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Diagnostica batterica
Dott.ssa Mariateresa VitielloDipartimento di Medicina SperimentaleSeconda Università degli Studi di Napoli
Identificazione dei batteri
1. esame microscopico diretto del materiale in esame
2. Caratteristiche morfologicheColorazione di GramColorazione di Ziehl-Neelsen
3. Caratteristiche colturali4. Caratteristiche biochimiche5. Tipizzazione fagica6. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)7. Antibiogramma
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esame microscopico diretto del materiale in esame
Identificazione dei batteri
TIPO DI MICROSCOPIO
MASSIMO INGRANDIME
NTO
UTILIZZAZIONE VANTAGGI SVANTAGGI
OTTICOIN CAMPO ILLUMINATO
1000X OSSERVAZIONE PREPARATI COLORATI. CONTA MICROBICA
DI FACILE USO E POCO COSTOSO; PERMETTE DI DISTINGUERE I MICRORGANISMI DOPO COLORAZIONE DIFFERENZIALE
MANCANZA DI CONTRASTO; INCAPACITA' A VISUALIZZARE VIRUS E ALCUNI BATTERI MOLTO PICCOLI; LA MAGGIOR PARTE DELLE STRUTTURE DEVE ESSERE COLORATA PER ESSERE OSSERVABILE; A SEGUITO DELLE COLORAZIONI SI FORMANO ARTEFATTI
OTTICOIN CAMPO
OSCURO
1000X OSSERVAZIONE DI MICRORGANISMI VIVI, NON COLORATI E CON STRUTTURE MORFOLOGICHE DIFFICILMENTE VISIBILI IN CAMPO ILLUMINATO
PERMETTE DI OSSERVARE MICRORGANISMI VIVENTI, NON E' RICHIESTA COLORAZIONE PER CUI NON COMPAIONO ARTEFATTI
NON E' POSSIBILE VALUTARE PREPARATI COLORATI. I PARTICOLARI SUBCELLULARI NON SONO FACILMENTE INDIVIDUABILI
OTTICO CONTRASTO DI FASE
1000 X OSSERVAZIONE DI MICRORGANISMI VIVI, NON COLORATI E DI STRUTTURE INTRACELLULARI
PERMETTE L'OSSERVAZIONE DI STRUTTURE INTRACELLULARI, EVIDENZIANDONE I DETTAGLI
NON E' POSSIBILE VALUTARE PREPARATI COLORATI
OTTICOFLUORESCENZA
1000 X USATO IN MOLTE PROCEDURE DIAGNOSTICHE, IMPIEGANDO REAGENTI FLUORESCENTI, PER IDENTIFICARE I MICRORGANISMI E PER SVELARE REAZIONI IMMUNOLOGICHE
PERMETTE UNA RAPIDA IDENTIFICAZIONE DEGLI AGENTI INFETTIVI
CONSENTE SOLO L'OSSERVAZIONE DI PREPARATI NATURALMENTE FLUORESCENTI O MARCATI CON SOSTANZE FLUORESCENTI
ELETTRONICOTRASMISSIONE (TEM)
1.000.000 X OSSERVAZIONE DELL'ULTRASTRUTTURA DEI MICRORGANISMI, VIRUS. DIAGNOSI DI MALATTIE VIRALI. OSSERVAZIONE DI MACROMOLECOLE
PERMETTE L'OSSERVAZIONE DI MICRORGANISMI E STRUTTURE INVISIBILI AL MICROSCOPIO OTTICO
MOLTO COSTOSO. CONSENTE L'OSSERVAZIONE SOLO DI MICRORGANISMI UCCISI, FISSATI, DISIDRATATI E COLORATI: TALI PROCEDURE FAVORISCONO GLI ARTEFATTI. I PREPARATI NON DEVONO SUPERARE I 50-200 nm DI SPESSORE
ELETTRONICOSCANSIONE (SEM)
300.000X OSSERVAZIONI DETTAGLIATE DELLE STRUTTURE SUPERFICIALI DEI MICRORGANISMI: PRODUCE IMMAGINI TRIDIMENSIONALI
VISIONE TRIDIMENSIONALE MOLTO REALISTICA. PERMETTE DI AGEVOLMENTE DI VARIARE L'INGRANDIMENTO DEL CAMPIONE DA 1 A 40.000X
MOLTO COSTOSO. CONSENTE DI OSSERVARE SOLO STRUTTURE DI SUPERFICIE. L'INGRANDIMENTO MASSIMO E' INFERIORE A QUELLO DEL MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE
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Microscopio Ottico Composto in Campo Chiaro
Antonie van Leeuwenhoek(1632 - 1723)
IL MICROSCOPIO
LIMITE DI RISOLUZIONE: imposto dalle proprietà fisiche della luce(0,2 µm)
PER OSSERVARE I BATTERI SENZA COLORARLI:- IN CAMPO CHIARO- OBIETTIVO 100X - OCULARE 10X- IN IMMERSIONE- CONTRASTO DI FASE
Obiettivo a contrasto di fase
e ad immersione
IL MICROSCOPIO
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MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
Vengono utilizzate sostanze dette FLUORESCENTI:
Sostanze che se irradiate con luce di una determinata lunghezza d’onda , la
riemettono con lunghezza d’onda maggiore
I fluorocromi più usati sono:la FLUORESCEINA che ha un massimo
di assorbimento a 490-495 nm ed emette una luce giallo-verde
e la RODAMINA che ha un massimo di assorbimento a 550 nm ed emette luce
rossa-arancio
Pneumocystis carinii al microscopio a fluorescenza.Anticorpi specifici per questo patogeno, coniugati
con fluoresceina, hanno ricoperto la superficie dellacisti, che appare colorata in giallo-verde.
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Microscopio elettronico a trasmissione (TEM).Questo microscopio viene utilizzato per osservare sezioni di cellule molto sottili per rilevare le strutture interne.
Il TEM viene anche utilizzato per studiarei virus.
MICROSCOPIA ELETTRONICA: basata sul
principio che un campoelettromagnetico agisce su unfascio di elettroni in modo analogo ad una lente su un
fascio di fotoni
MICROSCOPIO ELETTRONICO
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Microscopio elettronico a scansione (SEM).Questo microscopio serve per fornire immagini tridimensionali delle cellule.
Salmonella typhimurium osservata al microscopioelettronico a scansione.
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TECNICA PER L'ESAME A FRESCO DA COLTURA
L'esame microscopico può essere praticato a fresco ( osservazione diretta dei microrganismi solitamente in condizioni di vitalità) o su preparati colorati (osservazione dei microrganismi dopo che sono stati essiccati, fissati e colorati).L'esame a fresco permette di studiare la forma, la disposizione, le dimensioni, la rifrangenza, la mobilità e la riproduzione dei microbi. Viene compiuto sempre in mezzo liquido per cui nel caso si abbiamateriale solido o semisolido, esso va stemperato in un liquido.I preparati a fresco sono allestiti in vario modo:
esame microscopico
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Preparati su vetrini porta-oggetto con copri-oggetto:
1) sterilizzare arroventando sulla fiamma l'ago o l'ansa fino al raggiungimento del colore rosso, si usa l'ansa per prelievi di maggiore quantità, l'ago per prelievi di piccole quantità;2) raffreddare l'ansa o l'ago;3) prelevare il materiale in esame con l'ansa o l'ago se da una coltura o con un tampone sterile se da materiale patologico;4) allestire la sospensione microbica: per l'esame è necessario un mezzo liquido, ed è preferibile utilizzare un numero limitato di microrganismi; a tal scopo si può sospendere una ansata in 5ml di soluzione fisiologica sterile ma ci si regolerà di volta in volta a seconda se il materiale iniziale è in terreno solido o liquido, se èabbondante o meno, o se il tampone è ricco di materiale oppure no;
esame microscopico
5) dispensare sul vetrino portaoggetti 2-3 gocce della sospensione microbica;
6) con un lato del vetrino coprioggetto lambirelateralmente il liquido posto sul portaoggetti e depositare il coprioggetto cercando di non formare bolle. Per osservazioni lunghe sigillare i margini del coprioggetto con un mastice (paraffina);
7) porre il vetrino preparato sul tavolino traslatoredel microscopio;
8) osservare al microscopio composto o a contrasto di fase con obiettivo a secco oppure ad immersione.
esame microscopico
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esame microscopico diretto del materiale in esame
Caratteristiche morfologiche– Colorazione di Gram– Colorazione di Ziehl-Neelsen
Identificazione dei microrganismi
Le colorazioni in Microbiologia.Perché colorare ?
La cellula batterica è trasparente contrasto insufficiente tra cellula batterica ed ambiente circostante.I coloranti debbono consentire:
forte contrasto tra i microrganismi ed il fondodifferenziazione di vari tipi morfologici (forma, organizzazione, colorazione Gram)evidenziazione di alcune strutture (flagelli, capsule, endospore)
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Le colorazioni in MicrobiologiaI coloranti
I coloranti constano di ioni (positivi o negativi). Al riguardo, essi possono essere suddivisi in:
Coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica, violetto di genziana, cristalvioletto, tionina):⌧Carica positiva Affinità per le strutture acide
(superficie cellulare, proteine, acidi nucleici) colorazione diretta
Coloranti acidi (eosina, negrosina, rosso Congo):⌧Carica negativa Affinità per le strutture
basiche, si depositano attorno al microrganismo colorazione indiretta o negativa
Le colorazioni in MicrobiologiaTecniche di colorazione
Colorazioni SEMPLICI: un colorante basico (blu di metilene, fucsina fenicata) viene applicato al campione fissato per un tempo variabile. L’eccesso di colorante viene eliminato tramite risciacquo con acquaConsente di rilevare la morfologia e l’organizzazione cellulare
Colorazioni DIFFERENZIALI:due o più coloranti ed altri reagenti (mordenzanti, differenziatori) consente di distinguere due differenti tipologie di microrganismi o 2 differenti strutture di un microrganismo
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Le colorazioni in MicrobiologiaPreparativa
Preparazione di soluzioni colorantiSoluzione alcoolica (colorante come sale):⌧10 g sostanza colorante + 100 ml alcool assoluto
Soluzione idroalcoolica 10% (colorante subisce dissociazione elettrolitica):⌧10 ml soluzione alcoolica madre colorante + 90 ml H2O
distillataReagenti per colorazioni
Mordenzanti, sostanze che fissano il colorante od amplificano l’ingombro del campione: fenolo, soluzione iodo-iodurataDifferenziatori, sostanze decoloranti: alcool-acetone, acido solforico al 20%
Le colorazioni in MicrobiologiaTipologie di colorazione
Colorazioni PROGRESSIVE: si esegue con soluzioni molto diluite di colorante, interrompendo tempestivamente la colorazioneColorazioni REGRESSIVE: si esegue una ipercolorazione e si usa poi un differenziatore la cui azione decolorante va interrotta tempestivamente
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Tecniche di colorazioneColorazioni DIFFERENZIALI
Colorazione di GramColorazione per bacilli acido-resistenti:⌧Metodo di Ziehl-Neelsen⌧Metodo a freddo di Kinyoun⌧Metodo della fluorescenza con auramina
Colorazione della capsula (inchiostro di china)Colorazione di flagelli (Leifson)Colorazione di spore
Hans Christian Joachim Gram
Batteriologo daneseed inventore dellacolorazione di Gram (nel tentativo didifferenziare Klebsiellapneumoniae dagli pneumococchi)
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Colorazione di GramTecnica
I batteri Gram+ appaiono blu
(Staphylococcus epidermidis)
I batteri Gram- appaiono rossi
(Escherichia coli)
Colorazione di GramOsservazione microscopica
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The Cell EnvelopeThe Cell Envelope
Gram PositiveGram Positive Gram NegativeGram Negative
Parete batterica: Confronto delle superfici
DUNQUE PERCHÉ I BATTERI G– PERDONO LA COLORAZIONE CON CRISTALVIOLETTO?
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Gli acidi teicoici sono legati covalentementeal gruppo 6-ossidrile dell’acido muramico
LEGAME FOSFODIESTERE
LA PARETE BATTERICA DEI GRAM +
LA PARETE BATTERICA DEI GRAM -
Escherichia coli O157 O157:H7
Antigene somatico
Antigene flagellare
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Nei batteri Gram+ il cristalviolettoe lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all’interno della cellula. Il decolorante condensa per disidratazione la struttura petidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene “catturato” dalla parete cellulareNei batteri Gram- il decolorante, agendo come solvente lipidico, dissolve la membrana esterna della parete cellulare così permettendo il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.
Colorazione di GramPrincipio
Colorazione di Gram: l’eccezione
La colorazione di Gram non è applicabilea tutti i batteri.
Esempi consistono nel Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium lepraeIncapacità di colorare per la natura“cerosa” dell’involucro esterno, altamente impermeabile ai colorantiColorazione di Ziehl-Nielsen
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Mycobacterium spp.Parete cellulare
Composizione:Grosse quantità di glicolipidi:⌧acido micolico (60%)⌧complessi lipidi-
arabinogalattani⌧lipoarabinomannani
Scarso petidoglicano
Funzioni:Forma e prevenzione lisi osmotica (peptidoglicano)Inibizione ingresso composti chimici⌧Crescita lenta⌧Maggiore resistenza agli
agenti chimici⌧Maggiore resistenza alla
fagocitosiInduzione sintesi citochine(TNF-α) da parte dell’acido micolico
Mycobacterium spp.Parete cellulare
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Presenza caratteristica di ceramidi e fosfolipidialla superficie cellulare di Mycobacterium spp. eNocardia spp.I coloranti ordinari non possono superare lo strato cerato.Colorazioni con la tecnica per l’acido-resistenza:
KinyounZiehl-Neelsen
Le colorazioni in microbiologiaColorazione di Ziehl-Neelsen
Step 1:Step 1:Versare la fucsina basica
Step 2:Step 2:Fare evaporare scaldando il colorante alla fiamma per 5 minLavare con acqua
Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (1 di 2)
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Step 3:Step 3:Decolorare con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante (circa 2 min)Lavare con acqua
Step 4:Step 4:Contrastare con blu di metilene per 1-2 minLavare con acqua
Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (2 di 2)
Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rossoGli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu
Colorazione di Ziehl-NeelsenOsservazione microscopica
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Ziehl-NeelsenZiehl-Neelsen
1000x
Le colorazioni in MicrobiologiaColorazioni speciali
La colorazione negativa viene usata quando un organismo od una sua struttura non vienecolorata facilmente come, ad esempio, in presenza di capsula.
La colorazione delle spore richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante
La colorazione dei flagelli richiede un mordenzante per ispessire la strutturaflagellare
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Le colorazioni in MicrobiologiaColorazione di flagelli
Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori
Le spore batteriche per la presenza di uno spesso involucro costituito da più strati vengono difficilmente colorate, viceversa una volta che hanno assunto una colorazione si decolorano con estrema difficoltà.Le tecniche di colorazione prevedono una energica fissazione, trattamenti preliminari del preparato che modificano l’impermeabilità delle spore (cloroformio e acido cromico), facilitano l’attraversamento del colorante, l’utilizzo di mordenzanti fisici (calore) o chimici (acido fenico, FeCl2, borato), utilizzo di decoloranti (acidi, sostanze riducenti,, alcool assoluto) che evidenziano la resistenza della spora alla decolorazione.
Le colorazioni in MicrobiologiaColorazione di spore
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1) distensione,essiccazione ed energica fissazione del preparatobatterico;
2) distendere sul preparato blu borace (blu di metilene 2% + 5grborato di sodio in acqua distillata); con la fiamma delbecco bunsen riscaldare per 2-3 min. direttamente il vetrinonella parte sottostante fino a che non si ottiene la comparsa divapori;
3) decolorare con acido nitrico (10%) per 20 sec.;4) allontanare l'eccesso di decolorante;5) lavare e trattare per 1 min. con una soluzione acquosa di cosina
1%;6) lavare ed asciugare con carta bibula;7) osservare con obiettivo ad immersione
Le colorazioni in MicrobiologiaColorazione di spore
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Identificazione dei microrganismi
1. esame microscopico diretto del materiale in esame
2. Caratteristiche morfologicheColorazione di GramColorazione di Ziehl-Neelsen
3. Caratteristiche colturali
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Coltivazione dei batteri
COLTIVAZIONE DEI BATTERI: processo mediante il quale si cerca di ottenere la riproduzione dei microrganismi in un ambiente artificiale fornendo loro le sostanze nutritizie necessarie e adatte condizioni ambientali:
-Temperatura-Acidità (pH)
-Pressione osmotica-Luce ecc.
La coltivazione dei batteri ci permette di:-studiarne le caratteristiche biologiche-isolarli ed identificarli da un campione biologico a scopo diagnostico
Terreni di colturaTerreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo
Classificazione dei terreni di coltura
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Terreni selettivi: sono terreni di crescita adatti alla moltiplicazione diuno specifico microrganismo o di un numero ristretto di microrganismi e che sfavoriscono la crescita di altri microrganismi.
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Cetrimide Agar: Terreno selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato per stimolare la produzione di pigmento. Cetrimide inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.
MacConkey agar: evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di Gram+.
Terreni selettivi: esempi
Mannitol Salt Agar:Terreno selettivo e differenziale per l’isolamento di stafilococchi presunti patogeni. Azione selettiva dell’elevata [NaCl]. Indicatore: rosso fenolo. S. aureus produce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora.
Salmonella-Shigella Agar (Agar SS):Terreno selettivo (Sali biliari) e differenziale per l’isolamento di Salmonella e Shigella dalle
feci. Zucchero: lattosio. Indicatore: rosso neutro. Tiosolfato di sodio e citrato ferrico.
Terreni differenziali: rendono possibile alle colonie di un dato microrganismo di svilupparsi assumendo un aspetto
tale da essere riconosciuto a prima vistaEsempi
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TERRENI DI ARRICCHIMENTO: sono terreni selettivi liquidi. La presenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero delle specie da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici.
Preparazione dei terreni di coltura
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La semina dei terreni di coltura
Semina di terreno solido
Striscio Spatolamento
Inclusione
Inoculo in terreno liquido
Trasferimento insterilità di cellule nelterreno liquido con
ansa o pipetta
Lavorare in Sterilità
Si lavora con fiamma ossidante(azzurra, più calda, più
stabile), NON riducente (gialla)
Becco Bunsen
Pipette Spatola
Ansa
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Tecniche di semina per isolamento
Semina per isolamento
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Tecniche di semina per isolamento
Incubazione dei microrganismiI brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad unaTEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali perpermettere la crescita del microrganismo con sui si sta lavorando
Bacillus stearothermophilusG+, anaerobio facoltativo, termofilo
Incubazione a 60°C per 8-12 h
Bifidobacterium bifidumG+, anaerobio stretto, mesofiloIncubazione a 37°C per 36-48 h
Giara per anaerobiosi
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Cappa (camera) anaerobica
Anaerobiosi
Figure 6.6
Giara per anaerbiosi
Anaerobiosi
Figure 6.5
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Candle jar
CO2-packet
Carbossifilia
Figure 6.7
Concetto di Sterilità
Sterilizzazione:Sterilizzazione:Impiego di procedure Impiego di procedure
chimiche e/o fisiche per la chimiche e/o fisiche per la completa eliminazione o completa eliminazione o distruzione di qualsiasi distruzione di qualsiasi forma di vita microbica, forma di vita microbica,
incluse le spore (forme di incluse le spore (forme di resistenza).resistenza).
Disinfezione:Disinfezione:Processo che riduce o elimina completamente Processo che riduce o elimina completamente
tutti i microrganismi patogeni unicellulari (solo tutti i microrganismi patogeni unicellulari (solo allo stato vegetativo) presenti nellallo stato vegetativo) presenti nell’’ambiente.ambiente.
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MICROBIOTAMICROBIOTA
AmbienteNORMAL HUMAN NORMAL HUMAN
MICROBIOTAMICROBIOTA
Agricoltura
Industria
AnimaliMicrobiota capace di
causare malattienell’uomo
AreeAree in cui in cui ilil controllocontrollo deidei microrganismimicrorganismi èènecessarionecessario (a (a differentidifferenti livellilivelli))
MICROBIOTAMICROBIOTA
AmbienteNORMAL HUMAN NORMAL HUMAN
MICROBIOTAMICROBIOTA
Agricoltura
Industria
Animali
PPercherchéé èè necessario il controllo dei necessario il controllo dei microrganismi: microrganismi: alcuni esempialcuni esempi
Cibo,
farm
aceu
tici,
carb
uran
te,
cosm
etici
, etc
Animali, pollame, (conservazione, produzione), etc
Sanitizzazionedelle aree
Malattie di alberi, raccolto, piante, etc
PrevenzionePrevenzione didi infezioniinfezioniiatrogeneiatrogene, , infezioniinfezioni
chirurgichechirurgiche, , infezioniinfezioni crociatecrociate, , diffusionediffusione didi microrganismimicrorganismi e e
genigeni associatiassociati ad ad antibioticoantibiotico--R, R, etcetc
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Quali sono i mezzi a nostra Quali sono i mezzi a nostra disposizione ?disposizione ?
DisinfezioneDisinfezionemetodi chimicimetodi chimici
SterilizzazioneSterilizzazionemetodi fisicimetodi fisicimetodi chimicimetodi chimicimetodi metodi chimicochimico--fisicifisici
TTecnicheecniche di di sterilizzazionesterilizzazione
From: PR Murray et al Medical From: PR Murray et al Medical Microbiology 3rd edition, Microbiology 3rd edition, MosbyMosby, , 19981998
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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche FISICHETecniche FISICHE
CaloreCalore⌧⌧UmidoUmido⌧⌧SeccoSecco
FiltrazioneFiltrazioneRadiazioni UVRadiazioni UVRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzantiUltrasuoniUltrasuoni
Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisica
CALORESECCO - Esposizione diretta alla fiamma (flambaggio)
- Incenerimento- Stufa a secco
UMIDO - Vapore fluente*- Vapore sotto pressione - Tindalizzazione- Pasteurizzazione
*L’impiego di acqua in ebollizione e di vapore fluente sono da proscrivere: a t° <110°C non si ha una sterilizzazione efficace
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TRAMITE CALORE UMIDO
TEMPERATURA TEMPO
100°C oltre 1200 min.108°C 420 min.110°C 120 min.113°C 30 min.125°C 1 min.135°C 30 sec.
Si definisce sterilizzazione a calore umido il procedimento che utilizza vapore acqueo saturo a T° non minore di 110°C
TRAMITE CALORE UMIDO
TEMPERATURA TEMPI PRESSIONE
115°C 20 min. 0,7 atm121°C 15 min. 1,0 atm134°C 3 min. 2,0 atm
VANTAGGI•Rapidità di penetrazione del calore nei materiali
•Distruzione dei microrganismi in breve tempo
•Facile controllo della sterilità•Atossicità•Economia di esercizio
SVANTAGGI•Degradazione del materiale termolabile
•Corrosione dei metalli•Impossibilità di sterilizzare grassi e polveri anidre
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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaCalore umido (autoclaveCalore umido (autoclave))
Tecnica piTecnica piùù comunemente impiegatacomunemente impiegataMateriali Materiali termostabilitermostabili, terreni di coltura, , terreni di coltura, rifiuti infettivirifiuti infettiviNon adatta per: chimici Non adatta per: chimici toxtox e/o volatili, e/o volatili, radioisotopi radioisotopi Camera a pressione che utilizza vapore Camera a pressione che utilizza vapore saturo per ottenere elevate temperature. saturo per ottenere elevate temperature. LL’’aria viene rimossa dalla camera per gravitaria viene rimossa dalla camera per gravitàào tramite o tramite prevuotoprevuotoCiclo Ciclo ““classicoclassico””: 121: 121°°C, 15 C, 15 minmin, 1 , 1 atmatm
Diversi cicli in base alla tipologia di materialeDiversi cicli in base alla tipologia di materiale
Calore umido - Autoclave
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AutoclaveAutoclave
From: AD Russell et al.From: AD Russell et al.Principles & Practice of Principles & Practice of Disinfection, Preservation Disinfection, Preservation & Sterilization, Blackwell, & Sterilization, Blackwell, 19991999
Killing Killing takes timetakes time
1 log reduction
Note:Note:•• Uccisione richiede Uccisione richiede
tempotempo•• ““SterilitSterilitàà”” non non èè
assolutaassoluta•• II protocolli si basano su protocolli si basano su
““overkilloverkill”” calcolatecalcolate
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TINDALIZZAZIONE
Tindalizzazione o sterilizzazione frazionata (calore umido) viene utilizzata per sterilizzare terreni contenenti sostanze termolabili.
- 73÷80°C per 30’- raffreddare a temperatura ambiente- ripetere il trattamento dopo 24 h a 73÷80°C per 30’- raffreddare a temperatura ambiente- ripetere il trattamento dopo 24 h a 73÷80°C per 30’
PASTORIZZAZIONE
Tecnica utilizzata per la bonifica e la conservazione di alimenti.
- 63°C per 30’ (pastorizzazione bassa)- 72°C per 15’’ (pastorizzazione alta)- 90°C per 1’’ (pastorizzazione ultra alta
UHT)
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TRAMITE CALORE SECCO
Materiale non sterilizzabile-Tessuti-Soluzioni acquose-Farmaci organici-Oggetti smaltati-Materiale termosensibile
Materiale sterilizzabile-Vetreria-Strumentazione metallica-Polveri farmaceutiche-Preparazioni non acquosedi sostanze termostabili
(olii)-Materiale termoresistente
SVANTAGGI•Deterioramento materiale termosensibile•Durata eccessiva del processo
VANTAGGI•Apparecchiatura ubiquitaria•Sterilizzazione strumenti all’interno dei contenitori, se metallici
•Non corrode i metalli
Caldo secco Caldo secco –– Forno PasteurForno Pasteur
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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaCalore secco (forno Calore secco (forno PasteurPasteur))
Utilizzato per materiali danneggiati Utilizzato per materiali danneggiati dal vapore o perchdal vapore o perchéé impermeabili al impermeabili al vaporevapore⌧⌧OliiOlii, polveri, oggetti taglienti, vetreria, , polveri, oggetti taglienti, vetreria,
rifiuti infettivi (alternativa al calore umido)rifiuti infettivi (alternativa al calore umido)Meno efficace del calore umido e Meno efficace del calore umido e
richiede tempi e temperature maggioririchiede tempi e temperature maggioriDistruzione Distruzione ossidativaossidativa
Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaCalore seccoCalore secco
TEMPERATURA TEMPO180°C 30 min.170°C 60 min.160°C 120 min.150°C 150 min.140°C 180 min.120°C 360 min.
Il tempo di sterilizzazione deve essere conteggiato a partire dal momento in cui il materiale ha raggiunto la temperatura prefissata
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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche FISICHETecniche FISICHE
CaloreCalore⌧⌧UmidoUmido⌧⌧SeccoSecco
FiltrazioneFiltrazioneRadiazioni UVRadiazioni UVRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzantiUltrasuoniUltrasuoni
Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaFiltrazioneFiltrazione
Rimozione di microrganismi e particelle Rimozione di microrganismi e particelle microscopiche dalle soluzioni, aria ed altri microscopiche dalle soluzioni, aria ed altri gasgas
Filtri a membrana (nitrato di cellulosa, acetato di Filtri a membrana (nitrato di cellulosa, acetato di cellulosa)cellulosa)Filtri 1.2 Filtri 1.2 µµm: m: prefiltroprefiltro per chiarificare la per chiarificare la soluzionesoluzioneFiltri 0.45 Filtri 0.45 µµm: rimozione batteri, lieviti e funghi m: rimozione batteri, lieviti e funghi da liquidi biologici e farmaceuticida liquidi biologici e farmaceuticiFiltri 0.22 Filtri 0.22 µµm: rimozione m: rimozione pseudomonadipseudomonadi ed altri ed altri casi particolaricasi particolari
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FiltrazioneFiltrazione
Sistemi filtranti
Microfotografia filtro
FiltrazioneFiltrazione
Enterococchi su membrana
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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche FISICHETecniche FISICHE
CaloreCalore⌧⌧UmidoUmido⌧⌧SeccoSecco
FiltrazioneFiltrazioneRadiazioni UVRadiazioni UVRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzantiUltrasuoniUltrasuoni
Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaRadiazione ultravioletta (Radiazione ultravioletta (U.VU.V.).)
Agiscono efficacemente sugli acidi nucleici Agiscono efficacemente sugli acidi nucleici cellulari per diretta esposizione a 254 cellulari per diretta esposizione a 254 nmnmApplicazioni:Applicazioni:
decontaminazione aria, acqua, superficidecontaminazione aria, acqua, superficisterilizzazione fredda di composti chimici e sterilizzazione fredda di composti chimici e plastiche per uso farmaceutico, siero per TCplastiche per uso farmaceutico, siero per TC
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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaRadiazione ultravioletta (Radiazione ultravioletta (U.VU.V.).)
Fattori critici:Fattori critici:CapacitCapacitàà di penetrazione (generalmente scarsa)di penetrazione (generalmente scarsa)Distanza della sorgente UV dal materiale Distanza della sorgente UV dal materiale esposto a trattamentoesposto a trattamentoIntensitIntensitàà della luce (sostituzione dopo 8.000 h)della luce (sostituzione dopo 8.000 h)UmiditUmiditàà relativarelativaSpecie microbicaSpecie microbica
Radiazione U.V.
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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche FISICHETecniche FISICHE
CaloreCalore⌧⌧UmidoUmido⌧⌧SeccoSecco
FiltrazioneFiltrazioneRadiazioni UVRadiazioni UVRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzantiUltrasuoniUltrasuoni
Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzanti
Radiazioni dello spettro elettromagnetico Radiazioni dello spettro elettromagnetico (microonde, raggi (microonde, raggi γγ, raggi X, elettroni), raggi X, elettroni)Sterilizzazione fredda (a basse temperature)Sterilizzazione fredda (a basse temperature)Effetto letale risultante da unEffetto letale risultante da un’’azione diretta azione diretta (trasferimento di energia alle molecole (trasferimento di energia alle molecole bersaglio) ed indiretta (diffusione di radicali) bersaglio) ed indiretta (diffusione di radicali) sulla molecola bersaglio (DNA)sulla molecola bersaglio (DNA)
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Onde elettromagnetiche a bassa frequenza (3x108-3x1010 Hz)- Meccanismo d’azione: Aumento della temperatura per attrito
interno• P. aeruginosa, E. coli, S. aureus distrutti dopo 90 secondi• B. subtilis, B. stearothermophilus distrutti dopo 150 secondi
MICROONDE
VANTAGGI•Velocità•Mancanza di vapori o gas tossici
•Economia di esercizio•Elevata sterilizzazione•Non scalda i materiali plastici
•Bassa T° a fine ciclo•Maneggevolezza
SVANTAGGI•Difficoltà controllo T°•Impossibile sterilizzare metalli
Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzanti
Applicazioni:Applicazioni:microonde:microonde:⌧⌧Sterilizzazione Sterilizzazione ““flashingflashing”” di terreni di colturadi terreni di coltura
raggi raggi γγ::⌧⌧prodotti da cobaltoprodotti da cobalto--6060⌧⌧alto potere di penetrazionealto potere di penetrazione⌧⌧non applicabile (costi elevati) in laboratorionon applicabile (costi elevati) in laboratorio⌧⌧dispositivi medici, (siringhe ipodermiche, suture, dispositivi medici, (siringhe ipodermiche, suture,
terreni di coltura, contenitori)terreni di coltura, contenitori)fascio elettronico:fascio elettronico:⌧⌧Trattamento di rifiuti infettiviTrattamento di rifiuti infettivi⌧⌧Non applicabile in laboratorio (scarso potere di Non applicabile in laboratorio (scarso potere di
penetrazione) penetrazione)
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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche FISICHETecniche FISICHE
CaloreCalore⌧⌧UmidoUmido⌧⌧SeccoSecco
FiltrazioneFiltrazioneRadiazioni UVRadiazioni UVRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzantiUltrasuoniUltrasuoni
Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaUltrasuoniUltrasuoni
Energia ultrasonica a bassa frequenza inattiva per cavitazione i microrganismi in sospensioni acquoseSonicatori usati per pulizia di strumenti ma non vengono considerati sterilizzatori,tuttavia:
Combinazione ultrasuoni + trattamento chimico può avere effetto letale
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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche CHIMICHETecniche CHIMICHE
Acido Acido peraceticoperaceticoGlutaraldeideGlutaraldeide
Sterilizzazione chimicaAcido peracetico, glutaraldeide
Acido peraceticoimmersione (0.2% per 20’ - acqua sterile - aria sterile)industrie alimentari, strumenti chirurgici (micronizzato)efficace in presenza di materiale organico e produce prodotti finali non tox (ac. acetico + O2)
Glutaraldeide2% per materiale medico e chirurgico, in alternativa a trattamento termico o irraggiamentopreparazione di vaccini
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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche CHIMICOTecniche CHIMICO--FISICHEFISICHE
Ossido di etilene (ETO)Ossido di etilene (ETO)Formaldeide (vapori)Formaldeide (vapori)
Sterilizzazione chimico-fisicaOssido di etilene (ETO)
Tecnica piTecnica piùù usata nelle strutture sanitarie per usata nelle strutture sanitarie per sterilizzare materiale sterilizzare materiale termosensibiletermosensibileAlchilazioneAlchilazione di gruppi funzionali (amminici, carbossilici, di gruppi funzionali (amminici, carbossilici, fenolici, fenolici, idrossiliciidrossilici))12% ETO + 88% Freon (oppure CO12% ETO + 88% Freon (oppure CO22, N, N22))Fattori critici:Fattori critici:
Concentrazione ETOConcentrazione ETOTemperaturaTemperaturaUmiditUmiditàà relativarelativaTempo di esposizioneTempo di esposizioneNatura del materialeNatura del materiale
ETO ETO èè carcinogenocarcinogeno, mutageno. Impiego regolamentato., mutageno. Impiego regolamentato.
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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche CHIMICOTecniche CHIMICO--FISICHEFISICHE
Ossido di etilene (ETO)Ossido di etilene (ETO)Formaldeide (vapori)Formaldeide (vapori)
Sterilizzazione Sterilizzazione chimicochimico--fisicafisicaFormaldeide (vapori)Formaldeide (vapori)
Reagisce con proteine cellulari, DNA, RNAReagisce con proteine cellulari, DNA, RNAVaporizzazione 2Vaporizzazione 2--5% formaldeide in 5% formaldeide in presenza di vapor acqueo a 60presenza di vapor acqueo a 60--8080°°CCFormaldeide Formaldeide èè carcinogenacarcinogena, residui trovati , residui trovati in materiale polimerico (cellulosa, gomma)in materiale polimerico (cellulosa, gomma)
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Scelta della tecnica di Scelta della tecnica di sterilizzazionesterilizzazione
AttivitAttivitàà:: battericida, battericida, tubercolicidatubercolicida, fungicida, , fungicida, sporicidasporicida, , virucidavirucidaRapiditRapiditàà di azione:di azione: sterilizzazione raggiunta in breve sterilizzazione raggiunta in breve tempotempoPenetrazione:Penetrazione: forte penetrazione allforte penetrazione all’’interno del interno del confezionamento e della strumentazioneconfezionamento e della strumentazioneCompatibilitCompatibilitàà:: non causa rilevanti cambiamenti non causa rilevanti cambiamenti strutturali o funzionali del materiale in seguito a ripetuti strutturali o funzionali del materiale in seguito a ripetuti cicli di sterilizzazionecicli di sterilizzazioneAtossicitAtossicitàà:: non produce rischi per lnon produce rischi per l’’operatore e per operatore e per ll’’ambienteambienteResistenza a materiale organico:Resistenza a materiale organico: efficacia invariata in efficacia invariata in presenza di materiale organicopresenza di materiale organicoCostoCosto--efficaciaefficacia:: costi ragionevoli per attrezzatura, costi ragionevoli per attrezzatura, installazione e operazioniinstallazione e operazioni
… in altre parole:
non esiste una tecnica di sterilizzazione IDEALE !
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DISINFEZIONE
ANTISETTICO sostanza che, applicata sui tessuti umani, espleta azione batteriostatica o battericida sulle forme vegetative di molti patogeni (e alcuni virus)
DISINFETTANTE composto chimico antimicrobico ad azione aspecifica e non selettiva in grado di agire su superfici ed oggetti inanimati con effetto decontaminante sulle forme vegetative (e alcuni virus) fino a livello di sicurezza
TecnicheTecniche dididisinfezionedisinfezione
From: PR Murray et al From: PR Murray et al Medical Microbiology Medical Microbiology 3rd edition, 3rd edition, MosbyMosby, , 19981998
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DISINFEZIONEAldeidi
Formaldeide, glutaraldeideAlchilazione dei gruppi polari (aminici, idrossilici, fenolici) delle proteineFormaldeide
37%, formalina (sterilizzazione)3-8%, disinfenzione (tox, carcinogenico)
Glutaraldeide2%, battericida, fungicida, virucidaNo disinfezione superfici (vapori irritativi)Disinfezione per immersione di strumentazione ospedaliera: 2% glutaraldeide per 2-10 min(3-10 h per sporicidia)
DISINFEZIONEDISINFEZIONEAgenti ossidantiAgenti ossidanti
Perossido dPerossido d’’idrogeno (Hidrogeno (H22OO22), acido ), acido peraceticoperaceticoBattericidi, fungicidi, Battericidi, fungicidi, virucidivirucidiFormazione di radicali Formazione di radicali ossidriliciossidrilici in in grado di ossidare sistemi enzimatici grado di ossidare sistemi enzimatici critici per il microrganismocritici per il microrganismoUtilizzo principalmente industriale, per Utilizzo principalmente industriale, per la disinfezione di apparecchiature e la disinfezione di apparecchiature e materialimateriali
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DISINFEZIONEAlcooli
Etanolo, isopropanolo (60-85%)Danneggiano membrana citoplasmatica:
denaturazione (coagulazione) proteinesolubilizzazione lipidi
Battericidi, fungicidi, tubercolicidiEtanolo esibisce ampio spettro virucida (HIV, adenovirus, herpesvirus, virus influenzale, coxsachie B1 virus, poliovirus 1)
Disinfezione superfici in zone ben ventilate e lontano da fiamme
DISINFEZIONEFenoli e derivati fenolici
Fenolo: tossico, corrosivo, carcinogenicoDerivati fenolici con gruppo funzionale (cloro, bromo, alchil, benzil, phenyl, amil) a sostituzione di un H del ring aromaticoDistruzione membrana e parete cellulare, inattivazione enzimatica, denaturazione proteicaBattericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi
2-5% (0.5%, HIV; 2%, funghi)O-phenylphenol (Lysol), IrgasanEsaclorofene (Phisohex):
HLD per cocchi Gram+Strumenti chirurgici
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DISINFEZIONEAlogeni
Bromuri, fluoruri, cloruri, ioduriBattericidi, fungicidi, virucidi, sono combinati per ridurre tox, instabilità e corrosivitàEliminazione di gruppi S-H:
Ossidazione: form. di ponti di-sulfidrilici inattiviCombinazione: ione metallico sottrae SH liberi
CloruriCl + p-toluene-sulfonamide (chloramine T)1:10 sodio-ipoclorito (NaOCl) 5.25% per rischi ematogeni (soluzione “recente”, cute pulita)
IoduriPVP-J (Betadine) per uso cutaneo e chirurgico
DISINFEZIONEComposti ammonio quaternario
Detergenti cationici, derivati da modificazioni di NH4
+
Distruzione membrana cellulare, inattivazioneenzimatica, denaturazione (coagulazione) proteicaBatteriostatico (-cida ad elevate concentrazioni), fungistatico, virustaticoFrequenti infezioni da Gram- QUATs-associate(Pseudomonas spp. è QUATs-resistente)Non corrosivi, non tossici, economiciNeutralizzati da materiale organico, saponi e detergenti anionici
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DISINFEZIONESurfattanti
Saponi e detergentiSaponi e detergentiRimozione meccanica dei microrganismi Rimozione meccanica dei microrganismi (flora transitoria: (flora transitoria: GramGram--, 80%) per , 80%) per sfregamentosfregamentoI saponi degradano la pellicola I saponi degradano la pellicola idrolipidicaidrolipidica sopracutanea sopracutanea ((emulsificazioneemulsificazione))
DisinfezioneDisinfezione
-- SensibilitSensibilitàà relativarelativa-- LimitazioniLimitazioni
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ApplicaziApplicazione delle tecniche di one delle tecniche di disinfezionedisinfezione
Un Un approccioapproccio convenienteconveniente èè quelloquello suggeritosuggeritodada Spaulding, Spaulding, applicatoapplicato nellenelle lineelinee--guidaguida U.S.U.S.GliGli oggettioggetti cheche necessitanonecessitano didi essereesseredisinfettatidisinfettati o o sterilizzatisterilizzati sonosono classificaticlassificaticome:come:
criticicriticisemisemi--criticicriticinon non criticicritici
I I livellilivelli richiestirichiesti didi disinfezionedisinfezione sonosono::alto alto livellolivellointermediointermediobasso basso livellolivello
LivelliLivelli didi disinfezionedisinfezione
Alto Alto livellolivelloPer Per strumentazionistrumentazioni ““critichecritiche”” cheche sonosono a a contattocontatto con con tessutitessuti corporeicorporei e non e non possonopossonoessereessere sterilizzatisterilizzati ((laparoscopilaparoscopi, , artroscopiartroscopi, etc), etc)
IntermedioIntermedioPer Per strumentazionestrumentazione ““semisemi--criticacritica”” cheche puòpuò venire venire a a contattocontatto con con mucosemucose o cute, ma non o cute, ma non penetranopenetranoneinei tessutitessuti ((termometritermometri, etc), etc)
Basso Basso livellolivelloPer Per oggettioggetti ““non non criticicritici””, , disinfezionedisinfezione ambientaleambientale, , etcetc
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Spaulding’s scheme
AAltolto livello di livello di disinfezionedisinfezione
BBassoasso livello livello di di
disinfezionedisinfezione
IIntermediontermediolivello di livello di
disinfezionedisinfezione
Resistenza Resistenza dei dei
microrganismi microrganismi alla alla
disinfezionedisinfezione
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DISINFEZIONEFattori critici
Ambiente:temperatura (20-37°C)pH del mezzo in cui deve agire il disinfettante
Materiale:natura del materiale (porositàpresenza di materiale organico (sangue, pus)⌧Inattivazione principio attivo⌧Rivestimento superficie batterica⌧Adsorbimento (eliminazione) del principio attivo
Disinfettante:concentrazione del principio attivotempo di applicazione (contatto con materiale)qualità acqua per diluizione disinfettante
Microrganismo:tipologiacarica microbica
Il fenolo è il disinfettante più attivo
Coefficiente fenolicoRapporto tra la concentrazione minima di fenolo, capace di uccidere un germe test
(Salmonella typhimurium) in 10 minuti ma non in 5, e quella del composto in esame
DISINFEZIONEValutazione del potere disinfettante
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Scelta di un disinfettanteScelta di un disinfettante
AttivitAttivitàà:: esteso spettro di azione (battericida, esteso spettro di azione (battericida, fungicida, fungicida, tubercolicidatubercolicida, , virucidavirucida))RapiditRapiditàà di azione:di azione: breve breve ““tempo minimo di tempo minimo di applicazioneapplicazione””: 1: 1--10 minuti10 minutiAtossicitAtossicitàà:: non irritante per occhi, mucose, cutenon irritante per occhi, mucose, cuteNo colorazioniNo colorazioniNon corrosivoNon corrosivoStabilitStabilitàà:: per diluizioni e tempi consigliati (anche in per diluizioni e tempi consigliati (anche in presenza di materiale organico)presenza di materiale organico)Buona capacitBuona capacitàà di penetrazione e di penetrazione e detersionedetersioneCosti:Costi: ragionevoli (ragionevoli (economiciteconomicitàà))
Fenoli (superfici, oggetti)
Aldeidi (superfici, oggetti, strumenti
Cloro (oggetti, superfici, biancheria
Ammonio quaternario (pelle, ferite, oggetti)
Ossigeno attivo (ferite, strumenti)
Iodio (pelle, mani, ferite)
Clorexidina (pelle, mani, ferite)
Alcool (pelle, mani, ferite)
PseudomonasSporeB. kock
LievitiFunghiVirusGram-Gram +Principio attivo e (suo impiego)
Attivitànessuna
Solo su alcuneforme
Attivitàmedia
Attivitàbuona
LA DISINFEZIONE
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