Post on 12-Feb-2020
OBIECTIVUL GENERAL 5. : Managementul durabil al resurselor genetice animale
Obiectivul specific 5.1: Ameliorarea genetică a populaţiilor de animale (rase, linii) cu status normal
Numărul/codul proiectului : ADER 5.1.3.
Denumirea proiectului:
Contract nr.: 5.1.3./22.10.2015
Anul începerii: 2015; Anul finalizării: 2018; Durata (luni): 38
CUANTIFICAREA STATISTICO-INFORMAŢIONALĂ A BIODIVERSITĂŢII LA
RASELE DE OVINE CRESCUTE ÎN ROMÂNIA CU AJUTORUL MARKERILOR
GENETICI
Contractor: SCDCOC Popăuți-Botoşani – Conducător proiect (CP)
Agent economic: S.C. AGRO IND COM S.R.L. Botoşani – Partener 1 (P1)
• Elaborarea metodologiei experimentale privind estimarea resurselor genetice la specia
ovină cu ajutorul statisticii informaționale;
• Identificarea și analiza unor markeri genetico-biochimici, imunogenetici și genetico-
moleculari la ovine;
• Comensurarea relațiilor genetice dintre rasele de ovine pe baze genetico-biochimice,
imunogenetice și genetico-moleculare cu ajutorul corelației informaționale și a distanței
genetice;
• Cuantificarea diversității genetice la rasele de ovine pe baze genetico-biochimice,
imunogenetice și genetico-moleculare cu ajutorul energiei informaționale și al entropiei
informaționale;
• Transpunerea în produs software a metodologiei de cuantificare a diversității genetice la
ovine cu ajutorul conceptelor de statistică informațională;
• Fundamentarea (conceptualizarea) metodologiei de cuantificare statistico-informațională a
biodiversității la specia ovină utilizând markerii genetici.
CONŢINUTUL TEMATIC:
- Principală ţintă a proiectului a fost evaluarea polimorfismului unor markeri genetici la
specia ovină, care sa contribuie la un management sustenabil al patrimoniului genetic şi
conservarea biodiversităţii, prin concepte de statistică informaţională.
- Pentru atingerea obiectivelor proiectului cercetările au fost efectuate pe populatii de
ovine din rase autohtone Karakul de Botoşani, Ţurcană, Ţigaie, Merinos din diferite exploataţii
zootehnice.
Obiectivul principal al proiectului:
- Eşantionarea animalelor şi recoltarea probelor biologice pentru analizele programate a
fost făcută în funcţie de cerinţele experimentului pe criterii de vârstă, sex, varietate de
culoare, linie zootehnică, tip morfo-productiv, ecotip etc.
1. Metode de analiză a sistemelor genetico-biochimice:
▪ Identificarea fenotipurilor hemoglobinei, transferinei, albuminei etc, a fost realizată prin
metode electroforetice specifice; Polimorfismul celor şase proteine majore din lapte, patru din
fracţiunea cazeinică (alfa S1-cazeina, beta-cazeina, alfa S2-cazeina şi K-cazeina) şi două din
lactoserum (alfa-lactoalbumina şi beta-lactoglobulina) a fost analizat prin tehnica focalizării
izoelectrice (IEF);
▪ Identificarea fenotipurilor elementelor minerale (potasiu, sodiu etc.) a fost realizată
prin metoda flamfotometrică.
Metodele de analiză de laborator folosite
2. Metode de analiză a sistemelor imunogenetice:
▪ Identificarea fenotipurilor factorilor de grupă sanguină a fost realizată prin metoda
imunoserologică a testului hemolitic şi a hemaglutinării.
3. Metode de analiză a polimorfismului ADN:
▪ Identificarea markerilor moleculari de tip SNP din gena calpastatinei, gena responabilă de
Sindromul Spider Lamb, genele asociate cu prolificitatea, genele care codifica proteinele din
lapte (alfa S1-cazeina şi beta-lactoglobulina) a fost realizată prin metoda PCR-RFLP;
▪ Caracterizarea profilului polimorf al alfa s1-cazeinei, evidenţiat prin electroforeza IEF la
indivizi din rasa Merinos, a fost realizată prin amplificarea şi secvenţierea întregii regiuni
codificatoare a genei;
3. Metode de analiză a polimorfismului ADN:
▪ Identificarea polimorfismelor din gena PRNP, asociată cu rezistenţa sau susceptibilitatea la
scrapie a ovinelor, a fost realizata prin trei metode: Real-Time PCR (folosind un kit comercial)
şi două metode alternative testate în cadrul cercetărilor efectuate. Una dintre metode se
bazează pe amplificarea şi secvenţierea întregii regiuni codificatoare a genei PRNP, iar
cealaltă pe amplificarea parţială şi microsecvenţiere prin metoda extensiei primerilor;
▪ Determinarea filiaţiei descendenţilor a fost realizată prin analiza unui panelul de 22 markeri
ADN microsateliţi. Metoda a fost testată şi validată pe un eşantion de ovine din rasa Karakul
de Botoşani;
▪ Evaluarea comparativă a unor indici de diversitate genetică relevanţi şi a distanţelor
genetice dintre patru rase autohtone: Karakul de Botoşani (KB), Ţurcană (Ţu), Ţigaie (Ţi),
Merinos Românesc (RoM) şi una străină - Merinos Spaniol (SpM) a fost realizată pe baza
rezultatelor de genotipare obţinute la 22 de loci microsateliţi, cu ajutorul unor programe
bioinformatice disponibile;
▪ A fost creat un produs software, care permite încărcarea datelor de identificare ale ovinelor,
a rezultatelor testelor genetice efectuate şi calcularea unor parametrii de diversitate genetică,
cum ar fi frecvenţa de genă şi genotip.
Metodele de analiză de laborator folosite
Principale rezultate obţinute. Concluzii
- Cuantificarea statistico-informațională a biodiversității unor rase de ovine crescute în
România a vizat evaluarea polimorfismului unor markeri genetico-biochimici, imunologici şi a
unor markeri ADN de tip SNP şi microsateliţi;
- De departe informaţiile cele mai precise privind polimorfismul genetic şi calcularea unor
parametrii de diversitate genetică şi a distanţelor genetice dintre rasele de ovine studiate au
fost obţinute prin analiza unor markeri ADN;
- Cei mai polimorfi markeri de tip SNP studiaţi la ovine s-au dovedit a fi cei localizati în
genele, beta-lactoglobulinei, alfa S1-cazeinei (responsabile de sinteza acestor proteine
specifice din lapte) şi în gena PRNP, care codifică o proteină responsabilă de funcţionarea
neuronilor şi care prin mutaţii determină sinteza unei proteine modificate numită prion,
asociată cu apariţia scrapiei la ovine;
- Un polimorfism foarte accentuat la rasele de ovine studiate s-a constatat în cazul
markerilor microsateliţi;
- Principale rezultate obţinute în cazul celor mai relevanţi markeri studiaţi vor fi sintetizate
în continuare.
Figura 1. Profil electroforetic IEF
evidenţiind polimorfismul proteinelor
majore din lapte la o parte din indivizii din
cele patru rase de ovine studiate: a.
Merinos; b. Karakul de Botoşani;
c.Ţurcană ; d. Ţigaie.
1. Analiza polimorfismului genetic al celor şase proteine majore din lapte la ovine
- Analizele au fost realizate pe eşantione de ovine din patru rase authohtone Karakul de
Botoşani (KB), Ţurcană (Ţu), Ţigaie (Ţi). Acestea au evidenţiat un monomorfism în cazul beta-
cazeinei, alfa S2-cazeinei, K-cazeinei şi alfa-lactoalbuminei (Figura 1).
- La toate rasele analizate s-a constatat un polimorfism al beta-lactoglobulinei, caracterizat
prin prezenţa a două alele A şi B (Figura 2).
Figura 2. Frecvenţele alelelor şi genotipurilor la rasele luate în studiu.
- La rasa Merinos, în cazul alfa S1-cazeinei X, s-a constatat un profil de migrare mult mai
catodic faţă de cel al variantei comune C, cauzat probabil de mutaţii în secvenţa de
aminoacizi a proteinei X care afectează punctul izolectric (Figura 3).
Figura 3. Profil electroforetic IEF evidenţiind
polimorfismul alfa S1-cazeinei la rasa Merinos (RoM):
Probele 1, 9 - genotip CX; Probele 2-8, 10 - genotip CC.
- Secvenţierea întregii regiuni codificatoare a alfa S1-cazeinei de la indivizii normali CC şi
polimorfi CX, a evidenţiat prezenţa unei substituţii nucleotidice de tip G/A în codonul 68 -
AGT/AAT. Ea determină în proteină substituţia unei serine (S) cu o asparagină (N). Aceasta
corespunde cu varianta genetică D (welsh), evidenţiată şi la alte rase de ovine din
străinătate.
- La locusul alfa S1-cazeina a fost identificată cu frecvenţa 1 prezenţa alelei C la trei din
cele patru rase analizate, asociată în multe studii cu calităţi superioare de procesare a laptelui
şi randamente mai mari de obţinere a brânzeturilor;
2. Analiza polimorfismului genei PRNP la ovine
- Analiza polimorfismului genei PRNP la ovinele din rasele Karakul de Botoşani (KB),
Ţurcană (Ţu), Ţigaie (Ţi) au vizat testarea unor metode bazate pe analiza ADN de identificare
a mutaţiilor din codonii 136, 141, 154 şi 171, asociaţi cu rezistenţa sau susceptibilitatea la
scrapie;
- Genotiparea a fost realizată prin tehnicile Real-Time PCR (cu un kit comercial),
secvenţierea întregii regiuni codificatoare a genei PRNP, respectiv microsecvenţiere.
Figura 4. a. Produşi specifici obţinuţi prin amplificarea exonului 3 al genei PRNP la ovinele analizate. L - ladder
de 100 pb; b. Cromatogramă de secvenţiere evidenţiind codonii polimorfi 136, 141, 154, 171, asociaţi cu
genotipul ARR/ARQ; c. Cromatogramă de microsecvenţiere evidenţiind codonii polimorfi 136, 154 şi 171
asociaţi cu genotipul ARR/ARQ.
- Pe baza datelor de genotipare obţinute, indivizii au fost clasificaţi în mai multe clase de
risc conform nomenclaturii existente;
Figura 5. Date privind frecvenţele genotipurilor obţinute la ovinele genotipate la locusul PRNP, evidenţiate
pe clase de risc.
- Genotiparea la locusul PRNP a indivizilor din cadrul raselor de ovine luate în studiu a
permis stabilirea structurii genetice (calcularea frecvenţelor alelelor şi genotipurilor) la acest
locus;
- O parte dintre rezultatele obţinute sunt evidenţiate în Figura 5.
- În eşantionul de indivizi analizaţi din rasa Karakul de Botoşani au fost identificate cu
frecvenţa cea mai mare genotipuri din clasa de risc R3 (0,61), respectiv din clasa de risc R2
0,31). Genotipurile din clasele de risc R4 şi R5, care în mod normal trebuie eliminate de la
reproducţie, nu au fost identificate în eşantioanele analizate;
- În eşantionul de indivizi analizaţi din rasa Ţurcana au fost identificate predominat
genotipuri din clasa de risc R2 (0,60), respectiv din clasa de risc R3 (0,20);
- În eşantionul de indivizi analizaţi din rasa Ţigaie au fost identificate predominant
genotipuri din clasele de risc R1 (0,17), R2 (0,25), respectiv R3 (0,41).
3. Analiza polimorfismului markerilor microsateliţi la ovine
3.1 Analiza filiaţiei la ovine cu ajutorul markerilor microsateliţi
- Cercetările realizate în acest sens au vizat testarea şi validarea, pe un număr de 12
familii de ovine din rasa Karakul de Botoşani (din 5 varietaţi de culoare) a unei metode de
confirmare a filiaţiei pe baza amprentei ADN generată cu ajutorul a 22 de markeri microsateliţi
specifici ovinelor.
3.2. Evaluarea comparativă a unor indici de diversitate genetică relevanţi şi a
distanţelor genetice dintre unele rasele de ovine autohtone cu ajutorul
markerilor microsateliţi
- Evaluarea diversităţii genetice a ovinelor luate în studiu aparţinând la patru rase
autohtone: Karakul de Botoşani (KB), Ţurcană (Ţu), Ţigaie (Ţi), Merinos Românesc (RoM) şi
una străină - Merinos Spaniol (SpM) şi stabilirea distanţelor genetice a fost realizată pe baza
datelor de genotipare a 22 de markeri microsateliţi specifici.
- Markerii microsateliţi sunt reprezentaţi în genomul animalului sub forma unor secvenţe
nucleotidice repetitive în tandem şi prezintă o rată mare de mutaţii. De aceea, un microsatelit
de la un anumit locus poate coexista în mai multe forme variabile ca lungime în cadrul unei
rase / populaţii de animale.
3.1 Analiza filiaţiei la ovine cu ajutorul markerilor microsateliţi
- Analiza rezultatelor obţinute prin amprenta ADN generată prin amplificarea unui panel de
22 de markeri ADN microsateliţi specifici ovinelor, a permis stabilirea cu precizie a filiaţiei în
cele 12 familii de ovine din rasa Karakul de Botoşani luate în studiu (Figura 6).
- Amprenta ADN generată pentru fiecare individ în parte, organizaţi pe familii conform
fişelor de montă, a evidenţiat faptul că toate mamele (M1-M12) din cele 12 familii (F1-F12) de
ovine din rasa Karakul de Botoşani s-au calificat ca mame genetice ale descendenţilor
nominalizaţi, în conformitate cu fişele de montă;
- În cazul berbecilor, doar 3 dintre cei 12 masculi au fost excluşi ca taţi potenţiali ai
descendenţilor, restul de 9 fiind taţii genetici reali, în concordanţă cu fişele de montă;
- Procentul de taţi incompatibili nu a fost mare, având în vedere condiţiile de management
reproductiv mai dificil în cazul ovinelor. Metoda folosită pentru stabilirea filiaţiei s-a dovedit o
unealtă extrem de utilă care ar putea contribui substanţial la un management mai bun al
reproducţiei în fermele de ovine.
3.2. Evaluarea comparativă a unor indici de diversitate genetică relevanţi şi
a distanţelor genetice dintre unele rasele de ovine autohtone cu ajutorul
markerilor microsateliţi
- Analiza ,,population assignment” (Figura 7), a evidenţiat faptul că un procent de 94% dintre
indivizii studiaţi au fost atribuiţi corect rasei de provenienţă. Un individ din rasa Ţu a fost
atribuit rasei KB, explicat prin contribuţia acesteia la formarea rasei KB. Un individ din rasa
RoM a fost atribuit rasei SpM, iar unul din rasa SpM a fost atribuit rasei RoM, explicat prin
fondul lor de gene comun.
- În cazul rasei KB gradul de heterozigoţie observat
(Ho) a fost mai mic decât cel aşteptat (He), ceea ce
sugerează un anumit grad de consangvinizare. Cea
mai mare valoare a indicelui de heterozigoţie a fost
observată la rasa Ţi (0,771), iar cea mai mica la
rasa KB (0,672) (Figura 8);
- Rasa KB a prezentat un grad mare de diferenţiere
genetică faţă de rasele Ţu, Ţi, RoM şi SpM, cu valori
ale Fst între 0,056-0,066. Cea mai mare diferenţiere
între rasele autohtone luate în studiu s-a constatat
între Ţu şi RoM (0,071), în timp ce rasa RoM este mai
apropiată genetic de rasa Ţi. Cel mai mic grad de
diferenţiere genetică s-a constatat între rasele RoM şi
SpM (Figura 9);
- Calcularea distanţelor genetice Nei, a confirmat diferenţierea clară între rasele analizate
(Figura 10);
- Analiza structurii genetice a celor cinci rase luate în studiu a evidenţiat încă de la K=2 o
diferenţiere clară între KB versus Ţu, Ţi, RoM şi SpM. Diferenţierea se referă la formarea a
două clustere, care evidenţiază structura lor genetică diferită (Figura 11). Rasa KB are origine
Asiatică şi a fost obţinută prin încrucişarea în generaţii succesive a unor berbeci din rasa
Karakul cu populaţii locale de ovine din zona Moldovei. La K=2 celelalte patru rase luate în
studiu formează un singur cluster deoarece originea fondului lor de gene este Europeană.
Figura 11. Structura genetică comparativă la
K=2 a populaţiilor de ovine din cele cinci
rase analizate.
Figura 12. Structura genetică comparativă la
K=3 a patru (Ţu, Ţi, Ro-M şi Sp-M) din cele
cinci rase de ovine analizate.
- Structurarea genetică a raselor de ovine studiate Ţu, Ţi, RoM şi SpM (fără KB) devine mai
evidentă la K=3 şi K=4 (cel mai probabil numar de clustere conform valorii delta K). O primă
observaţie este diferenţiere clară între rasa RoM versus Ţu şi Ţi. Rasele Ţu şi Ţi evidenţiază
similarităţi genetice, explicate printr-un posibil flux de gene pe parcursul formării lor. Cele două
rase din grupul Merinos (RoM şi SpM) se diferenţiază genetic încă de la K=3.
- Analizele genetice efectuate în cadrul proiectului, folosind markeri genetici de
tip SNP şi microsateliţi, au permis pe de-o parte evaluarea polimorfismului câtorva
loci implicaţi în determinismul genetic al unor caractere fenotipice de interes, iar pe
de alte parte evaluarea diversităţii şi a distanţelor genetice între rasele de ovine
analizate;
- Folosirea ulterioară a unor metode de analiza genomică va permite estimarea
mai precisă a indicilor de diversitate genetică sau stabilirea distanţelor genetice între
rase / populaţii de animale, dar şi identificarea cu precizie a substratului genetic al
unor caractere fenotipice de interes, esenţiale în stabilizarea genetică a caracterelor
specifice fiecarei rase.
Recomandari