de la señal en la primera etapa con el aumento del flujo podría estar
relacionado con un incremento en la velocidad de transporte del analito y la
dilución de éste por parte del nitrógeno no es importante en esta región. Sin
embargo, con un flujo por encima de 55,6 mL N2 min-1 el efecto es contrario, la
dilución del analito por el gas de arrastre es más importante que la velocidad de
transporte lo que conlleva a tener una menor cantidad de moléculas de
amoniaco en el camino óptico del espectrofotómetro. Sobre la base de esta
experiencia se seleccionó el flujo de nitrógeno donde la señal alcanza un valor
máximo.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
15 35 55 75 95 115Flujo de N2 mL min-1
A
00.20.40.60.8
1
0 20 40 60 80 100 120
Figura 12. Efecto del flujo de nitrógeno, sobre la señal analítica de una solución de 1,389x10-2 mol.L-1 de amonio
4.2.5 Efecto del volumen de inyección sobre la señal analítica
Para este estudio se utilizaron una serie de bucles “loops”
intercambiables en la unidad de inyección con volúmenes entre 74,5 a 500 µL.
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 59
El efecto de la respuesta instrumental con la variación de este parámetro se
presenta en la Figura 13. En ella se observa que la señal se incrementa
continuamente con el aumento de este parámetro. Para volúmenes por debajo
de 100 µL no es posible observar la generación de la especie de interés. Se
seleccionó un volumen de inyección de 100 µL para el resto del trabajo ya que
con este valor la sensibilidad que se obtiene es adecuada y además se
requiere el uso de pequeñas cantidades de muestras en la determinación de
nitrato a fin de prolongar el tiempo de vida media de la columna reductora.
00.05
0.10.15
0.20.25
0.30.35
0.40.45
0.50.55
0 100 200 300 400 500 600
Volumen de inyección µL
A
00.40.81.21.6
2
0 100 200 300 400 500 600
Figura 13. Efecto del volumen de inyección, sobre la señal analítica de una solución de
1,389 x 10-2 mol.L-1 de amonio
4.3 Caracterización analítica del sistema FIA-GFG-EAM-UV-Vis para la determinación de amonio
Bajo las condiciones experimentales indicadas en la Tabla 4, la señal
analítica obtenida por el método propuesto mostró una relación lineal con la
concentración de amonio hasta 4,167 x 10-2 mol.L-1. En la Tabla 7, se resumen
las características analíticas obtenidas para la curva de calibración del
amoniaco a partir de soluciones de amonio. El límite de detección y
cuantificación fue definido como tres y diez veces la desviación estándar
(3 σ y 10 σ) de la señal del blanco, respectivamente. La precisión del sistema
expresada mediante la desviación estándar relativa, se obtuvo a partir de cinco
medidas independientes de una solución estándar de 1,389 x 10-2 mol.L-1 del
analito y una solución de la muestra con un contenido igual del mismo. La
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 60
frecuencia de análisis fue estimada en 10 muestras por hora, considerando un
análisis por triplicado de cada una.
Tabla 7. Caracterización analítica del sistema AIF-GFG-EAM-UV-Vis para el ión amonio
Parámetros analíticos Valor Ecuación de la recta A= 0,0190 [NH4
+]a - 0,0061 Coeficiente de correlación (r2) 0,9995
Intervalo lineal (0- 41.67) x 10-3 Intervalo dinámico (mol.L-1) (0,56 - 27,78) x 10-3
Limite de detección (mol.L-1)b 0,008 Limite de cuantificación
(mol.L-1)c 0,027
Desviación estándar relativa (%)d 0,58
a [amonio] indica la concentración de amonio en mol.L-1. b Definido como la concentración de amonio cuya señal corresponde a tres veces la desviación estándar del blanco. c Definido como la concentración de amonio cuya señal corresponde a diez veces la desviación estándar del blanco. d Obtenido de diez réplicas de una solución de 1,389x10-2 mol [NH4
+] L-1.
4.4 Estudios de efectos de matriz para el ión amonio
Con el objetivo de establecer la presencia o ausencia de interferencias
por parte de la matriz, se realizó un estudio de adición estándar en las que se
mantuvo el volumen de muestra y el volumen final constante, mientras se
adicionaron volúmenes variables de un estándar de amonio. Para ello se
prepararon una serie de soluciones a las que se les añadieron 10 mL de una
solución de muestra de fertilizante (se tomaron de manera aleatoria 5 muestras
de fertilizantes y se preparó una solución de cada una con una concentración
aproximada de 5 x 10-2 mol.L-1 y posteriormente se mezclaron. La mezcla
resultante se utilizó para tomar los 10 mL de muestra) y se adicionaron
volúmenes con cantidades conocidas y diferentes de una solución estándar de
5,556 x 10-2 mol NH4+ L-1.
En la Figura 14, se presentan de manera comparativa las curvas de
regresión lineal que se obtuvieron para la adición estándar y la de calibración
normal con estándares de amonio en medio acuoso. Al comparar las
pendientes obtenidas mediante los dos métodos utilizando una prueba t al
95 % de confianza (p = 0,005 y n-2 grados de libertad) los resultados
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Br. Eliana R Guillén C 61
encontrados indican que no existen diferencias significativas entre las mismas,
y por ende se denota la ausencia de interferencias de tipo químico y físico.
Estos resultados establecen que la determinación de amonio en las diferentes
muestras de fertilizantes puede realizarse por interpolación de la señal obtenida
de una solución de muestra en una curva de calibración construida a partir de
soluciones estándar del analito en medio acuoso.
-0.1
00.1
0.2
0.3
0.40.5
0.6
0.7
-10 -5 0 5 10 15 20 25 30
mol [NH4+] L-1
A
(10-3)
Figura 14. Estudios de adición de estándar para el ión amonio
Curva de Calibración A= 0,0190 [amonio]* - 0,0061 Curva de Adición Estándar A = 0,0192 [amonio]* + 0,1017
* mol [NH4+] L-1
4.5 Estudios de recuperación para el ión amonio
Para establecer la exactitud del procedimiento propuesto se realizaron
diversos estudios de recuperación. Para esta experiencia se utilizaron dos
muestras de fertilizantes (M2 y M6) tomadas al azar y se preparó una solución
de cada una de ellas; con una concentración de aproximadamente de
5,556 x 10-2 mol.L-1. Seguidamente se tomaron 10 mL de estas soluciones y se
colocaron en balones aforados de 100 mL, a los cuales se le adicionaron
volúmenes variables de una solución de concentración conocida de amonio
para obtener una concentración del analito añadido entre (5,56 y 27,78) x 10-3
mol.L-1. Los resultados obtenidos con esta experiencia se presentan en la
Tabla 8. En la última columna se observa que los porcentajes de recuperación
oscilan entre 98 - 103 % respectivamente. Estos resultados indican con
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Br. Eliana R Guillén C 62
claridad que no existen pérdidas del analito durante la preparación y análisis de
las muestras.
Tabla 8. Estudio de recuperación para el ión amonio
Muestra [Amonio] (añadido) (mol.L-1)
10-3
[Amonio] (recuperado)
(mol.L-1) 10-3
[Amonio] (recuperado) -
[Amonio] (Inicial) (mol.L-1)
10-3
Recuperación(%)
2 0 5,39 ----- ----- 5,56 11,06 5,67 102 13,89 18,96 13,57 98 27,78 31,11 27,22 100
6 0 5,56 ----- ----- 5,56 11,21 5,66 102 13,89 19,62 14,06 101 27,78 34,03 28,47 103
4.6 Determinación de nitrato
Todos los parámetros que se optimizaron en la determinación de amonio
fueron utilizados para poner a punto la metodología en la determinación de
nitrato. Para este fin, en la configuración propuesta se activa la válvula
selectora para permitir el paso de la solución portadora y muestra por la ruta b
indicada en la Figura 3.
4.6.1 Efecto de la longitud de la columna reductora sobre la señal analítica
El parámetro a optimizar en la configuración propuesta es la longitud de
la columna reductora y por ende la cantidad de agente reductor. Para esta
experiencia se utilizó una solución de 4,03 x 10-3 mol.L-1 de nitrato y se varió la
longitud de una tubería de teflón entre 7,5 a 17 cm respectivamente con un
diámetro interno de 2 mm.
En la Figura 15, se muestran los resultados obtenidos de esta
experiencia. En la misma se observa como la señal analítica se incrementa con
la longitud de la tubería (que implica mayor cantidad de agente reductor). Para
una longitud de 17 cm, se observó que la señal analítica del nitrato es la misma
que se obtiene cuando se introduce al sistema una solución de amonio con
igual concentración. Esto significa que la reducción del nitrato a la forma de
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Br. Eliana R Guillén C 63
amonio es 100 % cuantitativa. Sobre la base de esta experiencia se seleccionó
una longitud de 17 cm para la determinación de nitrato.
Es importante resaltar que el tiempo de vida útil de la columna reductora,
depende de la cantidad de materia oxidante que pasa a través de esta. En este
trabajo, la columna reductora comienza a evidenciar una pérdida de eficiencia
tras la inyección de aproximadamente 200 muestras. El deterioro se manifiesta
por una disminución en la señal analítica, así como por una pérdida en la
reproducibilidad de un 10 % de la medida.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
7 9 11 13 15 17 19
Longitud de la columna reductora [Zn/Cu] cm
A0
0,20,40,60,8
1
6 8 10 12 14 16 18 20
Figura 15. Efecto de la longitud de la columna reductora, sobre la señal analítica de una
solución de 4,03 x 10-3 mol NO3- L-1
4.7 Caracterización analítica para la determinación de nitrato
Bajo las condiciones experimentales indicadas en la Tabla 4, la señal
analítica obtenida por el método propuesto, mostró una relación lineal con la
concentración de nitrato hasta 1,613 x 10-2 mol.L-1. En la Tabla 9, se resumen
las características analíticas obtenidas para la curva de calibración del
amoniaco a partir de soluciones de nitrato, luego de pasarlas por la columna
reductora de Zn/Cu. El límite de detección y cuantificación fue definido como
tres y diez veces la desviación estándar (3 σ y 10 σ) de la señal del blanco,
respectivamente. La precisión del sistema, expresada mediante la desviación
estándar relativa, se obtuvo a partir de cinco medidas independientes de una
solución estándar de 4,03 x 10-3 mol NO3- L-1 y una solución de la muestra. La
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 64
frecuencia de análisis fue estimada en 10 muestras por hora, considerando un
análisis por triplicado de cada muestra.
Es importante destacar que el intervalo lineal del nitrato es
aproximadamente la mitad del correspondiente al amonio. La razón de esto se
debe a que por encima de 1,613 x 10-2 mol.L-1 de nitrato, la cantidad de Zn/Cu
que se encuentra en la columna de 17 cm, se hace insuficiente para hacer la
conversión del ión nitrato al amonio en un 100 %. Por lo tanto, para lograr una
conversión cuantitativa por encima de esta concentración habría que aumentar
la longitud de la columna con lo cual se crea un problema de sobrepresión en el
sistema, dificultando las determinaciones del analito en estudio.
Tabla 9. Caracterización analítica del sistema AIF-GFG-EAM-UV-Vis para el ión nitrato
Parámetros analíticos Valor Ecuación de la recta A= 0,0191 [NO3
-]a - 0,0021 Coeficiente de correlación (r2) 0,9998
Intervalo lineal (mol.L-1) (0 - 16,13) x 10-3
Intervalo dinámico (mol.L-1) (0,32 - 16,13) x 10-3 Limite de detección (mol.L-1)b 0,012
Limite de cuantificación (mol.L-1)c 0,041
Desviación estándar relativa (%)d 0,76
a [nitrato] indica la concentración de nitrato en mol.L-1. b Definido como la concentración de nitrato cuya señal corresponde a tres veces la desviación estándar del blanco. c Definido como la concentración de nitrato cuya señal corresponde a diez veces la desviación estándar del blanco. d Obtenido de diez réplicas de una solución de 4,03 x 10-3 mol [NO3
-] L-1.
4.8 Estudios de efectos de matriz en la determinación de nitrato
Al igual que en el caso del amonio se realizaron estudios de interferencia
para conocer la influencia de los componentes de la matriz en la formación del
amoniaco a partir del nitrato. Los estudios de interferencia que se han
reportado en la literatura para la determinación de nitrato utilizando columnas
de Zn/Cu, indican que algunas especies iónicas como S2-, Ca2+, Cd2+, entre
otros[22] disminuyen la eficiencia de ésta, obligando a una regeneración de la
misma en períodos de tiempo más cortos.
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 65
En este sentido, se realizó una curva de adición estándar en la
modalidad clásica de volumen de muestra y el volumen final constante,
mientras se adicionaron volúmenes variables de un estándar de nitrato. Para
ello se prepararon una serie de soluciones a las que se les añadieron 5 mL de
una solución de muestra de fertilizante, tal y como se hizo con el ión amonio
(se tomaron de manera aleatoria 5 muestras de fertilizantes y se preparó una
solución de 1,613 x 10-2 mol.L-1 de cada una de ellas y posteriormente se
mezclaron. La mezcla resultante se utilizó para tomar los 5 mL de muestra) y
se adicionaron volúmenes con cantidades conocidas y diferentes de una
solución estándar de 1,613 x 10-2 mol NO3- L-1.
En la Figura 16, se presentan de manera comparativa las curvas de
regresión lineal que se obtuvieron para la adición estándar y la de calibración
normal con estándares de nitrato en medio acuoso. Al comparar las pendientes
obtenidas mediante los dos métodos utilizando una prueba t al 95 % de
confianza (p = 0,005 y n-2 grados de libertad) los resultados encontrados
indican que no existen diferencias significativas entre las mismas, y por ende
se denota la ausencia de interferencias de tipo químico y físico en la
determinación de nitrato. Por lo tanto, la cuantificación de esta especie en las
diferentes muestras de fertilizantes puede realizarse por interpolación de la
señal obtenida de una solución de muestra en una curva de calibración
construida a partir de soluciones estándar del analito en medio acuoso.
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
mol [NO3-] L-1
A
(10-3)
Figura 16. Estudios de adición de estándar para el ión nitrato
Curva de Calibración A= 0,0191 [nitrato]* - 0,0021 Curva de Adición Estándar A= 0,019 [nitrato]* + 0,0109
* mol [NO3-] L-1
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4.9 Estudios de recuperación para el ión nitrato
Para establecer inicialmente la exactitud del procedimiento propuesto en
la determinación del ión nitrato, se realizaron diversos estudios de
recuperación. Para esta experiencia, se utilizaron dos muestras de fertilizantes
tomadas al azar (M5 y M6), y se preparó una solución de cada una de ellas;
con una concentración de aproximadamente 1,613 x 10-2 mol.L-1.
Seguidamente se tomaron 10 mL de la solución correspondiente a (M5) y 5 mL
de la solución de (M6), dichas soluciones se colocaron en aforados de 100 mL,
a los cuales se le adicionaron volúmenes variables de una solución de
concentración conocida de nitrato para obtener una concentración del analito
añadido entre (0,81 y 8,06) x 10-3 mol.L-1. Los resultados obtenidos se resumen
en la Tabla 10 y en ellos se puede observar que en todos los casos el
porcentaje de recuperación fue cuantitativo 100 - 101 %. Estos resultados
indican con claridad que no existen pérdidas de los analitos durante la
preparación de las muestras y análisis de las mismas.
Tabla 10. Estudio de recuperación para el ión nitrato
Muestra [Nitrato]
(añadido) (mol.L-1)
10-3
[Nitrato] (recuperado)
(mol.L-1) 10-3
[Nitrato] (recuperado) -
[Nitrato](Inicial) (mol.L-1)
10-3
Recuperación(%)
5 0 0,81 ----- ----- 1,61 2,44 1,63 100 4,03 4,88 4,07 101 8,06 8,97 8,16 101
6 0 1,62 ----- ----- 0,81 2,44 0,82 101 1,61 3,25 1,63 101 4,03 5,65 4,03 100
5. Análisis de muestras reales
Se analizaron por el método propuesto seis muestras comerciales de
fertilizantes. Los resultados obtenidos para la determinación simultánea de
amonio y nitrato se resumen en la Tabla 11. El contenido de amonio y nitrato
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 67
osciló entre 9,88 ± 0,06 y 22,87 ± 0,07 % (p/p), y entre 22,02 ± 0,04 y
72,28 ± 0,04 % (p/p) respectivamente. En la Tabla 11 se puede observar que
los valores encontrados para la concentración de amonio y nitrato están en el
orden de magnitud del valor reportado en la etiqueta de los productos
comerciales. En este punto es importante destacar que en la etiqueta de los
productos se reporta es el porcentaje de nitrógeno total contenido en los
mismos tal y como se muestra en la Tabla 3, por lo que es necesario realizar
cálculos estequiométricos para obtener el porcentaje de nitrato y amonio que
contienen las muestras de fertilizante en estudio y los mismos se presentan en
la Tabla 11. Destacándose que en dichas etiquetas no se da ninguna
información relativa al método utilizado para el control de calidad de los mismos
ni la condición de la muestra en el momento de análisis. Por otra parte, la
exactitud del método propuesto fue evaluada inicialmente de forma satisfactoria
con base a los estudios de recuperación. La concordancia entre los resultados
obtenidos por vía de la curva de calibrado y la calibración por adición de
estándar representan una segunda evidencia de la validez del procedimiento
utilizado.
Tabla 11. Contenido de amonio y nitrato en fertilizantes.
MUESTRA
[NH4+]
Encontrado por este
método (a)
% (p/p)
[NH4+]
Reportado en la
etiqueta (b)
% (p/p)
[NO3-]
Encontrado por este
método (a)
% (p/p)
[NO3-]
Reportado en la
etiqueta (b)
% (p/p) M1 9,88 ± 0,06 10,29 22,02 ± 0,04 22,14 M2 20,74 ± 0,06 21,60 71,89 ± 0,05 73,96 M3 22,87 ± 0,07 23,79 33,74 ± 0,06 33,21 M4 ----- ----- 55,31± 0,05 57,57 M5 ----- ----- 56,79 ± 0,05 57,57 M6 21,58 ± 0,07 21,60 72,28 ± 0,04 73,96
(a) Media ± desviación estándar de tres determinaciones independientes obtenidas mediante el procedimiento propuesto. (b) Valor declarado en la etiqueta del producto.
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Br. Eliana R Guillén C 68
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
En el presente trabajo se desarrolló una metodología para la
determinación de nitrato y amonio en fertilizantes nitrogenados de origen
inorgánico. La metodología propuesta utiliza un sistema acoplado de análisis
por inyección en flujo con determinación espectrofotométrica y tiene por base la
reacción entre el cloruro de amonio con el hidróxido de sodio para generar el
amoniaco gaseoso. El método consiste en la inyección en dos etapas de
volúmenes de muestra en un sistema de flujo. En la primera se determina
amonio y en la segunda nitrato. Para este último el método incorpora en el
sistema una columna rellena con Zn/Cu.
Se encontró que con una columna de 17 cm de longitud y 2 mm de
diámetro interno rellena de Zn/Cu es posible la reducción en un cien por ciento
de los iones nitrato a amonio de una forma altamente reproducible y con una
eficiencia adecuada a través de un sistema en línea.
Los estudios realizados denotan marcadores analíticos de calidad
objetivos en términos de sensibilidad, precisión y exactitud, que compiten de
forma abierta con otras propuestas descritas en la literatura.
En relación a la robustez del método, es evidente que los parámetros
críticos del sistema son los caudales de la solución portadora y del hidróxido de
sodio 13 mol.L-1. Por tal motivo, es importante mantener un control estricto
sobre los flujos de las soluciones y el estado físico de las tuberías de tygon.
En cuanto a la columna reductora, se evaluó el tiempo de vida media de
esta mediante un control en el número de inyecciones de muestras y
estándares de nitrato y luego de 200 inyecciones se observó cambios
significativos de la respuesta instrumental. Por cuanto se estableció como
protocolo de trabajo la regeneración de la misma luego de estas inyecciones.
Las mayores ventajas del método propuesto se relacionan a la
frecuencia de análisis que es favorable frente a otros métodos
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Br. Eliana R Guillén C 69
espectrofotométricos y a la selectividad que implica la separación del analito de
la matriz mediante la generación de una fase gaseosa, la cual elimina en una
proporción importante la presencia de potenciales interferentes.
En cuanto a los resultados obtenidos en el análisis de las muestras
reales de fertilizantes, se puede decir que los valores encontrados para la
concentración de amonio y nitrato están en el orden de magnitud del valor
reportado en la etiqueta de los productos comerciales. Al comparar los
resultados experimentales con los teóricos, se observa que los valores de
concentración obtenidos experimentalmente están por debajo de los
reportados, estas pequeñas diferencias se pueden atribuir al hecho de que no
se conoce el método utilizado para el control de calidad de los fertilizantes en
estudio, ni la condición de la muestra en el momento de análisis.
Con relación a los objetivos planteados en el trabajo, estos fueron
cumplidos en un cien por ciento. El método desarrollado permitió declarar
aceptada la hipótesis de estudio, ya que se aplicó a la determinación de nitrato
y amonio en fertilizantes inorgánicos nitrogenados que se comercializan en la
región de los Andes Venezolanos. Dicho método analítico representa una
alternativa viable y valida, que puede ser utilizado para el análisis de control
rutinario en este tipo de productos.
Una vez descritas las conclusiones del trabajo se recomienda la
realización de estudios posteriores dentro de esta línea de investigación en el
laboratorio de Espectroscopía Molecular, sugiriéndose la adaptación del
método al análisis de estas especies en otras matrices. Sin embargo, el
protocolo de trabajo a seguir estará fundamentalmente basado en el origen de
la muestra y los niveles de concentración de los analitos en las mismas.
Trabajo Especial de Grado Laboratorio de Espectroscopía Molecular
Br. Eliana R Guillén C 70
BIBLIOGRAFÍA
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