Fabrice GUERIF

Service de Médecine

et Biologie de la Reproduction

CHRU Bretonneau - TOURS

Congélation lente / Vitrification

le bilan ?

Préservation

de la fertilité féminine

Contribution

au développement des

transferts mono-embryonnaires

+désynchronisation

entre ponction et transfert

VIT

RIF

ICA

TIO

N

3

• Nombre de centres participants :

o Enquête 12/2012 : 60 centres / 105

=> 48 centres engagés dans la vitrification (80%)

40 centres avaient procédé à des réchauffements

• Vitrification mise en place pour :

o Blastocystes 46/48

o Embryons précoces 31/48

o Zygotes 17/48

4

• Type de milieux utilisés : • Irvine ® 36/48 (75%)

• Vitrolife ® 9/48

• Origio ® / Fertipro ® / Kitazato ® 3/48

• Marque des paillettes utilisées : • CBS ® 35/48 (73%)

• Rapid i ® 11/48

• Vitrosafe ® / Cryotop ® 2/48

• Système utilisé : o Fermé 47/48 (98%)

o Ouvert 1/48

5

Blastocystes

• Les résultats

6

Congélation lente 2011

Vitrification

Nb blastocystes décongelés

4218 2698

Tx survie 71%* 88%*

Tx Grossesse / transfert

18.5%* [6.3-33.3]

29.5%* [0-50%]

* p<0.001

Expérience du CHRU de Tours

7

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

19

97

19

98

19

99

20

00

20

01

20

02

20

03

20

04

20

05

20

06

20

07

20

08

20

09

20

10

20

11

20

12

20

13

Proportion de cycles de FIV avec culture embryonnaire prolongée

8

Congélation au stade blastocyste (85%) CL+V

Congélation embryonnaire précoce (15%) CL

9

0

50

100

150

200

250

300

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

Evolution du nombre de décongélations

annuelles

Embryons J2 Blastocystes

10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

Evollution du taux de survie (blastocystes)

0

5

10

15

20

25

30

35

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

Evolution du taux de Grossesse (blastocystes)

Blastocystes

• Etude prospective randomisée

• Période de congélation de 15 jours en

alternance CL puis V

• Etude initiée en septembre 2011 (en cours)

• Critères de congélation

o J5 : B2 à B5 (sauf CC)

o J6 : B4 à B5 (sauf CC)

11

Blastocystes

• Milieux de congélation :

o Congélation lente : Milieux Cook®

o Vitrification : Milieux Vitrolife ® + Rapid i ®

o Système fermé

• Procédures :

o Recommandations des fabricants

o Décongélation la veille du transfert présumé

12

Blastocystes

Congélation lente

Vitrification p

Effectifs 180 155

Age femme 33.0 + 4.9 33.7 + 4.4 0.3907

Rang de ponction 1.7 + 0.9 1.5 + 0.8 0.1755

Nb ovocytes totaux 9.9 + 5.0 10.8 + 5.6 0.3263

Tx ovocytes matures 86% 91% 0.0563

Nb embryons totaux 6.5 + 3.1 7.4 + 4.1 0.1443

Nb embryons Top Qualité 1.6 + 1.5 1.8 + 1.7 0.5018

Fréquence ICSI 54% 50% 0.7857

13

Blastocystes

Congélation lente Vitrification p

Effectifs 180 155

Nb blastocystes décongelés 1.5 + 0.6 1.4 + 0.6 NS

Tx survie 79% 89% 0.0043

Tx transfert 85% 94% 0.0206

Nb blasto transférés 1.4 + 0.5 1.3 + 0.5 NS

Tx Gros. Clinique / décong. 24.4% 33.5% NS

Tx Naissance / décong. 20.0% 31.0% 0.029

14

La littérature

Vitrification Blastocystes

15

Considérations méthodologiques

• Système ouvert / fermé

• Kits de Cong. / Dec.

• Supports de congélation

• Jour de congélation (J5/J6)

• Stade d’expansion

• Qualité Morphologique

• Survie (immédiate / 24h)

• Recours au collapse avant vitrification

• Recours au hatching post vitrification

Congélation lente

vs

vitrification

17

Tx SURVIE Congélation lente Vitrification Collapse p

Huang 2005 57% (72) 84%(81) <0.05

Kuwayama 2005 84% (156) 90% (6328) NON <0.05

Stehlik 2005 83% (71) 100% (41) NON <0.05

Lieberman et Tucker 2006

92% (570) 97% (547) NON NS

Kuc 2010 83% 84% NS

CHRU Tours 2013 79% (275) 89% (220) NON <0.05

18

% Gros. clin/ transfert SBT Congélation lente

Vitrification p

Kuwayama 2005 ? 51% (98) 53% (4745) NS

Stehlik 2005 NON 17% (24) 50% (20) <0.05

Lieberman et Tucker 2006 43% (254) 46% (254) NS

Kuc 2010 26% 50% <0.05

CHRU Tours 2013 NON 24% (180) 34% (155) NS

Système ouvert

vs

Système fermé

19

• Système ouvert

o Descente ultrarapide

o + Taux de grossesse

o - Risque de contamination par contact direct avec

N2 liquide

Système OUVERT : ≈ - 20 000 °C / minute

Système FERME : - 1000 à 2 000 °C / minute

Tx SURVIE Collapse Syst. ouvert Syst. fermé p

Kuwayama 2005 NON 97% (227) 93% (88) NS

Guns 2008 NON 86% 91% NS

Chen 2013 LASER 98% (150) 96% (308) NS

Desai 2013 NEEDLE 91% (148) 97% (89) NS

Hashimoto 2013 NON 100% (163) 97% (100) NS

Panagiotidis 2013 NON 84% (492) 82% (513) NS

21

% Gros. clin/ transfert Collapse SBT Syst. ouvert Syst. fermé p

Kuwayama 2005 NON ? 59% (221) 51% (82) NS

Chen 2013 LASER NON 48% (103) 42% (218) NS

Desai 2013 NEEDLE NON 46% (85) 59% (51) NS

Hashimoto 2013 NON OUI 47% (158) 45% (97) NS

Panagiotidis 2013 NON NON 46% (194) 42% (205) NS

Vitrification

• Vitesse de refroidissement

• Vitesse de réchauffement (+++)

• Viscosité de l’échantillon

• Volume de l’échantillon

• => Equation à 4 variables influençant la probabilité

pour une solution liquide de passer à l’état vitreux

sans la formation de cristaux de glace o Yavin et Arav, 2007

o Etude pilot de Vanderzwalmen 2009

Influence

jour congélation

23

24

Van Landuyt, 2011

Milieu Irvine

Paillettes CBS

Système fermé

Blastocystes congelés à J6 (ICM A)

=Stades B1B2 avec qualité + à J5

= Si considération uniquement des « Full et expanded » à J5

=> taux de survie identique entre J5 et J6

TAUX de SURVIE Collapse Day 5 Day 6 p

Mukaida 2003 NON 87% (569) 55% (156) <0.05

Hiraoka 2004 100% 96% NS

Hiraoka 2009 NEEDLE 100% (214) 98% (145) NS

Stehlik 2005 NON 100% (41) 100% (36) NS

Lieberman 2009 NON 96% (1373) 96% (1357) NS

Van Landuyt 2011 NON 81% (864) 70% (321) <0.05

Cobo 2012 NON 96% (1033) 98% (929) NS

CHRU Tours 2013 NON 93% (137) 82% (67) <0.05

25

26

% Gros. clin/ transfert Collapse SBT Day 5 Day 6 p

Mukaida 2003 NON NON 39% (172) 29% (51) NS

Hiraoka 2004 54% 47% NS

Hiraoka 2009 NEEDLE NON 54% (144) 53% (100) NS

Stehlik 2005 NON NON 50% (20) 33% (15) NS

Lieberman 2009 NON NON 58% (678) 42% (720) <0.05

Van Landuyt 2011 NON OUI 17% (406) 16% (124) NS

Cobo 2012 NON OUI 46% (649) 43% (589) NS

Kang 2013 OUI OUI 42% (737) 30% (154) <0.05

CHRU Tours 2013 NON NON 34% (94) 17% (43) <0.05

Influence

stade

congélation

27

28 Van Landuyt, 2011

Milieu Irvine

Paillettes CBS

Système fermé

Tx survie Tx transfert

Tx implantation

=

=

=

29

Van Landuyt, 2011

=

TAUX de SURVIE Early Blastocyst Expanded Blastocyst

Hatched Blastocyst

Cho 2002 52%* 40.5% *

Vanderzwalmen 2002 (Day 5) 80% (41)* 29%(71)*

Mukaida 2003 (Day 5) 92% (119)* 87% (361)* 82% (89)*

Ebner 2009 (Day 5) 84% (86)* 74% (53) 68% (134)*

Cobo 2012 (Day 5) 94% (458) 98% (549)* 89% (72)*

CHRU Tours 2013 (Day 5) 97% (17) 87% (65) 81% (27)

30

Tx Gros. Clin. / transfert Early Blastocyst Expanded Blastocyst

Hatched Blastocyst

Vanderzwalmen 2002 (Day 5) 25% (16) 14% (7)

Mukaida 2003 (Day 5) 45% (38) 37% (107) 35% (20)

Ebner 2009 (Day 5) 45% (42) 30% (23) 48% (48)

Cobo 2012 (Day 5) 32% (285) 44% (349) 44.4% (41)

CHRU Tours 2013 (Day 5) 6% (17)* 38% (65)* 8% (27)*

* = p<0.05

31

Blastocystes expansés :

- Risque accru de formation de glace

- Perméabilité diminuée aux cryoprotecteurs

Idée d’induire

un collapse artificiel

Mukaida 2006 Expanded / Hatched Blastocysts

Expanded / Hatched Blastocysts + collapse

p

Tx Survie 85% (339) 97% (502) <0.05

Tx grossesse / transfert

34% (85) 60% (266) <0.05

32

Raju 2009 Early Blastocyst Expanded blastocyst + collapse

p

Tx Survie 95% (576) 81% (370) <0.05

Tx grossesse / transfert

38% (281) 32% (193) NS

Iwayama 2011 Expanded Blastocysts

Expanded Blastocysts + collapse

p

Tx Survie 97% (?) 100% (?) NS

Tx grossesse / transfert

34% (85) 60% (129) <0.05

Devenir des enfants nés

après vitrification

33

2001

Wikland 2010

Grossesses uniques Blasto frais Blasto vitrifié p

n 199 103

Age gestationnel (AG) 40.1 40.3 NS

AG < 37 semaines 7% 7% NS

Poids naissance (g) 3510 3650 <0.05

Poids < 2500 g 5% 7% NS

Tx de malformations 2% 1% NS

Mortalité périnatale 0.5% 1% NS

Feng 2012

Grossesses uniques Blasto frais Blasto vitrifié p

n 252 142

Age gestationnel (AG) 38.2 + 4.6 38.6 + 1.6 NS

AG < 37 semaines 10% 10% NS

Poids naissance (g) 3155 + 590 3103 + 515 NS

Poids < 2500 g 5.6% 7.9% NS

Wirleitner 2013

Grossesses uniques Blasto frais Blasto vitrifié p

n 42 42

Age gestationnel (AG) 38.6 + 1.5 38.8 + 1.8 NS

AG < 37 semaines 10% 5% NS

Poids naissance (g) 3198 + 436 3406 + 549 NS

Poids < 2500 g 10% 5% NS

Chen 2013

Grossesses uniques Système ouvert Système fermé p

n 30 60

Age gestationnel (AG) 38.3 + 1.3 37.9 + 1.5 NS

AG < 37 semaines 6.7% 15% NS

Poids naissance (g) 3248 + 408 3163 + 481 NS

Poids < 2500 g 3.3% 8.3% NS

Effet de la durée

de conservation ?

39

Absence de formation de structures cristallines =>

Stabilité dans le temps des blastocystes vitrifiés ?

Analyse rétrospective de 603 transferts (2009-2012)

Système fermé

Mois 0-3 3-6 6-12 12-24 24-36 36-48 48-72

Souris (6 mois)

Porc (3 ans)

Lapin (15 ans)

Conclusions

42

Evolution

• Un tiers des centres français a abandonné la

congélation lente (fin 2012)

• Embryons précoces

• Congélation lente 28/53

• Vitrification 16/53

• Congélation et vitrification 9/53

• Blastocystes

• Vitrification 40/52

• Congélation lente 8/53

• Congélation et vitrification 4/52

43

44

• Commentaires

Surcoût de la technique (DM) +++

Pb gestion des cuves (place) ++

Manipulation Azote liquide ++

Réorganisation laboratoire ++

Nécessité apprentissage +

45