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Leucemie acute e PCR:diagnostica e valutazione dellamalattia residua
D.ssa Sabrina Coluzzi
Dipartimento Clinico Assistenziale
Oncologico
Unità Operativa di EmatologiaCentro Trapianto di Cellule Staminali
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L¶ematopoiesi
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Leucemie acute
Le leucemiederivano da
alterazionimolecolaripresenti alivello di unprecursoreematopoietico
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³Leukemic Stem Cell´
La popolazione leucemica è eterogenea:
solo una piccola percentuale di queste
cellule ha capacità di autorinnovamento emostra una multidrug resistance
Queste caratteristiche spiegano
l¶importanza di tecniche (come la PCR)volte alla individuazione di eventuali cellule
leucemiche residue dopo l¶ottenimento di
una risposta apparentemente completa
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Percorso diagnostico
Emocromo Morfologia delle cellule
Esami citochimici Esami citofluorimetrici Indagini citogenetiche
Indagini molecolari
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Classificazione leucemie (WHO)1. LMA CON TRASLOCAZIONI GITOGENETICHE RICORRENTI
- LMA con t(8;21)(q22;22), AML1(CBF)/ETO- Leucemia Promielocitica Acuta [LMA con t(15;17)(q22;q11-12) e varianti PML/RAR]- LMA con ipereosinofilia midollare [inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q11), CBF/MYH11X]- LMA con anomalie 11q23
2. LMA CON DISPLASIA MULTILINEARE- Secondaria a sindrome mielodisplastica o sindromi mielodisplastiche/malattie
mieloproliferative
- De novo3. LMA E SINDROMI MIELODISPLASTICHE SECONDARIE A CHEMIOTERAPIA- Secondaria ad agenti alchilanti- Secondaria a epipodofillotossine- Alti tipi
4. LMA NON ALTRIMENTI CLASSIFICATA- LMA con differenziazione minima
- LMA senza maturazione- LMA con maturazione- Leucemia mielomonocitica acuta- Leucemia monocitica acuta- Leucemia eritroide acuta- Leucemia megacariocitica acuta- Leucemia basofila acuta- Panmielosi acuta con mielofibrosi
- Sarcoma mieloide (granulocitico)
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Traslocazioni citogenetiche
ricorrenti Rappresentano il 15-20% delle LAM Sono alterazioni del ³core binding factor´,
complesso proteico essenziale per l¶ematopoiesi, che normalmente attiva unaistone acetiltrasfrasi e la trascrizione di fattori didifferenziamento
Il complesso, se mutato, attiva una istonedeacetilasi e quindi si ha blocco trascrizionale e
blocco differenzitivo Hanno prognosi favorevole
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Rilevamento trascritti di fusione
EstrazioneRNA
Retrotrascrizio
ne Amplificazione Corsa su gel di
agarosio 2% Osservazoneagli UV
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Monitoraggio mediante RQ-PCR
Il livello diespressione deltrascritto èquantizzato in
Real Time Numero Copie
trascritto/NumeroCopie ABL x 104
Una riduzione alfollow-up di trelogaritmi èconsiderata
remissione
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Follow up AML1 ETO
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Classificazione leucemie (WHO)1. LMA CON TRASLOCAZIONI GITOGENETICHE RICORRENTI
- LMA con t(8;21)(q22;22), AML1(CBF)/ETO- Leucemia Promielocitica Acuta [LMA con t(15;17)(q22;q11-12) e varianti PML/RAR]- LMA con ipereosinofilia midollare [inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q11), CBF/MYH11X]- LMA con anomalie 11q23
2. LMA CON DISPLASIA MULTILINEARE- Secondaria a sindrome mielodisplastica o sindromi mielodisplastiche/malattie
mieloproliferative
- De novo3. LMA E SINDROMI MIELODISPLASTICHE SECONDARIE A CHEMIOTERAPIA- Secondaria ad agenti alchilanti- Secondaria a epipodofillotossine- Alti tipi
4. LMA NON ALTRIMENTI CLASSIFICATA- LMA con differenziazione minima
- LMA senza maturazione- LMA con maturazione- Leucemia mielomonocitica acuta- Leucemia monocitica acuta- Leucemia eritroide acuta- Leucemia megacariocitica acuta- Leucemia basofila acuta- Panmielosi acuta con mielofibrosi
- Sarcoma mieloide (granulocitico)
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Difficoltà diagnostiche
Tuttavia, solo nel 50% dei casi siriscontrano alterazioni genetiche, utili per
indirizzare il clinico verso un sottotiponeoplastico piuttosto che un altro
Nei rimanenti casi la diagnosi si deve
attualmente avvalere delle tecnicheprecedentemente accennate
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Nuovi marker molecolari Sono in corso studi multicentrici per individuare
nuovi markers molecolari
L¶attenzione si è focalizzata principalmente su:
- FLT3 (fms-like tyrosine kinase)
- WT1 (Wilms tumor 1)
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FLT3 Recettore
tirosin-chinasipresente sulla
superficie deiprogenitoriematopoietici
Fondamentale
per sopravvivenza edifferenziazionedelle cellule
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Pathway di FLT3
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Genetica di FLT3 Nel 30% dei casi di
LAM si osservamutazione di FLT3 ITD,associata a leucocitosi
ed alto numero di blasti. Tale mutazione
consiste in una
ripetizione da 3 a 400nucleotidi nel dominioiuxtamembrana di FLT3
Exon 14
Exon 14
Exon 15
Exon 15Intron
Intron
Abnormal
Normal
ITD
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Rilevamento FLT3-ITD Estrazione di DNA Amplificazione con primers specifici sugli esoni
14 e 15 Corsa elettroforetica su gel 2% agarosio
Visualizzazione agli UV
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FLT3-ITD
32%
34%
31%
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Impatto di FLT3-ITD
RISCHIO DI RICADUTA
ITD + ITD -
Citogeneticafavorevole
37% 29%
Citogeneticaintermedia
67% 43%
Citogeneticasfavorevole
75% 76%
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Rilevamento FLT3 D835 mut Estrazione di DNA Amplificazione con primers specifici sulla regione TK Digestione con Eco RV Corsa elettroforetica su gel 2% agarosio
Visualizzazione agli UV Le bande non digerite (mutate) sono sequenziate
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FLT3 D835 mut Presente nel 5-10% dei casi di LAM CN Ha un minore impatto sulla prognosi rispetto a FLT3-ITD
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FLT3: considerazioni
Attualmente FLT3 è un ottimo marker prognostico in pazienti a citogeneticanegativa
Nei pazienti a citogenetica nota deveessere correlato con la specificaalterazione
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FLT3: livelli di espressione
I livelli di espressione
di FLT3 correlano conla conta dei blasti nelmidollo
Sono più alti in M5,
bassi in M3
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FLT3: livelli di espressione
Ancorapochi studi
tendono aconsiderare ilivelli di
espressione
di FLT3 wtun utilemarker
prognostico
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WT1:nuovo marker molecolare
WT1 è una proteina con probabilefunzione di oncosoppressore cherecentemente è stato correlato a molte
forme leucemiche Presenta tre domini zinc-finger codificati
dagli esoni 7 e 9 in grado di legare il DNA
Il suo mRNA è espresso a bassi livelli nelpaziente sano, invece nel pazienteleucemico è iper-espresso
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WT1: PCR Real Time
Estrazione RNA dal campioni
Retrotrascrizione a cDNA Amplificazione del cDNA di WT1 e di Abl
(gene housekeeping)
N° copie WT1/N° copie Abl x 104
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Range di riferimento in campionenormale
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Range di riferimento in campionepatologico
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WT1
Diventa fondamentale la quantizzazionedell¶mRNA di WT1 per:
Diagnosi di leucemia acuta Follow up del paziente nel tempo. Èevidente che mediante WT1 possanoessere seguiti anche pazienti privi dialterazioni citogenetiche e molecolarievidenti
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WT 1 e inv16 (CBF-MYH11)
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WT1 e inv16 post allotrapianto
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Casi Clinici
T h r e s h o l d c
y c l e
Log starting quantity, copy number
Leucemia acutaT(8;21): NCN 369
AREB in evoluzione: NCN 1794
AREB stazionaria: NCN 137
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WT1:vantaggi
WT1 appare più sensibile degli altrimarkers genetici precedentementeutilizzati
WT1 rappresenta un marker prognosticodi altissima importanza nel prevederel¶andamento di una terapia o la ricaduta
del paziente
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WT1: aggiornamenti
Recentemente, si è osservata anche unacorrelazione tra il grado mutazionale diWT1 e la prognosi
Sono state riscontrate mutazioni negliesoni 7 e 9 che determinano una perditadei domini zinc-finger
Ciò non comporta una diversa risposta allaterapia, bensì una maggiore possibilità diricaduta
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Mutazioni di WT1 e prognosi
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Correlazione tra WT1 mutato edalterazioni molecolari classiche
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WT1: considerazioni
Al momento, WT1 rappresenta il marker prognostico più importante per il follow updelle leucemie
Ha infatti valore prognostico in tutti i tipi dileucemia
È utile però valutare ogni singolo casoindipendentemente
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Conclusioni
Con il termine LAM si intende un insiemeeterogeneo di patologie ematologiche
La individuazione di marker molecolari è
fondamentale per inquadrare le LAM insottogruppi distinti per prognosi e scelteterapeutiche
Le recenti scoperte, principalmente diWT1 e FLT3, sono di notevole supportoalla diagnosi e al follow up
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Grazie per l¶attenzione!