Post on 05-Jan-2017
Université de Bretagne Occidentale Microbiologie Fondamentale et Appliquée Master 2 recherche
Compte-rendu de stage méthodologique
Clarisse LEMONNIER
COMPARAISON DE TROIS TECHNIQUES D’EXTRACTION D’ADN APPLIQUÉES À L’ÉTUDE DES MICROORGANISMES
MARINS
Laboratoire d’accueil : Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes
Encadré par Loïs Maignien
UE Méthodologie Année 2014-2015
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Table des matières Introduction 3
I. Le choix des protocoles d’extraction 4
Extraction au phénol-‐chloroforme : 4 Kit MO-‐Bio PowerSoil® : 5
II. Matériels et méthodes 5 Prélèvement 5 Extractions 6 Quantité et Qualité de l’ADN extrait 6 Diversité microbienne 7
III. Résultats et Discussion 7 Quantité d’ADN 7 Amplification des ITS 8 Diversité microbienne 9
IV. Conclusion 12
Bibliographie 13
ANNEXES 14
Table des illustrations Figure 1 : Organisation des gènes ribosomiques chez les prokaryotes. 7
Figure 2: Photo du gel de migration des différentes PCR des ITS. 8
Figure 3 : Richesse spécifique obtenue pour les différentes extractions et les deux témoins négatifs. 10
Figure 4: a. Proportions relative des différentes tailles d’ITS obtenues avec la technique ARISA
b. Comparaison des électrophorégrammes de S3a (rouge) S3b (bleu) et S3c (vert). 11
Tableau 1 : Résultats du dosage au Nanodrop et Picogreen 8
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Introduction
Depuis le milieu des années 80 le développement des techniques cultures-
indépendantes a permit une grande avancée dans l’étude de la diversité des microorganismes
de nombreux environnements (Head et al., 1998) En effet, on estime que moins d’1% des
microorganismes peuvent être approchés par les techniques de culture. Les outils moléculaires
sont particulièrement essentiels dans l’étude des procaryotes marins, qui ne livrent les
mystères de leur diversité depuis 10-20 ans seulement. Les Archées pélagiques, par exemple
ont été mises en évidence grâce au séquençage de leur ADNr 16S dans les océans au début
des années 1990, alors qu’elles peuvent représenter selon certaines estimations, jusqu’à 40%
du bactérioplancton total. De plus, des lignées phylogéniques entières de bactéries ou archées
pélagiques ne sont décrites exclusivement par approches moléculaires, sans représentants
cultivés pour l’ors.
Les analyses culture-indépendante varient en fonction de la problématique posée. Pour
étudier la diversité d’un échantillon, classiquement elles débutent par une étape d’extraction
des acides nucléiques suivi d’une amplification de certaines régions particulières de l’ADN ou
ARN par PCR, puis la diversité est observée via utilisation de techniques d’empreintes
moléculaires ou encore séquençage.
Parmi toutes ces étapes, l’extraction d’ADN est la plus critique. En effet, de base, on ne
connaît pas la diversité totale de l’échantillon, il est donc complexe de déterminer le
rendement ou l’efficacité d’une extraction. (Head et al., 1998)
Une bonne extraction repose sur une lyse efficace des cellules, pour pouvoir accéder,
idéalement, à la totalité des acides nucléiques. Cependant ces derniers ne sont pas extraits
avec la même efficacité selon le type d’échantillon ou le microorganisme. Il est ainsi plus
complexe de lyser une spore ou une bactérie GRAM (+) qu’une bactérie GRAM (-).
Différentes stratégies de lyse existent, qui peuvent être combinées : celles reposant sur
l’utilisation de détergents, dite lyse chimique, celles utilisant des enzymes (Lysozyme,
Protéinase K) dite lyse enzymatique, et enfin celles qui détruisent les cellules par application
de forces les lyses mécaniques : chocs thermiques, ou encore le « bead beating » qui vise à
casser les cellules à l’aide de microbilles agitées fortement.
Un point important également, est la reproductibilité de l’extraction, qui sera moindre si l’on
utilise des billes de différentes tailles dans le bead beating par exemple
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L’objectif de ce travail va être de comparer trois techniques d’extraction, appliquées à l’étude
des microorganismes marins, récupérés par filtration d’eau de mer sur des filtres Sterivex® de
0,22µm : deux extractions phénol-chloroforme, l’une avec une lyse chimique-enzymatique,
l’autre une lyse chimique-mécanique et une extraction utilisant un kit commercialisé : le kit
MoBio PowerSoil®. Différents aspects de l’extraction seront étudiés et comparés : la quantité
et la qualité de l’ADN extrait ainsi que la diversité obtenue.
I. Le choix des protocoles d’extraction
Extraction au phénol-chloroforme :
L’extraction au phénol-chloroforme a été choisie car c’est une technique de référence
dans l’extraction des acides nucléiques, largement utilisée depuis le début des années 1950.
De plus, le protocole s’applique à des cellules déjà lysées, ce qui va permettre de tester
différentes techniques de lyse.
L’extraction au phénol-chloroforme se base sur les différences de solubilité des
molécules dans un mélange de deux solutions de densité différente : une solution aqueuse (où
l’on retrouve les cellules lysées) et une solution de phénol-chloroforme. Ces deux solutions
sont mises à volume égal, mélangées doucement et séparées par centrifugation. Le phénol,
plus dense que l’eau va se retrouver au fond du tube. L’ADN de part sa charge négative va
être plus soluble dans l’eau et donc rester dans la phase acqueuse. A l’inverse, les protéines
vont être plus soluble dans le phénol. Cette étape peut être réalisée plusieurs fois afin
d’optimiser le rendement de l’extraction. A la fin, l’ADN va être précipité avec de l’éthanol,
ou de l’isopropanol, puis être re-suspendu dans un tampon ou de l’eau stérile.
Pour l’extraction d’ADN de cellules retenues sur des filtres, on retrouve
principalement l’utilisation du bead beating, qui permet de casser les cellules en même temps
que de les détacher du filtre. Afin de voir l’efficacité de ce type de lyse particulier, deux
extractions au phénol chloroforme ont été réalisées selon différentes lyses : une comprenant
une étape de bead-beating (extraction S3), l’autre comprenant une étape avec de la protéinase
K (extraction S2). Les deux techniques de lyse utiliseront des détergents (Sarkosyl et SDS)
en même quantité.
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L’extraction au phenol-chloroforme est très longue en temps. Se sont développés ces
dernières années des kits d’extraction standardisés.
Kit MO-Bio PowerSoil® :
Parmi les kits standardisés, le Kit MO-Bio PowerSoil est couramment utilisé dans les
laboratoires, et notamment dans les recherches en microbiologie marine car il présente une
étape de bead-beating (Jacobs et al., 2009; Portillo et al., 2012) Contrairement à l’extraction
au phenol-chloroforme, l’ADN va être isolé et récupéré sur une colonne de silice.
Dans ce travail, les extractions ont été faites en respectant les instructions du fabricant
(extraction S1).
Ce protocole stipule 5-10min de bead-beating, c’est ce temps qui a également été choisi dans
la lyse mécanique pour l’extraction phénole-chloroforme S3.
II. Matériels et méthodes
Afin de pouvoir comparer strictement les différentes techniques d’extraction, la même eau a
été filtrée sur différents filtres, et en triplicat. Un triplicat correspond à un demi filtre.
Prélèvement Le prélèvement a été effectué à la station SOMLIT en baie de Ste Anne, Plouzané
(48°21’32.17’’ N, 4°33’07.21’’ O). L’eau a été prélevée à 2m de profondeur sous la surface, à
l’aide d’une bouteille Niskin, et directement reversée dans un bidon Nalgen® stérile de 10L.
La filtration a été faite en laboratoire, avec un système de filtration en série, relié à une pompe
péristaltique. L’eau a été pré-filtrée sur des filtres de 10µm, 3 µm (filtres membrane PC,
Whatman) et les microorganismes ont été récupérés sur des filtres de 0,22 µm (Sterivex®
Millipore). 1 litre d’eau au total a été filtré sur chaque sterivex. Un blanc de filtration a été
effectué également, en filtrant de l’eau stérile.
A la fin de le filtration, les Sterivex sont refermés avec des bouchons stériles et mis à -80°C,
jusqu’à extraction.
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Extractions
Les protocoles détaillés de toutes les extractions sont donnés en annexe (Annexes 1&2)
Les filtres à l’intérieur des Sterivex ont été récupérés en découpant la coque en plastique avec
un scalpel chauffé à la flamme. Puis précautionneusement découpés en 2 dans une boite de
pétri stérile et insérés dans des tubes numérotés pour les différentes extractions : des tubes de
2mL classiques (numérotés S2a, S2b et S2c) pour la lyse chimique, des tubes matrix B pour
la lyse mécanique et chimique (numérotés S3a, S3b et S3c) et enfin les tubes PowerBead
fournis avec le kit MO-bio PowerSoil (numérotés S1a, S1b et S1c).
En plus, un témoin négatif pour chaque extraction a été effectué (nommés S1-, S2- et S3-) ,
ainsi qu’une extraction à partir d’un filtre sterivex stérile (non utilisé).
Pour l’extraction au phénol-chloroforme avec une lyse chimique, dans le tube contenant le
filtre a été ajouté 1 mL de tampon de lyse (Tris-HCl – EDTA – NaCl), 100 µL de SDS 10%,
100µL de Sarkosyl 10% et 50 µL de Protéinase K. Les tubes ont ensuite été mis au bain-marie
à 55°C pendant 1h afin de permettre l’activité de la protéinase K. A la fin de cette étape, 1 mL
de solution a été transférée dans un nouveau tube de 2mL.
Pour l’extraction phénol-chloroforme par lyse mécanique-chimique, 1 mL de tampon de lyse
(Tris-HCl – EDTA – NaCl), 100µL de SDS 10% et 100µL de Sarkosyl 10% ont été ajoutés
dans les tubes matrix B, avant d’être mis à vortexer à puissance maximale pendant 5-10min. 1
mL de solution a ensuite été récupérée dans un nouveau tube de 2mL.
L’extraction au phénol-chloroforme proprement dite a commencé par une étape de séparation
au Phenol-Chloroforme-Isoamyl alcool (25 :24 :1), suivi d’une autre étape de séparation au
Chloroforme. L’ADN a été tout d’abord été précipité en ajoutant 40µL d’Acétate de Sodium
3M (pH 5,2) et 0,7 volumes (~700µL) d’isopropanol glacé (-20°C), puis à l’éthanol froid
75%. L’ADN extrait a été repris dans 100µL d’eau miliQ stérile.
Les extractions avec le kit MO-Bio PowerSoil ont été réalisées selon les instructions du
commercant. C’est également avec ce kit qu’ont été effectuées les extractions du Témoin
négatif de filtration et du Sterivex.
Quantité et Qualité de l’ADN extrait La quantité et qualité d’ADN extrait ont été mesurées par spectrophotométrie sur le
Nanodrop1000.
Pour une mesure plus précise de la quantité d’ADN, il a été effectué un dosage au Picogreen
(kit Quant-iTTM PicoGreen®), en suivant les instructions du fabricant (Annexe 3).
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Diversité microbienne Pour estimer la diversité obtenue avec chaque extraction, une technique d’empreinte
moléculaire a été utilisée : Automatic rRNA Intergenic Spacer Analysis (ARISA).
L’ARISA se base sur la grande variabilité de taille des séquences inter-ribosomiques (ITS),
qui migrerons plus ou moins loin par électrophorèse.
Figure : Organisation des gènes ribosomiques chez les prokaryotes.
Une PCR sur les ITS a donc été réalisée, en utilisant les amorces bactériennes ITSF (GTC-
GTA-ACA-AGG-TAG-CCG-TA) et ITSR (GTC-GTA-ACA-AGG-TAG-CCG-TA). (Annexe
4) La migration sur gel a été effectuée sur biopuce provenant du kit Agilent 7500 et les
bandes ont été analysées par des capteurs dans un bioanalyseur (Annexe 5). Les données ont
été traitées avec le logiciel 2100 Expert. Tous les pics supérieurs à 5 RU ont été pris en
compte et comptés comme étant 1 OTU.
III. Résultats et Discussion
Quantité d’ADN Les résultats obtenus entre le Nanodrop et le Picogreen sont très contradictoires (Tableau 1).
Le Nanodrop donne des estimations 10 à 100 fois plus élevées que le Picogreen et présente
des valeurs de résultats positives, voir supérieures que d’autres extractions pour les témoins
négatif de l’extraction S1, le Sterivex et le témoin négatif de filtration. Ces résultats
aléatoires peuvent s’expliquer par le fait que le Nanodrop présente un seuil de détection
d’ADN de 2 ng/µL. Si l’on suit les résultats –plus précis– du Picogreen, la concentration
d’ADN extrait n’excède pas 0,62 ng/µL. Le Nanodrop ne peut donc être utilisé sur ces
échantillons, d’un point de vue quantitatif, mais également qualitatif.
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Tableau 1 : Résultats du dosage au Nanodrop et Picogreen
*ND : correspond aux valeurs en dessous du seuil minimal de dosage du kit Quant-iTTM PicoGreen® : 25.10-3 ng/µL. *S1= Kit MO-Bio PowerSoil, S2= Phénol-chloroforme lyse chimique/enzymatique S3= Phénol-chloroforme lyse
chimique/mécanique.
Les résultats obtenus avec le Picogreen nous montrent que selon les extractions, il a été extrait
entre 0,07 et 0,62 ng/µL d’ADN. L’extraction qui a permit d’extraire le plus d’ADN est le kit
MO-Bio PowerSoil. Bizarrement, l’extraction S3 au phenol-chloroforme avec une étape de
bead-beating a produit une quantité d’ADN très faible, voire nulle.
Amplification des ITS Avant analyse par ARISA, les résultats des différentes PCR d’ITS ont été mis à migrer sur gel
d’agarose. (Figure 1)
Figure 1: Photo du gel de migration des différentes PCR des ITS.
La PCR nous montre dans un premier temps que de l’ADN était présent dans tous les tubes
d’extraction, et pas dans les témoins négatifs d’extraction, sauf pour le Sterivex et le Témoin
négatif de filtration (des bandes très légères sont visibles). L’absence d’amplification pour le
réplica a de l’extraction S1 est probablement due à une erreur de manipulation lors de la PCR,
car de l’ADN a bien été quantifié au Picogreen.
De l’ADN a bien été extrait dans l’extraction S3, en très faible quantité, mais suffisante pour
pouvoir être amplifié. Il ne s’agit pas d’une contamination de PCR, ni d’extraction, car le
témoin négatif n’a pas montré d’amplification.
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Il faut donc regarder au niveau de l’extraction, pour tenter de savoir pourquoi un aussi faible
taux d’ADN a été extrait. La technique d’extraction S3 ne variait par rapport à S2 que par
l’étape de bead-beating. Une hypothèse alors serait que une partie de l’ADN aurait été
dégradé durant la lyse des cellules. Le temps de bead-beating (5-10min), combiné à des
détergents en forte concentration aurait pu être responsable de cette dégradation de l’ADN. Ce
temps a été basé sur celui donné dans le kit MO-Bio PowerSoil mais ce dernier présentait
surement une solution de lyse moins puissante. Cela reste hypothétique, car la composition
des solutions du kit n’est pas transmise.
Cependant, dans la littérature les temps de bead-beating sur des filtres pour des extractions au
phénol-chloroforme similaires à la notre sont de 30-40s, soit 10 fois plus court que celui
utilisé dans notre étude (Urakawa et al., 2010). De plus, Fujimoto et son équipe ont montré
l’impact du temps de bead-beating sur le taux d’ADN extrait à partir cultures de
Staphylococcus aureus. Le rendement était meilleur pour un temps de 30s et était diminué de
moitié pour un temps de 3min (Fujimoto et al., 2004).
La migration sur gel nous montre la présence de bandes de différentes tailles aux alentours
des 500-1000 pb, et qui correspondent aux différents ITS amplifiés.
Une légère contamination est présente, qui peut avoir multiples origines : le système de
stérilisation des bidons et circuits de filtration n’est pas entièrement performant, lors de
manipulation près de la flamme pour la récupérer et découper les filtres ou possiblement une
contamination des Sterivex eux même.
Diversité microbienne
Les électrophorégrammes obtenus à l’issue de l’ARISA sont mis en annexe (Annexe 6).
Malheureusement, suite à deux erreurs survenues lors de la PCR (pour S1a) et durant
l’ARISA (pour S2b), seule l’extraction S3 présente des résultats de diversité pour tous ses
triplicats, c’est pourquoi les résultats sont à considérer avec précaution, et ne peuvent être
confortés par des calculs statistiques, de type NMDS.
L’ARISA nous donne des profils d’électrophorèses, à l’issue de l’analyse. Ces profils
permettent d’identifier les différents fragments présents dans les échantillons, mais également
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de les quantifier en mesurant l’aire sous la courbe des pics et en se référent à un marqueur
interne.
Théoriquement, le nombre de pics obtenus correspond au nombre d’« espèces » présentes
dans l’échantillon. C’est ainsi que l’on peut mesurer la richesse spécifique pour chaque
extraction. Il faut tout de même considérer que des espèces, voire des genres bactériens
différents peuvent présenter la même taille d’ITS.
Etrangement, l’extraction qui présente la plus grande richesse spécifique est
l’extraction S3, au phénol-chloroforme avec lyse chimique-mécanique, alors que c’est celle
qui présente la plus faible quantité d’ADN extrait (Figure 3).
Ainsi la technique d’extraction au phénol-chloroforme avec du bead-beating est la plus
performante en terme d’extraction et de lyse des cellules pour notre type d’échantillon. On
peut même émettre l’hypothèse qu’avec un temps de bead-beating plus approprié, cette
diversité aurait été encore augmentée.
Figure 2 : Richesse spécifique obtenue pour les différentes extractions et les deux témoins négatifs. Elle est exprimée en nombre de pics obtenus sur l’électrophorégramme.
L’extraction qui aurait le moins marché en terme de diversité serait l’extraction S2, cependant
sans triplicat, il est délicat de conclure.
La diversité obtenue nous permet également de réfléchir sur la reproductibilité entre et dans
les différentes extractions.
La graphique de la figure 4 représente les différentes tailles d’ITS obtenues en fonction des
échantillons, une taille correspondant théoriquement à une espèce. La répartition de ces tailles
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est variable selon les extractions, et même au sein des triplicats, pour l’extraction S1 et S2.
L’extraction S3 quand à elle montre des profils relativement similaires entre les différents
triplicats. Ce résultat se retrouve si l’on superpose les électrophorégrammes. Il y a cependant
une mauvaise reproductibilité au niveau de la quantité des différents fragments.
a.
Echelle (en pb)
b.
Figure 3: a. Proportions relative des différentes tailles d’ITS obtenues avec la technique ARISA b. Comparaison des électrophorégrammes de S3a (rouge) S3b (bleu) et S3c (vert).
Pourtant il a été montré que la technique d’ARISA appliquée à des environnements
aquatiques est très reproductible (Fisher and Triplett, 1999) Le décalage que l’on obtient est
peut-être lié à la quantité d’ADN initiale variable, qui n’aurait donc pas donné les mêmes
amplifications.
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IV. Conclusion
Dans cette étude ont été testées trois techniques d’extraction différentes sur des
microorganismes pélagiques récupérés par filtration sur des filtres Sterivex de 0,22µm : deux
extractions phénol-chloroforme avec des techniques de lyse différentes, bead-beating et
enzymatique, et un kit d’extraction le MO-Bio PowerSoil.
La technique qui donne les meilleurs résultats serait l’extraction au phénol-
chloroforme avec une lyse chimique-physique, en effet c’est celle qui permet d’extraire une
plus grande diversité de bactéries. Cependant cette extraction devrait être refaite, en jouant sur
les temps de bead-beating pour vérifier lequel serait le plus optimal, car celui utilisé pour cette
étude était inadapté, et aurait considérablement réduit le taux d’ADN extrait.
De plus, dans cette étude, la qualité de l’ADN n’a pas pu être investie, car les
concentrations d’ADN extrait étaient trop faibles pour le Nanodrop1000. Il serait intéressant
de refaire cette expérience en filtrant des volumes d’eau plus importants et en se basant sur
des filtres entiers plutôt que des demi-filtres pour l’extraction afin d’obtenir plus d’ADN.
Un autre élément qui a beaucoup limité les analyses de cette expérience est le manque de
triplicat. Pour pouvoir affermir les résultats il serait intéressant à l’avenir de partir de 5, ou
plus, réplicats.
Enfin une légère contamination a été détectée sur le témoin négatif, mais également sur le
filtre sterivex témoin. Un des biais peut-être du au moment d’extraire le filtre de sa coque
plastique. Pour valider ou infirmer l’origine de cette contamination, il serait intéressant
d’éviter cette étape en utilisant le kit spécial Sterivex ou des protocoles d’extraction où les
premières étapes d’extraction ont lieu directement dans le Sterivex. (Somerville et al., 1989)
Les techniques d’extraction sont donc très complexes et demandent un ajustement précis pour
chaque environnement, avec une expérience de mise au point nécessaire. Il faut se poser la
question de quelle exigence on veut avoir, une économie de temps, d’argent ou encore le plus
de diversité possible, une reproductibilité dans les résultats.
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Bibliographie Fisher M.M., Triplett E.W., 1999. Automated approach for ribosomal intergenic spacer analysis of microbial diversity and its application to freshwater bacterial communities. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4630–4636. Fujimoto S., Nakagami Y., Kojima F., 2004. Optimal bacterial DNA isolation method using bead-‐beating technique. Mem. Kyushu Univ Dep Health Scis Med. Sch 3, 33–38. Head I.M., Saunders J.R., Pickup R.W., 1998. Microbial Evolution, Diversity, and Ecology: A Decade of Ribosomal RNA Analysis of Uncultivated Microorganisms. Microb. Ecol. 35, 1–21. Jacobs J., Rhodes M., Sturgis B., Wood B., 2009. Influence of environmental gradients on the abundance and distribution of Mycobacterium spp. in a coastal lagoon estuary. Appl. Environ. Microbiol. 75, 7378–7384. Portillo M.C., Anderson S.P., Fierer N., 2012. Temporal variability in the diversity and composition of stream bacterioplankton communities. Environ. Microbiol. 14, 2417–2428. Somerville C.C., Knight I.T., Straube W.L., Colwell R.R., 1989. Simple, rapid method for direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55, 548–554. Urakawa H., Martens-‐Habbena W., Stahl D.A., 2010. High abundance of ammonia-‐oxidizing Archaea in coastal waters, determined using a modified DNA extraction method. Appl. Environ. Microbiol. 76, 2129–2135.
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ANNEXES ANNEXE 1 : Protocole extraction phénol-‐chloroforme Lyse cellulaire Extraction S3 : lyse cellulaire Bead-‐Beating + SDS + Sarkosyl -‐ Séparer le filtre de sa coque plastique à l’aide d’un scalpel chauffé à la flamme -‐ Avec un scalpel stérile, séparer le filtre de son socle et le découper précautionneusement en deux. A
l’aide d’une pince stérile, les mettre dans deux tubes de 2mL remplis de billes de verre 0,1mm et de 1mL de tampon de lyse (Tris-‐HCl – EDTA-‐ NaCl)
-‐ Ajouter 100µL de SDS 10% et 100µL de Sarkosyl 10%. -‐ Mettre au Bead-‐Beating pendant 10-‐15min. -‐ Récupérer 1 mL de solution dans un nouveau tube de 2mL, en prenant garde à récupérer le moindre
de billes possibles. -‐ Centrifuger rapidement et reprendre 1 mL dans un nouveau tube de 2mL Extraction S2 : lyse cellulaire Protéinase K + SDS + Sarkosyl -‐ Séparer le filtre S2 1 de sa coque plastique à l’aide d’un scalpel chauffé à la flamme. -‐ Avec un scalpel stérile, séparer le filtre de son socle et le découper précautionneusement le filtre en
deux. A l’aide d’une pince stérile, les mettre deux tubes de 2mL stériles. -‐ Faire de même avec le sterivex S2 2, mais ne récupérer qu’une moitié. -‐ Prévoire un blanc de l’extraction = tube vide noté S2 -‐ -‐ Ajouter 1 mL de tampon de lyse (Tris-‐HCl – EDTA-‐ NaCl) dans chaque tube -‐ Ajouter 100 µL de SDS 10%, 100 µL de Sarkosyl 10% et 50 µL de Protéinase K. -‐ Mélanger doucement et incuber au bain marie à 55°C pendant 1h agiter lentement de temps en temps. -‐ A la fin récupérer 1 mL et le transférer dans des nouveau tube de 2mL Extraction de l’ADN -‐ Ajouter 1 mL de PCI, puis agiter sans vortexer pendant 45 secondes. -‐ Centrifuger à 14000 rpm pendant 15min à 4°C. -‐ Récupérer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de 2mL. Répéter cette extraction au PCI si il y a beaucoup de débris au niveau de l’interface -‐ Ajouter 1 mL de Chloroforme, puis agiter sans vortexer pendant 45 secondes. -‐ Centrifuger à 14000 rpm pendant 15min à 4°C. -‐ Récupérer la phase acqueuse supérieure. Précipitation de l’ADN -‐ Ajouter 40 µL de solution d’Acétate de sodium 3M, pH 5,2. -‐ Ajouter 0,7 volumes d’isopropanol glacé (-‐20°C) -‐ Placer les tubes 1h minimum à -‐20°C (possibilité de laisser overnight) -‐ Centrifuger pour récupérer le culot d’ADN 14000 rpm pendant 20min à 4°C. -‐ Re-‐suspendre le culot avec 0,5 mL d’ethanol froid à 75%. -‐ Centrifuger à 14000 rpm pendant 5 minutes à 4°C. -‐ Laisser sécher le culot à l’air libre, ou au speed vac pendant 10min à température moyenne. -‐ L’ADN est repris dans 100-‐200µL de TE (1X) -‐ L’ADN peut être conservée à 4°C.
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ANNEXE 2 : Protocole kit MO-‐Bio PowerSoil® (selon les instructions du fabricant) Récupération du filtre et lyse cellulaire -‐ Séparer le filtre de sa coque plastique à l’aide d’un scalpel chauffé à la flamme -‐ Avec un scalpel stérile, séparer le filtre de son socle et le découper précautionneusement en deux. A
l’aide d’une pince stérile, les mettre dans deux tubes PowerBead -‐ Vortexer rapidement et doucement pour mélanger -‐ Ajouter 60µL de solution C1 et vortexer brièvement. -‐ Placer les tubes sur un vortex horizontal de type « bead beat ». Vérifier qu’ils sont bien accrochés, et
vortexer à puissance maximale pendant 10-‐15min. -‐ Centrifuger les tubes à 10000g pendant 30s. T°C ambiante. Extraction d’ADN -‐ Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2mL, rempli de 250 µL de solution C2. Vortexer
rapidement pendant 5s puis laisser 5min à 4°C. -‐ Centrifuger les tubes à température ambiante pendant 1 min à 10000g -‐ Transférer le surnageant (600µL max) dans un nouveau tube de 2 mL, rempli de 200µL de solution
C3. Vortexer brièvement puis laisser 5min à 4°C. -‐ Centrifuger les tubes à température ambiante pendant 1 min à 10000g -‐ Transférer le surnageant (750µL max) dans un nouveau tube rempli de 1200µL de solution C4 ( !
Agiter la bouteille avant de prélever). Vortexer brièvement
Rétention de l’ADN sur colonne et précipitation -‐ Transférer environ 675 µL de surnageant dans un tube avec colonne Spin Filter et centrifuger pendant
1 min à 10000 g à température ambiante. -‐ Eliminer le surnageant, et remettre 675 µL re centrifuger etc… x2 -‐ Ajouter 500 µL de la solution C5 et centrifuge à température ambiante pendant 30s à 10000g -‐ Eliminer le liquide passé. Re-‐centrifuger à température ambiante pendant 1 min à 10000g -‐ Déplacer le filtre dans un nouveau tube de 2 mL. Ajouter 100µL de la solution C6. Centrifuger à
température ambiante pendant 30s à 10000g.
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Extraction 3 : Protocole Picogreen kit Quant-iTTM PicoGreen® 1. Préparation des réactifs : . -‐ Préparation du tampon TE : Dans un tube Falcon 50ml, diluer 20 fois la solution mère de TE 20X, stérilement pour ainsi obtenir du tampon TE 1X. Ajuster le volume à préparer en fonction de la manipulation à réaliser. Cas n°1 : Pour un volume final de 40 ml : 2 ml de TE 20X + 38ml d’eau milliQ stérile. Cas n°2 : Pour un volume final de 20 ml : 1 ml de TE 20X + 19ml d’eau milliQ stérile. -‐ Préparer la gamme étalon : À partir du tube de Lambda DNA à 100 μg/ml fourni dans le kit, préparer une 1ère dilution à 2 μg/ml (soit une dilution de la solution mère au 1/50ème) dans un microtube 1,5ml. Cas n°1 : Pour un vol. final de 500μl, prélever 490μl de TE1X et 10μl de lambda DNA 100μg/ml. Cas n°2 : Pour un vol. final de 250μl, prélever 245μl de TE1X et 5μl de lambda DNA 100μg/ml. À partir de ce tube à 2 μg/ml, réaliser les 7 points de gamme, en série de dilution en cascade au demi. Penser à annoter vos microtubes 1,5ml et à bien vortexer entre chaque dilution. Cas n°1 : 250μl TE1X + 250μl ADN Cas n°2 : 125μl TE1X + 125μl ADN -‐ Préparation des échantillons : il est important que les échantillons mesurés se situent dans la gamme étalon. Diluer vos échantillons à quantifier par exemple, au 1/100ème dans du TE 1X. Si les échantillons sont très peu concentrés, il est évident que la dilution est inutile. Cas n°1 : 100μl d’échantillon/puits sont nécessaires. Soit pour des mesures en dupliquat, préparer un volume d’échantillon dilué minimum de 250μl : 2,5μl d’ADN pur dans 247,5μl de TE 1X. Cas n°2 : 50μl d’échantillon /puits sont nécessaires. Soit pour des mesures en dupliquat, préparer un volume d’échantillon dilué minimum de 125μl : 1,25μl d’ADN pur dans 123,75μl de TE 1X. -‐ Préparation de la solution de Picogreen : Diluer la solution mère fourni dans le kit, au 1/200ème dans du TE 1X. Attention, protéger le tube de la lumière, et le recouvrir avec de l’aluminium. Cas n°1 : Préparer un volume de 10ml, soit 50μl de picogreen pur dans 10ml de TE1X. Cas n°2 : Préparer un volume de 5ml, soit 25μl de picogreen pur dans 5ml de TE1X. 2. Préparation de la plaque : 1 vol. de solution de picogreen* pour 1 vol. d’ADN. -‐ Verser la solution de picogreen diluée fraîchement préparée, dans une boite de pétri stérile (ou un réservoir pour multicanaux) -‐ Distribuer dans un premier temps, le picogreen avec une pipette P200 multicanaux, dans tous les puits de la microplaque, à hauteur de : 100 μl de picogreen pour une plaque à puits classiques 50μl de picogreen pour une plaque demi-‐puits -‐ Déposer ensuite, la gamme étalon en duplicat (au minimum) à l’aide d’une pipette P200 simple, selon votre plan de plaque : 100 μl d’ADN pour une plaque à puits classiques 50μl d’ADN pour une plaque demi-‐puits -‐ Penser à faire des témoins négatifs « Blanc » exempt d’ADN. -‐ Déposer vos échantillons dilués ou non, selon votre plan de plaque : 100 μl d’échantillon pour une plaque à puits classiques 50μl d’échantillon pour une plaque demi-‐puits -‐ Recouvrir la plaque avec un film adhésif en aluminium. -‐ Homogénéiser au vortex brièvement la plaque, puis centrifuger quelques secondes afin de faire redescendre les éventuelles gouttelettes. 3. Lecture au lecteur de microplaques TECAN Infinite200Pro -‐ Allumer l’ordinateur, puis le lecteur de microplaques (interrupteur à l’arrière de l’appareil) -‐ Ouvrir le logiciel IControl (icône sur le bureau) -‐ Ouvrir la méthode désirée « Quantification picogreen -‐ puits classiques » ou « Quantification picogreen -‐ demi puits » Paramètres de la méthode définir : seul le type de plaque change dans ces 2 méthodes ; Plan de plaque = sélection des puits à mesurer Agitation « shaking » 5sec. mode orbital, amplitude 1mm -‐ Pause « wait » 5sec. Fluo. excitation 485nm/ émission 535nm, gain fixe 91, nbre de flash 25, z-‐position A1 -‐ Charger votre plaque à l’intérieur de l’appareil : pour ouvrir (et refermer) le clapet, appuyer sur le bouton situé dans le coin en haut à droite, de l’appareil.
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-‐ Cliquer sur « Start » représenté par l’icône flèche verte. La mesure démarre et une page Excel s’ouvre automatiquement pour afficher les résultats. -‐ Mettre en forme si besoin vos résultats de mesure (document Excel : mise en page, calcul de moyenne, écart type, etc ...) et enregistrer le fichier sur l’ordinateur (dossier personnel à créer) ou sur une clé USB. 4. Analyse des résultats -‐ Soustraire la valeur de fluorescence des témoins « Blanc » à tous les échantillons. -‐ A partir des valeurs des différents points de gamme, générer la droite étalon (graphique « nuage de points », puis ajouter une courbe de tendance) : intensité de fluorescence Picogreen (RFU) en fonction de la concentration d’ADN (μg/ml). -‐ Déterminer la concentration des échantillons avec l’équation de la droite étalon. Attention, ne pas oublier les facteurs dilutions ! Annexe 4 : Protocole de la PCR Composition du Master Mix -‐ Préparer le mélange réactionnel dans un tube eppendorf de 1,5 ml. -‐ Ajouter la Taq polymérase en dernier. -‐ Répartir 24μl de mélange réactionnel dans chaque tube de PCR de 0,2ml. -‐ Ajouter 1μl d’ADN. Le témoin positif de PCR est de l’ADN extrait d’une souche de Thermosipho sp. Le témoin négatif est de l’eau mQ stérile. Le programme de PCR était de 36 cycles, avec une température d’hybridation de 56°C. Marqueur de taille utilisé : Ladder 100bp G5711 Promega
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Annexe 5: Protocole kit Agilent 7500 Préparation du « Gel-‐Dye Mix » : -‐ Laisser le DNA Dye Concentrate (Bleu) et le DNA gel matrix (Rouge) s’équilibrer à température ambiante pendant 30 min. -‐ Mettre 25μl de DNA Dye Concentrate (Bleu) dans le tube de DNA gel matrix (Rouge). -‐ Bien vortexer la solution et centrifuger pour faire descendre les gouttes au fond du tube. Transférer dans un tube à filtre « spin filter ». -‐ Centrifuger à 1500 g +-‐ 20% (soit environ jusqu’à 6000 rpm sur la centrifugeuse ayant un rayon horizontal effectif de 4 cm depuis le centre du rotor jusqu’au bout inférieur du tube) pendant 15min. Protéger la solution de la lumière (aluminium autour du tube) et stocker à +4°C. Nettoyage de la machine (avant et après chaque analyse) -‐ Déposer 350μl d’eau Milli-‐Q dans le puit marqué de la puce de nettoyage (electrode cleaner). -‐ Placer cette puce dans le bionalyser Agilent 2100 pendant 5min. -‐ Retirer cette puce et laisser sécher 2min les électrodes avant l’analyse. Dépôt du Gel-‐Dye Mix -‐ Laisser le Gel-‐Dye Mix, les échantillons et les Markers à température ambiante pendant 30min avant utilisation. -‐ Mettre une nouvelle puce à ADN (DNA Chip) dans la station d’amorçage de la puce. -‐ Déposer 9μl de Gel-‐Dye Mix dans le puits marqué . -‐ Mettre la seringue dans son support et tirer sur le piston de la seringue jusqu’à 1ml. -‐ Visser la seringue dans le support de la puce ( ! ne pas oublier de mettre le chronomètre sur 30 sec). -‐ Enfoncer le piston de la seringue jusqu’au clip (le piston reste enfoncé grâce au clip). -‐ Attendre exactement 30 sec et relâcher le clip (en appuyant sur la gâchette du clip). -‐ Attendre 5 sec et tirer doucement le piston à la position 1ml. -‐ Ouvrir la station d’amorçage et déposer 9μl de Gel-‐Dye Mix dans le puits marqué G. Dépôt des Markers -‐ Déposer 5μl de Markers (Vert) dans les puits de 12 échantillons et dans le puits « échelle ». Tous les puits doivent être remplis. Dépôt du marqueur (Ladder) et des échantillons -‐ Déposer 1μl de DNA Ladder (jaune) dans le puits marqué -‐ Dans chacun des 12 puits destinés aux échantillons, déposer 1μl d’échantillons (déposer 1μl d’eau Milli-‐Q dans les puits qui ne seront pas utilisés). -‐ Vortexer la puce 1min à 2400rpm (vortex adapté aux puces Agilent). -‐ Placer la puce dans le bionalyser Agilent 2100 et lancer l’analyse dans les 5min.
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ANNEXE 6 : Résultats ARISA Electrophorégrammes Gel image L S1a S1b S1c S2a S2b S2c S3a S3b S3c Sterivex ES T -‐
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ANNEXE 7 : Coût des consommables
EXPERIENCES CONSOMMABLES REFERENCE FOURNISSEUR QUANTITE PRIX COÛT3TOTALSterivex((15) SVGV01015 Milipore( 7 147,00(€ 68,60(€
filtre(10(µm((100) 511P101 ipPORE( 3 100(€ 3(€
filtre(3(µm((100) 111112 Whatman( 3 100(€ 3(€
Bouchon(luer(lock((200) 394075 BD 7 16,90(€ 0,60(€
Total 75,20(€
Tubes("bead(beating" 118585N MP(Bio( 4 3,96(€(le(tube 15,84(€
Tampon(de(lyse
Tris)HCl T3253 Sigma(Aldrich( 3,025(g 36,20€/100g 1,09(€
EDTA E6758 Sigma(Aldrich( 10(mL 32,80/100g 3,20(€
NaCl 71382 Sigma(Aldrich( 4,38(g 73,71/1Kg 0,33(€
Proteinase(K 11578916 Invitrogen( 500(µL 120€/100mg 0,60(€
SDS( 7920 Sigma(Aldrich( 800(µLZ(0,1(g 0,62€/g 0,06(€
Sarkosyl LZ5777 Sigma(Aldrich( 800(µLZ(0,1(g 112€/100g 0,11(€
PCI 77617 Sigma(Aldrich 8(mL 0,43/ml 3,44(€
Chloroforme 438601 Carlo(Erba 8(mL 5,5€(le(litre 0,04(€
Acétate(de(Sodium S2889( Sigma(Aldrich 20,4g 78,40€(le(kg 1,60(€
Isopropanol I9516 Sigma(Aldrich 5,6(mL 21,90/100mL 1,18(€
Ethanol 529152 Carlo(Erba 4mL 46,25€(les(25L 0,01(€
Total 27,50(€
Kit3MoBio3PowerSoil Z 6(extractions 266€(/(50(extractions 31,92(€
Total 31,92(€
dNTP U1511 Promega 10,5(µL 25€(200µL 1,31(€
Tampon(Z(MgCl2 M7911 Promega 105(µL 35€(20(mL 0,17(€
Primer(ITSR Z EuroGenTec 2,1(µL 0,058 1,33(€
Primer(ITSF Z EuroGenTec 2,1(µL 0,043 0,98(€
Taq M7806 Promega( 2,52(µL 600€/2500u 3,40(€
Barettes(de(PCR I1402Z3500 Starlab 2 42,5/125(barettes 0,68(€
Caps(de(barettes(PCR I1400Z0810 Starlab 2 10,9/125(caps 0,17(€
Total 39,96(€
ladder(100bp G5711 Promega( 3(µL 0,56(€
Agarose A9539 Sigma(Aldrich ~(1g 79,80€/100g 0,80(€
tampon(TAE GEPTAE00(09 EuroBio 200mL 130€/10L 0,26(€
Total 1,62(€
QuantZiT(PicoGreen®(
dsDNA(Assay(Kit 10535213 Fisher 28 536€/200 75,04(€
plaque(noire(96(puits 137502 Sigma(Aldrich 1 89€/100 0,89(€
Total 75,93(€
ARISA Z Agilent 1 24,96 24,96(€
24,96(€
tubes(2mL E1420Z2000 Starlab 28 11€/500 0,62(€
Pointes(à(filtre(1000µL S1122Z1830 Starlab ~(20 144€/960 3(€
Pointes(à(filtre(200µL S1120Z8810 Starlab ~(50 47€/960 2,35(€
Pointes(à(filtre(10µL S1120Z3810 Starlab ~(100 47€/960 4,70(€
Gants(nitrile(taille(Small 112Z2371 VWR( 1/2(boîte 9,10/boîte 4,55(€
Total 15,22(€
TOTAL 292,31(€
Migration3sur3gel
Filtrations
Picogreen
PCR
Extraction3d'ADN3phénol/chloroforme
Matériel3de3routine
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ANNEXE 8 : Exemple de devis
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ANNEXE 9 : Cahier de laboratoire
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