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5 de Octubre de 2011
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIA 1. 5 de Octubre
Microarrays (Ricardo Gonzalo)RTqPCR (Paqui Gallego)Diseño experimental y análisis de resultados (Alex Sánchez)
DIA 2. 30 de Noviembre
Ultrasecuenciación (Paqui Gallego y Alex Sánchez)
Pre-Experimento…
UEB
INVESTIGADOR
UCTS
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
TIPOS DE ARRAYS
•Según su tecnología•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
MIC
RO
AR
RA
YS
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
TIPOS DE ARRAYS
•Según su tecnología•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
MIC
RO
AR
RA
YS
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de arrays de expresión según su tecnología (I)
Arrays de cDNA – 2 colores Arrays de oligos – 1 color
Impresión de la sonda síntesis de la sonda “in situ”
2 dyes fluorescentes (Cy3/5) 1 dye fluorescente (FE)
1 gen = pocos spots/replicados 1 gen = representado por muchas sondas diferentes
2 muestras / slide 1 muestra / slide
Longitud (nt) elevada oligos de 20-25 nt
Medidas relativas medidas absolutas
Tipos de arrays de expresión según su tecnología (II)
•Más económicos
•Alta flexibilidad en el diseño
•Chips de alta densidad
•Muy reproducibles
•Medidas absolutas
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Arrays de cDNA (2 colores) Arrays de oligos (1 color)
pros
•Manejo de clones
•Posibles hibridaciones cruzadas
•Baja reproducibilidad
•Precio elevado
•Falta de flexibilidad en algunos formatos
•Equipamiento especializado
cons
•Genome-Wide SNP Analysis GW Human SNP array 6.0
? 1.8 M marcadores genéticos (900.000 SNP + 900.000 CNV)
•Resequencing Arrays Human Mitochondrial array
“Custom” resequencing arrays
•Citogenética GW Human SNP array 6.0
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (I)
DNA ANALYSIS ARRAYS
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENE REGULATION ANALYSIS ARRAYS
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (II)
• ChiP-on-Chip: Estudio de interacciones entre DNA y proteínas
y modificaciones del DNA, ej.
Sitios de unión de factores de transcripción
Sitios de unión de histonas
Metilación del ADN
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (III)
EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS (I)
3’ Expression Human U133 Plus 2.0 array
Human U219 array plate
Rat, Mouse, Porcine, Zebrafish, …
3’5’
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (IV)
EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS (II)
Gene Arrays Human, Mouse, Rat Gene 1.0 ST Array
Exon Arrays Human, Mouse, Rat Gene 1.0 ST Array
3’5’
Gene Arrays
Exon Arrays
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (V)
miRNA GeneChip miRNA 2.0 Array
•131 organisms in the array (human, mouse, rat, canine, ….)
•100% miRBase v115
•2.334 snoRNAs and scaRNAs (human small nuclear RNAs)
•Low inputs amounts (0.1 to 1 ug total RNA)
•2.202 probe sets unique to pre-miRNA hairpins
• Según el método de purificación se enriquece una fracción u otra.
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (VI). Resumen
RNA - 3’IVT Expression Hg U133 Plus 2.0 Formato individual o formato placa (16, 24 ó 96)
Hg U219 Formato placa
- WT-Expression Human Gene Array Formato individual o formato placa
Human Exon Array Formato individual
- miRNA miRNA Array Formato individual
DNA - Resequencing Mitochip Formato individual
“Custom” Formato individual
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
¿Cómo están hechos? (I). Fotolitografía
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
¿Cómo están hechos? (II)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
TIPOS DE ARRAYS
•Según su tecnología•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
MIC
RO
AR
RA
YS
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MATERIAL DE PARTIDA RNA TOTAL
Poli A mRNA
EXTRACCIÓN
Células eucariótas QIAGEN
Tejido TRIZOL
CALIDAD CANTIDADBIOANALYZER
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (I): BIOANALYZER
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (II): BIOANALYZER
CALIDAD RNA (III): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración
RNA Area: 192.0 RNA Concentration: 150 ng/µlResult Flagging Color: 255 Result Flagging Label: Bad RNA quality
RNA Area: 155.7 RNA Concentration: 122 ng/µlrRNA Ratio [28s / 18s]: 1.6 RNA Integrity Number (RIN): 8.5 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Not all expected ladder peaks have been found. You should try to modify peak find settings or add peaks using manual integration.
Issue with ladder peak detection. Please check ladder.
RNA Area: 1,653.2 RNA Concentration: 50,101 pg/µlrRNA Ratio [28s / 18s]: 1.3 RNA Integrity Number (RIN): 7.7 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label: Good RNA quality
CALIDAD RNA (IV): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
BIOANALYZER
Chips disponibles:
RNA
PROTEINAS
DNA
CÉLULAS
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent 2100 Small RNA Kit
Agilent DNA 1000 Kit Agilent DNA 7500 Kit Agilent DNA 12000 Kit Agilent High Sensitivity DNA Kit
Agilent Protein 80 Kit Agilent Protein 230 Kit High Sensitivity Protein 250 Kit
Agilent Cell Kit
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (III): RNA INTEGRITY NUMBER
0 ≤ RIN ≤ 10
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (IV): RNA INTEGRITY NUMBER
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (V): RNA INTEGRITY NUMBER
? ¿qué RIN es el más adecuado?
RIN 5.0 RIN 8.0
¿hasta que RIN se puede utilizar?
¿se pueden mezclar diferentes RIN?
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (VI): TIPO DE MUESTRA
• kits especiales extracción RNA
• extracción “genes globina”
• no trabajar con sangre total
• HABLAR CON NOSOTROS ANTES
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CANTIDAD RNA
• 3’ IVT ARRAYS 200 ng / 3 µL
• Exon/Gene ARRAYS 200 ng / 3 µL
• NUGEN 500 pg / 5 µL
• miRNA 1 µg / 8 µL
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)
•Cantidad (Kits amplificación)
TIPOS DE ARRAYS
•Según su tecnología•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)
•EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
MIC
RO
AR
RA
YS
RNA (150 ng)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
3’IVT EXPRESS
AAAAAAAAAAAATTTTTTT
TTTTT
RNA (150 ng) RNA-cDNA dscDNA cRNA (≈ 40 µg)
IVT
O/N
PROCEDIMIENTO (I)
EXON/GENE
NNNNN
RNA-cDNA dscDNA
IVT
O/NcRNA
NNNNN
ssDNA (7 µg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
NUGEN
PROCEDIMIENTO (II)
NNNNN
RNA (500 pg) RNA-cDNA dscDNA
SPIA
ssDNA (8 µg)TTTTT
miRNA
ATPAAAAAA
RNA (1 µg) AAAAAA
Biotin-labeled 3DNA
Biotin-labeled RNA
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
PROCEDIMIENTO (III)
Fragmentación
O/N
3’IVT EXPRESS EXON/GENE NUGEN miRNA Resequencing
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Y ESTO SOLO ACABA DE EMPEZAR…
.CEL
UEB
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIFERENCIAS ENTRE LOS KITS
3’ IVT Exon/Gene NUGEN
Oligo dT NNN oligo dT + NNN
cRNA ssDNA ssDNA
15 µg 5.5 µg 5 µg
NO MEZCLAR DIFERENTES PROTOCOLOS DE AMPLIFICACIÓN
EN UN MISMO PROYECTO…
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN (I)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN(II)
• Formato placa: 16, 24, 96 arrays
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN(III)
• Formato placa: 16, 24, 96 arrays
mayor high throughtput
reducción del tiempo de procesado
disminución de costes
mayor reproducibilidad (disminución de efecto batch)
Formato cerrado (16, 24, 96)
No todos los tipos de especies, tipo de array representados
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (I)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (II)
CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Puricado
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Fragmentado
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA